1

Universidade Federal Fluminense

Instituto Biomédico
Curso de Graduação em Farmácia

Identificação de Enterobacteriaceae I, II e III (Bacilos Gram-negativos)

N e s s e c a p í t u l o , d e s c r e v e m - s e o s p r o c e s s o s d e i d e n t i f i c a ç ã o d e e n t e r o b a c t é r i a s e m g ê n e r o s o u

e s p é c i e s . S e g u e m - s e a s s e g u i n t e s e t a p a s :

1. Plaqueamento Seletivo (Isolamento)

t a p a d e i s o l a m e n t o b a c t e r i a n o a p a r t i r d e e s p é c i m e s c l í n i c o , u t i l i z a n d o m e i o s s e l e t i v o -

i n d i c a d o r e s c o m o o Á g a r o s i n e t h y l e n e - l u e ) , t a m b é m c o n h e c i d o c o m o T e a g u e . N e s t e

E M B ( E M B

m e i o , a s b a c t é r i a s G r a m p o s i t i v a s s ã o i n i b i d a s p e l a p r e s e n ç a d o s c o r a n t e s e o s i n a e a z u l d e

(LAC +)
m e t i l e n o . A s b a c t é r i a s G r a m n e g a t i v a s f e r m e n t a d o r a s d e l a c t o s e p o d e m s e a p r e s e n t a r

rosa-avermelhadas centro negro

c o m o c o l ô n i a s c o m o u s e m e e m c a s o s d e f e r m e n t a d o r e s f o r t e s

verde metálico (LAC -)

a s c o l ô n i a s a p r e s e n t a m u m b r i l h o , e n q u a n t o a s n ã o - f e r m e n t a d o r a s

colônias transparentes
f o r m a m . A s e m e a d u r a d e v e s e r f e i t a p o r e s g o t a m e n t o .

2. Triagem
o n j u n t o d e p r o v a s b i o q u í m i c a s r e a l i z a d a s s i m u l t a n e a m e n t e , p e r m i t i n d o u m a d i f e r e n c i a ç ã o

i n i c i a l d o s i s o l a m e n t o s e o d i r e c i o n a m e n t o d a i d e n t i f i c a ç ã o b i o q u í m i c a . Q u a n d o r e a l i z a d a e m m e i o

T S I t r i p l e s u g a r i r o n ) , p o d e m o s o b s e r v a r :

- F e r m e n t a ç ã o d e g l i c o s e e p r o d u ç ã o d e g á s ;

- F e r m e n t a ç ã o d e l a c t o s e e / o u s a c a r o s e ;

- P r o d u ç ã o d e H 2 S g á s s u l f í d r i c o ) .

S e m e a d u r a : o m u m a a g u l h a b a c t e r i o l ó g i c a , t o c a r s o b r e u m a c o l ô n i a d o c r e s c i m e n t o b a c t e r i a n o

n o m e i o Á g a r e r e a l i z a r a s e m e a d u r a p i c a d a c e n t r a l a s s o c i a d a + e s t r i a s i n u o s a e m

E M B (

s u p e r f í c i e ) .

T r a t a - s e d e u m m e i o d i f e r e n c i a l r e c o m e n d a d o p a r a a i d e n t i f i c a ç ã o d e b a c i l o s e n t é r i c o s ,

b a s e a d o n a f e r m e n t a ç ã o d e g l i c o s e , s a c a r o s e e l a c t o s e e n a p r o d u ç ã o d e s u l f e t o d e h i d r o g ê n i o

H 2 S ) . N e s s e m e i o h á g l i c o s e , l a c t o s e e s a c a r o s e , s e n d o q u e t o d a s a s e n t e r o b a c t é r i a s f e r m e n t a m

Bacteriologia na prática: Manual de acompanhamento das aulas práticas da disciplina de Bacteriologia

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Curso de Graduação em Farmácia
d e i n í c i o a g l i c o s e , d e t a l f o r m a q u e a c o r d o m e i o m u d a d e l a r a n j a p a r a a m a r e l o , d e v i d o a u m a

m u d a n ç a d e p H s e t o r n a á c i d o ) . A g l i c o s e p o d e s e r f e r m e n t a d a c o m o u s e m p r o d u ç ã o d e g á s e ,

q u a n d o h o u v e r , a p a r e c e r ã o b o l h a s n o t u b o o u o m e i o f i c a r á q u e b r a d o . a s o a b a c t é r i a n ã o

f e r m e n t e a g l i c o s e , a c o l o r a ç ã o d o m e i o f i c a r á t o d a n a c o r o r i g i n a l , s e m a l t e r a ç ã o , m a s i s s o é u m

i n d i c a d o r d e q u e a b a c t é r i a e m q u e s t ã o n ã o é u m a e n t e r o b a c t é r i a . Q u a n d o h á p r o d u ç ã o d e H 2 S , a

b a s e d o m e i o f i c a e s c u r a , p o d e n d o d e s a p a r e c e r c o m p l e t a m e n t e o s i n d í c i o s a m a r e l o s d e q u e

f e r m e n t o u a g l i c o s e .

