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SERVIO PBLICO FEDERAL MINISTRIO DA EDUCAO INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA DO SERTO PERNAM BUCANO CAM PUS

PETROLINA

IDENTIFICAO DO RISCO DE CONTAMINAO MICROBIOLGICA EM VINHOS PRODUZIDOS NO VALE DO SO FRANCISCO AUTOR: EUDBERG ALVES DE OLIVEIRA

MONOGRAFIA DE CONCLUSO DO CURSO DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS DE ORIGEM VEGETAL ORIENTADOR: D.SC GIULIANO ELIAS PEREIRA CO-ORIENTADOR: D.SC CARLOS ALBERTO TUO GAVA

PETROLINA, 15 DE JULHO DE 2011.

EUDBERG ALVES DE OLIVEIRA

IDENTIFICAO DO RISCO DE CONTAMINAO MICROBIOLGICA EM VINHOS ELABORADOS NO VALE DO SO FRANCISCO

Trabalho de concluso de curso apresentado como parte das atividades para obteno do ttulo de Tecnlogo, do curso de Tecnologia em Alimentos de Origem Vegetal do IF SERTO-PE.

Orientador: D.sc Giuliano Elias Pereira Co-orientador: D.sc Carlos Alberto Tuo Gava

Petrolina, 2011

Autoria: Eudberg Alves de Oliveira

Ttulo: IDENTIFICAO DO RISCO DE CONTAMINAO MICROBIOLGICA EM VINHOS ELABORADOS NO VALE DO SO FRANCISCO.

Trabalho de concluso de curso apresentado como parte das atividades para obteno do ttulo de Tecnlogo, do curso de Tecnologia em alimentos de origem vegetal do IF SERTO-PE

Os componentes da banca de avaliao, abaixo listados, consideram este trabalho aprovado.


Nome Titulao Assinatura Instituio Embrapa Uva e Vinho/ Semirido Embrapa Semirido IF-SERTO PE

Giuliano Elias Pereira

Doutor

Carlos Alberto Tuo Gava

Doutor

Data da aprovao: ____ de _____________________ de ________.

DEDICATRIA Porque este Melquisedeque, rei de Salm, sacerdote do Deus Altssimo, que saiu ao encontro de Abrao quando este regressava da matana dos reis, e o abenoou a quem tambm Abrao separou o dzimo de tudo (sendo primeiramente, por interpretao do seu nome, rei de justia, e depois tambm rei de Salm, que rei de paz; sem pai, sem me, sem genealogia, no tendo princpio de dias nem fim de vida, mas feito semelhante ao Filho de Deus), permanece sacerdote para sempre. Considerai, pois, quo grande era este, a quem at o patriarca Abrao deu o dzimo dentre os melhores despojos.

Dedico esse trabalho quele que sacerdote segundo a ordem de Melquisedeque

Agradecimentos
No tem sido uma trajetria fcil. Tive de percorrer alguns atalhos, antes de chegar aestrada principal. Tendo conseguido alcanala, percebo que ela no est completamente acabada. Devo continuar a constru-la passoa passo. Cada etapa vencida, coloca a minha frente um novo desafio. Evocando as dificuldades e frustraes surgidas nesses atalhos, constato com sentimento de muita satisfao e orgulho, que consegui transform-las em momentos criativos de minha vida. Gosto de ser posto a prova. Sinto prazer em buscar novas metas, para alm dos empecilhos. Se acredito no que quero, luto por alcan-lo. Estou batendo palmas. Uma vez que os livros no tem auto falantes, voc no pode me ouvir. Mas creia, estou oferecendo uma salva de palmas a meus pais. Vocs so responsveis pelo que sou hoje. todos os professores do IF SERTO PE, ao Laboratrio de enologia, ao Dr Giuliano, pela pacincia e disposio em ajudar sempre, ao Dr Carlos Gava por gentilmente ceder a estrutura do Laboratrio de Controle Biolgico para a realizao das anlises e dividir um pouco de seus conhecimentos preciosos em microbiologia, e as orientaes sempre pertinentes sobre carreira profissional, ao Laboratrio de Controle Biolgico, especialmente Herbeth por colaborar sempre, sem reservas; Carliana, Glaucia e Emison, que algumas vezes lavaram e autoclavaram placas, involuntariamente esquecidas por por mim na pia. E finalmente, obrigado tambm s vincolas Miolo, Vinibrasil e Ducos que abriram as portas para que as amostras fossem coletadas. Sem essa ajuda preciosa, esse trabalho no teria sido realizado. Se as sugestes feitas por esse trabalho vier a melhorar a qualidade dos vinhos do Vale do So Francisco, ambos os esforos tero valido a pena.

