CDD: 543.

EXPERIMENTOS DE CROMATOGRAFIA EM COLUNA NO ENSINO DE GRADUAO COLUMN CHROMATOGRAPHY EXPERIMENTS IN A GRADUATION COURSE
Eliana Beleski Borba Carneiro1, Paulo Irajara Borba Carneiro2
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Universidade Estadual de Ponta Grossa - UEPG, Campus em Uvaranas, Departamento de Qumica, Ponta Grossa, Pr, Brasil Autor para contato: Universidade Estadual de Ponta Grossa - UEPG, Campus em Uvaranas, Departamento de Qumica, Ponta Grossa, Pr, Brasil; (42)220-3063; e-mail: pibc@uepg.br

Recebido para publicao em 26/01/2004 Aceito para publicao em 21/07/2004

RESUMO Este trabalho mostra experimentos de cromatografia em coluna de duas horas, separando mistura de corantes: fluorescena/rodamina B; azul de bromotimol/ rodamina B e fluorescena/azul de metileno. O experimento permite ilustrar conceitos de equilbrio cido-base e fluorescncia, bem como objetivos e fundamentos dos mtodos cromatogrficos. Experimentos de cromatografia em camada delgada foram efetuados para escolher os solventes de eluio. Os resultados mostraram que etanol foi o solvente adequado e foi utilizado nos experimentos de cromatografia em coluna. Essa metodologia pode ser adaptada para separar outras substncias. Palavras-chave: coluna cromatogrfica, corantes, experimentos didticos

ABSTRACT This work shows two-hour column chromatography experiments separating dye mixtures: fluorescein/rhodamine B, bromethymolblue/rhodamine B and fluoresceine/methyleneblue. It illustrates concepts of basic-acids and fluorescence equilibrium, as well as the objectives and the foundations of chromatographic methods. Thin layer chromatography experiments were performed in order to choose the elution solvents. The results showed that ethanol was the adequate solvent, and it was thus used in the column chromatography experiments. This methodology can be adapted to separate other substances. Key words: chromatographic column; didactic experiment; dyes

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1. Introduo O processo de separao dos componentes de uma amostra em cromatografia envolve a distribuio dos componentes entre duas fases, uma mvel e outra estacionria. Os fatores envolvidos no processo cromatogrfico - carga inica, foras intermoleculares, polaridade molecular, volume molecular, adsoro e solubilidade - atuam simultaneamente, provocando a separao dos constituintes da amostra (Furniss, 1989; Pavia, 1999, Skoog, 1998). A fase estacionria pode estar revestindo uma placa de vidro, como uma camada fina sobre a qual a fase mvel ascende por capilaridade (cromatografia em camada delgada), ou pode estar empacotada na forma de uma coluna, atravs da qual a fase mvel flui (cromatografia em coluna). A cromatografia em coluna utilizada quando se pretende separar grandes quantidades de substncias. A fase estacionria pode ser uma substncia lquida ou slida e a fase mvel, lquida ou gasosa. As diversas tcnicas cromatogrficas de uso geral so combinaes destas fases. Assim, na cromatografia de partio, a fase estacionria um filme lquido fino adsorvido na superfcie de um suporte inerte. A fase mvel pode ser um lquido (cromatografia de partio lquido-lquido) ou um gs (cromatografia de partio gs-lquido ou cromatografia gasosa GLC). A cromatografia em papel um exemplo de cromatografia de partio, na qual um papel de filtro utilizado como fase estacionria e suporte em fase lquida. Na cromatografia de adsoro, a fase mvel geralmente um lquido e a fase estacionria um adsorvente slido finamente dividido (cromatografia slido-lquida). Outros processos podem ser utilizados. A separao por cromatografia gs-slido tem aplicaes limitadas a misturas orgnicas. O uso de resinas trocadoras de ons como fase slida um exemplo de cromatografia slido-lquida, na qual as foras eletrostticas presentes reforam as foras fracas de adsoro (Pavia, 1999; Dekker, 1998; Bell, 2000; Lehman, 1998). Executar experimentos de cromatografia em laboratrio no perodo de 2 horas, durao normal das aulas de graduao, apresenta dificuldades. Nem sempre as sugestes da literatura podem ser adaptadas com sucesso, devido reduzida carga horria para as atividades experimentais, deficincias na infra-estrutura e dificuldades de dispor de materiais e reagentes adequados. Assim, necessrio adequar os experimentos que possam ser realizados, atendendo s exigncias da qualidade de ensino: experimentos simples que demonstrem conceitos importantes da qumica. Alm disto, que sejam de fcil execuo e boa reprodutibilidade. Os corantes apresentam extenso uso industrial. A indstria de alimentos, particularmente, os utiliza porque a cor influencia a aceitabilidade do produto. Muitos corantes so obtidos como misturas de extratos vegetais que necessitam ser separados, para posterior aplicao. A cromatografia em coluna um mtodo simples e eficiente para realizar esta separao. Na literatura, h exemplos de misturas de corantes separveis por cromatografia, como os componentes de extratos vegetais (Pavia, 1999) e misturas de corantes como a fluorescena e azul de metileno (Svoronos, 1996). Neste trabalho, desenvolvido com a participao de acadmicos, a cromatografia em coluna foi utilizada para a separao de misturas de corantes, processo didaticamente vantajoso, porque permite acompanhamento visual. So propostas separaes de diversas misturas, com boa resoluo. A separao da mistura dos corantes: azul de bromotimol e rodamina B indita nas condies apresentadas.

