PROGRAMA E PROTOCOLOS PRTICOS DA DISCIPLINA DE

LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA

Jos Antnio Henriques de Conde Belo

Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais

Faro, Fevereiro de 2006

Laboratrios de Engenharia Gentica 2005/06

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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA Objectivos gerais dos trabalhos prticos A construo de uma molcula de DNA recombinante que permitir a produo e inactivao in vitro de uma protena. OBJECTIVOS ESPECFICOS
1. Inserir um Tag numa sequncia de um cDNA especfico. 2. Subclonar este fragmento modificado do gene Cerl2 de ratinho no vector plamdico de expresso pCS2+. 3. Transformar a estirpe XL-1 de E. coli com o DNA recombinante e seleccionar as colnias transformadas. 4. Induzir a expresso/inactivao desta protena recombinante em Reticulcitos de coelho . 5. Anlise de protenas em gel de poliacrilamida.

Objectivos
Adquirir experincia em: isolar DNA plasmdico em pequena escala. utilizar enzimas de restrio e DNA ligase. transformao de bactrias sequenciao de DNA produo/inactivao de protenas em bactrias. visualisao de protenas em geis de poliacrilamida. planeamento de experincias e interpretao de resultados.

Sumrio das aulas:

A primeira tarefa ser a preparao e anlise por enzimas de restrio de um plasmideo contendo o cDNA de interesse. A este cDNA ser inserido uma tag por PCR na sua regio 3 de modo a poder ser produzida uma protena recombinante. Este tag codifica um epitopo de 19 aminocidos contra o qual existe um anticorpo monoclonal especfico. Este fragmento de PCR ser posteriormente digerido com enzimas de restrio de modo a originar extremidades coesivas (EcoRI e XbaI) para ligar no vector de expresso. De modo a analizar-se a eficincia da digesto, e de modo a obter-se o fragmento de DNA a subclonar, o DNA digerido ser corrido em gel de agarose. O fragmento desejado dever nesta altura ser isolado do gel. O fragmento isolado e o vector linearisado, com as mesmas enzimas, sero ento misturados e a ligao fragmento-vector efectuada por adio de DNA ligase. A mistura de ligao assim obtida ser utilizada na transformao
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de clulas de E. coli competentes, e a seleco de colnias transformadas com o DNA recombinante ser feita por plaqueamento em meio contendo ampicilina. Este cDNA recombinante ser introduzido no vector de expresso pCS2+ e posteriormente digeridos com estas endonucleases de restrico de modo a verificar a eficincia da clonagem. Em seguida ser sequenciado para confirmao de que a sequncia recombinante est correcta. Este vector de expresso recombinante ser utilizado para induzir a expresso desta protena em reticulcitos de coelho. Este sistema in vitro de transcrico/traduo muito utilizado devido sua elevada eficincia e fiabilidade. Ao mesmo tempo que estaremos a activar esta transcrico/traduo da protena recombinante de interesse iremos testar a eficcia de um Oligonucletido Morfolino especifico para impedir a traduo e consequente produo da protena recombinante. Estas protenas sero ento analisadas em gel de poliacrilamida por colorao com Azul de Bromofenol. Simulao em computador Gene Isolation and Characterization da Biotol.

Propriedades importantes do plasmdeo pBlueScript KS (pBS KS; ver Anexo 1). 1. Contm vrios locais unicos de digesto para diversos enzimas de restrio, agrupados numa regio do plasmdeo denominada local multiplo de clonagem (LMC). 2. O plasmdeo pBS contm o gene de resistncia ampicilina, permitindo que as clulas transformadas sejam seleccionadas em placas com meio contendo ampicilina. A E. coli sensvel ampicilina e no pode crescer na presena desta droga, e apenas as clulas que incorporaram o plasmdeo (clulas transformadas) conseguem crescer. Propriedades importantes do plasmdeo pCS2+ (ver Anexo 2). 1. Contm vrios locais unicos de digesto para diversos enzimas de restrio, agrupados numa regio do plasmdeo denominada local multiplo de clonagem (LMC). 2. contm um local de ligao RNA polimerase 6 (SP6) na regiao 5 do LCM e um local de PoliAdenilao a 3.

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FLOW CHART DAS AULAS PRTICAS Trabalho 1: Isolamento de DNA plamdico contendo o cDNA (pBS-Cerl2) de culturas de E. coli. (15/03) Digesto do DNA com enzimas de restrico. (16/03) Anlise do DNA em gel de agarose.

Trabalho 2: Estratgia de cloning e tagging deste cDNA por PCR. (17/03) Anlise e extrao do fragmento de PCR em gel de agarose. Digesto do produto de PCR. Digesto do vector pCS2+. Trabalho 3: Anlise e extrao dos fragmentos de DNA em gel de agarose. (20/03) Ligao do fragmento de DNA ao vector digerido.

Trabalho 4: Preparao de clulas competentes (21/03) Transformao de clulas competentes com a mistura de ligao. Plaqueamento das clulas em meio contendo ampicilina.

Trabalho 5: Anlise dos transformantes e lanamentos das culturas (22/03) Isolamento de DNA plamdico da aula anterior, de culturas de E. coli. (23/03) Digesto do DNA com enzimas de restrico. Anlise do DNA em gel de agarose. (24/03)

Trabalho 6: Reaco de sequnciao dos clones positivos da aula anterior. (27/03) Limpeza dos produtos de PCR da reao de sequenciao.

Trabalho 7: Anlise das reaes de sequenciao. (29/03) Expresso/inactivao da protena em Reticulcitos de coelho. Trabalho 8: Anlise das protenas em geis de poliacrilamida. (30/03) Anlise dos gis e discusses sobre os trabalhos (31/03) Trabalho 9-10: Simulao em computador utilizando o programa Gene Isolation and Characterization da Biotol. (4, 5/04)
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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA TRABALHO PRTICO 1

EXTRACO, RESTRICO E ELECTROFORSE DE DNA PLASMDICO DE E. COLI
Trabalho Prtico 1 Isolamento do plamdeo contendo o cDNA (pBS-Cerl2). - Digesto do DNA com enzimas de restrico. - Anlise do DNA em gel de agarose. Objectivos Pretende-se com este trabalho isolar o vector plasmidico contendo o cDNA (pBS-Cerl2; ver Anexo 3 e 4), que esto presentes em clulas transformadas de E. coli. Introduo Existem vrios mtodos de extraco de DNA plasmdico. O mtodo utilizado neste trabalho consiste numa modificao do mtodo de lise alcalina (Birnboim & Doly, 1979). O processo, que permite a extraco de DNA plamdico de clulas de bactria, consiste em provocar a lise destas numa soluo fortemente alcalina (de hidrxido de sdio) contendo SDS (dodecil sulfato de sdio). Esta soluo causa simultaneamente a dissoluo da membrana plasmtica, a desnaturao de macromolculas (protenas e DNA) e a hidrlise do RNA. As macromoleculas so depois precipitadas por adio de acetato de potssio (KAc), e devido ao pH cido desta soluo o pH do lisado neutralisado. O reequilbrio do pH permite a renaturao do DNA plasmdico, restabelecendo a sua conformao original. O DNA genmico, devido s suas dimenses e estrutura, no consegue voltar sua forma nativa, permanecendo sob a forma de agregados complexos. Aps a adio do KAc pois possivel, por centrifugao, separar um sedimento, constitudo por membranas, protenas e DNA cromossmico, de um sobrenadante onde o DNA plamdico se encontra dissolvido. Uma desproteinizao mais profunda desse sobrenadante pode posteriormente ser levada a cabo utilizando-se uma mistura de fenol-clorofrmio (1:1), de modo a obter DNA plasmdico suficientemente puro e assim adequado a servir de substrato para os enzimas de restrio. No final, o DNA plasmdico purificado precipitado com etanol, seco sob vcuo, e ressuspenso em tampo TE. Birnboim, HC & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.