Vino aluntur vires, sanguis calorque hominum. (Com o vinho se alimentam as foras, o sangue e o calor dos homens.)
Plnio Antigo, Naturalis Historia 23.22

RESUMO

Orientador: D. SC Giuliano Elias Pereira Autor: Eudberg Alves de Oliveira

A contaminao microbiolgica em vinhos, tem se mostrado um fator de risco potencial para a qualidade final do produto. O vinho est sujeito a contaminao desde o momento da colheita das uvas at o momento do engarrafamento. Fungos toxignicos, bactrias lcticas, acticas e leveduras contaminantes, fazem parte da flora microbiana, naturalmente presente nas bagas e que podem entrar no processo de elaborao, caso as bagas estejam injuriadas, ou com baixo nvel de sanitizao, ou mesmo ausncia do uso de substncias enolgicas antioxidantes. Os compostos sintetizados por esses microrganismos so capazes de alterar a qualidade sensorial do vinho. A produo de etilfenis, por parte de leveduras do gnero Brettanomyces/Dekkerea e bactrias lcticas do gnero Lactobacillus brevis, que sintetizam esse composto a partir dos cidos p-cumrico e ferlico presentes no mosto, podem conferir ao vinho aromas desagradveis como couro e animal. Fungos ocratoxignicos Aspergillus e Penicillium podem produzir Ocratoxina A, um composto cancergeno. Nesse estudo foram efetuadas anlises microbiolgicas em uvas e equipamentos envolvidos no processo de produo de uvas e de elaborao de vinhos, com o propsito de identificar em qual momento a presena de microrganisamos poderia causar danos ao vinho. A coleta foi feita em trs vincolas da regio do Vale do Submdio So Francisco, onde so elaborados vinhos finos. A anlise dos resultados apontou a presena de bactrias, leveduras e fungos. Dentre estes, foram encontrados nas bagas das uvas os gneros Aspergillus e Penicillium, mostrando que necessrio, ao longo do processo, o acompanhamento e prticas que evitem a contaminao da matria-prima e dos produtos elaborados. Sugere-se, neste caso, a adoo e possivelmente a implantao das boas prticas agrcolas BPA, Boas prticas enolgicas BPE, bem como sanitizao, anlises

microbiolgicas peridicas, registros de elaborao e a identificao, ao longo do processo, dos pontos crticos de controle tanto microbiolgico quanto fsicoqumicos, com a finalidade do aumento da qualidade.

rsum La contamination microbiologique des vins, a montr tre un facteur de risque potentiel pour la qualit du produit final. Le vin est soumis une contamination partir du moment de la rcolte des raisins jusqu' l'embouteillage. Des champignons toxignes, des bactries lactiques, actiques et des levures contaminantes font partie de la flore microbienne, naturellement prsentes la surface externe des baies et peut entrer dans le processus de dveloppement, si les baies sont blesss, ou de bas niveau de l'assainissement ou d labsence de substances antioxidantes. Les composs synthtiss par ces micro-organismes sont capables d'altrer la qualit sensorielle du vin. La production de phnols volatils par les levures Brettanomyces / Dekkerea et les bactries lactiques du genre Lactobacillus brevis, qui synthtisent ce compos partir prsents p-coumarique et frulique dans le vin, peut donner des armes dsagrables comme "cuir" et " des animaux ". Des moisissures ocratoxignes Aspergillus et Penicillium peuvent produire lOcratoxine A, un compos cancerigne. Dans cette tude, les tests microbiologiques ont t effectues sur les raisins et les quipements impliqus dans le processus de production de rasins et la vinification, dans le but didentifier dans quel moment la prsence de microorganismes pourrait causer des problmes aux vins. Les donnes ont t recueillies en trois proprits dans la Valle du So Francisco. Les rsultats indiquent la prsence de bactries, de levures et de champignons, et parmi ces champignons isols ont t trouvs des Aspergillus et Penicillium, montrant qu'il est ncessaire, tout au long du processus, laccompagnement et des pratiques pour viter la contamination de la matire-prmire et des produits labors. Comme suggestion, dans ces cas, il faut adopter les bonnes pratiques agricoles BPA et les bonnes pratiques oenologiques BP, ainsi que laseptisation, des tests microbiologiques rguliers, l'enregistrement, la prparation et l'identification, dans le processus de matrise des points critiques microbiologiques et physico-chimiques dans le but davoir une qualit croissante

1.

INTRODUO

O vinho, desde a sua elaborao e principalmente durante a conservao est sujeito a alteraes microbianas que podem afetar a qualidade final do produto. Essas alteraes dividem-se em duas categorias. As aerbias, quelas que acontecem na superfcie do mosto, exposto ao ar e as anaerbias, que acontecem no interior do mosto. As contaminaes microbianas do vinho no apresentam risco significativo a segurana alimentar do produto, entretanto afetam as caractersticas organolpticas do mesmo. Partindo disto, a obteno de vinho de boa qualidade, alm de mtodos enolgicos especficos, deve-se utilizar matria-prima com bom estado sanitario e ao longo do processo de elaborao empregar mtodos de sanitizao eficientes para minimizar ao mximo o risco de contaminao por microrganismos que acompanham a matria-prima. O primeiro veculo de contaminao microbiano durante o processo de vinificao so as uvas. Elas trazem consigo diversos gneros e espcies tanto de fungos e leveduras quanto de bactrias. Devido ao alto teor de acar, baixo pH, condies anaerbicas, e altas concentraes de etanol no final da fermentao, somente poucas bactrias e bolores conseguem sobreviver. Entre essas espcies que so capazes de sobreviver at o final do processo, esto as leveduras do gnero Dekkera/Brettanomyces, que embora possuam um comportamento no competitivo durante o processo de fermentao, passam a atuar lenta e progressivamente aps a vinificao, causando srios problemas ao vinho ( SILVA, 2003). Um dos problemas causados por tais leveduras, est associado a formao de elevadas concentraes de etilfenis que conferem aromas desagradveis como animal e band-aid. Se a atividade metablica desses microrganismos, assim como o de bactrias acticas, que produzem cido actico, no forem controladas antes, durante e depois da fermentao, eles podem afetar negativamente as propriedades sensoriais do vinho, devido a alteraes na composio qumica do mesmo. O perigo deste microrganismo para o vinho tinto reside no fato de ele se fazer presente mais freqentemente quando o vinho est pronto, ou seja, quando as fermentaes alcolicas e malolticas j foram efetuadas (SILVA, 2003a). Essas leveduras so

