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Derivado de matriz extracelular nativa

Cite isto: DOI: 10.1039 / c7lc00317j
inserções de membrana semipermeáveis, opticamente
transparentes e baratas para cultura de células microfluídicas
Publicado a 15 de agosto de 2017. Descarregado por University of Windsor em 15/08/2017 14:09:33.

†
Mark J. Mondrinos, ‡ Yoon-Suk Yi,‡ Nan-Kun Wu,
Xueting Ding e Dongeun Huh *

Membranas de cultura de células semipermeáveis são comumente usadas em dispositivos microfluídicos multicamadas para imitar a membrana basal na Vivo e para criar

microambientes compartimentados para crescimento e diferenciação de células fisiológicas. No entanto, as membranas existentes são predominantemente compostas por

polímeros sintéticos, fornecendo capacidade limitada para replicar interações celulares com matrizes extracelulares nativas que desempenham um papel crucial na indução de

fenótipos fisiológicos. Aqui, descrevemos um novo tipo de membranas de cultura de células projetadas a partir de materiais de matriz extracelular nativa (ECM) que são finas,

semipermeáveis, opticamente transparentes e passíveis de integração em dispositivos de cultura de células microfluídicas. A fabricação fácil e econômica dessas membranas foi

alcançada por etapas sequenciais controladas de vitrificação que transformaram hidrogéis de ECM tridimensionais (3D) em filmes finos estruturalmente estáveis. Ao modular a

composição do ECM, nossa técnica forneceu um meio de ajustar as principais propriedades da membrana, como transparência óptica, rigidez e porosidade. Para cultura de células

microfluídicas, construímos um microdispositivo multicamadas que consiste em duas câmaras paralelas separadas por uma inserção de membrana fina derivada de diferentes tipos

de ECM. Este estudo mostrou que nossas membranas ECM apoiaram a fixação e o crescimento de vários tipos de células (células epiteliais, endoteliais e mesenquimais) sob

condições de cultura de perfusão. Nossos dados também revelaram os efeitos promotores das membranas na sinalização intracelular associada à adesão que medeia as células

construímos um microdispositivo de múltiplas camadas que consiste em duas câmaras paralelas separadas por uma inserção de membrana fina derivada de diferentes tipos de

ECM. Este estudo mostrou que nossas membranas ECM apoiaram a fixação e o crescimento de vários tipos de células (células epiteliais, endoteliais e mesenquimais) sob condições

de cultura de perfusão. Nossos dados também revelaram os efeitos promotores das membranas na sinalização intracelular associada à adesão que medeia as células construímos

um microdispositivo de múltiplas camadas que consiste em duas câmaras paralelas separadas por uma inserção de membrana fina derivada de diferentes tipos de ECM. Este

estudo mostrou que nossas membranas ECM apoiaram a fixação e o crescimento de vários tipos de células (células epiteliais, endoteliais e mesenquimais) sob condições de cultura

de perfusão. Nossos dados também revelaram os efeitos promotores das membranas na sinalização intracelular associada à adesão que medeia as células-Interações ECM. Além

Recebido em 24 de março de 2017, disso, demonstramos o uso dessas membranas para a construção de sistemas de cultura de células microfluídicas compartimentadas para induzir a diferenciação fisiológica de
aceito em 12 de junho de 2017
tecidos ou para replicar interfaces entre diferentes tipos de tecidos. Nossa abordagem fornece uma plataforma robusta para produzir e projetar substratos de cultura de células

biologicamente ativos que servem como alternativas promissoras para inserções de membrana sintética convencionais. Esta estratégia pode contribuir para o desenvolvimento de
DOI: 10.1039 / c7lc00317j

rsc.li/loc em vitro modelos de cultura de células para uma ampla gama de aplicações.