2. Material e mtodos Para a realizao dos experimentos em coluna foram utilizadas buretas de 25 mL (como alternativa s colunas de vidro) contendo um pequeno chumao de algodo para sustentar o recheio da coluna, uma suspenso contendo 3 g de slica gel (Merck, 70-230 mesh) para coluna em etanol. As fraes foram coletadas em tubos de ensaio. Os experimentos de cromatografia em camada delgada foram realizados em placas de vidro de 2,5 x 7,5 cm revestidas com suspenso de slica gel G em gua (1:2, m/m) (Furniss, 1989). Por razes didticas foram utilizadas solues alcolicas a 0,1 % (m/v) de corantes orgnicos de fcil visualizao durante a eluio com etanol: fluorescena

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(amarelo), rodamina B (rseo), azul de bromotimol (amarelo) e azul de metileno (azul). O procedimento simplificado, no havendo necessidade de se utilizar material sofisticado, o que facilita a aplicao didtica desta tcnica experimental. REAGENTES, SOLVENTES E SOLUES: Foram utilizados fluorescena, rodamina B, azul de bromotimol, azul de metileno, hexano, diclorometano, clorofrmio, ter etlico, acetato de etila, acetona, etanol (95%) e cido actico de grau analtico (PA), sem purificao prvia. TESTE DE SOLUBILIDADE: Os ensaios de solubilidade dos corantes em diversos solventes (0,100 g/ 3 mL) foram realizados em tubos de ensaio. A partir destes dados, foram realizados experimentos em camada delgada para prever o possvel comportamento dos corantes em coluna cromatogrfica. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA: Foram realizados experimentos para a escolha dos solventes de eluio. As placas de vidro (2,5 x 7,5 cm) previamente lavadas foram limpas com algodo umedecido em lcool, fixadas em suporte de alumnio e revestidas com uma camada de 250 m de slica gel G (Merck), usando-se um espalhador contendo a suspenso aquosa da slica (1:2, m/m). Foram ativadas em estufa durante 1 h a 110 C e mantidas secas em dessecador. A seguir foram aplicados 2 L das solues alcolicas dos corantes (0,1 % m/v), utilizando-se micropipetas. Os cromatogramas foram desenvolvidos em frascos de vidro de 100 mL (10,0 cm x 5,0 cm) tampados, contendo aproximadamente 20 mL de solvente (Furniss, 1989; Svoronos, 1996). As placas foram eludas em diversos solventes (Tabela 2). Foram selecionados os solventes que eluram a maioria dos corantes (Rf 0,50 - 0,80). Neste procedimento, dispensou-se a saturao dos frascos, devido s pequenas dimenses das placas utilizadas. PREPARAO DA COLUNA (Furniss, 1989; Bell, 2000; Lehman, 1998; Svoronos, 1996; Hart, 1995).
Introduzir o etanol na coluna (bureta) at cerca