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Plasmid Miniprep Cada grupo vai fazer 2 extraces (2 tubos Eppendorf iniciais). Em cada tubo: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Centrifugar 1,5 ml da cultura de E. Coli, durante 5 min. a 2,000 rpm; eliminar o Vortex durante 2 min. para ressuspender o pellet e adicionar 5ul Rnase A (soluo Incubar temperatura ambiente durante 10 min. Adicionar 400ul, de uma soluo 0.2M NaOH / 1% SDS (preparado na altura); Misturar por inverso e colocar os tubos em gelo durante 5 min. Adicionar 300ul acetato de potssio (3M, pH 4,5); Misturar por inverso e colocar os tubos em gelo durante 10 min. Centrifugar o lisado durante 10 minutes a 12,000 rpm; Transferir 0,7 ml do sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga, contendo

sobrenadante e adicionar 200ul GTE stock a 10mg/ml).

0,8 ml de etanol arrefecidos a 4oC, 10. Misturar por inverso e colocar os tubos em gelo durante 15 - 30 min. para precipitao do DNA. 11. Separar o precipitado por centrifugao, durante 10 min. a 12,000 rpm. 12. Deitar fora o sobrenadante, invertendo o tubo em cima de uma toalha de papel, e batendo ligeiramente no tubo. preciso cuidado tanto ao despejar o sobrenadante como posteriormente, para no perder a pellet. 13. Lavar o sedimento de DNA plasmdico com 1ml de etanol a 70%. 14. Separar o precipitado por centrifugao, durante 10 min. a 12,000 rpm 15. Retirar o excesso de etanol com uma micropipeta 16. Secar o pellet ao ar livre (aproximadamente 15 min.) 17. Adicionar 50 ul de TE 18. Guardar a 20C e/ou prosseguir para digesto com enzimas de restrio. Solues: TE: 10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8.0
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RESTRICO E ELECTROFORSE DE DNA DE PLASMDEO

Os objectivos deste trabalho so visualizar o DNA de plasmdeo extrado previamente. Pretende-se fazer estimativa do tamanho das molculas e da quantidade de DNA obtida, atravs de comparao com marcadores de tamanho e de marcadores de peso molecular, aps electroforse em gel de agarose. Tem-se tambm em vista a observao das diversas conformaes que o DNA de plasmdeo pode apresentar atravs da mobilidade diferencial daquelas formas sujeitas a electroforse.

1. Digesto de DNA de plasmdeo com EcoRI/XbaI e com HindIII : Estas enzimas so endonucleases de restrico presentes no polylinker do plasmdeo. A digesto do DNA com esta enzima vai conduzir ao aparecimento de 2 bandas, o que vai ser observado aps electroforse.

1.a) Preparar as seguintes reaces de digesto

Amostra DNA (ul) EcoRI/XbaI (ul) HindIII (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)

DNA p DNA p DNA p

3.0 3.0 3.0

0.5/0.5 ---------

----0.5 -----

1.5 1.5 1.5

9.5 10.0 10.5

15.0 15.0 15.0

DNAp DNA plasmidico b) Incubar a reaco no banho a 37 C, durante pelo menos 60 min.

2. Parar a reaco de digesto juntando 2 l de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um dos tubos.

3. Preparao do gel de agarose: Preparar 80 ml de 1.0 % agarose em TBE, a partir de TBE 10x. Aquecer no microondas at dissolver a agarose, com agitao. Arrefecer (at cerca de 50 C). Adicionar 4.0 l de Brometo de Etdeo do stock (a 10mg/ml). O brometo de etdeo um agente mutagnico forte e deve ser manipulado sempre com luvas e muito cuidado.
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Enquanto a soluo de agarose arrefece, preparar o tabuleiro com dois pentes e fita adesiva. Despejar devagar soluo de agarose suficiente. Deixar solidificar durante 20-30 min. Retirar a fita e os pentes e introduzir o tabuleiro com o gel na tina contendo TBE (300 ml), com os poos onde vo ser colocadas as amostras perto do elctrodo negativo (azul). 4. Electroforse em gel de agarose: Os plasmdeos encontram-se geralmente em vrias conformaes, tais como a forma circular fechada super-enrolada (supercoiled) que compacta e tem maior mobilidade no gel do que as outras formas; a forma circular aberta que tem pelo menos um corte numa das cadeias (a forma menos mvel); e a forma linear em que os cortes ocorreram nas duas cadeias num stio prximo, como o caso das molculas digeridas com uma enzima de restrio. a) As amostras de DNA vo ser introduzidas no gel, ao lado do marcador de tamanho (1 kb Plus DNA Ladder), para fazer uma estimativa do tamanho e da quantidade das molculas de DNA. Usar 5,0 l do 1 kb ladder (contendo um total de 500 ng de DNA) b) Correr o gel a 100V, durante 30-60 min. c) O gel corado com brometo de etdeo pode ser visualizado sobre uma fonte de UV, com uma mscara protectora, e fotografado.

Restrico e electroforse de DNA de plasmdeo: DNA do plasmdeo pBS-Cerl2 foi extrado de E. coli e submetido a electroforse em gel de agarose. A amostra foi tambm analisada por electroforse aps digesto do DNA de plasmdeo com endonucleases de restrico cujas sequncias de reconhecimento so nicas no plasmdeo. Da observao do gel, pretende-se: 1. Identificar os padres de tamanho (1kb Plus DNA Ladder) e de peso molecular e as amostras correspondendo ao DNA do plasmdeo digerido com as endonucleases de restrico. 2. Identificar as diversas conformaes presentes no DNA de plasmdeo tais como a molcula linear, as formas superenroladas, circulares abertas, e os mltiplos. 3. Estimar o tamanho e a quantidade do DNA de plasmdeo atravs da comparao com os padres de tamanho e peso molecular conhecidos. 4. Referir a concentrao das amostras analisadas em g/l.
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Solues: TBE 10x, pH 8.3: 0.89 M Tris.base 0.89 M cido Brico 0.02 M Na2EDTA.2H2O Gel loading buffer: 0.25% azul bromofenol 40% glicerol

NOTA: Para fcil referncia, h uma dupla de bandas mais afastadas das outras, a 2,000 e a 1,650 pb. A banda de 1,650 pb contm aproximadamente 10% do total de DNA presente em todas as bandas.