raramente encontradas durante a fermentao alcolica do mosto (QUEROL et al., 1990). O mosto em fermentao um ecossistema microbiano complexo, onde vrias linhagens de leveduras crescem e morrem de acordo com sua capacidade de adaptao ao meio. As bactrias acticas, outra fonte de contaminao dos vinhos so parte integrante da flora microbiana das uvas. As populaes variam muito de acordo com a sanidade da uva. Em uvas saudveis, o nvel de bactrias acticas baixa, cerca de 10UFC / ml, e quase inteiramente composta de Glucanobacter oxydans. Em uvas com problema de sanidade, entretanto, a quantidade muito maior: as populaes podem alcanar nveis acima de 10 5 a 106 UFC/g e so mistas, compreendendo propores variveis de Glucanobacter e Acetobacter (LAFONLAFOURCADE e JOYEUX, 1981). Esta microflora bacteriana modifica a composio de acares e cidos, e por vezes, o metabolismo orgnico. Acetobacter parcialmente degrada cidos ctrico e mlico (JOYEUX et al., 1984). A principal caracterstica fisiolgica de bactrias acticas a necessidade de oxignio para se multiplicar. No vinho, Acetobacter aceti e A. pasteurianus obtem energia a partir da oxidao do etanol. A presena de cido actico indica sua atividade. Vinhos em estabilizao contem cerca de 0,3-0,5 g de acidez voltil (H2SO4) por litro, resultantes do metabolismo de leveduras e bactrias lticas. Concentraes acima indicam a formao de cido actico na maioria das vezes por esse tipo de bactria e esse problema chamado de deteriorao actica. A deteriorao actica acompanhada por um aumento nos nveis de acetato de etila. O limiar de percepo deste ster de cerca de 160-180 mg/l. Leveduras tambm podem formar esses compostos entretanto, em concentraes de at 50 mg/l. Uma temperatura excessiva durante o armazenamento do vinho acelera essa deteriorao. As bactrias acticas multiplicam-se facilmente em aerobiose, ou seja, quando o mosto fica excessivamente em contato com o ar, mas este no o caso durante a fermentao. To logo comea a fermentao alcolica, o meio fica pobre em oxignio e o potencial de oxidao-reduo cai, voltando a crescer durante as trasfegas e durante o engarrafamento quando o oxignio no suprimido. Durante o envelhecimento em barris ou tanques, o vinho, quando no protegidos do oxignio, podem ser contaminados por bactrias acticas e leveduras oxidativas ainda viveis

no mosto. Para evitar esse problema, os recipientes (tanques ou barris) deve ser preenchidos o mais completamente possvel. Um gs inerte pode tambm ser usado para substituir a atmosfera presente no topo dos tanques. Outra classe de microrganismo capaz de crescer em processos de elaborao de vinhos so os fungos. Aspergillus e Penicillium utilizam a glicose atravs da via Embden-Meyerhof-Parnas. Como apontado por Torriani et al., (2011), miclios de B. cinerea tambm podem oxidar a glicose pela via Entner-Doudoroff . O Gliceraldedo-3-fosfato formado a partir desta reao e pode ser oxidada a piruvato por enzimas na via Embden-Meyerhof-Parnas. Como os fungos so aerbios estritos, o cido tricarboxlico ou o ciclo de Krebs, ativa NADH sendo reoxidada a NAD+ atravs da fosforilao oxidativa. Apesar de vrios cidos orgnicos serem sintetizados atravs do ciclo de Krebs, como o ctrico, itacnico e mlico, Aspergillus tambm pode produzir quantidades significativas de cido glucnico a partir da oxidao da glicose pela enzima glicosidase (CHANG et al., 2000). Em ambiente pobres em oxignio, o glicerol acumula devido atividade de desidrogenase de glicerol, uma enzima que permite a regenerao de NAD+. Uma grande preocupao com o crescimento de fungos em uvas a produo de micotoxinas como a ocratoxina A e patulina (SCOTT et al, 1977; BATTILANI e PIETRI, 2002; CABANES et al, 2002; DELAGE et al, 2003). A Patulina causa problemas gastrointestinais e erupes na pele, e ocratoxina A uma nefrotoxina potente e cancergena. Os fungos conhecidos por produzir micotoxinas em uvas, entre outros incluem-se, os do gnero Aspergillus e Penicillium. Recentemente, Rosa et al. (2002) isolaram 101 cepas de A. niger, dos quais 24 poderiam produzir ocratoxina A. Da mesma forma, Moeller et al. (1997) e Abrunhosa et al. (2001) descobriram que Penicillium spp. podem produzir uma ou mais micotoxinas (isofumigaclavine A, B isofumigaclavine, festuclavine, patulina, roquefortine C, e as toxinas PR), quando inoculadas em mostos de uvas. Finalmente, Esteban et al. (2004) observou que cepas de Aspergillus podem produzir ocratoxina A em uma ampla faixa de temperaturas. A luz dessas informaes, este trabalho teve o propsito de determinar o risco de contaminao microbiolgica ao longo de todo o processo de elaborao de vinhos, atravs de anlises microbiolgicas em uvas e equipamentos envolvidos no processo. Como parte desse controle, este trabalho

tambm se pretende uma referncia para o controle de qualidade.

