1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS CENTRO SUPERIOR DE EDUCAO TECNOLGICA TECNOLOGIA EM SANEAMENTO AMBIENTAL

ROTEIRO DE AULA PRTICA Coliformes totais e fecais Deteco em amostras de gua atravs do teste de Presena-Ausncia (P/A), segundo CETESB L5.240 1. INTRODUO Desde o incio da bacteriologia sanitria, marcada pela observao de Escherich em 1885, de que o Bacillus coli (Escherichia coli) poderia ser usado como indicador de na avaliao da contaminao fecal da gua as bactrias do grupo coliforme tem sido extensivamente utilizadas na avaliao da qualidade das guas, sendo at hoje o parmetro microbiolgico bsico includo nas legislaes relativas a guas para consumo humano. Para a avaliao das condies sanitrias de uma gua, utilizam-se bactrias do grupo coliforme, que atuam como indicadores de poluio fecal, pois esto sempre presentes no trato intestinal humano de outros animais de sangue quente, sendo eliminadas em grandes nmeros pelas fezes. A presena de coliformes na gua indica poluio, com o risco potencial da presena de organismos patognicos, e uma vez que so mais resistentes na gua do que as bactrias patognicas de origem intestinal. COLIFORMES TOTAIS: grupo de bactrias constitudo por bacilos gramnegativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presena de sais biliares ou outros compostos ativos de superfcie (surfactantes), com propriedades similares de inibio de crescimento, e que fermentam a lactose com produo de aldedo, cido e gs a 35C em 24-48 horas. O grupo inclui os seguintes gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebisiela. COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES TERMOTOLERANTES: so coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produo de cido e gs temperatura de 44,5 0,2C em 24 horas. O principal componente deste grupo Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gnero Klebisiela tambm apresentam essa capacidade. 2. OBJETIVO Este mtodo tem como objetivo a deteco de coliformes (totais e fecais) em amostras de gua, atravs do teste de Presena-Ausncia (P/A), com aplicao na avaliao da qualidade bacteriolgica de guas destinadas a consumo humano.

2 3. APARELHAGEM 3.1. Equipamentos, vidrarias, outros. Balana, banho-maria (44,5C), destilador de gua ou aparelho de desionizao, equipamentos para esterilizao (autoclave, estufa de esterilizao), incubadora bacteriolgica termostatizada, medidor de pH, bales, frascos para o meio presuntivo, frasco para coleta da amostra, tubos de Durham, tubos de ensaio, alas de inoculao, bico de Bunsen ou similar, estantes, estojo para pipetas, tela de amianto, termmetros, trip. 3.2. Meio de cultura 3.2.1. Caldo P-A Caldo lactosado........................... 39,0 g Caldo lauril................................... 52,5 g Prpura de bromocresol.............. 0,0255 g gua destilada............................. 1000 mL 3.2.2. Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% Peptona....................................... 10,0 g Lactose........................................ 10,0 g Bile de boi desidratada................ 20,0 g Verde brilhante............................ 0,0133 g gua destilada............................. 1000 mL 3.2.3. Meio E.C. Triptose ou trypticase....................................... Lactose............................................................. Mistura de sais biliares ou sais biliares n3..... Fosfato dipotssio (K2HPO4).......................... Fosfato monopotssio (KH2PO4).................... Cloreto de sdio (NaCl).................................... gua destilada................................................. 4. PROCEDIMENTO a) Antes de iniciar o exame, desinfetar a bancada de trabalho, usando desinfetante. b) Dispor sobre a bancada de trabalho o material necessrio para a execuo do exame. c) Identificar os frascos contendo 50 mL de P/A, com o nmero da amostra. d) Acender o Bico de Bunsen, para manter o ambiente assptico. e) Homogeneizar a amostra, no mnimo 25 vezes, suavemente. f) Dosar 100 mL da amostra em proveta estril e proceder inoculao, vertendo cuidadosamente esse volume da amostra no frasco contendo o caldo P-A, tomando cuidado para que no ocorra entrada de ar no tubo de Durham contido no interior do frasco.

20,0 g 5,0 g 1,5 g 4,0 g 1,5 g 5,0 g 1000 mL

3 g) Aps a inoculao das amostras, efetuar a incubao a 35 0,5C, durante 24 h. h) Aps esse perodo de incubao, efetuar a 1 leitura, considerando como resultado positivo acidificao do meio (evidenciado pela mudana de sua colorao de prpura para amarelo), com ou sem produo de gs. Se os resultados forem negativos, retornar os frascos incubadora por mais 24 horas, efetuando aps esse perodo, a leitura final conforme especificado acima. i) Submeter as culturas com resultado presuntivo aos testes confirmativos, para a determinao de coliformes totais e para a diferenciao de coliformes fecais. j) Com auxlio de uma ala de inoculao, devidamente flambada e resfriada, retirar um inculo da cultura positiva em caldo P/A. Recomenda-se fazer uma leve agitao do frasco, para a disperso das bactrias. k) Imediatamente aps a abertura contendo as culturas positivas em caldo P/A, flambar a boca do mesmo antes de colher os inculos, repetir a operao antes do seu fechamento. l) Transferir esse inculo para um tubo contendo caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% e incubar a 35 0,5C, durante 24-48 h e para um tubo contendo o meio E.C. e incubar a 44,5 0,2C, em banho-maria com agitao, durante 24 h. m) Aps os perodos determinados de incubao, efetuar as leituras, considerando resultado positivo para coliformes totais a produo de gs a partir da fermentao da lactose no meio caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%, coliformes fecais esto presentes se houver produo de gs no meio E.C. 5. RESULTADOS Para coliformes totais, o resultado final emitido com base nos resultados obtidos no caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%, sendo expresso como: Presena ou ausncia de coliformes totais/ 100 mL. Para coliformes fecais, o resultado final baseado no meio E.C., sendo expresso como: Presena ou ausncia de coliformes fecais/ 100 mL.

Responsveis: dria, Cassiana e Gilberto