Introdução tipos de sue e seus comportamentos integrativos que dão origem a

Os modelos de cultura de células microfisiológicas, conhecidos
coletivamente como órgãos em chips, estão emergindo rapidamente como
uma nova plataforma para emular as unidades essenciais de órgãos vivos
para uma ampla variedade de aplicações.1-3 Ao permitir novos recursos
para apresentar células cultivadas com pistas estruturais, bioquímicas e
biomecânicas fisiologicamente relevantes, os modelos de órgão em um
chip tornam possível imitar o fenótipo nativo de vários tecidos
Departamento de Bioengenharia, Escola de Engenharia e Ciências Aplicadas,
Universidade da Pensilvânia, PA, EUA. E-mail: huhd@seas.upenn.edu ; Tel: +1 215 898
5208
† Informações complementares eletrônicas (ESI) disponíveis. Consulte DOI: 10.1039 / c7lc00317j
‡ Estes autores contribuíram igualmente para este trabalho.
funções complexas em nível de órgão. Na última década, um sucesso
considerável foi alcançado em demonstrar a viabilidade de alavancar
esta estratégia de microengenharia biomimética para modelar as
unidades funcionais de vários órgãos para pesquisa básica e
translacional.4-7
A construção desses modelos microfisiológicos frequentemente requer
sistemas microfluídicos perfusáveis que consistem em camadas
empilhadas de câmaras de cultura de células microfabricadas.8 Este projeto
fornece um ambiente compartimentado vantajoso para a co-cultura de
diferentes tipos de células para replicar a heterogeneidade celular e as
estruturas de tecido em várias camadas encontradas em praticamente
todos os órgãos. Como um componente chave neste tipo de
microdispositivo, membranas semipermeáveis contendo poros nano ou
microscópicos são comumente usadas como substratos de cultura de
células imprensados entre duas câmaras adjacentes. Nisso