misturar com um basto de vidro. Abrir um pouco a torneira da coluna deixando gotejar o solvente para dentro de um bquer, o qual percolado novamente atravs da coluna. Com a ajuda do basto de vidro, introduzir lentamente e de forma contnua a suspenso na coluna. Deixar gotejar o solvente durante 5 minutos aps o enchimento da coluna para facilitar a sedimentao da slica. O nvel do solvente deve ficar no mnimo 1 cm acima da fase estacionria durante essa etapa. Fechar a torneira deixando um volume suficiente de solvente para cobrir a parte superior da fase estacionria contida na coluna. Colocar papel de filtro com um dimetro inferior ao da coluna (bureta) sobre a fase estacionria, a fim de proteger a superfcie da mesma, utilizando basto de vidro, se necessrio. Colocar um pouco de algodo hidroflico para cobrir o papel de filtro (aproximadamente 1 cm de espessura). PREPARAO E APLICAO DA AMOSTRA: Preparar amostras contendo mistura de 2 corantes de colorao diferentes (1:1, v/v). Percolar o solvente at este ficar 2-3 mm acima do nvel do algodo. Medir 0,2 mL da soluo da amostra de corantes. Verter lentamente a mistura no topo da coluna. Gotejar o solvente na coluna at que a soluo da amostra desa ao nvel do algodo, colocado na parte inferior da coluna. ELUIO: Deixar gotejar lentamente o eluente, de um funil de decantao fixado sobre a coluna. Percolar aproximadamente 60 a 100 mL do eluente atravs da coluna, recolhendo aproximadamente 10 mL em tubos de ensaio previamente numerados, numa vazo de 3 mL/min. Prosseguir a eluio at a sada total dos analitos. Reunir os eludos correspondentes a cada corante separado no processo (colorao diferente). Remover o solvente em evaporador rotativo. NOTAS: 1. Por vezes torna-se difcil arrastar a suspenso para a coluna, caso isto ocorra, usar basto de

de 1/4 da altura total desta. Verificar o funcionamento da torneira. Pesar aproximadamente 3 g de slica gel para coluna em bquer de 100 mL. Adicionar uma quantidade suficiente de etanol para formar uma suspenso;

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vidro e juntar um pouco mais de solvente para auxiliar na transferncia. 2. Quando se interrompe a adio da suspenso coluna por algum tempo a slica tende a sedimentar e formam-se zonas estratificadas. Uma maneira de evitar esta situao agitar o solvente na coluna com o basto entre duas adies da suspenso. 3. Nunca deixar a superfcie da coluna sem eluente porque esta se deteriora em contacto com o ar. 4. O controle das fraes eludas por cromatografia em camada delgada dispensvel, pois os corantes separados exibem coloraes diferentes. 5. Os valores de Rf so calculados da razo da/ ds, onde da distncia percorrida pela substncia e ds distncia percorrida pelo solvente (do ponto de aplicao at a frente do solvente).

3. Resultados e discusso Os testes de solubilidade (Tabela 1) indicaram etanol e gua como solventes adequados para solubilizar as amostras dos corantes. Assim, foram usadas solues alcolicas nos experimentos de cromatografia em camada delgada.

Tabela 1 - Dados da solubilidade dos analitos nos solventes avaliados*.

Solventes Compostos utilizados Fluorescena Rodamina B Azul de bromo-timol Azul de metileno

* (+) = solvel; (-) = insolvel.

Diclorometano + + -

Clorofrmio + + -

Eter etlico + + -

Acetato de etila + + + -

Acetona + + + -

Etanol + + + +

gua + + + +

Na Tabela 2 so apresentados os dados da eluio dos analitos em diversos solventes. A srie eluotrpica utilizada na cromatografia em camada delgada foi: hexano, ter etlico, acetato

de etila, acetona, etanol e cido actico glacial. A anlise dos dados mostra que o etanol foi o melhor eluente, sendo escolhido para utilizao na cromatografia em coluna.

Tabela 2 - Dados da eluio dos analitos por cromatografia em camada delgada empregando diversos solventes

Solventes (Rf) Compostos utilizados Fluorescena Rodamina B Azul de bromotimol Azul de metileno Hexano 0,0 0,0 0,0 0,0 ter etlico 0,0 0,0 0,0 0,0 Acetato de etila 0,7 0,0 0,2 0,0 Acetona 0,7 0,2 0,9 0,0 Etanol 0,7 0,4 0,9 0,1 cido actico 1,0 1,0 1,0 0,1

Rf = da/ds; razo da distncia percorrida pela substncia e o solvente.