2.

REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 A vitivinicultura no semirido Pernambucano A presena da videira no nordeste do Brasil no recente. Desde o sculo 16, a videira j era cultivada no litoral dos estados da Bahia e Pernambuco, de onde avanou para o interior desses estados, at alcanar reas de clima mais seco localizadas no Vale do So Francisco (LEO; POSSDIO, 2000). Na dcada de 1950, surgem os primeiros empreendimentos pblicos e privados, que funcionaram como embries da vitivinicultura hoje praticada no Vale do So Francisco. A partir de 1960 ocorreram profundas transformaes na estrutura produtiva, o que favoreceu o processo de integrao a uma economia de mercado e agroindustrial (SILVA et al, 1998). O pioneirismo de alguns produtores que vieram de fora, a partir de ento, tambm contribuiu para a afirmao da fruticultura. Esses produtores foram capazes de perceber o potencial que a regio oferecia para a fruticultura irrigada. Deve-se reconhecer que tais empreendimentos pioneiros tiveram um efeito importante para o desenvolvimento da fruticultura na regio (SILVA , 2001). No submdio do vale do so francisco, a rea irrigada no ano de 2006 era de aproximadamente, 120 mil hectares. Destes, por volta de 12,2 mil hectares cultivados com videira. Em 2006, esta regio j respondia por mais de 10% da rea cultivada e por mais de 30% da produo de uva para consumo in natura no Brasil (AGRIANUAL,2007). A rea cultivada com uvas para vinho nesta regio, no ano de 2006, era da ordem 1000 hectares, dos quais 70% em fase de produo e 30% em fase de implantao. A regio j respondia por mais de 7 milhes de litros de vinhos finos e espumantes, correspondendo a cerca de 15% da produo nacional. Com uma boa adaptao das principais cultivares de uvas utilizadas na elaborao dos melhores vinhos das melhores regies vinferas do mundo, a regio vem especializando-se em vinhos finos varietais de uvas como: Cabernet Sauvignon, Syrah, Chenin Blanc, e Moscato Canelli (LEO et al.,2009). 2.2 Contaminao em vinhos

O processo de elaborao de vinhos envolve muitos riscos. Diversos fatores podem influenciar na obteno de um produto de baixa qualidade. Doenas, clima e

insetos podem causar problemas srios antes mesmo de a primeira uva ter sido colhida e esmagada. Depois do incio da fermentao, nem sempre fcil gerenciar a presena dos microrganismos desejveis dos indesejveis. Finalmente, durante o envelhecimento, o vinho pode tanto se transformar em um produto espetacular ou em uma bebida totalmente intragvel. A deteriorao dos vinhos podem se dar por reaes qumicas como a presena de metais ou atividades fsicas. Entretanto, a deteriorao do vinho mais comumente causada por microrganismos. Na verdade, fungos, bactrias e leveduras podem ser responsveis pela deteriorao em algum ponto durante o processo de elaborao do vinho. O crescimento, e a consequente deteriorao por fungos, raramente ocorre durante a fermentao do vinho, pois a maioria dos fungos so aerbios e sensveis ao etanol. mais provvel a sua presena antes e depois do processo.

2.2.1 Doenas da videira causadas por microrganismos e sua relao com a contaminao dos vinhos.

Nos ltimos anos tem-se verificado um aumento da incidncia de doenas nas uvas de origem microbiolgica, em especial, as podrides, cujos agentes so totalmente conhecidos, mas tambm existe outras podrides ainda mal compreendidas e controversas, como o caso da podrido cida. Embora sendo uma doena mais espordica que a podrido cinzenta, no uma doena nova, apesar dos conhecimentos sobre ela e a sua etiologia serem muito mais limitados (GRAVOT et al., 2001). Esta doena foi descrita pela primeira vez na Itlia. Trata-se de uma doena grave das uvas que ocorria frequentemente, no norte e na regio central de Itlia, durante os perodos de chuva prolongada (BISIACH et al., 1982). No entanto, tem assumindo uma prevalncia cada vez maior, em lugares onde h grande incidncia de chuvas prximas poca da colheita, originando grandes perdas (GOMES, 2004). Os ataques manifestam-se com intensidade varivel, a sua apario repentina, provavelmente, devido combinao favorvel de diversas condies fisiolgicas determinadas pelo clima e as prticas de cultura. Alm disso, as caractersticas da casta apresentam uma importncia considervel (GUERZONI & MARCHETII, 1987). Atravs de vrios estudos desenvolvidos verificou-se que a flora