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configuração, as membranas fornecem uma barreira física para a
migração celular e permitem a compartimentação de diferentes
populações de células, permitindo a sua troca de moléculas de
sinalização solúveis através dos poros, mimetizando o papel da
membrana basal na Vivo.8,9 Esta abordagem tem sido usada
extensivamente em modelos de cultura de células
microengenharia para reconstituir vários tipos de tecido-
interfaces de tecido e estudar suas funções fisiológicas em uma
variedade de contextos, incluindo respostas imunológicas,7
transporte biomolecular,4 troca de gás e fluido,10 entrega de
drogas,5 e absorção de nanopartículas.11
Apesar de seu uso difundido em cultura microfluídica, no
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entanto, uma seleção existente de membranas semipermeáveis
comercialmente disponíveis ou personalizadas sofre de várias
limitações. Mais notavelmente, a grande maioria das membranas
de cultura de células em uso hoje é composta de polímeros
sintéticos, como poliésteres, policarbonatos ou poli-
IJdimetilsiloxano) (PDMS), que difere significativamente do ECM
nativo. O ECM representa o componente insolúvel chave do
microambiente celular e serve como um substrato de ancoragem
para células aderentes, envolvendo receptores de superfície
celular específicos do ligante ECM.12,13 Para imitar este aspecto
crítico da célula-Interações ECM, membranas sintéticas podem
ser modificadas por revestimento absorvente ou ligação
covalente de proteínas ECM na superfície para apoiar a fixação
celular.8,14 No entanto, o material a granel permanece estranho e
não consegue imitar a composição bioquímica da membrana
basal que fornece pistas instrutivas para a expressão de
fenótipos celulares fisiológicos.15 Essas membranas poliméricas
também não têm a capacidade de imitar a arquitetura fibrosa e
as propriedades físicas (por exemplo rigidez) de matrizes nativas
que influenciam profundamente a estrutura e função das células.
16Essas limitações inerentes muitas vezes se tornam a fonte de
discrepâncias entre os modelos microfisiológicos e seus na Vivo
homólogos. A falta de transparência óptica é outro problema
comum em certos tipos de membranas sintéticas (por exemplo,
substratos eletrofiados, inserções Transwell microporosas)
que impõem restrições à imagem e análise de células em
dispositivos microfluídicos contendo membrana. Além disso,
a fabricação de membranas porosas exige técnicas de
fabricação especializadas e caras, como gravação em trilha,17
eletrofiação,18 e gravação química.19 Este requisito apresenta um
grande desafio prático para a produção de rotina e otimização de
membranas de cultura de células necessárias para sistemas
microfisiológicos de prototipagem rápida em um ambiente de
laboratório de pesquisa.
Em um esforço para resolver esses problemas, aqui nós descrevemos
uma estratégia simples e econômica para gerar membranas de cultura de
células semipermeáveis derivadas de proteínas ECM nativas que podem
ser facilmente integradas em dispositivos microfabricados. Esta técnica
utiliza desidratação e vitrificação de hidrogel de ECM orientada por
evaporação natural para formar filmes de ECM finos sem a necessidade de
infraestrutura ou equipamento especializado. As membranas resultantes
são fibrosas, claras, permeáveis e mecanicamente estáveis o suficiente
para reter sua integridade estrutural durante a ligação e montagem de
camadas múltiplas
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dispositivos microfluídicos. Usando hidrogel de colágeno e Matrigel
como materiais representativos, demonstramos novos recursos para
ajustar as propriedades das membranas ECM e para modular a
fixação e a organização de diferentes tipos de células aderentes. Além
disso, mostramos a prova de princípio para o uso dessas membranas
em microdispositivos compartimentados para projetar tecidos de
barreira humanos vivos que se assemelham a vários tipos de tecido-
interfaces de tecido na Vivo. Nossas membranas derivadas
naturalmente oferecem novas oportunidades para superar as
principais limitações das membranas semipermeáveis convencionais
e para melhorar a relevância fisiológica e a capacidade preditiva de
modelos de cultura de células microfluídicas.
Métodos
Fabricação de membrana
A produção de membranas de ECM foi realizada pelo
processo de fabricação de várias etapas representado na Fig.
1. Para começar, um volume predeterminado de solução
precursora de hidrogel de ECM foi distribuído uniformemente
em uma placa PDMS plana e incubado a 37ºC °C por 1 hora
para permitir a gelificação (Fig. 1A). Posteriormente, o
hidrogel foi seco em ambiente estéril à temperatura
ambiente durante a noite. Durante este processo, uma perda
evaporativa do conteúdo de água do gel causou uma redução
drástica do volume e, eventualmente, levou à formação de
uma lâmina fina na superfície do PDMS que apresentou uma
cor rosa e resíduos cristalizados (Fig. 1B). O filme de ECM foi
então reidratado em água destilada pura desionizada (DDI)
por 4 horas para remover sais, vermelho de fenol e outras
impurezas (Fig. 1C). Após aspiração suave de água, o filme
passou por outro ciclo de secagem para criar uma membrana
ECM fina suportada por um substrato PDMS subjacente (Fig.
1D). Finalmente, a membrana foi retirada do pedestal PDMS
usando uma pinça fina (Fig. 1E) e cortada no tamanho e
forma desejados para uso em dispositivos microfluídicos.-2
mm foram cortados das bordas das membranas ECM após a
etapa de descascamento para remover as regiões de limite
inclinadas. A espessura uniforme foi verificada medindo a
espessura de cada membrana em vários locais usando a
técnica de análise de imagem descrita na próxima seção.
Produção de membranas ECM com diferentes composições
e espessuras
Em nosso estudo, geramos três tipos de membranas ECM compostas
por i) colágeno tipo I (COL), ii) colágeno tipo I e Matrigel (COL)-MAT),
ou iii) colágeno tipo 1 e alginato (COL-ALG). Para a produção de
membranas COL puras, solução de colágeno de cauda de rato tipo I
(Corning) foi preparada a 2 mg ml-1 de acordo com os protocolos do
fabricante. 400µ1 desta solução foi usada para realizar o
procedimento de fabricação de várias etapas descrito acima. Para
gerar COL-Membranas MAT, Matrigel (∼10 mg ml-1 conforme
fornecido pela Corning) foi misturado com 2 mg ml-1 solução de
colágeno em proporções de volume de 1: 4, 1:
1 e 4: 1. O restante do processo de fabricação foi idêntico,
com a adição de uma etapa de incubação com 10 mU
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Figura 1 Fabricação de inserções de membrana derivadas de ECM para cultura de células microfluídicas. A. Hidrogel de ECM fundido em uma superfície de PDMS. B.
Desidratação do hidrogel de ECM para produzir um filme de ECM seco. C. Reidratação do filme de ECM seco para remover sais e outras impurezas seguida por
reticulação da transglutaminase (para fabricação de COL + MAT). D. Desidratação do filme ECM purificado e reticulado para produzir membranas ECM usadas como
inserções de cultura de células microfluídicas. E. Descascamento da membrana ECM da superfície PDMS subjacente usando uma pinça, seguido de corte manual com
tesoura, se necessário. F. As placas de canal microfluídico fabricadas por litografia suave são marcadas com PDMS não curado para facilitar a ligação de inserções de
membrana ECM sobre canais microfluídicos. G. Uma membrana ECM é colocada sobre o canal inferior usando uma pinça. H. A laje do canal superior estampada com
PDMS não curado é ligada à laje do canal inferior para criar um sistema de canal fechado de três camadas. A vista em corte transversal do dispositivo totalmente
montado é mostrada em I e JI. As células são semeadas nas inserções de membrana derivadas de ECM em dispositivos microfluídicos. J. Durante a cultura de perfusão,
as células semeadas proliferam na superfície da membrana para formar monocamadas confluentes estáveis em microdispositivos.