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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA TRABALHO PRTICO 2

TAGGING DO CDNA POR PCR
Trabalho Prtico 2 Estratgia de cloning e tagging deste cDNA por PCR. - Anlise e extrao do fragmento de PCR em gel de agarose. - Digesto do produto de PCR. - Digesto do vector pCS2+. Objectivos Pretende-se com este trabalho inserir um tag no poro 3 do cDNA presente no vector plasmidico pBS-Cerl2. O mtodo de PCR, introduzido inicialmente por Saiki et al. (1985) e Mullis & Faloona (1987), foi utilizado para tentar obter uma ampliao selectiva de genes de interesse. Este mtodo utiliza uma enzima DNA polimerase termoestvel para copiar in vitro uma determinada regio da molcula de DNA, regio esta que condicionada pelo uso de pequenos primers que hibridam com locais individualizados dos cadeias de DNA delimitando assim o fragmento a amplificar. Este tcnica permite amplificar uma molcula vrios bilies de vezes em poucas horas (Eidne, 1991), sendo particularmente til quando se analisa tipos de mRNA pouco abundantes ou quando as quantidades de tecido disponvel so limitadas (Dallman & Porter, 1993). O PCR um processo cclico em que os seguintes passos, so repetidos durante um nmero determinado de vezes: A cadeia dupla de DNA desnaturada por aquecimento, obtendo-se duas cadeias simples; os primers introduzidos na reaco ligam-se com zonas homologas em cada uma destas cadeias; a DNA polimerase cataliza a produo de novas cadeias complementares. Cada uma destes ciclos, que demora apenas alguns minutos, duplica a quantidade da DNA pretendida, deixando-a como uma cadeia dupla. Os reagentes necessrios so, para alm da enzima, primers e DNA, nucletidos livres (dNTP) para construo das cadeias e uma soluo-tampo da reaco buffer, que estabelece as condies ptimas para a enzima.
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O tag a adicionar, na regio 3 do cDNA de Cerl2, vai codificar para o epitopo designado FLAG (contra o qual existe um anticorpo monoclonal), cuja sequncia de aminocidos : DYKDDDDK. Para visualizao do produto final pretendido ver Anexo5. Objectivos: Aprendizagem da tcnica PCR Adicionar uma sequencia de nucleotdeos ao cDNA de Cerl2 contido no plasmideo pBS SK.

Protocolo Amostras: DNA plasmidico do pBS-Cerl2. 1. Retirar a amostra de DNA plasmidico que dever estar guardada no congelador. 2. Deixar descongelar temperatura ambiente 3. Preparar 1 tubo de PCR com as quantidades de reagentes indicadas na tabela 1, 4. Adicionar a amostras ao tubos preparado em 3. A quantidade de amostra a usar ser dada pelo prof. pois poder ter de proceder a uma diluio 5. Adicionar aos tubos 1 gota de leo mineral antes de os colocar no aparelho PCR

Tabela 1 - Quantidades (em l) de reagentes utilizados em cada tubo de reaco

dNTPs 10mM 10XPCR buffer Enzima Taq Primer F 20pmol Primer R 20pmol H2O esterile DNA

PBSCerl2

1.0

2.5

0.4

1.0

1.0

18.1

1.0

PRIMERS UTILIZADOS: Primer Forward: T3 AATTAACCCTCACTAAAGGG Primer Reverse: cerl2-Flag-XbaI (5CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCT

CCTCCTCCCAGCTTCGGGCGGCACTGACACTTCTGG-3).

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Programa PCR 1 ciclo 20 ciclos desnaturao inicial desnaturao hibridao extenso 1 ciclo 1 ciclo extenso final Manuteno 94oC, 1 min 94oC, 30 segundos 55oC, 1 min 72oC, 1 min 72oC, 10 min 4oC, 24 Horas

6. Parar a reao definitivamente adicionando 3.0 l de GLB. ANLISE E EXTRAO DO FRAGMENTO DE PCR. Mtodo de QIAquick Gel Extraction Kit 1- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE 2- O volume total das amostras obtidas pela reao de PCR so introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 l de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora. 3-Cortar a banda do gel e colocar num tubo eppendorf. 4- Adicionar 300 l Buffer QG. 5- Incubar a 50C durante 10min ou at ao gel se dissolver completamente. (vortexar ao fim de 5min).
Protocol

6. Place a QIAquick spin column in a provided 2 ml collection tube. 7. To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column, and centrifuge for 1 min. The maximum volume of the column reservoir is 800 l. For sample volumes of more than 800 l, simply load and spin again. 8. Discard flow-through and place QIAquick column back in the same collection tube. Collection tubes are re-used to reduce plastic waste. 9. (Optional): Add 0.5 ml of Buffer QG to QIAquick column and centrifuge for 1 min. This step will remove all traces of agarose. It is only required when the DNA will
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subsequently be used for direct sequencing, in vitro transcription or microinjection. 10. To wash, add 0.75 ml of Buffer PE to QIAquick column and centrifuge for 1 min. Note: If the DNA will be used for salt sensitive applications, such as blunt-end ligation and direct sequencing, let the column stand 25 min after addition of Buffer PE, before centrifuging. 11. Discard the flow-through and centrifuge the QIAquick column for an additional 1 min at 13,000 rpm (~17,900 x g). IMPORTANT: Residual ethanol from Buffer PE will not be completely removed unless the flow-through is discarded before this additional centrifugation. 12. Place QIAquick column into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube. 13. To elute DNA, add 50 l of Buffer EB (10 mM TrisCl, pH 8.5) to the center of the QIAquick membrane and centrifuge the column for 1 min. Alternatively, for increased DNA concentration, add 30 l elution buffer to the center of the QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge for 1 min. IMPORTANT: Ensure that the elution buffer is dispensed directly onto the QIAquick membrane for complete elution of bound DNA. The average eluate volume is 48 l from 50 l elution buffer volume, and 28 l from 30 l. Elution efficiency is dependent on pH. The maximum elution efficiency is achieved between pH 7.0 and 8.5. When using water, make sure that the pH value is within this range, and store DNA at 20C as DNA may degrade in the absence of a buffering agent. The purified DNA can also be eluted in TE (10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8.0), but the EDTA may inhibit subsequent enzymatic reactions.

13- Usar 2.0l deste DNA + 1 l de GLB + 7.0l H2O. Correr em gel de agarose para verificar a eficincia da extrao.

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DIGESTO COM ENZIMAS DE RESTRIO Pretende-se agora digerir o produto de PCR e o vector de expresso pCS2+ com enzimas de restrio de modo a que se possa proceder clonagem do fragmento no novo vector.

1.a) Preparar as seguintes reaces de digesto

Amostra DNA (ul) EcoRI (ul) XbaI (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)

PCR DNA p

5.0 5.0

1.0 1.0

1.0 1.0

2.0 2.0

11.0 11.0

20.0 20.0

DNAp DNA plasmidico; PCR- fraagmento de PCR. b) Incubar a reaco no banho a 37 C, durante a noite (ON).

2. Parar a reaco de digesto juntando 2 l de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um dos tubos.

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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA TRABALHO PRTICO 3

PREPARAO DE REAES DE LIGAO
Trabalho Prtico 3 Anlise e extrao dos fragmentos de DNA em gel de agarose. - Ligao do fragmento de DNA ao vector digerido. Objectivos: pretende-se preparar os fragmentos de DNA necessrios para proceder reao de ligao que permitir subclonar o fragmento de DNA recombinante resultante do PCR, no novo vector de expresso pCS2+. Mtodo de Freeze-Squeeze 1- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE 2- O volume total das amostras obtidas pela reao de restrio da aula Prtica 2, so introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 l de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora. 3- Prosseguir com o mtodo de QIAquick de acordo com o protocolo da aula Prtica 2 de modo a isolar as duas bandas de DNA. 4- Ressuspender os produtos em 5.0l de TE. REACO DE LIGAO 1- Proceder reao de ligao do seguinte modo:
TUBO PCR (ul)

vector (ul) 1.0

DNA ligase (ul)

Buffer 5x (ul)

H2O (ul)

Total (ul)

2.0

0.5

2.0

4.5

10.0

PCR - fragmento de PCR digerido; vector pCS2+ digerido; b) Incubar a reaco a 16 C, durante a noite (ON) ou 2 horas TA.