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A Tabela 3 apresenta os resultados de 3 experimentos de cromatografia em coluna que podem ser realizados num perodo de 2 horas. Nestes experimentos, cada mistura de 2 corantes foi eluda em etanol, coletando-se fraes de 10 mL em tubos de ensaio. O primeiro componente, geralmente contido nas 3 primeiras fraes, foi isolado juntando-se estas fraes e removendo-se o solvente no evaporador rotativo. O 2 componente foi eludo a partir da 5 frao e isolado da mesma maneira. O nmero total de fraes variou de 6 a 10, conforme o experimento. A 4 frao, geralmente contendo traos dos 2 corantes, foi reservada para nova tentativa de separao.
Tabela 3 - Cromatografia em coluna dos analitos em estudo. Amostras Fluorescena/rodamina B Azul de bromotimol/rodamina Ba Fluorescena/azul de metilenob
a=
a

Eluente: etanol +/+ +/+ +/-

O 2 componente, rodamina B (rseo), elui em aproximadamente 60 min. b = O 2 componente, azul de metileno (azul), no elui em etanol, exigindo fase eluente mais polar. (+) = componente eludo.

Na mistura fluorescena/rodamina B, observase primeiramente a eluio da fluorescena de cor amarelada, seguindo-se a rodamina B, de colorao rsea, quando eludas em etanol. Na mistura azul de bromotimol/rodamina B, observa-se primeiramente a eluio do azul de bromotimol de cor amarelada, seguindo-se a rodamina B, de colorao rsea. Todos estes analitos foram obtidos com boa resoluo em etanol. Na mistura fluorescena/azul de metileno, observa-se primeiramente a eluio da fluorescena, de cor amarelada, porm, o segundo componente, o azul de metileno, no elui em etanol, necessitando de um sistema eluente mais polar. Foram utilizados dois sistema para eluio do azul de metileno: a mistura gua/etanol (1:1 v/v) onde o composto eluiu em aproximadamente 60 min. e a mistura etanol/gua/acetona/cido actico

(1:1:1:1 v/v), onde o composto eluiu rapidamente, em aproximadamente 20 min. A anlise das estruturas dos corantes utilizados (Figura 1) mostra um composto polar, o azul de bromotimol [3] e 3 sais: o sal dissdico da fluorescena [1], com concentrao de cargas negativas no radical orgnico; e os cloretos da rodamina B [2] e do azul de metileno [4], ambos, com concentrao de cargas positivas no radical orgnico. O constituinte polar SiO2.xH2O, presente na fase estacionria, mais efetivo na adsoro de ons positivos e molculas polares, sendo pouco efetivo na adsoro de ons negativos. Assim, adsorve melhor o azul de metileno [4] e rodamina B [2], sendo pouco eficiente na adsoro da fluorescena [1] e azul de bromotimol [3], que so eludos rpdamente em etanol (aproximadamente 10 min). Os compostos policclicos com anis coplanares, mostram adsoro mais efetiva na fase estacionria. Assim, o composto azul de metileno [4], com os 3 anis coplanares, foi o mais adsorvido, no sendo eludo em etanol. Esta dificuldade foi contornada alterando-se a polaridade do sistema solvente: em etanol/gua (1:1 v/ v) o azul de metileno [4] foi eludo lentamente (aproximadamente 60 min.) e rapidamente em etanol/gua/ acetona/cido actico (1:1:1:1 v/v, aproximadamente 20 min). A rodamina B [2], com 3 anis aproximadamente coplanares e 1 anel fora do plano, apresentou adsoro menos efetiva que o azul de metileno, sendo eluda lentamente em etanol (aproximadamente 60 min). Os compostos polares, fluorescena [1, amarelo] e azul de bromotimol [3, amarelo], adsorvidos na fase estacionria polar, foram removidos e eludos nos solventes polares acetona e etanol. Os compostos rodamina B [2, rseo] e azul de metileno [4, azul], os quais apresentam interaes eletrostticas e polares mais efetivas com a fase estacionria polar, no foram eludos em hexano, ter etlico, acetato de etila e acetona. O composto rodamina B [2] foi eludo em etanol e cido actico glacial.