ml-1 transglutaminase em 1× Solução PBS por 2 horas a 37
°C antes da reidratação em água DDI para reticular os componentes
de Matrigel com a matriz de colágeno tipo I. COL-As membranas ALG
foram fabricadas usando colágeno (2 mg ml-1) e alginato (10 mg ml-1)
soluções misturadas em proporções de 2: 1, 1: 1 e 1: 2 (v / v). As
mesmas etapas de fabricação foram seguidas com a exceção de que
as membranas foram embebidas em água DDI por 2 horas em
temperatura ambiente e outras 2 horas a 37°C para remover o
alginato usado como material de sacrifício para aumentar a
porosidade das membranas resultantes.
Para alterar a espessura de nossas membranas ECM, usamos técnicas
de estratificação sequencial para gerar membranas que consistem em
camadas empilhadas de membranas COL. O número de camadas COL
variou de 2 a 4 para variar a espessura da membrana resultante. Depois
que a primeira camada foi formada usando o protocolo mencionado
acima, ela foi umedecida com 10 mU ml-1
solução de transglutaminase e cuidadosamente sobreposta com a
segunda camada para evitar a formação de bolhas de ar entre as
camadas. As membranas COL em camadas foram incubadas por 2
horas em solução de transglutaminase a 37ºC°C, e esta etapa foi
seguida por 3 lavagens em 1× DPBS. Essas etapas foram repetidas
para camadas adicionais. Para medir a espessura da membrana, uma
borda da membrana foi ensanduichada entre conjuntos de lâminas
de vidro enquanto o centro da membrana permaneceu livremente
suspenso. Para cada membrana, aquisição de pilha z de 100µm foi
realizado usando um microscópio invertido de longa distância de
trabalho (Zeiss) no centro da membrana. Usando o software ZEN
(Zeiss), uma projeção ortogonal foi criada a partir do z-stack e
posteriormente processada usando a projeção de intensidade
máxima ao longo doz-eixo. A imagem final exibiu cada pixel em sua
intensidade máxima ao longo do
pilha inteira de imagens. A análise de imagem foi realizada usando
ImageJ para quantificar a espessura da membrana.
Fabricação de microdispositivos
Os microcanais usados em nosso estudo foram fabricados
usando litografia suave convencional.4,5 Em resumo, um pré-
polímero de poliIJdimetilsiloxano) (PDMS) (Sylgard, Dow Corning)
foi misturado com um agente de cura a 10: 1 (p / p) e
desgaseificado em um dessecador para remover bolhas de ar. A
mistura foi então fundida em um mestre de silício
fotograficamente preparado e curada a 65°C por pelo menos 2
horas. Após a cura, a placa de PDMS foi retirada do molde e
cortada no tamanho desejado.
Para construir dispositivos microfluídicos de múltiplas camadas,
nós fabricamos microcanais superior e inferior com uma seção
transversal retangular com largura e altura de 500 µme 100
µm, respectivamente. Um punção de biópsia de 1 mm foi usado para criar
portas de acesso de fluidos nesses canais. Para montar um dispositivo de
três camadas, a placa do canal inferior foi suavemente mergulhada em
uma camada fina de PDMS não curado preparado por spin-coating de 10:
3 PDMS em uma placa de Petri a 2500 rpm por 5 minutos. Quando a placa
foi removida, o filme PDMS foi transferido para a superfície contendo as
características do microcanal (Fig. 1F). Em seguida, uma membrana ECM
foi colocada sobre o canal inferior na superfície estampada com PDMS (Fig.
1G) e curada à temperatura ambiente durante a noite. Após a cura, a placa
do canal superior foi revestida com PDMS não curado usando a mesma
técnica de estampagem e imediatamente ligada à placa inferior do PDMS
contendo a membrana (Fig. 1H). O dispositivo montado foi deixado em
temperatura ambiente durante a noite para garantir a adesão completa.