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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA TRABALHO PRTICO 4

TRANSFORMAO DO CDNA RECOMBINANTE
Trabalho Prtico 4 Preparao de clulas competentes - Transformao de clulas competentes com a mistura de ligao. - Plaqueamento das clulas em meio contendo ampicilina.

PREPARAO DE CLULAS COMPETENTES DE E. COLI

Certas estirpes de E. coli podem-se tornar competentes para transformao com DNA plasmdico atravs de tratamento com caties, tais como Ca2+, Mn2+ ou Co3+. Uma soluo 0.1M de CaCl2 utilizada frequentemente para este fim. O objectivo deste trabalho a obteno de clulas competentes de E. coli para transformao gentica. 1. Preparar uma cultura de E. coli em meio LB com uma densidade ptica a 550 nm (A550) de 0.4-0.6, o que corresponde fase logartmica de crescimento. (Requer a inoculao da cultura no dia anterior e diluio 1:500 no dia de utilizao.) 2. Transferir assepticamente 25 ml de cultura para tubo esterilizado. Reduzir a temperatura da cultura para aprox. 0 C, mantendo o tubo no gelo durante 10 min. As clulas devem ser mantidas a baixas temperaturas e manuseadas com cuidado durante todo o procedimento, porque o tratamento necessrio para as tornar competentes torna-las mais frgeis. 3. Centrifugar a cultura a 1 000 rpm e a 4 C, durante 10 min. 4. Despejar o sobrenadante e adicionar 10 ml de CaCl2 0.1M frio. Agitar com cuidado para ressuspender a pellet (sobre gelo). Aps ressuspenso, incubar no gelo durante 20 min. 5. Centrifugar novamente as clulas a 1 000 rpm e a 4 C, durante 10 min. 6. Despejar o sobrenadante e ressuspender a pellet em 1 ml de CaCl2 0.1M frio. Incubar no gelo durante 10 min. 7. Neste ponto, as clulas esto competentes e prontas a ser transformadas. Podem tambm ser armazenadas a -70 C durante alguns meses, sem grandes perdas de competncia. Distribuir as clulas em aliquotas de 200 l, em tubos Eppendorf previamente identificados e congelar rapidamente em azoto lquido.
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TRANSFORMAO GENTICA DE E. COLI

Transformao gentica pode ser definida como a incorporao estvel e hereditvel de DNA exgeno por clulas de um hospedeiro. Em certas bactrias, a transformao ocorre naturalmente o que contribui para o aumento da variabilidade gentica das populaes. Outras bactrias, tais como a E. coli, tm que ser tornadas competentes para transformao antes de poderem ser transformadas (Prtica 3). Com este trabalho vamos colocar clulas competentes de E. coli em presena de DNA exgeno, com o fim de obter clulas transformadas. 1. Cada grupo vai fazer trs transformaes- com a reaco de ligao da Prtica 3 , um controlo constitudo por clulas competentes com DNA circular e um controlo constitudo por clulas competentes sem DNA. Descongelar/utilizar portanto, 3 tubos com 200 l de clulas competentes, no gelo. 2. Etiquetar cada tubo e adicionar 10.0l do DNA ou H2O no fundo de cada tubo, mexendo brevemente com a ponta. Incubar no gelo durante 30 min. 3. Remover os tubos do gelo directamente para um banho aquecido a 42 C, incubar durante 90 segundos a 42 C, e de novo no gelo durante 2 min, causando um choque trmico. 4. Adicionar 700 l de meio SOC a cada tubo, e incubar a 37 C durante 45 min. Este o perodo de recuperao das clulas. 5. Transferir aliquotas de 100 l de cada transformao e do controlo para uma placa de Petri contendo meio LB com 50 g/ml ampicilina e para uma placa contendo meio LB sem antibitico. O antibitico permite seleccionar as clulas transformadas atravs do gene de resistncia presente no plasmdeo.

6. Espalhar o inculo na superfcie do meio com um espalhador esterilizado chama, e manter a placa semi-aberta na cmara de fluxo laminar durante 15-20 min at que o lquido seja absorvido pelo meio de cultura. 7. Incubar as placas de Petri invertidas, numa estufa a 37 C durante 18-24h.

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Solues:

Meio de cultura SOC (1l): Triptona Extracto de levedura NaCl glucose Meio de cultura LB (1l): Triptona Extracto de levedura NaCl

20 g 5g 0.5g 20 mM

10 g 5g 10g

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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA TRABALHO PRTICO 5

ANLISE DOS RESULTADOS DA TRANSFORMAO
Trabalho Prtico 5 Calcular a eficincia de transformao. - Isolamento de DNA plamdico da aula anterior, de culturas de E. coli. - Digesto do DNA com enzimas de restrico. - Anlise do DNA em gel de agarose. Transformao gentica de E. coli Para efectuar a transformao gentica, clulas competentes da bactria so postas em contacto com DNA exgeno (DNA de plasmdeo). Aps um perodo de recuperao, em que as clulas so submetidas a condies ptimas de crescimento, as clulas so incubadas no meio de seleco. Cada clula transformada exibe o fentipo de resistncia ao antibitico de seleco, conferido pelo gene presente no plasmdeo, e vai formar uma colnia no meio de cultura. O sucesso da transformao medido atravs da eficincia de transformao, definida como o nmero de clulas hospedeiras transformadas por micrograma de DNA:

Eficincia de = Transformao

no de clulas transformadas g de DNA usado

volume final da suspenso celular (ml) volume de suspenso usado (ml)

Da anlise das placas de Petri com as transformaes e o controlo incubadas em meio LB com ou sem antibitico, observar: 1. A viabilidade das clulas competentes atravs do crescimento do controlo em meio LB. 2. A ausncia de resistncia ampicilina das clulas competentes indicada pela ausncia de crescimento em meio com antibitico.
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3. A incorporao do plasmdeo pelas clulas competentes indicada atravs da aquisio de resistncia ampicilina. 4. Clculo da eficincia de transformao.

ISOLAMENTO DE DNA PLASMDICO

Plasmid Miniprep Cada grupo vai fazer 2 extraces (2 tubos Eppendorf iniciais) de duas colnias individuais resultantes da reao de ligao/transformao da aula Prtica 4. 1- Proceder extrao de DNA plasmidico de acordo com o Protocolo Plasmid Miniprep da aula Prtica 1. 2- Ressuspender o DNA plasmidico num volume final de 50.0l de TE. 3- Preparar as seguintes 2 reaces de digesto
Amostra DNA (ul) EcoRI/XbaI (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)

DNA p

3.0

0.5/0.5

1.5

9.5

15.0

DNAp DNA plasmidico 4Incubar a reaco no banho a 37 C, durante pelo menos 60 min.

5- Parar a reaco de digesto juntando 2 l de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um dos tubos. 6- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE 7- O volume total das amostras obtidas pela reao de restrio da no ponto 5, so introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 l de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora. 8- Tirar fotografia e analisar o padro das bandas de DNA.