4. Concluso Este trabalho mostra os resultados de experimentos de cromatografia em coluna, realizados em

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2 h, com a separao da mistura de 2 corantes: fluorescena/rodamina B; azul de bromotimol/rodamina B e fluorescena/azul de metileno. Os experimentos de cromatografia em camada delgada indicaram o etanol como o eluente de escolha, o qual foi utilizado nos experimentos de cromatografia em coluna. A seqncia de eluio dos componentes de cada mistura mostra a influncia da estrutura e interaes entre cada componente com o adsorvente e o eluente. Em resumo, a demonstrao permite trabalhar conceitos importantes da qumica a partir de experimentos simples. A anlise estrutural das substncias aplicadas permite fazer previses de solubilidade e possvel comportamento cromatogrfico.

Na O

O Na

CO 2 H

O H3C O H3C N O
-

CH3

Cl

CH3

Flurescena [1]
O S O OH H3C CH3 Br HO H3C H3 C CH3 H3 C N CH 3

Rodamina B [2]

O H 3C Br N

CH3 N CH3

Cl

Azul de bromotimol [3]

Azul de metileno [4]

Figura 1 - Estrutura dos corantes utilizados: [1] 3,6-Dissdioespiro [isobenzofuran-1(3H),9-[9H]xantenato] -3-ona (fluorescena sdica); [2] Cloreto de N-[9-(2-carboxifenil)-6-(dietilamino)-3H-xanten-3-ilideno]N-etiletanamnio (rodamina B); 3] 4,4-(3H-2,1-benzoxatiol-3-ilideno)bis[2-bromo-3-metil-6(1-metiletil)fenol]S,S-dixido (azul de bromotimol); [4] Cloreto de 3,7-bis (dimetilamino)fenotiazin-5-o (azul de metileno).

Comentrios e sugestes para aplicao e estudo As solues de corantes podem ser utilizadas para mostrar: 1. O equilbrio de adsoro: a distribuio do soluto na fase estacionria (adsorvente) e na fase mvel (eluente). 2. O equilbrio cido-base envolvendo indicadores de pH como o azul de bromo-timol (amarelo/ azul em pH cido/bsico). 3. O equilbrio de adsoro da rodamina B e

fluorescena (colorao esverdeado/alaranjado) em argentimetria. 4. As propriedades fluorescentes da fluorescena e rodamina B podem ser observadas em ambiente de pouca luminosidade. Pode-se discutir conceitos de fluorescncia e fosforescncia. 5. A demonstrao pode ser feita em qualquer laboratrio de ensino, realando aspectos relacionados ao equilbrio cido-base (reaes, conceito de pH, indicadores cido-base), equilbrio de adsoro (indicadores de adsoro).

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Sugestes para pesquisa 1. Qual o grau de confiabilidade do Rf como critrio qualitativo na identificao de substncias? 2. Porque a fluoresceina elui mais rapidamente da coluna do que o azul de metileno? 3. Comente sobre a natureza das interaes entre os componentes da amostra e o adsorvente da coluna.
2 DEKKER, M. Advances in chromatography. Phyllis, R. Brown Ed.; Publisher book news, Inc.; Portland, OR; USA; 1998. 3 FURNISS, B. S.; HANNAFORD, A. J.; ROGERS, V.; SMITH, P. W. G.; TATCHELL, A. R. Voguels textbook of practical th organic chemistry; 5 ed., John Wiley & Sons, Inc.; New York, USA, 1989. 4 HART, D.; CRAINE, L. Organic chemistry: A short course th laboratory manual, 9 ed., New York, USA, 1995. 5 LEHMAN, J. W. Operational organic chemistry: a problem rd solving approach to the laboratory course, 3 ed., Pearson Higher Education, New York, USA, 1998. 6 PAVIA, D. L.; LAMPMAN, C. M.; KRIZ, G. S, ENGEL, R. G. Introduction to organic laboratory techniques: a micro scale rd approach; 3 ed., Saunders College Publishing Ed.; New York, USA, 1999. 7 SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMANN, T. A. Principles th of instrumental analysis, 5 ed., Saunders; New York, USA, 1998. 8 SVORONOS, P.; SARLO, E.; KULAWIEC, R. J. Organic nd chemistry laboratory manual, 2 ed., WCB publishers; Iowa, USA, 1996.

Agradecimentos Aos acadmicos do curso de Farmcia que nos auxiliaram nos experimentos, e a UEPG pela utilizao de laboratrios de ensino.

REFERNCIAS 1 BELL, C.; TABER, D.; CLARCK, A. Organic chemistry rd laboratory with quantitative analysis, 3 ed.; Thomson learning, New York, USA, 2000.

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