Bolpd 387 Maria Cristina

ISSN 1676-918X
BOLETIM DE ISSN on-line 2176-509X

Setembro/2021
PESQUISA E
DESENVOLVIMENTO
387
Estudo de Expressão Gênica para

a Seleção de Genótipos de Trigo
Contrastante na Resposta à Seca
ON
OFF
ISSN 1676-918X
ISSN on-line 2176-509X
Setembro/2021
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Centro de Pesquisa Agropecuária dos Cerrados
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
BOLETIM DE PESQUISA
E DESENVOLVIMENTO
387
Estudo de Expressão Gênica para a Seleção de

Genótipos de Trigo Contrastante na Resposta à Seca
Maria Cristina Rocha Cordeiro

Walter Quadros Ribeiro Jr
Marco Aurélio Pessoa Filho
Rodrigo da Rocha Fragoso
Marilia Santos Silva
Embrapa Cerrados
Planaltina, DF
2021
Exemplar desta publicação disponível Comitê Local de Publicações
gratuitamente no link: https://www.bdpa.cnptia. da Unidade
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Revisão de texto
Jussara Flores de Oliveira Arbues
Margit Bergener Leite Guimarães
Normalização bibliográfica
Shirley da Luz Soares Araújo
Projeto gráfico da coleção

Carlos Eduardo Felice Barbeiro
Editoração eletrônica
Wellington Cavalcanti/Renato Berlim Fonseca
Foto da capa
Fabiano Bastos
1ª edição
1ª impressão (2021): tiragem 30 exemplares
Todos os direitos reservados.

A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte,
constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Embrapa Cerrados
E82 Estudo de Expressão gênica para a seleção de genótipos de trigo contrastante na

resposta à seca / Maria Cristina Rocha Cordeiro ... [et al.]. – Planaltina,
DF : Embrapa Cerrados, 2021.
34 p. (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Cerrados, ISSN

1676-918X, ISSN on-line 2176-509X, 387).
1. Seleção fenótipa. 2. Seca. 3. Mudança climática. I. Cordeiro, Maria

Cristina. II. Embrapa Cerrados. III. Série.
CDD (21 ed.) 633.11
Shirley da Luz Soares Araújo (CRB-1/1948) © Embrapa, 2021

Sumário
Resumo.......................................................................................5
Abstract.......................................................................................6
Introdução...................................................................................7
Material e Métodos......................................................................9
Resultados e Discussão............................................................14
Conclusões................................................................................31
Referências...............................................................................32
5
Estudo de Expressão Gênica para a Seleção

de Genótipos de Trigo Contrastante na
Resposta à Seca
Maria Cristina Rocha Cordeiro1; Walter Quadros Ribeiro Jr 2; Marco Aurélio
Pessoa Filho3; Rodrigo da Rocha Fragoso4; Marilia Santos Silva5
Resumo – A seca é uma ameaça mundial à produção de alimentos e pode

resultar em grandes perdas de produtividade agrícola e, em especial, dos
cultivos de cereais como o trigo. A seleção de cultivares de trigo tolerantes à
seca é muito importante para que as perdas de produtividade advindas das
mudanças climáticas sejam mitigadas. A região do Cerrado brasileiro é uma
savana tropical situada no interior do País, e representa uma área conside-
rada como uma fronteira agrícola de produção de alimentos e cereais, como
o trigo. Nessa região, o trigo pode ser plantado no inverno com irrigação (de
abril/maio a agosto/setembro) e, alternativamente, na safrinha, em cultivo de
sequeiro (de fevereiro a maio) e, por isso, a seleção de genótipos tolerantes à
seca é muito importante. Este trabalho teve por objetivo estudar a expressão
gênica em genótipos contrastantes de trigo para compreender o complexo
sistema fisiológico-genético de tolerância à seca nessa cultura agrícola, au-
xiliando na seleção dos melhores genótipos que possam superar os efeitos
das mudanças climáticas. Duas abordagens foram envolvidas: (a) análises
em bibliotecas subtrativas de cDNA e (b) sequenciamento de transcriptoma
pela plataforma 454 GS FLX (Roche). Os potenciais genes expressos estão
relacionados com atividades de expressão e regulação gênica, ligação de fa-
tores de transcrição (FT) em ácidos nucleicos ou proteínas à FT, atividade ca-
talíticas ou de regulação enzimática, proteínas receptoras e transportadoras
ou com o sistema de oxidorredução. Este trabalho representa os primeiros
resultados de expressão gênica em genótipos com respostas contrastantes à
seca na Embrapa Cerrados.
Termos para indexação: fenotipagem; campo; cera; sequenciamento; mu-