Q u a n d o a g l i c o s e d o m e i o a c a b a c o m o f o n t e d e e n e r g i a , a s b a c t é r i a s p o d e m f e r m e n t a r

s a c a r o s e e / o u l a c t o s e , s e p o s s u í r e m a m a q u i n a r i a e n z i m á t i c a p a r a t a l , o u d e g r a d a r e m p e p t í d e o s e

o u t r a s s u b s t â n c i a s , c a s o n ã o s e j a m c a p a z e s d e f e r m e n t a r s a c a r o s e n e m l a c t o s e . N o c a s o d e

f e r m e n t a r e m s a c a r o s e o u l a c t o s e , o m e i o c o n t i n u a a m a r e l o e s e d e g r a d a r e m p e p t í d e o s v i a O 2

p a r a a o x i d a ç ã o ) p a r a o b t e r e n e r g i a , s ã o p r o d u z i d a s a m i n a s q u e e l e v a m o p H d o á p i c e n a b a s e

n ã o h á O ) d o m e i o m u d a n d o s u a c o l o r a ç ã o n o v a m e n t e p a r a l a r a n j a - a v e r m e l h a d o , q u e é a c o r
2

o r i g i n a l .

3. Confirmação Bioquímica
o n j u n t o d e p r o v a s n e c e s s á r i a s p a r a a i d e n t i f i c a ç ã o b i o q u í m i c a d a s c o l ô n i a s s u s p e i t a s .

A l g u m a s d e s s a s p r o v a s e s t ã o d e s c r i t a s a b a i x o :

a. Fermentação de Carboidratos
: g l i c o s e , l a c t o s e , m a n i t o l e s a c a r o s e .

A u t i l i z a ç ã o d o s c a r b o i d r a t o s l e v a à f o r m a ç ã o d e á c i d o s , c o m v i r a g e m d o i n d i c a d o r v e r m e l h o

d e f e n o l ) p a r a c o r a m a r e l a . A p a r t i r d a g l i c o s e p o d e m o s o b s e r v a r t a m b é m a p r o d u ç ã o o u n ã o d e

g á s O , H ) n o i n t e r i o r d o t u b o d e D u r h a n . N e s s e s t e s t e s , a s s i m c o m o e m t o d o s o s o u t r o s q u e
2 2

( C

u t i l i z a m c a l d o s , a s e m e a d u r a é f e i t a a p a r t i r d o c r e s c i m e n t o o b t i d o n o m e i o d e i s o l a m e n t o

p r i m á r i o c o m a g u l h a o u a l ç a b a c t e r i o l ó g i c a .

L e i t u r a :

o r a m a r e l a d a p o s i t i v o )

C (

S e m a l t e r a ç ã o

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b. VM/VP:
A v a l i a a v i a d e d e g r a d a ç ã o d a g l i c o s e u s a d a p e l o m i c r o - o r g a n i s m o . m p r e g a o m e i o

l a r k & L e w i s .

 VM:
á c i d o s e s t á v e i s ) .
e r i f i c a a o c o r r ê n c i a d e f e r m e n t a ç ã o á c i d o - m i s t a g l i c o s e →

V (

A p ó s i n c u b a ç ã o h ) , d e v e - s e a d i c i o n a r d e 3 a 5 g o t a s d o r e a t i v o d e v e r m e l h o d e

( 4 8 V M (

m e t i l a a l c a l i n o = a m a r e l o p á l i d o | á c i d o = v e r m e l h o ) . o r v e r m e l h a / o r a m a r e l a
→

C C

 VP (Voges & Proskauer)

: c a s o n ã o u t i l i z e a v i a á c i d o - m i s t a , a b a c t é r i a u s a r á o u t r a v i a

a c e t o í n a
g l i c o s e → ) . O u s e j a , e m c a s o d e t e s t e n e g a t i v o , v e r i f i c a - s e a o c o r r ê n c i a d e

( V M

f e r m e n t a ç ã o a c e t o í n i c a P + .

A d i c i o n a r o s r e a t i v o s P I a r r i t I ) : a l f a - n a f t o l , 6 m L ) e P I I a r r i t I I ) : K O H , 2 m L ) e l e r

V ( B ( 0 V ( B 4 0 % ( 0

a p ó s 1 - 1 5 m i n . A n é i s v e r m e l h o s n a s u p e r f í c i e d o t u b o p o s i t i v o ) / S e m a l t e r a ç ã o

0 (

n e g a t i v o )

c. Citrato
: v e r i f i c a a u t i l i z a ç ã o d o c i t r a t o c o m o ú n i c a f o n t e d e c a r b o n o . S u a u t i l i z a ç ã o p e l a b a c t é r i a ,

t o r n a o p H a l c a l i n o , a t e r a n d o a c o r d o m e i o p a r a a z u l .

e i o : i t r a t o d e S i m m o n s .