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Cultura de células
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), normais
(Lonza) e expressando GFP (Angio-Proteomie), foram cultivadas em
meio EGM-2 (Lonza). Pericitos murinos geneticamente modificados
para expressar uma forma marcada com vermelho de tomate do
marcador de pericito Gli-1 (um presente do Dr. Benjamin Humphreys,
Washington University, St. Louis) e células de adenocarcinoma de
pulmão humano (A549, ATCC) foram cultivadas no padrão 10 % FBS
contendo meio DMEM. As células epiteliais brônquicas humanas
(BEAS-2b, ATCC) foram mantidas em meio de crescimento epitelial
brônquico (BEGM, Lonza). Fibroblastos de pulmão humano normal
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(NHLFs, Lonza) foram cultivados em meio FGM-2 (Lonza).
Cultura de células microfluídicas
A cultura de células microfluídicas foi conduzida no sistema
microfluídico de três camadas descrito acima. Antes da semeadura de
células, os microcanais foram incubados com o meio de cultura de
células usado para cada tipo de célula em 37°C por pelo menos 2
horas. Para dispositivos contendo membranas de poliéster revestidas
com fibronectina, 40µg mL-1 solução de fibronectina foi introduzida
nos canais pré-tratados com descarga do ponto corona e incu
vencido em 37 °C e 5% CO2 por 30 minutos antes da incubação com meio
de cultura de células. Em seguida, as células suspensas na cultura
meio de tura a aproximadamente 10 milhões de células por ml foram
injetados no canal superior (Fig. 1I) e deixados para estabelecer e
anexar à superfície da membrana sob condições estáticas em 37 °C e
5% de CO2 por 2 horas. Após exame microscópico para confirmar a
fixação das células, os microcanais foram lavados suavemente para
remover as células não aderentes e, em seguida, conectados a
bombas de seringa (Braintree Scientific) que geraram um fluxo de
meio de cultura em taxas de fluxo volumétrico de 70-
100 µlh-1 As células foram cultivadas por 24-72 horas com um fluxo de meio
contínuo, conforme necessário para estabelecer monocamadas
confluentes (Fig. 1J) e por mais de 7 dias em experimentos selecionados
(Fig. S5†). A viabilidade celular foi avaliada por imagem de microscopia de
fluorescência de células marcadas com calceína-AM e homodímero de
brometo de etídio de acordo com protocolos padrão (kit Live / Dead,
Invitrogen).
Microscopia eletrônica de varredura (SEM)
Amostras de membrana para SEM foram fixadas em 4 °C durante a noite em
2,5% de glutaraldeído e 2% de paraformaldeído em tampão cacodilato 0,1
M a pH 7,4. Após várias etapas de lavagem, as membranas foram fixadas
posteriormente em tetróxido de ósmio a 2,0% por 1 hora, lavadas
novamente em tampão e desidratadas em uma série graduada de etanol.
Posteriormente, as amostras foram retiradas através de uma série
graduada de hexametildisilazano (HMDS) e secas ao ar antes da
montagem e revestimento por pulverização catódica com ouro / paládio.
Imagens SEM das membranas foram obtidas usando um microscópio
eletrônico de varredura FEI Quanta FEG 250. As micrografias eletrônicas de
varredura obtidas foram analisadas usando a função Analyze Particles de
ImageJ para medir a distribuição de tamanho dos poros da membrana.
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Força atômica microscópica - nanoindentação
Um Microscópio de Força Atômica Asylum (AFM) foi usado para
caracterizar as propriedades mecânicas de COL hidratado / úmido,
COL-MAT e membranas de poliéster. Um cromo-cantilever revestido
de ouro com uma constante de mola de 44,03 pN nm-1
e um indentador de pirâmide foi usado para obter curvas de força-
indentação. O módulo de Young foi calculado a partir dos dados de
indentação de força usando o software AtomicJ.
Análise de permeabilidade e transparência da membrana
A transparência óptica das membranas ECM foi quantificada na faixa
de comprimento de onda de 350-700 nm usando um
espectrofotômetro padrão (Infinite M200, TECAN). Para analisar a
permeabilidade, criamos dispositivos microfluídicos de três camadas
contendo membrana ECM usando o método de fabricação detalhado
acima. Neste sistema, a permeabilidade da membrana foi avaliada i)
carregando o microcanal superior com uma solução de FITCdextran
de 20 kDa (0,2 mM, Sigma-Aldrich), ii) recolhendo o fluxo de saída do
canal inferior ao longo de 3 horas e iii) medindo a intensidade de
fluorescência das amostras coletadas em leitor de placas
fluorimétricas (Infinite M200, TECAN). Durante esses experimentos, os
fluxos nos canais superior e inferior foram direcionados na mesma
direção em 100µl por hora por 3 horas. Para comparação entre os
diferentes tipos de membranas de ECM, os dados obtidos neste
estudo foram normalizados para a permeabilidade média das
membranas de colágeno puro (COL).
Análise da adsorção da superfície da membrana
A absorção de biomoléculas nas superfícies das membranas foi
medida tratando membranas COL nuas, membranas COL
semeadas com pericito e membranas Transwell com 1 mg ml-1
albumina de soro bovino conjugada com fluoresceína (FITC-BSA)
por 2 horas a 37 °C. Este passo foi seguido por duas lavagens
com PBS durante 5 minutos antes da detecção e medição da
fluorescência FITC. A intensidade média de fluorescência de pelo
menos 13 micrografias por grupo foi medida como o valor médio
de cinza usando imagens binarizadas no ImageJ.
Imunofluorescência
Após a conclusão dos experimentos de cultura de células, os
dispositivos foram desconectados das bombas de seringa e os
canais foram lavados suavemente 3 vezes por perfusão 1× PBS.
As células na superfície da membrana foram então fixadas
através da introdução de paraformaldeído a 4% (Affymetrix) em
ambos os canais superior e inferior e incubando em temperatura
ambiente por 15-20 minutos. Os canais foram então lavados 3
vezes com 1× PBS e armazenado em um ambiente úmido e
refrigerado antes da marcação de anticorpos e microscopia de
fluorescência. Após permeabilização celular e bloqueio com 0,1%
de Triton-X e 3% de albumina de soro bovino (BSA, Sigma) em 1×
PBS por 30 minutos, as células foram incubadas com anticorpos
primários contra FAK-Y397 (Cell Signaling), pan-laminina (Sigma-
Aldrich) e integrina alfa-6 (Abcam) diluída a 1: 50 em 1% contendo
BSA 1× Solução PBS por 2 horas na sala
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temperatura. Posteriormente, as células foram lavadas pelo menos 5
vezes, fluindo suavemente 1× PBS e depois tratado por 30-45 minutos
com anticorpos secundários apropriados diluídos a 1: 500 em 1× PBS
contendo 1% de BSA. O citoesqueleto de actina foi marcado usando
faloidina conjugada com Alexa488 (Life Technologies) a uma
concentração de 1µg ml-1 em 1× PBS, adicionado sozinho ou
misturado com os anticorpos secundários. A imagem de
imunofluorescência foi realizada em microscópio invertido com
objetivas de longa distância (Zeiss). Para quantificar a ativação de FAK
em várias membranas, adquirimos 10 campos de alta ampliação
posicionados aleatoriamente por tipo de membrana e usamos o
software ImageJ (NIH) para selecionar manualmente pelo menos 40
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aqui para o lado basolateral das células que compreendem epitélio,
endotélio vascular, axônios de nervos periféricos, tecido adiposo e
músculo.15 Esta camada ultrafina (<100 nm) é conectada a redes 3D de
fibras de ECM conhecidas como lâmina reticular.20
Esta zona especializada serve para ancorar a lâmina basal ao
tecido conjuntivo subjacente e desempenha um papel crítico na
compartimentação de diferentes tipos de tecido.20,21 Como o
principal componente da MEC da lâmina reticular, o colágeno
forma fibrilas estriadas que são montadas de maneira
hierárquica para fornecer suporte estrutural à membrana basal.21
Inspirados por esse importante papel do colágeno como uma proteína
estrutural importante, usamos o colágeno tipo I disponível comercialmente