danças climáticas; seca.
1
Bióloga, doutora em Ciências (Biologia Molecular), pesquisadora da Embrapa Cerrados Planaltina, DF
2
Biólogo, Ph.D. of Philosophy, pesquisador da Embrapa Cerrados Planaltina, DF
3
Biólogo, doutor em Biologia Molecular, pesquisadora da Embrapa Cerrados Planaltina, DF
4
Biólogo, doutor em Biologia Molecular, pesquisadora da Embrapa Cerrados Planaltina, DF
5
Engenheira-agrônoma, doutora em Biologia Molecular, pesquisadora da Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, Brasília DF
6
Gene Expression in Contrasting Wheat

Genotypes in Response to Drought
Abstract – Drought is a global threat to food production and can result in
large losses in agricultural productivity and, in particular, in cereal crops such
as wheat. The selection of drought-tolerant wheat cultivars is very important
so that yield losses resulting from climate change are mitigated. The Brazilian
Cerrado region is a tropical savanna located in the interior of the country and
represents an area considered as an agricultural frontier of food production
including cereals such as wheat. In this region, wheat can be planted in winter
with irrigation (from April/May to August/September) and, alternatively, in
off-season, in rainfed cultivation (from February to May) and, therefore, the
selection of drought-tolerant genotypes is very important. In order to select
common genotypes and mitigate the impacts of climate change in this region
on agricultural productivity, phenotyping methodologies associated with
molecular methodologies are carried out in order to understand the complex
physiological-genetic system of drought tolerance in this crop as a way to
assist in the selection of the best genotypes for this region, so that they can
overcome the effects of climate change. The study of gene expression in this
work involved two approaches: (a) analyzes in subtractive cDNA libraries
and (b) transcriptome sequencing using the 454 GS FLX platform (Roche).
The potential expressed genes are related to gene expression and regulation
activities, binding of transcription factors (TF) in nucleic acids or proteins to
TF, catalytic or enzymatic regulation activities, receptor and transport proteins
or related to the oxide-reduction system. This work represents the first results
in gene expression analysis in contrasting genotypes to drought response at
Embrapa Cerrados.
Index terms: phenotyping; field; wax; sequencing; climate change; drought.
Estudo de Expressão Gênica para a Seleção de Genótipos de Trigo Contrastante na Resposta... 7
Introdução
A seca é uma ameaça mundial à produção de alimentos e pode ser mais
drástica devido às mudanças climáticas. Pode resultar em grandes perdas de
produtividade agrícola e, em especial, dos cultivos de cereais como o trigo,
que é largamente utilizado como alimento sendo uma das maiores fontes
de energia no mundo todo (Sallam et al., 2019). Portanto, a seleção de cul-
tivares de trigo tolerantes à seca é muito importante para que, as perdas de
produtividade advindas das mudanças climáticas sejam mitigadas (Khan et
al., 2019).
A seleção de genótipos tolerantes à seca envolve um estudo multidisci-
plinar e integrado com as ferramentas de análises morfológicas, fisiológicas
e as modernas de análises genéticas como a genômica, a transcriptômica,
a proteômica, além da utilização de sensores fotoelétricos entre outras me-
todologias, para que se possa alcançar mais êxito e velocidade na seleção
dos melhores genótipos. Adicionalmente, essas ferramentas auxiliam na
identificação dos principais mecanismos genéticos das plantas associados à
tolerância à seca, que nos apontam caminhos para a geração de genótipos
superiores mais tolerantes (Mosa et al., 2010). Um desses mecanismos que
as plantas possuem e permitem maior tolerância à seca é a produção de cera
cuticular (BI et al., 2017; Xue et al., 2017; Patwari et al., 2019).
A tolerância à seca em plantas é uma característica que pode ser asso-
ciada a outros estresses, como calor, salinidade, doenças e pragas, resultan-
do em um sistema fisiológico-genético bastante complexo para se pontuar
os mecanismos principais envolvidos. Representa uma herança poligência,
que envolve a integração de mais de um mecanismo fisiológico como a fo-
tossíntese e o metabolismo (Marcek et al., 2019; Sallam et al., 2019), além
dos processos de resposta de defesa em função da homeostase do sistema
nessa situação.
O trigo tem uma estrutura genômica complexa sendo uma planta hexaploi-
de. Em nível genético, a tolerância à seca, por ser uma herança multigênica,
envolve diferentes traços de loci quantitativos (QTLs) (Qassem et al., 2018).
Atualmente, já foi obtida a sequência genômica completa do trigo (Guan
et al., 2020; Walkowiak et al., 2020), permitindo o avanço de estudos multidis-
ciplinares integrados, pois essa sequência possibilita o isolamento de novos
8 BOLETIM DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO 387
marcadores genéticos (Microsatélites, SNPs, KASPs); a revisão e a correção