M C

L e i t u r a :

e i o a z u l a d o

S e m c r e s c i m e n t o c o r o r i g i n a l – v e r d e )

d. Indol
: v e r i f i c a a p r o d u ç ã o d e t r i p t o f a n a s e , q u e q u e b r a t r i p t o f a n o , l i b e r a n d o g á s i n d o l , o q u a l é

r e v e l a d o c o m o u s o d o r e a t i v o d e K o v a c s o b s e r v a - s e a f o r m a ç ã o d e u m a n e l r o s a / v e r m e l h o n a

s u p e r f í c i e d o m e i o ) .

e i o s : Á g a r s e m i - s ó l i d o S I o u a l d o c o m T r i p t o f a n o .

M M C

A p ó s a i n c u b a ç ã o , a d i c i o n a r 5 g o t a s d o R e a t i v o d e K o v a c s .

L e i t u r a :

o r r o s a

S e m a l t e r a ç ã o

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e. Meio SIM (Produção de H2S, Indol e Motilidade)

.
I n o c u l a ç ã o : u t i l i z a r a g u l h a b a c t e r i o l ó g i c a , f a z e n d o u m a p i c a d a c e n t r a l a t é ¾ d a p r o f u n d i d a d e

 Produção de H2S:
m c a s o d e p r o d u ç ã o d o g á s s u l f e t o d e h i d r o g ê n i o , o m e i o f i c a n e g r o .

 Indol:
v e r i t e m 3 d .

 Motilidade
: v e r i f i c a s e a b a c t é r i a é m ó v e l o u i m ó v e l .

L e i t u r a d a o t i l i d a d e :

r e s c i m e n t o a p a r t i r d a p i c a d a e s t e n d e n d o - s e p a r a t o d o o m e i o m ó v e l

r e s c i m e n t o s o m e n t e a o r e d o r d a p i c a d a i m ó v e l

f. Uréia
: a l d o c o n t e n d o u r é i a p a r a v e r i f i c a r a p r o d u ç ã o d a e n z i m a u r e a s e , l i b e r a n d o a m ô n i a q u e

a l a c a l i n i z a o m e i o e a c o r m u d a p a r a r o s a .

L e i t u r a :

o r r o s a o u v e r m e l h a +

o r a m a r e l a o u l a r a n j a - c l a r o -

R e s u l t a d o s s p e r a d o s n o s T e s t e s i o q u í m i c o s p a r a I d e n t i f i c a ç ã o d e

E B

a l g u n s g ê n e r o s d e e n t e r o b a c t é r i a s

E. coli Salmonella Klebsiella Proteus

A R A T R Í S T I A

C C E C

Á g a r L a c + L a c - L a c + L a c -

E M B

T S I á p i c e / b a s e ) á c / á c a l c / á c a c / a c a l c / á c o u á c / á c

H 2 S - + - +

G l i c o s e + + + +

G á s + + + +

L a c t o s e + - + -

S a c a r o s e - +

V V

a n i t o l + + +

M V

+ + + +

V M

P - - - -

i t r a t o - + 5 d i a s ) -

C V (

I n d o l + - -

o b i l i d a d e + - +

M V

U r é i a - - +

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4. ENTEROKIT B É

u m k i t c o m e r c i a l p a r a a i d e n t i f i c a ç ã o d e e n t e r o b a c t é r i a s . o n s i s t e d e 3 m e i o s : P , I L i

C E M M

e i t r a t o d e S i m m o n s . O m e i o P c o n t é m o s t e s t e s d e f e r m e n t a ç ã o e p r o d u ç ã o d e g á s e m

C E M

g l i c o s e , p r o d u ç ã o d e H S , h i d r ó l i s e d a u r é i a e d e s a m i n a ç ã o d o t r i p t o f a n o . O m e i o l L i c o n t é m o s
2

t e s t e s d e m o t i l i d a d e , i n d o l e d e s c a r b o x i l a ç ã o d e l i s i n a . O i t r a t o d e S i m m o n s o f e r e c e o t e s t e d e

u t i l i z a ç ã o d o c i t r a t o c o m o ú n i c a f o n t e d e c a r b o n o . O s t r ê s m e i o s t o t a l i z a m t e s t e s q u e s o m a d o s

a o d a f e r m e n t a ç ã o d a l a c t o s e n a p l a c a d e i s o l a m e n t o Á g a r ) , p e r m i t e m i d e n t i f i c a r c o m

( E M B

f i d e l i d a d e a g r a n d e m a i o r i a d a s e n t e r o b a c t é r i a s i s o l a d a s d e e s p é c i m e s c l í n i c o s .