células individuais com bordas claramente discerníveis como regiões
de interesse para medir a intensidade média de fluorescência. Esses
dados foram apresentados como a intensidade de fluorescência em
uma base por célula, normalizada para o sinal obtido a partir de
células cultivadas em Transwell de poliéster não tratado™
membranas.
Análise estatística
Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão. A
significância estatística da variância entre os grupos foi avaliada por
ANOVA com Student bicaudalt-teste para comparações individuais
usando o software GraphPad (Instat).
como material de base para o desenvolvimento de um método simples e de
baixo custo para gerar membranas de cultura de células derivadas de ECM.
Conforme mostrado na Fig. 2A, o processo sequencial de desidratação
de hidrogel de colágeno resultou na formação de folhas planas
completamente secas em 48 horas que poderiam ser descascadas,
aparadas nas dimensões desejadas e facilmente manipuladas usando uma
pinça fina. Com 400µl de hidrogel de colágeno uniformemente espalhado
por uma área de 200 mm2 (10 mm × 20 mm), a espessura média dos filmes
resultantes foi medida em 20
µm (Fig. S1†). A espessura da membrana foi ajustável alterando o
volume inicial de hidrogel de colágeno (dados não mostrados) e /
ou repetindo sequencialmente o mesmo ciclo de reidratação para
depositar camadas de membrana adicionais (ver Métodos) (Fig. S1