dominante da podrido cida constituda essencialmente por leveduras e bactrias acticas (GUERZONI & MARCHETII, 1987 e BISIACH et al., 1982). As leveduras que mais frequentemente so isoladas de bagas afetadas por podrido cida pertencem s espcies Hanseniaspora uvarum, Torulopsis stellata, Metshnikowia pulcherrima, Candida krusei e Kloeckera apiculata (GUERZONI & MARCHETII, 1987 e BISIACH et al., 1986). Estes autores efetuaram um amplo estudo, durante alguns anos, dos microrganismos associados podrido cida e isolaram vrias espcies de leveduras. Barata et al. (2004) demonstraram que a utilizao de uvas com podrido cida contribuiu para o aumento da biodiversidade de leveduras e potencia o desenvolvimento de leveduras contaminantes, como Zygosaccharomyces

bisporus, Z. bailii e Pichia sp.. Este efeito tanto mais visvel quanto maior a percentagem de uvas afetadas, demonstrando a elevada capacidade de crescimento destas leveduras na presena de elevado stress ambiental, resultante da presena de cido actico e outros metabolitos produzidos durante o processo de apodrecimento das uvas afetadas por podrides. A presena de leveduras do gnero Zygosaccharomyces constitui um indicador de futuros problemas de alterao dos vinhos e permite considerar as uvas podres como um dos principais veculos de contaminao de vinhos (BARATA et al., 2004). 2.2.2 Problemas decorrentes da contaminao por fungos

A contaminao por fungos nas uvas um dos mais srios problemas na vitivincultura. Se no for controlado, podrido, mofo e doenas causadas por fungos podem causar a perda de um parreiral inteiro. Alguns fungos, como Penicillium (figura 1), e Aspergillus (figura 2) podem se proliferar em bagas recm-colhidas durante o transporte para a cantina. Aps a fermentao, a contaminao por fungos pode ocorrer devido a rolhas contaminadas. Esse um dos mais graves problemas no vinho engarrafado e que tem atraido a ateno de produtores, pesquisadores e consumidores. O crescimento desses fungos em rolhas raramente evidente, e quando em contato com o vinho contamina o mesmo com os metablitos desses fungos como as aflatoxinas e ocratoxinas. As micotoxinas so metablitos secundrios txicos produzidos por

fungos filamentosos que ocorrem naturalmente como contaminantes de produtos agrcolas e demonstram propriedades txicas em animais quando administradas por via natural, essencialmente por via oral (ABRAMSON, 1998).

Figura 6 - estrutura da ocratoxina A

Na Europa, depois dos cereais, o vinho a maior fonte de OTA ingerida pela populao (MIRAGLIA & BRERA, 2002). A OTA uma isocumarina ligada a uma molcula de fenilalanina que possui diversas propriedades txicas, notavelmente nefrotxicas (JECFA, 2001). Esta micotoxina foi associada nefropatia endmica dos Balcs, doena caracterizada por progressiva reduo das funes renais em humanos. Em estudos com animais, a OTA (figura 6), tem demonstrado efeitos carcinognicos (BROWN et al., 2007), mutagnicos (PALMA et al., 2007), teratognicos (BALASAHEB et al., 2007), imunossupressores (ROSSIELLO et al., 2008), genotxicos e neurotxicos (SAVA et al., 2006). Em virtude da evidente carcinogenicidade em animais, a OTA foi classificada pela Agncia Internacional de Pesquisa sobre o Cncer (IARC) no grupo 2B, ou seja, como possivelmente carcinognica para humanos (IARC, 1993).A contaminao da uva por Aspergillus se d quando quando as bagas so injuriadas por insetos ou passaros durante o estgio de maturao das uvas, o que provoca o rompimento das bagas e consequentemente o fungo penetra na polpa. Perodos de chuva durante a colheita tambm podem causar o rompimento das bagas, o que favorece a colonizao da polpa por Aspergillus. A infeco por Aspergillus causa a chamada podrido preta (figura 7) na uva, que torna as bagas secas e com aspecto enrugado. Os danos na superfcie das bagas causados por insetos, aves e outros fungos tambm facilitam o desenvolvimento de fungos produtores de OTA (LEONG et al., 2006a).

Figura 7 - Cacho de uvas so e afetados pela podrido preta

2.2.3 A contaminao por leveduras e os danos causados ao vinho

As leveduras representam uma das principais causas de deteriorao nos vinhos engarrafados. No caso das leveduras, muito difcil dizer quais so as contaminantes das no contaminantes j que as mesmas esto presentes durante todo o processo de elaborao dos vinhos. Aps o crescimento e incio da fermentao de S. cerevisiae, as outras leveduras em geral so incapazes de competir e crescer. No entanto, se no houver um crescimento vigoroso de S. Cerevisiae, outras leveduras como Zygosaccharomyces bailii (figura 8), podem se desenvolver e produzir cidos actico e succnico.