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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA TRABALHO PRTICO 6

PREPARAO DE REAES DE SEQUENCIAO
Trabalho Prtico 6 Reaco de sequnciao dos clones positivos da aula anterior. - Limpeza dos produtos de PCR da reao de sequenciao. Objectivos Pretende-se com este trabalho determinar a sequncia de nucletidos correcta do cDNA recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag. Introduo A determinao da sequncia de nucletidos que compem um fragmento de DNA clonado representa um dos processos finais na anlise de DNA. A capacidade de sequenciar DNA rapidamente teve um impacto revolucionrio na Biologia. Crucial para os processos de sequenciao, foi o desenvolvimento de electroforese em gel de acrilamida vertical que permite separar cadeias de DNA com centenas de nucletidos e com apenas um nucletido de diferena entre elas (a mais ou a menos). O mtodo laboratorial mais comum de sequenciao de DNA, conhecido como o mtodo de Sanger ou mtodo de terminao de cadeias. Este envolve a sntese de novo de uma srie de cadeias simples de DNA, usando como molde a cadeia de DNA que se quer sequenciar. As cadeias sintetizadas so terminadas prematuramente nos vrios tamanhos possveis. A sntese comea sempre num ponto definido (por um primer) e termina por incorporao de nucletidos terminadores. Estes so derivados didesoxi dos nucletidos normais que, no possuindo um grupo hidroxilo na posio 3 da desoxirribose, impedem as ligaes fosfodiestricas do DNA. Consequentemente, termina a incorporao de nucletidos cadeia de DNA que est a ser sintetizada. Os quatro terminadores sero abreviadamente designados ddA, ddC, ddG e ddT. Um fragmento de DNA clonado num plasmdeo representa um substrato tpico para sequenciao. O primeiro passo a separao (desnaturao) das cadeias de DNA. Em seguida, um pequeno oligonucletido primer (aproximadamente 20 resduos) emparelhado numa zona adjacente ao DNA clonado, normalmente em sequncias conhecidas do plasmdeo. Uma DNA polimerase utilizada para sintetizar DNA a partir do primer. Hoje em dia, para que o DNA fique marcado utilizam-se compostos que emitem fluorescncia a cores diferentes em cada um dos terminadores utilizados e depois so analisados num aparelho chamado Sequenciador Automtico. A funo deste aparelho resolver as diferentes emisses que vo passando ao longo do tempo num detector Laser e interpretar assim a sequncia de nucleotides continda na amostra de DNA analisada.
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PROTOCOLO PARA SEQUENCIAO CICLICA Este protocolo utiliza uma mistura de reaco (BigDye Terminator v1.1) que por adio da amostra e primers especificos, permite a determinao da sequncia de nucletidos aps uma reaco de PCR e anlise num Sequenciador Automtico 1- Para cada reaco de sequenciao misturar os seguintes componentes: a) Terminator Ready Reaction Mix b) Amostra de DNA pCS2+-Cerl2-Flag (300-500ng) c) Primer de sequenciao SP6 (3.2pmol) d) H2O Volume final 2- Misturar bem e colocar os tubos no aparelho de PCR. Programa para Sequenciao por PCR: 1 ciclo 25 ciclos desnaturao inicial desnaturao hibridao extenso 1 ciclo Manuteno 96oC, 1 min 96oC, 10 segundos 50oC, 10 segundos 60oC, min 4oC, 24 Horas 4.0l 1.0l 1.0l 4.0l 10.0l

PURIFICAO DAS REAES POR PRECIPITAO COM ETANOL/NaAc. 1- Retirar os tubos do Termociclador e centrifugar por instantes 2- adicionar a cada tubo: 2.0l de 3M NaAc, pH 4.6 50.0l de 95% Etanol. 3- Transferir para um tubo eppendorf e e misturar bem. 4- Incubar a TA durante 20 minutos para precipitar os produtos de extenso.
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10.0l de H2O

5- Centrifugar a 4C durante 10 min. a 14,000 rpm. 6- Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e deitar fora. 7- Lavar o sedimento com 250l de etanol a 70%. 8- Centrifugar a 4C durante 5 min. a 14,000 rpm. 9- Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e deitar fora. 10- Secar o pellet ao ar livre (aproximadamente 15 min.). 11- Guardar a 20C. As amostras esto agora prontas para serem analisadas no Sequenciador Automtico.

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TRANSCRIO/TRADUO IN VITRO
Trabalho Prtico 7 Anlise das reaes de sequenciao. - Expresso/inactivao da protena em Reticulcitos de coelho. Objectivos Pretende-se com este trabalho determinar a sequncia de nucletidos correcta do cDNA recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag. Pretendese depois utilizar este cDna recombinante num sistema de transcrio/traduo in vitro (sistema TNT da Promega) para testar a produo da protena e sua inactivao por Oligonucletidos de Morfolino especificos. Introduo Quando a regio codificante de um cDNA clonada num plasmdeo, adjacente a um promotor, a respectiva protena pode ser expressa in vitro por sistemas de transcrio e traduo. Estes sistemas so menos eficientes do que a expresso in vivo, obtendo-se muito menos protena. No entanto, a protena pode ser marcada por incorporao de aminocidos radioactivos, uma marcao que especfica e facilita a sua deteco. Nos sistemas de transcrio so utilizados promotores vricos, como os dos fagos T7, T3 e SP6, pois as RNA polimerases envolvidas actuam exclusiva e eficientemente nos respectivos promotores. O mRNA, codificado pelo cDNA, sintetizado numa reaco in vitro que contm o plasmdeo recombinante isolado e a correspondente RNA polimerase purificada. A transcrio na presena de nucletidos radioactivos permite a marcao do mRNA, com alta actividade especfica, e a sua utilizao como sonda em experincias de hibridao. Alternativamente, o mRNA pode ser traduzido in vitro para produzir a respectiva protena. Os sistemas de traduo utilizam extractos celulares, como lisados de reticulcitos de coelho, que contm grandes quantidades de todos os componentes necessrios sntese de protenas. A utilizao destes extractos celulares envolve um tratamento prvio para destruir o mRNA endgeno que eles possuem. Assim, quando um mRNA especfico adicionado aos extractos, como o obtido por transcrio de um plasmdeo recombinante, apenas produzida a protena desejada. Estas protenas marcadas podem ser usadas em diversos tipos de experincias, tais como estudos de processamento, interaces com outras protenas ou molculas, distribuio celular e muitas outras.

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OLIGONUCLETIDOS MORFOLINO Estes so compostos sintticos de bases ribonucleicas. Isto confere bastante estabilidade a estes pequenos oligos de RNA. Ver o WebSite http://www.gene-tools.com/. Desenhando um oligo, normalmente 19-25 mer, com a sequncia anti-sense do mRNA que queremos inibir, este oligo ao emparelhar com o mRNA (Figura 1) vai impedir a sua traduo a nivel dos ribossomas no havendo assim produo da respectiva protena (Figura 2). Este um metodo que comea a ser cada vez mais utilizado em estudos de actividae gentica pois permite inferir de um modo bastante acessivel, o resultado da falta de actividade de um determinado produto gentico.

Figura 1

Figura 2

Utilizando um Morfolino contra Cerl2 (ver Anexo4, regio a verde e sublinhada) podemos testar este efeito conjugado com o sistema de Trancrio/Traduo in vitro (Figura 3).