Resultados e discussão †). É importante ressaltar que a microscopia eletrônica de

Produção de membranas biomiméticas derivadas de ECM
A membrana basal é composta por duas camadas estruturalmente
distintas.15,20 A primeira camada é a lâmina basal composta por
moléculas de adesão celular e filamentos de ancoragem que
varredura revelou que as membranas de colágeno (COL)
consistiam em fibrilas orientadas aleatoriamente organizadas em
redes 3D densas (Fig. 2B), imitando a arquitetura fibrosa da
membrana basal na Vivo. As fibras individuais que compõem a
malha também exibiram o padrão de bandas característico

Figura 2 Aparência macroscópica, ultraestrutura da superfície e composição das membranas derivadas da ECM. A. Foto digital de um COL-Membrana MAT presa por
pinça demonstrando integridade mecânica e transparência. B. Visualização por microscopia eletrônica de varredura (SEM) da ultraestrutura da superfície da
membrana de colágeno tipo I (COL), barra de escala = 10µm. Detalhe: padrão de bandas característico visível em fibrilas maiores. C. Visualização SEM de colágeno tipo
I e compósito Matrigel (COL-MAT) ultraestrutura da superfície da membrana, barra de escala = 10 µm. D. A coloração por imunofluorescência da proteína laminina
(verde) em membranas COL demonstra uma ausência esperada de proteína laminina. Barra de escala = 200µm. E. Coloração por imunofluorescência da proteína
laminina (verde) em COL-As membranas MAT mostram incorporação robusta de laminina na microarquitetura fibrosa (inserção). Barra de escala = 200µm. F.
Visualização de SEM da ultraestrutura da superfície da membrana Transwell mostrando poros de 400 nm e superfícies de cultura lisas, barra de escala = 10µm.