Figura 8 - clulas de Zygosaccharomyces bailii vistas sob microscopia eletronica

O crescimento deste microrganismo especialmente um problema no vinho, devido

sua tolerncia presso osmtica e altas concentraes de etanol. O crescimento de leveduras em garrafas e barris de envelhecimento um problema particularmente grave de contaminao nos vinhos. Os principais causadores nessa etapa so leveduras dos gneros (DELIA et Brettanomyces/Dekkera al., 2006). Essas (figura leveduras 9) e so

Brettanomyces

bruxellensis

contaminantes comuns em cantinas e em barris de carvalho usados no envelhecimento. Leveduras desse gnero produzem no vinho etilfenis,

responsveis por conferir aromas desagradveis (CHATONNET et al., 1995; DIAS et al., 2003; EDLIN et al., 1995). H tambm outras leveduras contaminantes como espcies de Pichia, Candida e Hansenula, que podem crescer na superfcie do vinho durante a estabilizao responsvel por aspecto desagradvel. Em circunstncias normais, o crescimento de leveduras desse gnero levam oxidao do etanol e formao de cidos, steres, acetaldedos, e produtos finais indesejaveis. A maioria das leveduras detriorantes podem ser controladas ou reduzidas pela adio de SO 2, da manuteno de condies adequadas de anaerbiose, e boas prticas de sanitizao, ou em casos extremos, por filtrao estril. Entretanto algumas leveduras podem apresentar alta tolerncia ao SO2 (OLIVEIRA et al., 2011). A produo de fenis volteis varia com a cepa de Brettanomyces. Qumicamente, 4etil guaiacol e 4-etil fenol so originados a partir do cido ferlico e p-cumrico, respectivamente. A orgem dos fenis volteis envolve a ao sequencial de duas enzimas sobre os cidos hidroxicinmicos (ferlico e p-cumrico). Primeiro a enzima hidroxicinamato descarboxilase converte esse cido hidroxicinmico em vinilfenis os quais so ento reduzidos a derivados etil pela enzima vinilfenl redutase.

Figura 9 - Brettanomyces sp, vistas sob microscopia de contraste de fases

2.2.4 Acetificao por bactrias acticas

Por outro lado, Provavelmente a forma mais desastrosa de contaminao de vinhos a contaminao por bactrias. Dois grupos so muito importantes: As bactrias acticas e lcticas, ambas contm espcies capazes de tolerar baixo pH e as altas concentraes de etanol presentes no vinho. Essas bactrias so responsveis por produzir cidos que afetam a qualidade final dos vinhos. As bactrias acticas mais importantes no vinho so: Acetobacter, Gluconoacetobacter (figura 10) e Gluconobacter. O envelhecimento em barris de carvalho apontado como a principal fonte de contaminao em vinhos principalmente porque nos barris acontece microxigenao. Sob essas condioes as bactrias fermentam o etanol no vinho produzindo cido actico suficiente (0,7g/L), para dar ao vinho sabor e aroma pronunciado de vinagre. Outro grupo de bactrias associadas a

contaminao de vinhos so as cido-lcticas. As bactrias desse grupo so Granpositivas, em geral cocos e bastonetes de doze gneros diferentes. Entretanto apenas apenas quatro, Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus, esto envolvidos na deteriorao de vinhos. Devido a capacidade dessas bactrias metabolizar a sacarose, no de surpreender que sejam encontradas em uvas intactas, ainda que em baixa quantidade. Embora a maioria das bactrias no creso durante a

fermentao alcolica - com exceo das malolcticas - algumas cepas podem tolerar facilmente as altas concentraes de etanol do vinho vindo a se proliferar mais tarde durante a estabilizao. Altas temperaturas, pH elevado e baixas concentraes de SO2, favorecem o crescimento das bactrias cido-lacticas. O crescimento dessas bactrias no vinho resulta em condies diversas de deteriorao, como acidificao ou desacidificao. As bactrias lcticas podem ser homofermentativas, heterofermentativas ou em alguns casos, as duas capacidades. Quando bactrias homofermentativas crescem no vinho e fermentam a glicose, produzem cido actico. Esse cido faz com que o vinho se torne excessivamente cido.

Figura 10 - Glucanacetobacter sob microscopia (400X)

Varias bactrias lcticas, tem a capacidade de converter o cido mlico em cido lactico pela via malolctica. Em mostos com altas concentraes de cido mlico e pH baixo, realizam uma funo desejvel e at essencial para a reduo da acidz. Entretanto se a acidz j estiver baixa e o pH alto a fermentao malolctica resultar em um vinho ainda menos cido e consequentemente mais suscetvel a deteriorao, j que um dos obstculos ela a acidz. A manuteno da

qualidade do vinho ao longo do processo, envolve cuidados que devem se estender desde o campo at o produto acabado. Dessa forma, de suma importancia a adoo de prticas tais como os programas de qualidade baseados em sistemas de APPCC. Esse programa engloba no apenas o aspecto microbiolgico mas fsicos e

qumicos. A manuteno desse programa, alm de atender a demanda da segurana do alimento, aumenta a competitividade de toda a cadeia produtiva. Nesse programa devem ser aplicados a anlise dos perigos; a identificao dos PCCs e estabelecimento dos limites crticos.

3.