Procedimento:
T o c a r a c o l ô n i a c o m a g u l h a d e p l a t i n a e s e m e a r o s 3 m e i o s n a s e g u i n t e o r d e m : i t r a t o ,

P e l L i . P a r a i n o c u l a r o m e i o d e i t r a t o d e s l i z a r a a g u l h a p e l o c e n t r o e s t r i a n d o t o d a a

E M M C

s u p e r f í c i e i n c l i n a d a . N o m e i o P i n t r o d u z i r a a g u l h a a t é o f u n d o d o t u b o e a o r e t i r á - l a s e m e a r a

E M

s u p e r f í c i e d o m e i o e n q u a n t o o I L i d e v e s e r s e m e a d o p o r p i c a d a c e n t r a l q u e d e v e a t i n g i r o f u n d o

d o t u b o . I n c u b a r a 3 5 ± 2 ° c o m a s t a m p a s s e m i - r o s q u e a d a s e f a z e r a l e i t u r a a p ó s 1 - 2 h .

C 8 4

Leitura e interpretação
:

a. Meio EPM
 Produção de gás:
A p a r e c i m e n t o d e b o l h a s o u d e s l o c a m e n t o d o m e i o d o f u n d o d o t u b o .

 Produção de H2S:
n e g r e c i m e n t o d o m e i o e m q u a l q u e r i n t e n s i d a d e .

 Hidrólise da uréia:
A p a r e c i m e n t o d e c o r a z u l o u v e r d e a z u l a d a r e a ç ã o f r a c a ) q u e s e e s t e n d e

p a r a a b a s e d o m e i o , e n v o l v e n d o - a t o t a l m e n t e o u n ã o .

 Desaminação do triptofano (LTD):

A p a r e c i m e n t o d e c o r v e r d e - g a r r a f a n a s u p e r f í c i e d o m e i o .

b. Meio MlLi
 Motilidade (MOT):
A b a c t é r i a m ó v e l c r e s c e a l é m d a l i n h a d e p i c a d a . A i m ó v e l s ó n a l i n h a .

 Descarboxilação da lisina:
Q u a n d o a l i s i n a é d e s c a r b o x i l a d a o m e i o a d q u i r e c o r p ú r p u r a

a c e n t u a d a o u d i s c r e t a . Q u a n d o o a m i n o á c i d o n ã o é u t i l i z a d o , o m e i o a d q u i r e c o r a m a r e l a d a

n o s s e u s 2 / 3 i n f e r i o r e s . o n s i d e r a r o t e s t e p o s i t i v o s e m p r e q u e o m e i o n ã o e s t i v e r a m a r e l o .

 Produção de indol:
A d i c i o n a r 3 a g o t a s d o r e a t i v o d e K o v a c s à s u p e r f í c i e d o m e i o e a g i t a r

l e v e m e n t e . Q u a n d o a b a c t é r i a p r o d u z i n d o l , o r e a t i v o a d q u i r e c o r r o s a o u v e r m e l h a . Q u a n d o

n ã o p r o d u z , o r e a t i v o m a n t é m s u a c o r i n a l t e r a d a .

c. Meio Citrato de Simmons

A u t i l i z a ç ã o d o c i t r a t o r e v e l a - s e p e l o a p a r e c i m e n t o d e c o r a z u l n a s u p e r f í c i e d o m e i o . O

t e s t e d e v e s e r c o n s i d e r a d o n e g a t i v o q u a n d o a c o r d o m e i o n ã o s o f r e a l t e r a ç ã o .

A s r e a ç õ e s b i o q u í m i c a s d o n t e r o k i t s o m a d a s a o d a f e r m e n t a ç ã o d a l a c t o s e n a p l a c a d e

8 E B

i s o l a m e n t o f o r a m a g r u p a d a s e m 3 c o n j u n t o s d e p r o v a s . A s o m a d e c a d a u m d e s t e s c o n j u n t o s

p r o d u z u m a l g a r i s m o , d e m o d o q u e o r e s u l t a d o p r o d u z u m n ú m e r o d e 3 d í g i t o s , q u e i d e n t i f i c a

u m a e s p é c i e b a c t e r i a n a . O s 3 c o n j u n t o s d e p r o v a s e s e u s v a l o r e s s ã o :

Bacteriologia na prática: Manual de acompanhamento das aulas práticas da disciplina de Bacteriologia

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5. Resultados e Observações

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Bacteriologia na prática: Manual de acompanhamento das aulas práticas da disciplina de Bacteriologia