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de colágeno fibrilar nativo (inserção, Fig. 2B). Além disso, essas
membranas continham poros nanoscópicos em toda a superfície que
eram claramente visíveis nas micrografias eletrônicas de varredura
(inserção, Fig. 2B).
Com base nesses resultados, examinamos a viabilidade de usar
nossa técnica para criar membranas biomiméticas que imitam não
apenas a estrutura da membrana basal, mas também sua
composição de ECM. Os componentes estruturais primários da
membrana basal são laminina e colágeno tipo IV, que se automontam
em redes 3D com misturas específicas de tecidos de proteoglicanos e
glicoproteínas especializadas, como a entactina.22,23 Para integrar
esses constituintes nativos em nossas membranas, formamos
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hidrogéis compostos misturando colágeno com Matrigel, um material
semelhante à membrana basal reconstituído composto de
aproximadamente 60% de laminina, 30% de colágeno IV, 8% de
entactina, proteoglicanos e vários fatores de crescimento (ver
Métodos para informações do produto). Uma vez que os
componentes de Matrigel não se ligam covalentemente ao colágeno
tipo I durante a polimerização em hidrogel, usamos a
transglutaminase após a etapa de reidratação (Fig. 1C) para reticular
os componentes de Matrigel com a matriz de colágeno tipo I
polimerizada. Como foi o caso com as membranas COL, nosso
protocolo gerou colágeno planar-Matrigel (COL-MAT) membranas
com espessura semelhante e integridade estrutural que consistiam
em fibras de ECM densamente compactadas (Fig. 2C). A integração
bem-sucedida dos componentes Matrigel foi evidenciada por
detecção de imunofluorescência de laminina em COL-Membranas
MAT (Fig. 2E). A estrutura biomimética e a composição de nossas
membranas ECM estavam em forte contraste com a estrutura do
Transwell disponível comercialmente™ membranas de cultura de
células que mostraram superfícies altamente artificiais e lisas com
poros nanoscópicos distribuídos aleatoriamente (Fig. 2F).
Tomados em conjunto, esses resultados ilustram que
nosso método permite uma estratégia simples para produzir
membranas porosas finas que se aproximam da organização
estrutural e da composição da MEC na membrana basal
nativa.
Engenharia das propriedades das membranas ECM
A capacidade de variar as propriedades das membranas de cultura de
células torna possível projetar o microambiente celular insolúvel que
tem uma grande influência no crescimento, diferenciação e
manutenção das células. Essas capacidades também são benéficas
para modelar o transporte biomolecular e a troca de fatores solúveis
entre diferentes compartimentos de tecido. Além disso, as
características do material das inserções de membrana tornam-se
uma consideração importante para a imagem e análise de células
comumente necessárias paraem vitro estudos. Aproveitando a
flexibilidade para variar o tipo e a composição dos materiais de
hidrogel de partida, demonstramos a capacidade de nossa técnica de
fabricação de modular as seguintes propriedades das membranas
ECM.
Transparência ótica. A transparência óptica é uma propriedade
importante das inserções de membrana desejável para imagens e análises
microscópicas. Embora os hidrogéis de ECM tenham sofrido de
Chip de laboratório
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Lab on a Chip
hidratação e transformação durante nosso procedimento de
fabricação, sua clareza ótica inicial foi mantida relativamente bem,
resultando na formação de filmes finos cuja transparência era
superior à das membranas de cultura de células existentes. Por
exemplo, nossa análise mostrou que as membranas COL absorveram
menos luz em todo o espectro visual em comparação com as
membranas Transwell de poliéster (PE) com poros de 400 nm que são
comercializados como opticamente transparentes (Fig. 3A). Quando
Matrigel foi adicionado à base de colágeno, o COL resultante-As
membranas MAT pareceram consideravelmente mais transparentes a
olho nu (Fig. 3B). Esta observação foi apoiada pelos dados
espectrofotométricos de que a absorbância de luz do COL-As
membranas MAT foram significativamente mais baixas do que as
membranas COL e transparentes Transwell PE (Fig. 3A).
Permeabilidade. A troca de macromoléculas, como fatores de
crescimento e citocinas, entre compartimentos de tecido
adjacentes é essencial para interações multicelulares complexas
que desempenham um papel crítico em diversos processos
fisiológicos e fisiopatológicos. O transporte biomolecular
necessário para esses tipos de interação requer que a membrana
basal seja suficientemente permeável a moléculas grandes. Para
descobrir se nossas membranas ECM imitam esta importante
característica da membrana basal nativa, usamos 20 kDa FITC-
dextrano como uma macromolécula representativa e medimos
seu transporte através de membranas COL nuas embutidas entre
dois canais microfluídicos sob condições de fluxo (consulte
Métodos para obter detalhes) .
As medições de fluorescência do fluxo coletado dos microcanais
indicaram que as membranas COL permitiam a translocação de
moléculas de dextrana devido a gradientes de concentração impostos
externamente. COL e COL-As membranas MAT, no entanto, eram
significativamente menos permeáveis do que as membranas
Transwell PE com poros de 400 nm (Fig. 3C), provavelmente devido à
sua arquitetura de fibra densa (Fig. 2B). Para aumentar a
permeabilidade da membrana, desenvolvemos uma nova técnica em
que alginato solúvel em água (ALG) foi adicionado à base de colágeno
e usado como um material de sacrifício que foi dissolvido durante a
reidratação dos filmes inicialmente secos. Visualização SEM das
membranas de colágeno produzidas por este método (COL-
Membranas ALG) mostraram feixes acentuadamente aumentados de
fibrilas de colágeno e fenestrações mais claramente visíveis em toda a
superfície, sugerindo aumento da porosidade da membrana (setas,
Fig. 3D). Nossas análises quantitativas das micrografias eletrônicas de
varredura confirmaram que o tamanho médio dos poros da
membrana no COL-As membranas ALG (700 nm) eram
significativamente maiores do que as membranas COL (250 nm) (Fig.
S2†). Consistente com esses achados microscópicos, a
permeabilidade do COL-As membranas ALG para 20 kDa FITC-
dextrano foram medidas como sendo mais altas do que as
membranas COL e as membranas Transwell PE por um fator de 8 e
1,2, respectivamente (Fig. 3C).
Outro fator importante que impacta a permeabilidade de
nossas membranas ECM é a adsorção de moléculas biológicas na
superfície da membrana. Nosso ensaio usando FITC-BSA (ver
Métodos) mostrou que a adsorção de superfície nas membranas
COL foi significativamente maior do que na Transwell
Este jornal é © The Royal Society of Chemistry 2017