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Figura 3. Comparao de Sistema TNT de Lisados de Reticulcitos Integrado com o Sistema Rpido Integrado de Transcrio/Traduo. PREPARAO DE REAO TRANSCRIO/TRADUO 1- Preparar as seguintes 4 reaces
TUBO N

TNT Quick Master Mix (ul) 20.0 20.0 20.0 20.0

PCs2-Cerl2-Flag (ul) Morpholino (500.0ng/l) 2.0 0.0 2.0 2.0 Oligo 0.0 0.0 1.0 (CoMo) 1.0 (Cerl2Mo)

H2O (ul) 8.0 10.0 7.0 7.0

Total (ul) 50.0 50.0 50.0 50.0

1 2 3 4 2-

Incubar a reaco no banho a 30 C, durante pelo menos 60 min.

3- Parar a reaco de digesto juntando 5 l de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um dos tubos. 4- Guardar a 20C.
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TRANSCRIO/TRADUO IN VITRO
Trabalho Prtico 8 Anlise das protenas em geis de poliacrilamida. Objectivos Pretende-se com este trabalho determinar a eficincia do sistema de transcrio/traduo in vitro (sistema TNT da Promega) para testar a produo da protena recombinante e sua inactivao por Oligonucletidos de Morfolino especificos. Introduo As protenas celulares constituem uma vasta classe de biomolculas que desempenham na clula funes muito diversas. Para analisar simultaneamente um to grande e variado grupo de compostos, necessrio recorrer a tcnicas que utilizem uma propriedade comum a todos esses compostos, mas que simultaneamente evidenciem pequenas variaes no seu comportamento, de modo a que as vrias molculas sejam diferenciadas. As tcnicas de electroforese caem nesta categoria, e so largamente utilizadas pois baseiam-se no facto de todas as protenas apresentarem uma carga elctrica global quando colocadas num meio de pH diferente do seu ponto isoelctrico. Deste modo possivel provocar a migrao de protenas sugeitando-as a um campo electrico. Essa migrao variar de acordo com a protena, uma vez que influenciada pelo tamanho, carga, forma e composio qumica de cada molcula. Grosseiramente, pode-se considerar que a migrao electrofortica duma molcula apenas funo da sua densidade de carga, ou seja , da respectiva razo carga/massa. Assim as protenas separarse-o de acordo com o respectivo valor desta razo: quanto maior ela for, maior ser a velocidade de migrao da molcula. A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) um mtodo rpido e sensvel para analisar a composio de misturas proteicas complexas. A PAGE utiliza um suporte em que os monmeros de acrilamida, ao polimerizarem, formam longas cadeias, as quais se ligam entre si por crosslinking (ligaes cruzadas), atravs dos resduos de bisacrilamida, tambm nelas incorporados. O processo de polimerizao consiste numa reaco em cadeia de radicais livres, iniciada pelo persulfato de amnio (PSA) e pelo N,N,N,N-tetrametilinediamina (TEMED), os quais se encontram presentes na mistura de polimerizao. P PSA activa o TEMED, deixando-o com um electro desemparelhado. Este radical reage ento com uma molcula de acrilamida, transformando-a tambm num radical. Este, por sua vez, reage com um outro monmero de acrilamida (ou, ocasionalmente, com a bis-acrilamida), dando origem a novo radical, e assim sucessivamente at se formar um polmero com ligaes cruzadas (crosslinked). O
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numero de ligaes cruzadas (quantidade de crosslinking), controla o tamanho dos poros do gel, e consequentemente determina o intervalo de massa molecular das protenas que podem ser separadas nesse gel. Isto quer dizer consoante o numero de ligaes cruzadas assim se separam as protenas com baixa massa molecular ou com elevado massa molecular. O conteudo total de acrilamida de um gel pode variar entre 3 e 30%, correspondendo o valor da percentagem ao total das moleculas de acrilamida (i.e. acrilamida e bis-acrilamida, p/v). O gel em placa , na realidade, constituido por dois geis: o gel de separao, no qual as protenas so separadas, e o gel de concentrao (ou stacking gel), no qual se d a compresso da amostra antes desta entrar no gel de separao. Por isso se chama a este sistema um sistema descontnuo. Devido elevada resoluo obtida com os sistemas descontnuos, o sistema SDS-descontinuo (um sistema em que o detergente aninico dodecilsulfato de sdio adicionado a todas as solues), normalmente escolhido para a separao de elevada resoluo de misturas proteicas. Nesta tcnica as misturas so primeiramente desnaturadas por aquecimento, a cerca de 100C, durante 2-5min, na presena dum excesso de SDS e dum reagente tilico (b-mercaptoetanol, que desfaz a maior parte das ligaes persulfureto presentes nas molculas proteicas). O SDS liga-se fortemente s protenas desnaturando-as. Estudos realizados mostram que este detergente, quando presente em largo excesso, liga-se s protenas numa proporo constante de 1,4g de SDS para 1g de protena. Isto equivale aproximadamente a uma molcula de SDS para cada dois resduos de aminocidos na protena. Esta elevada taxa de ligao, e sendo as molculas de SDS carregadas negativamente, faz com que a carga intrnseca da protena se torne insignificante quando comparada com a carga total proveniente do SDS a ela ligado. Simultaneamente, como esta taxa de ligao constante, os diferentes complexos SDS-protena possuem densidades de carga essencialmente idnticas migrando , nos geis de poliacrilamida, em funo do respectivo valor de massa molecular. A separao de uma mistura de protenas no sistema SDS-PAGE pois um reflexo da diferena dos respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) protena(s) em questo pode ser estimada por comparao da respectiva mobilidade electrofortica (Rf), com a de protenas de massa molecular conhecida (padres). A simplicidade e rapidez desta tcnica, adicionadas ao facto de que apenas necessria uma pequena quantidade de amostra (alguns microgramas), tornam a electroforese em gel de poliacrilamida no mtodo mais utilizado para a anlise de misturas proteicas complexas. Uma vez que as protenas de prticamente todas as origens so fcilmente solubilizadas pelo SDS, a tcnica possui aplicao generalizada. As protenas separadas no gel de poliacrilamida podem ser fcilmente coradas com uma soluo contendo azul de Coomassie. Este composto permite visualizar quantidades de protena da ordem de 0,1 g. Apesar deste mtodo permitir detectar praticamente todos os constituintes da maior parte das amostras proteicas, surgem por vezes situaes em que necessria uma maior sensibilidade, a qual pode ser alcanada recorrendo-se ao mtodo de colorao com nitrato de prata.

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POOS PARA APLICAO DAS AMOSTRAS

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Preparao do gel de SDS-poliacrilamida 1. Limpe muito bem, com a mistura etanol-ter (2:1, v/v), todo o material de electroforese, onde vai formar os geis (placas de vidro e de alumina, espaadores e pentes). 2. Monte as diferentes sanduches, constituidas por duas placas (uma de vidro e outra de alumina), intercaladas com um par de espaadores. Coloque as molas que apertam o sistema. 3. Introduza o pente na sanduche at os dentes entrarem completamente e marque, na placa de vidro, um trao 0,5cm abaixo do nvel inferior do pente. 4. Prepare as solues, de resoluo e de concentrao, sem adicionar os agentes polimerizantes TEMED e PSA, de acordo com as quantidades indicadas nos quadros 1 e 2. (Ateno: a acrilamida neurotxica, portanto deve ser tomado o cuidado mximo na manipulao das solues deste composto. aconselhvel o uso de luvas. Uma vez polimerizada a acrilamida no txica.) 5. Transfira a soluo do gel resolvente para um goblet e adicione os agentes polimerizantes (TEMED e PSA). Agite. Coloque imediatamente a soluo, com auxlio de uma pipeta e evitando a formao de bolhas, entre as placas de vidro at marca traada prviamente. 6. Muito devagar, coloque com auxlio de uma seringa, um pouco de gua destilada sobre a superfcie da soluo do gel de resoluo. (A gua vai evitar que a superfcie de polimerizao fique irregular). 7. Deixe em repouso at a acrilamida polimerizar (vsivel pela formao de uma linha de interfase gel-gua (demora cerca de 10min)). 8. Uma vez polimerizado o gel, inverta a sanduiche, de modo a escorrer toda a gua que se encontra na superfcie do gel. 9. Transfira a soluo do gel de concentrao para um gobelet e adicione os agentes polimerizantes TEMED e PSA. Agite. Deite imediatamente na sanduiche at ao cimo (ou seja at comear a escorrer por fora). 10. Deixe em repouso at polimerizar (cerca de 15 min). (Aqui no necessrio adicionar gua para obter uma superfcie de polimerizao lisa). 11. Aps o gel ter polimerizado retire o pente (com cuidado para no destruir os poos).