METODOLOGIA

No processo de elaborao dos vinhos, tanto para os tintos, quanto para os brancos, as uvas foram colhidas pela manh, para evitar os riscos de degradao devido s altas temperaturas, e levadas imediatamente para a vincola, onde iniciouse o processo de elaborao. As mesmas foram desengaadas, levemente prensadas e sulfitadas (5 g/100 L de dixido de enxodre, para evitar a degradao e a ao de enzimas oxidativas. Para os vinhos tintos, as uvas com casca, semente e mosto, foram levadas para cubas de inox, onde a fermentao alcolica ocorreu a 25C, por cerca de 7-10 dias. Para os brancos, as cascas foram separadas e no entraram em contato com o mosto. Em seguida, as uvas foram prensadas, separando-se o vinho das partes slidas. O vinho foi colocado em outra cuba, atestada, plena, para no haver riscos de oxidao, para a realizao da fermentao maloltica, a 18C, por cerca de 15-20 dias. Em seguida o vinho foi estabilizado, filtrado e mantido a 18C, at o momento do engarrafamento. As etapas do processo onde foram colhidas as amostras, durante o processo foram: uvas in natura durante a colheita e amostragens por swabs nos equipamentos durante a elaborao. Esses equipamentos, quando no higienizadas da forma correta antes e depois do processamento do vinho, podem ser responsveis por contaminaes cruzadas. Os equipamentos analisados foram: desengaadeira; prensa; tanques de fermentao e tanques de conservao. Ao final do processo foram analisadas tambm amostras de gua utilizadas na higienizao das garrafas. O transporte das amostras, tanto das uvas, quanto dos swabs, foram feitas em embalagens devidamente autoclavadas e estreis, e imediatamente analisadas no laboratrio de controle biolgico da EMBRAPA semirido.

3.1 Amostragem esfregao de superfcie A tcnica de esfregao de superfcie foi empregada na anlise dos equipamentos. Para isso foram preparados tubos com 10 ml de gua peptonada

0,1%. Os mesmos foram devidamente autoclavados a 121C por 30 minutos. Para delimitao da rea a ser amostrada foi utilizado um molde estril de 50 cm, para delimitar a rea a ser amostrada. Foi aplicada presso ao swab,descrevendo movimentos da esquerda para a direita e depois de baixo para cima. Aps a aplicao o swab foi transferido para o tubo. O mesmo procedimento foi repetido com o swab seco na mesma rea, recolhendo o mesmo no mesmo tubo diluente.

3.2

Materiais utilizados

Uvas in natura e equipamentos 0.


gar Batata Dextrose Antibitico (BDA Clorafenicol); gar Nutriente Cicloheximida; Placas de Petri de 20 X 100mm estreis vazias; Estufa incubadora regulada para cultura de bolores/leveduras e

bactrias totais;

Swabs para amostragem dos equipamentos; gua peptonada 0,1%; Tubos de ensaio; Pipetas de 0,1mL e 5 mL

3.3

Procedimentos utilizados para anlise das uvas in natura

As uvas in natura foram colocadas em um saco estril e pesadas em balana semi-analtica. O diluente (gua peptonada 0,1%) foi colocado na proporo de 1:1 (1ml por grama da amostra), a abertura foi fechada e a embalgem agitada durante 10 minutos. O lquido obtido foi utilizado no plaqueamento. Cosiderou-se que nesse procedimento, cada 1mL do lavado corresponde a 1g de amostra. Tanto para a anlise de fungos e leveduras, quanto para bactrias totais, as anlise foram feitas em 3 diluies e em triplicata. O tempo de incubao e temperatura para bolores e leveduras e bactrias totais foram 5 dias/30 C e 3 dias/27C, respectivamente.

3.4

Procedimento utilizado para anlise dos equipamentos por

esfregao de superfcie Os tubos foram preparados com 10 mL de gua peptonada 0,1% e autoclavados. Usando um molde estril de 50 cm, foram feitas as coletas, descrevendo movimentos da esquerda para a direita. Aps a aplicao o swab foi transferido para o tubo diluente. O processo foi repetido uma segunda vez com um swab seco o qual tambm foi transferido para o tubo diluente. O lquido de coleta foi utilizado para o plaqueamento. Considerou-se que por 50 cm de rea amostrada, cada mililitro corresponde a 5cm de superfcie. Foram selecionadas trs diluies da amostra em triplicata e inoculou-se (em superfcie) 0,1 ml de cada diluio em placas previamente preparadas e secadas, de Agar BDA Clorafenicol, para fungos e NA Cicloheximida para bactrias, espalhou-se o inoculo com ala de Drigalski, das placas de maior para as placas de menor diluio, at que todo o excesso de lquido fosse absorvido. As placas secaram por 15 minutos dentro da capela de fluxo laminar com a lmpada germicida desligada para evitar morte dos microrganismos, incubou-se a 22-25C por 5 dias para fungos e leveduras e 3 dias/27C, sem

inverter, em pilhas de no mais de trs placas, no escuro. Para a contagem e clculo dos resultados, selecionou-se as placas com 15 a 150 colnias e contou - se as colnias com o auxlio de uma lupa, em um contador de colnias. Na placa selecionada, contaram-se separadamente as colnias com aspecto filamentoso, cotonoso ou pulverulento, caractersticas de bolores, diferenciando das leveduras e anotando o resultado. Logo aps a morfologia das clulas foram verificadas ao microscpio para diferenciao entre bactrias e leveduras. Para isso foi feito uma montagem mida e colorao de Gram. Determinou-se o nmero de colnias de leveduras na placa, em funo da porcentagem confirmada. O clculo dos resultados foi feito multiplicando-se o nmero de colnias confirmadas por 10 e pelo inverso da diluio. O resultado foi expresso em UFC/mL.