de mapas genéticos já estabelecidos; a seleção de genes ainda não conhe-
cidos nos diferentes processos fisiológicos-genéticos; as análises de sintenia
entre cultivares homólogas, como o arroz e outros cereais.
A região do Cerrado brasileiro é uma área de savana tropical com um cli-
ma típico, contendo uma estação chuvosa (de outubro a abril) e, outra, seca
(de maio a setembro) (Figura 1). Consideráveis avanços da agricultura foram
alcançados nessa região, que tem sido apontada como uma fronteira agrícola
de produção de alimentos, em especial, cereais e grãos (soja, milho, sorgo,
arroz, feijão, trigo, mas, também, algodão, cana-de-açúcar, café, fruta etc.)
(Albuquerque; Silva, 2008). Nessa região, o trigo pode ser plantado no inver-
no com irrigação (de abril/maio a setembro) e, alternativamente, na safrinha,
em cultivo de sequeiro (de fevereiro a maio), no final da estação chuvosa e,
por isso, a seleção de genótipos tolerantes à seca é muito importante (Ribeiro
Júnior et al., 2006). Com o objetivo de selecionar genótipos que enfrentem
os veranicos comuns na safrinha e de mitigar os impactos nas mudanças cli-
máticas e na produtividade agrícola, metodologias de fenotipagem têm sido
estudadas de forma a selecionar cultivares mais tolerantes à seca para essa
região.
Este trabalho teve por objetivo estudar a expressão gênica em genótipos
contrastantes de trigo, de forma a compreender o complexo sistema fisioló-
gico-genético de tolerância à seca nesta cultura agrícola, auxiliando e inte-
grando na seleção de possíveis genes marcadores para os processos de fe-
notipagem das plantas elite em campo, em regime de irrigação em gradiente
relacionados a aspectos morfológicos e fisiológicos.
350
Cultivo em sequeiro Cultivo irrigado
300
1974-1983 1984-1993
Precipitação pluvial (mm)
1994-2003 2004-2013
250
200
150
100
50
0
Jan. Fev. Mar. Abr. Maio Jun. Jul. Ago. Set. Out. Nov. Dez.
Mês
Figura 1. Precipitação pluviométrica média mensal observados na Estação Principal

