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Questionario

1. A) imuno -histoquimica
2. Analise de tecidos através de uma reação de anticorpo e antígeno  se tiver a proteína o anticorpo se liga
Se a proteína primaria estiver ligada, o segundo anticorpo ligará a uma segunda proteína.
3.

Situação 2

1 . DNA , foi feito um seuqnciamento de bases

Coleta de sangue  lise, limpeza/purificação( joga fora tudo que não é material genético ou não quero),
precipitação e reidratação( para conseguir usar a amostra para usar em alguma técnica)

2. sequenciamento – nova geraçã( vários genes para ser analisado) o e sanguer – terminação de cadeia

(mais especifico, fazendo exon por exon taq resiste a alteração de temperatura)

Matéria genético extraído, DNA polimerase, primer (para selecionar região e polimerase conseguir incluir mais
nucleotídeos) DDntp( nuleotideos terminadores de cadeia),a ultima base que é analisada, sempre vou saber qual
a ultima base foi colocada.

Menor fragmento é o que migra

De baixo para cima

3 . interpreta que a substituição de uma guanina por uma timina, consigo observar pela sequencia referencia ( cor do
pico).

Situação 3

1. PCR e eletroforese

2. etapas PCR – desnaturação aqueceimento 95C + abertura da cadeia, anelamento abaixa a temperatura, com
isso o primer liga e extensão a taqpolimerase se liga, adicionando nucleotídeos.

Amostra, Taqpolimerese, primer, DNA molde + um

Eletroforese- separação em gel do DNA em um campo elétrico, migra do positivo para o negativo.

Menor migra mais no gel, pois é como se fosse uma malha, permitindo a maior passagem

3.Pai é o 3, o que a mãe não possi, mas o pai tem.

Situação 4 ??

1.PCR em tempo real – aflorecencia

2. mais RNAmensageiro + florecencia  aparece antes no gráfico – com menor expressão de ciclos é possível saber
quem tem mais ciclos. + RNA

Linha vermelha nome? define o que é expressão genica, acima dela é quando começa a considerar a expressão
genica.
3. Wester gloting ? – separa as proteínas por eletroforese – por peso molecular ( + pesada migram menos), transfere
as proteínas -> membrana solida por corrente elétrica e faz marcação, utilizando anticorpo/ antígeno, proteína
presente aparece uma banda e analisa.

Situação 5

1.Sitometria de fluxo -> as células vão passa por um sensro- feixe de luz, de acordo com a luz bate em um detetor
frontal – tamanho detectorlateral -complexidade interna da célula.

2.avaliar ciclo celular, morte celular, marcadores superfície, viabilidade celular.

1 – CD8+ e CD4-

2 –+

3- CD8+ e CD4+

Situação 6

1.Microaray

2. gene 2- privação de nutriente

Gene 6 – ambas, não é afetado

Gene12- normal, aparece apenas nas celuas com nutrientes.

 Observações
• Na PCR convencional só se vê o final, enquanto a em tempo real acompanha todo o ciclo de
replicação.

*RNA*
“Diferença entre célula de um local e de outro está na expressão gênica e não no DNA, porque esse é igual para
todos.”
No caso da PCR em tempo real para RNA, pode-se usar para identificar carga viral, é preciso, no entanto, saber a
sequência para a inserção do primer.

   
O método Sanger envolve a produção de muitas cópias de uma região alvo de DNA.

Precisa-se de:

 Uma enzima DNA polimerase

 Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples que se liga ao DNA molde e atua como um
"iniciador" para a polimerase
 Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
 O DNA molde a ser sequenciado
 Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro nucleotídeos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP),
cada uma marcada com um corante de uma cor diferente.

Uma vez que um dideoxinucleotídeo é adicionado à cadeia, não há hidroxila disponível e nenhum outro nucleotídeo
pode ser adicionado. A cadeia termina com o dideoxinucleotídeo, o qual é marcado com um cor particular de
corante dependendo da base (A, T, C or G) que carrega.

Método Sanger de sequenciamento

A amostra de DNA a ser sequenciada é combinada em um tubo com primer, DNA polimerase e nucleotídeos de DNA
(dATP, dTTP, dGTP, and dCTP). Os quatro nucleotídeos terminadores de cadeia marcados com corantes são
adicionados também, mas em concentração muito menor que a dos nucleotídeos comuns.

A mistura é primeiro aquecida para a denaturação do DNA molde (separar as fitas), então resfriadas para que os
primers possam se ligar ao molde de fita simples. Uma vez que o primer se ligou, a temperatura é aumentada
novamente, permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA polimerase
continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até que aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um
normal. Nesse ponto, os nucleotídeos não podem mais ser adicionados, e portanto a fita terminará em um
dideoxinucleotídeo.

Este processo é repetido em um número de ciclos. Quando o ciclo se completa, é praticamente garantido que um
dideóxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do DNA alvo em pelo menos uma reação. Ou seja, o
tubo irá conter fragmentos de diferentes comprimentos, terminando em cada uma das posições de nucleotídeos no
DNA original. (veja a figura abaixo). As extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que indicam o
nucleotídeo final.

Depois que a reação é executada, os fragmentos são levados através de um longo e fino tubo contanto uma matriz
de gel em um processo chamado de electroforese capilar em gel. Pequenos fragmentos movem-se rapidamente
através dos poros do gel, enquanto longos fragmentos movem-se mais devagar. Assim que cada fragmento cruza a
"linha de chegada" no final do tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o corante anexado seja detectado.

O menor fragmento (que termina apenas um nucleotídeo após o primer) atravessa a linha de chegada primeiro,
seguido do próximo menor fragmento (terminando dois nucleotídeos após o primer), e assim por diante. Portanto, a
partir das cores dos corantes registradas uma após a outra no detector, a sequência do pedaço original de DNA pode
ser construída com um nucleotídeo por vez. Os dados registrados pelo detector consistem em uma série de picos em
intensidade de fluorescência, como mostrado no cromatograma acima. A sequência de DNA é lida a partir dos picos
no cromatograma.

Sequenciamento da nova geração

O nome pode soar Star Trek, mas é realmente como é chamado! O mais recente conjunto de tecnologias de
sequenciamento de DNA é coletivamente chamado de sequenciamento da nova geração.

Existe uma variedade de técnicas de sequenciamento de nova geração que usam diferentes tecnologias. No entanto,
a maioria tem algumas características em comum que as distinguem do sequenciamento Sanger:

Alto paralelismo: muitas reações de sequenciamento ocorrem ao mesmo tempo

Microescala: reações são pequenas e muitas podem ser realizadas de uma vez em um chip

Rapidez: pelas reações serem feitas em paralelo, resultados são obtidos muito mais rápido

Baixo custo: sequenciar um genoma é mais barato do que com o sequenciamento Sanger

Menor comprimento: leituras tipicamente variam entre 505050 -700700700 nucleotídeos de comprimento

Conceitualmente, o sequenciamento de nova geração é algo como conduzir um grande número de pequenas
reações Sanger de sequenciamento em paralelo. Graças a essa paralelização e pequena escala, grandes quantidades
de DNA podem ser sequenciadas de forma muito mais rápida e barata com métodos de próxima geração do que com
sequenciamento Sanger