3.5 PRY)

Deteco de leveduras resistentes aos conservantes (Meio de cultura

Meio de cultura 0. 100g de glicose; 5g de triptona; 5g de extrato de levedura; 15g de Agar; 1L de gua destilada; 5ml/L de cido actico glacial

3.6 Procedimento para anlise de bolores rresistentes aos conservantes

Inoculou-se trs alquotas de 1ml da amostra em trs tubos de 20ml de Caldo Triptona Glicose Extrato de Levedura 0,5% de acido actico. Incubaram-se os tubos a 30C por 72 horas. Aps esse tempo o meio slido foi preparado e esterilizado a 121C/10 min. ( Prolongamento da esterilizao pode causar reao de Maillard). No momento do uso, o gar foi fundido, resfriado a 45C e adicionado o cido actico a 0,5%, atravs de membrana. inocular 0,1ml da cada tubo em uma placa separada de Agar Triptona Glicose Extrato de Levedura 0,5% de cido Actico (em superfcie). Logo aps as placas foram incubadas a 30C por 48 horas e observado se houve crescimento de colnias.

3.6

Deteco de bctrias totais e bactrias produtoras de cido actico

Este meio, extrato de levedura glico-carbonato (GYCM), descrito por Swings (1992) detecta a presena de microorganismos que produzem cidos e considerado "meio padro de crescimento" para as bactrias produtoras de cido actico. 0.

50g de glicose; 10g de extrato de levedura; 30g de carbonato de clcio; 800 ml de gua destilada;

Aps a dissoluo dos ingredientes, diluiu-se para 1000 ml e adicionou-se 25g de gar previamente esterilizado a 121C por 15 minutos. O meio foi vertido nas placas imediatamente. O procedimento foi o mesmo descrito anteriormente para bactrias totais.

4.

RESULTADOS E DISCUSSO

Na amostragem por swabs os resultados foram expressos em UFC/cm de rea. Inicialmente, foi calculado o nmero de UFC por mL onde foram recolhidos os swabs. Para tanto foi considerada essa suspenso como uma amostra sem diluio, e em funo das diluies dessa suspenso, calculou-se os resultados. Em seguida o resultado foi convertido de UFC/mL da suspenso para UFC/cm da amostra. Para isso foi calculado a quantos cm corresponde cada mililitro da suspenso de gua peptonada. Os resultados esto dispostos na tabela a seguir, de acordo com a vincola em que as anlises foram realizadas.

As anlises realizadas mostraram que ao longo de todo o processo existe risco real de contaminao microbiolgica do vinho. Apesar de fato no apresentar risco microbiolgico a sade pblica, essas contaminaes afetam de forma significativa a

qualidade do produto. Este estudo apenas qualitativo, entretanto, partindo do pressuposto de que tanto quanto menos UFC's por cm existirem ao longo desse processo, ser possvel a minimizao desses riscos, foram identificados pontos, que podem ser considerados crticos para a qualidade. Dessa forma, extremamente importante, a manuteno de um programa de qualidade no ambiente de vinificao. Antes do desenvolvimento de um programa de qualidade de sucesso, uma srie de outros programas j deve estar implantados na cantina. Esses programas incluem boas prticas de fabricao (BPF), incluindo registros de produo; controle de pragas (aves, insetos e roedores; aplicaes de pesticidas; estratgias de manejo integrado de pragas); registro de processamento; protocolos de limpeza, cronogramas; treinamento de funcionrios, controle de qualidade da gua e dos registros de monitoramento, estratgias para lidar com as queixas dos consumidores, programas de rastreabilidade; controle de estoque e armazenamento de produtos, gesto da cadeia de suprimentos. Devido s difernas de mtodos de elaborao, instalaes, e equipes, os programas de qualidade para cada estabelecimento e tipo de vinho, so bem especficos. Entretanto, um programa simples e conciso de qualidade fornece a base para praticamente qualquer situao enfrentada durante a elaborao de vinhos. A seguir, de forma bem resumida, os passos gerais para a implantao de programas de qualidade em estabelecimentos vitivincolas.

Desenvolvimento de um fluxograma operacional ou diagrama de flow,

comeando com a matria-prima (uvas) at o engarrafamento do vinho e armazenamento das garrafas;

Realizar uma anlise de cada passo no processamento e identificar os

potenciais problemas que podem colocar em risco o programa em cada etapa;


Estabelecer limites crticos para cada ponto crtico de qualidade; Desenvolver procedimentos de acompanhamento e registro; Estabelecer aes corretivas quando o processo se desvia de um limite

crtico;

Estabelecer procedimentos de manuteno de registros e documentao; Desenvolver um plano de verificao para mostrar que o programa de

qualidade foi efetivamente implementado e monitorar fatores de qualidade

Importantes.

5.

CONSIDERAES FINAIS O mapeamento, como foi o propsito desse trabalho, a identificao dos

perigos e mensurao dos riscos, os controles preventivos e corretivos, os procedimentos de registro e verificao, conferem vincola, um melhor domnio do seu processo produtivo. A partir da possvel a praticada melhoria contnua, da rastreabilidade, da mudana cultural interna, da reduo de custos atravs da diminuio de perdas retrabalho, desperdcios e conseqente acrscimo de custos. A indstria vitivincola do semirido poder dessa forma competir mais efetivamente no mercado interno, fazer frente a concorrncia dos vinhos importados e se inserir no mercado internacional. A motivao para aplicao de programas de qualidade baseados no programa APPCC, deve transcender a questo do respeito a legislao. Deve ser uma ferramenta til de controle de qualidade.

6.

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