da Embrapa Cerrados, localizada na região administrativa de Planaltina, DF, no perí-
odo histórico de 1974 a 2013, que demonstra que esta região se caracteriza por duas
estações: uma chuvosa de outubro a abril e, outra seca de maio a setembro e os tipos
de cultivo do trigo na região são: cultivo em sequeiro/safrinha (fevereiro a maio) e
cultivo irrigado (maio a setembro).
Fonte: (Silva et al., 2017).
Material e Métodos
O experimento foi conduzido entre maio a setembro de 2011, na área ex-
perimental da Embrapa Cerrados, localizada em Planaltina, DF cujas coorde-
nadas geográficas são 15º35’30” S e 47º42’30” W e altitude de mil metros. Os
dados climatológicos (precipitação pluviométrica, umidade relativa e tempe-
ratura) podem ser observados na Figura 2. O clima predominante na região é
do tipo Aw, típico das savanas com duas estações bem definidas: uma seca e
fria (outono e inverno – abril/maio a agosto/setembro) e outra quente e úmida
(primavera e verão – setembro a março), segundo a classificação de Köppen.
O solo da área foi classificado como Latossolo Vermelho, distrófico, com
textura argilosa (Santos et al., 2018). A composição química do solo da área
do experimento continha 0,9 cmol/dm3 de cálcio; 0,6 cmol/dm3 de magné-
sio; 0,05 cmol/dm3 de potássio; 0,2 cmol/dm3 de alumínio; 0,5 cmol/dm3
de fósforo; 32,5 g/dm3 de matéria orgânica (MO); 200 g/kg-1 de areia,

275 g/kg-1 de silte, 525 g/kg-1 de argila e pH 5,6. Anteriormente à instalação
do experimento, a área foi cultivada com trigo por 6 anos com as mesmas
cultivares testadas no presente estudo. A adubação do plantio foi feita com
400 kg de 4:30:16, com 80 kg de N em cobertura no perfilhamento na for-
ma de ureia. O herbicida pré-emergente foi Pendimentalin, na dosagem de
3 L/ha e pós-emergente metsulforam metílico, na dosagem de 4 g/ha, além
de aplicação de um fungicida preventivo Estrobirulina+Triazol, na dosagem
de 1 L/ha. Foi utilizado também redutor de crescimento trinexapac etílico para
evitar acamamento na dosagem de 0,5 L/ha do produto. A semeadura dos
genótipos de trigo nas parcelas foi realizada com o auxílio de semeadora de
parcelas experimentais do modelo Semeato, de tração tratorizada, com oito
linhas espaçadas por 0,17 m. A quantidade de semente foi calculada para
obter um estande de 90 plantas por metro, sendo esta corrigida em função do
teste de germinação previamente realizado. A colheita do experimento foi me-
canizada e as parcelas foram pesadas e corrigidas para a umidade de 13%.
O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, em esquema de parce-
las subdivididas, com três repetições. As parcelas corresponderam aos genó-
tipos de trigo BRS020062 e PF020037, que apresentam níveis contrastantes
de cerosidade foliar que foi observado de forma bem evidente visualmente e
documentado em fotos (Ribeiro Júnior et al., 2006). Foram utilizadas parcelas
subdivididas, sendo estas correspondentes aos genótipos e as subparcelas,
aos regimes hídricos. A irrigação inicial foi feita de forma homogênea em to-
dos os genótipos até aos 30 dias após a emergência, que corresponde ao
perfilhamento. As lâminas utilizadas foram calculadas de acordo com o pro-
grama de Monitoramento da Irrigação no Cerrado6, que considera os dados
climáticos da região, a evapotranspiração da cultura e o turno de rega para
calcular a quantidade de água necessária. Após esse período de estabele-
cimento da cultura, adaptou-se a metodologia do line source (Hanks et al.,
1976). A sobreposição entre os diferentes aspersores promoveu uma dimi-
nuição gradiente de água da área central (considerada lâmina ideal) para a
extremidade do experimento, o que permitiu criar os regimes hídricos. O ma-
terial foliar (três folhas) foi coletado dos genótipos PF020037 e BRS020062,
respectivamente, que são linhas irmãs, com e sem produção de cerosidade
foliar, portanto, genótipos contrastantes para essa característica (que é consi-
6
http://hidro.cpac.embrapa.br/help.html
derado um mecanismo de tolerância à seca) em ponto referente à planta com