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Preparao e aplicao das amostras no gel. 1. Adicione a cada amostra de protena um volume idntico de tampo de amostra. 2. Ferva 2min e coloque em gelo at a aplicao no gel. 3. Com a ajuda de uma pipeta automtica, aplique as amostras e padres no gel que foi j prviamente preparado. (No se esquea de anotar a ordem de aplicao das amostras e padres). 4. Coloque a soluo de electroforese (j diluda) nas tinas superior e inferior do aparelho de electroforese. 5. Coloque a tampa da camara de electroforese, fazendo a conexo dos electrodos. 6. Ligue os electrodos fonte de electroforese, tendo em ateno respectiva polaridade. (Por conveno, o vermelho o positivo e o preto o negativo). As protenas iro migrar para o polo positivo. 7. Coloque o boto que regula a voltagem no mximo, de forma a esta no ser limitante. 8. Regule o boto da intensidade de corrente para um valor correspondente a 20mA por gel. 9. Deixe que a migrao do azul de bromofenol atinja o fim do gel de resoluo. 10. Desligue a fonte de energia, desligue os electrodos, remova a tampa da cmara, despeje a soluo de electroforese, e remova a sanduiche retirando as respectivas molas. 11. Com o auxilio de um espaador (ou de qualquer outro objecto de plstico), separe as duas placas (a de vidro e a de alumina).

Colorir as protenas no gel 1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo soluo corante com azul de Coomassie. 2. Deixe a corar durante 15-20min. 3. Retire o gel para outra caixa contendo gua destilada. Escorra a gua e lave novamente com gua destilada. 4. Escorra a gua e adicine soluo descorante. Agite durante 5-10min. 5. Repita o ponto anterior at observar ntidamente as bandas correspondendo s vrias protenas. 6. Coloque o gel sobre um pedao de papel de filtro grosso (3MM), cubra com Larfilm e seque no secador de geis.

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Tris-HCl 1.5M pH8,8 SDS 10% (p/v) 1 Sol. Acri-Bis gua destilada

Quadro 1 Soluo do gel de resoluo 10ml 2,5ml 0.1ml 3.3ml 4.1ml

TEMED 6l PSA 10% (p/v) 20l 1 Soluo contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)

Tris-HCl 0.5M pH6,82, SDS 10% (p/v) 1 Sol. Acri-Bis gua destilada TEMED PSA 10% (p/v)
1

Quadro 2 Soluo do gel de concentrao 10ml 5ml 0,1ml 1,7ml 5,7ml 26l 40l

Soluo contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)

Solues Tampo do gel de resoluo: Tris 1.5M pH8.8, SDS 10% Tampo do gel de concentrao: Tris 0.5M pH6.8, SDS 10% Soluo de acrilamida/bis-acrilamida: acrilamida 30% p/v, bis acrilamida 0.8% p/v. Persulfato de amnio 10% Tampo de electroforese: Tris 0.25M pH 8.3, glicina 1.92M, SDS 1%. Tampo para as amostras: 2ml glicerol, 1ml b-mercaptoetanol, 5ml SDS 10%, 2.5ml tampo gel de concentrao, 2mg azul de bromofenol. Soluo corante: Coomassie Blue R-250 0.3%, cido actico 5%, metanol 25%. Soluo descorante: cido actico 7.5%, metanol 45%.

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IDENTIFICAO E CARACTERIZAO DE GENES

Objectivos: O obectivo deste trabalho a aquisio de experincia nas estratgias a seguir para o isolamento de um gene correspondente a uma protena de interesse industrial. A actividade de um investigador numa empresa de Biotecnologia simulada atravs de um programa de computador Gene Isolation and Characterization da Biotol. O investigador responsvel pela produo de uma protena nova com propriedades antimicrobianas, tendo disponveis laboratrios onde se podem efectuar um determinado nmero de tcnicas, e uma biblioteca. Ao longo do trabalho, vo ser tomadas, pelo investigador, decises relativas investigao e ao desenvolvimento do novo produto, atravs da identificao, caracterizao, e expresso do respectivo gene.

Execuo: A empresa pretende explorar as propriedades de uma planta que contm uma protena com propriedades anti-fngicas, comprovadas medicamente. O trabalho envolvido no desenvolvimento da produo da protena pela empresa encontra-se dividido em 3 partes: Fase 1: O investigador tem que identificar os tecidos da planta responsveis pela actividade anti-microbiana e determinar o tamanho da(s) protena(s) envolvida(s). Com base nisto, escolhe uma estratgia para clonar e isolar o respectivo gene. Fase 2: Tomada de decises respeitantes extraco de cidos nucleicos e construo de um banco de clones adequado. Estas tcnicas so aspectos fundamentais da aplicao da Biologia Molecular Biotecnologia. Fase 3: O investigador conduz a pesquisa do banco de clones e identificao do gene que codifica a protena. O gene caracterizado e introduzido num vector de expresso para produo da protena em larga escala.

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Calendarizao: Aula 9: Fase 1: Determinao da estratgia de clonagem 1.1 Anlise da actividade anti-microbiana 1.2 Abordagens para a clonagem do(s) gene(s) envolvido(s) Fase 2: Construo do banco de clones de DNA 2.1 Extraco de cidos nucleicos 2.2 Construo do banco de clones Aula 10: Fase 3: Identificao e caracterizao do gene 3.1 Transferncia do DNA para suporte slido 3.2 Isolamento, caracterizao e expresso do gene

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Fontes de informao/tcnicas e protocolos: Tecnologia DNA Recombinante; Protocolos Prticos, A. Cravador Bioqumica; Protocolos Prticos, A. Tavares Birnboim, HC & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523 Quiagen, QIAquick Gel Extraction Kit Protocols Applied Biosystems, BigDye Terminator v1.1 Protocols (http://ifr31.toulouse.inserm.fr/PFT/BM/Mediabm/bd1versusbd 3.pdf) Gene Tools, Morpholino oligonucleotides (http://www.genetools.com/) Promega, TNT Quick Protocols (http://www.promega.com/tbs/tm045/tm045.html)

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ANEXO 1

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ANEXO 2

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ANEXO 3

CONSTRUCT NAME: mCerl2-CDNA VECTOR: pBluescript II KS+ INSERT: EcoRI/XbaI 0.8 Kb fragment with mCerl2 cDNA ANTISENSE PROBE: Cut with EcoRI, transcribe with T7 RNA Pol. SENSE RNA: Cut with XbaI, transcribe with T3 RNA pol. DIAGRAM:

EcoRV HindIII ClaI SalI XhoI

EcoRI 0.00 ATG 0.14 BamHI 0.27 SmaI 0.48 T3 CDS Stop 0.70 XbaI 0.77 T7 NotI

mCer2/CDS in PBS 3.80 kb

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ANEXO 4
G GAC GCG CAC CTG L AAT CTC AAG AGC TTC F

TCA TGA GAC CAA

ACT GGG CCT GTG

CTC CCG GAG ATG M

AAG CAC CCC TTC F

CTG TCC ATT CGT R

CTT ACA TTA AGC S

CCA CAC AGA CAG Q

GGA TAG CAA TTC F

ACA ACA ACA ACC T

GTA GCA GAC ACG T

TAA GGG AAA CTG L

AAA CCC CGA CTG L

GCA ACT CTG GGT G

AGT GGG GCC TGG CTA CCC ACA GGC TCA GGG AGG CCT GGG GCC CCA S G A W L P T G S G R P G A P GCG ACC CCT GTT CAG TCC GGG ACT GCT ATC AAT CAG AGC TGG ACT A T P V Q S G T A I N Q S W T CTG GAT CCC CTG GTG CCC ATC TCT GCC CTG GGT AGC TGG GAG GCC L D P L V P I S A L G S W E A TTC CTG GGC CTG CAG AAC AAA CAG CAG GGG ACA GGT GAG CTG CAG F L G L Q N K Q Q G T G E L Q GGA GGA GGG CAG AGA GTA GCT GCT GGT GTG CCT TTG CCC TTG GCT G G G Q R V A A G V P L P L A CCT CAA GAA GTG CTT CAG GAG ACT TGT AAA GCT CTG TCC TTT GTT P Q E V L Q E T C K A L S F V CAG GTG ATC TCC AGG CCT GGT TGC ACA AGT GCC CGG GTC CTT AAT Q V I S R P G C T S A R V L N CAT CTC TGT TTT GGC CGC TGT TCC TCC TTC TAC ATT CCC AGC TCA H L C F G R C S S F Y I P S S GAT CCC ACC CCT GTA GTC TTC TGC AAC AGC TGT GTG CCG GCT CGA D P T P V V F C N S C V P A R AAG CGC TGG ACA TCG GTG ACG CTG TGG TGT GGA GCT GGC CAA TTA K R W T S V T L W C G A G Q L GCC TCC CCT CGG CGG GTG AGG ATT TCC ACG GTA TTG GTC CAG AAG A S P R R V R I S T V L V Q K TGT CAG TGC CGC CCG AAG CTG TGA GCT GAG CAT CCT AGA GGA ATG C Q C R P K L * CGC AGG ACA TGA ATG AAC CTT GGC AAG AAG CAG GAG ACG CAA TAG ATC TAG A

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ANEXO 5 mCer2-flag GAATTCAACT GAGGGCCGCA GAGCCCATTT CCGTAGCCAG CCACAGGCTC ACTGCTATCA CCTGGGTAGC CAGGTGAGCT CCCTTGGCTC TGTTCAGGTG ATCTCTGTTT ACCCCTGTAG ATCGGTGACG TGAGGATTTC cDNA CTCAAGCTGC CTCCACACAC TAAGACAAAC TTCACCACGC AGGGAGGCCT ATCAGAGCTG TGGGAGGCCT GCAGGGAGGA CTCAAGAAGT ATCTCCAGGC TGGCCGCTGT TCTTCTGCAA CTGTGGTGTG CACGGTATTG

TTCCAGGAAC TAGACAGCAG AGACAAACGA TGCTGGGTCT GGGGCCCCAG GACTCTGGAT TCCTGGGCCT GGGCAGAGAG GCTTCAGGAG CTGGTTGCAC TCCTCCTTCT CAGCTGTGTG GAGCTGGCCA GTCCAGAAGT CCAGAAGT

AGTATAAAAA GGCCCACTGC CTGCACAGCC GTTCAGTGGG CGACCCCTGT CCCCTGGTGC GCAGAACAAA TAGCTGCTGG ACTTGTAAAG AAGTGCCCGG ACATTCCCAG CCGGCTCGAA ATTAGCCTCC GTCAGTGCCG GTCAGTGCCG

GCAGACCTCT GAAGGACCCT AAGTGATGTT GCCTGGCTAC TCAGTCCGGG CCATCTCTGC CAGCAGGGGA TGTGCCTTTG CTCTGTCCTT GTCCTTAATC CTCAGATCCC AGCGCTGGAC CCTCGGCGGG CCCGAAGCTG CCCGAAGCTG

TGAGCTGAGC GGAGGAGGAG ATTACAAGGA TGACGACGAT AAGTGATCTA GACGG

mcer2-flag-prot MFRSQFTTLL GLFSGAWLPT SALGSWEAFL GLQNKQQGTG SFVQVISRPG CTSARVLNHL WTSVTLWCGA GQLASPRRVR

GSGRPGAPAT ELQGGGQRVA CFGRCSSFYI ISTVLVQKCQ

PVQSGTAINQ SWTLDPLVPI AGVPLPLAPQ EVLQETCKAL PSSDPTPVVF CNSCVPARKR CRPKLGGGDYKDDDDK

Information on Entire Sequence : Sequence Length : 196

Laboratrios de Engenharia Gentica 2005/06

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LABORATRIOS DE ENGENHARIA GENTICA

ANEXO 6 MCerl2-cDNA (in pBluescript KS+) GAATTCAACT GAGGGCCGCA GAGCCCATTT CCGTAGCCAG CCACAGGCTC ACTGCTATCA CCTGGGTAGC CAGGTGAGCT CCCTTGGCTC TGTTCAGGTG ATCTCTGTTT ACCCCTGTAG ATCGGTGACG TGAGGATTTC TGAGCTGAGC GAAGCAGGAG CTCAAGCTGC CTCCACACAC TAAGACAAAC TTCACCACGC AGGGAGGCCT ATCAGAGCTG TGGGAGGCCT GCAGGGAGGA CTCAAGAAGT ATCTCCAGGC TGGCCGCTGT TCTTCTGCAA CTGTGGTGTG CACGGTATTG ATCCTAGAGG ACGCAATAGA TTCCAGGAAC TAGACAGCAG AGACAAACGA TGCTGGGTCT GGGGCCCCAG GACTCTGGAT TCCTGGGCCT GGGCAGAGAG GCTTCAGGAG CTGGTTGCAC TCCTCCTTCT CAGCTGTGTG GAGCTGGCCA GTCCAGAAGT AATGCGCAGG GCTCTAGATC AGTATAAAAA GGCCCACTGC CTGCACAGCC GTTCAGTGGG CGACCCCTGT CCCCTGGTGC GCAGAACAAA TAGCTGCTGG ACTTGTAAAG AAGTGCCCGG ACATTCCCAG CCGGCTCGAA ATTAGCCTCC GTCAGTGCCG ACATGAATGA TAGA GCAGACCTCT GAAGGACCCT AAGTGATGTT GCCTGGCTAC TCAGTCCGGG CCATCTCTGC CAGCAGGGGA TGTGCCTTTG CTCTGTCCTT GTCCTTAATC CTCAGATCCC AGCGCTGGAC CCTCGGCGGG CCCGAAGCTG ACCTTGGCAA

Laboratrios de Engenharia Gentica 2005/06

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