100% e 50% de água, nas fases fenológicas de espigamento (escala Zadoks
4.9) e enchimento de grãos na escala Zadoks 7.5 (Figuras 2, 3 e 4). Segundo
a adaptação da escala de Zadoks da Food and Agriculture Organization of
United Nations (FAO) para o trigo7, o ponto 4.9 corresponde ao final da fase
de bainha engrossada para a fase espigado, portanto, quase no início da fase
espigado e, o ponto 7.5 como sendo no meio da fase do estado leitoso do
grão, portanto, início da fase de enchimento de grãos. Neste trabalho, para
simplificar, será referenciado como espigamento (escala de Zadoks 4.9) e
enchimento de grãos (escala de Zadoks 7.5) (Zadoks et al., 1974).
As folhas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e man-
tidas congeladas à -80 oC até sua utilização. O RNA (ácido ribonucleico) foi
extraído das folhas coletadas nos pontos com e sem estresse das linhagens
PF020037 e BRS020062 nas fases de espigamento e enchimento de grãos
com o reagente Concert (Invitrogene) seguindo as instruções do fabricante. O
material da fase de espigamento também foi purificado na coluna do PureLink
RNA Mini Kit (Ambion). Após sua extração, o RNA foi quantificado em espec-
trofotômetro do tipo Nanodrop ND2000 e observado em eletroforese de gel a
1,5% de agarose. Tendo sido considerado íntegro, o material foi utilizado nas
etapas posteriores de purificação do RNA mensageiro poliA+ e construção
das bibliotecas subtrativas de cDNA (Figura 6). O RNA poliA+ foi purificado
utilizando-se o kit Oligotex mRNA Midi seguindo as instruções do fabricante.
Após a purificação, o RNA poli A+ foi quantificado em espectrofotômetro do
tipo Nanodrop ND2000 e observado em eletroforese de gel a 1,5% de agaro-
se. Sendo considerado íntegro, foi utilizado na construção das bibliotecas de
cDNA. Duas bibliotecas subtrativas de cDNA foram construídas utilizando-se
o kit PCR-Select cDNA Subtraction, seguindo as instruções do fabricante:
uma, tomando-se como tester o RNA poliA+ do genótipo PF020037 sob es-
tresse hídrico na fase de enchimento de grãos e driver o RNA poliA+ do ge-
nótipo PF020037 sem estresse hídrico na mesma fase; e outra, tomando-se
como tester o RNA poliA+ do genótipo BRS020062 sob estresse hídrico na
fase de enchimento de grãos e driver o RNA poliA+ do genótipo BRS020062
sem estresse hídrico na mesma fase. Os cDNAs resultantes da subtração
de cada uma das bibliotecas foram clonados em vetor do tipo PGemTeasy
7
https://pt.scribd.com/document/319732725/Escala-Zadoks-Trigo#logout
e transformados por eletroporação em células de Escherichia coli (E. coli)

competentes do tipo XL1blue. Os clones obtidos foram crescidos em meio
LB líquido, congelados e mantidos a -80 oC em glicerol e enviados em placa
de meio Luria Bertani (LB) sólido para posterior minipreparação e sequencia-
mento na empresa Macrogen Inc. (Seoul, Coréia).
O serviço de minipreparação para o sequenciamento foi realizado automa-
ticamente por meio de robôs em procedimento próprio da empresa Macrogen,
assim como, o sequenciamento, utilizando um sequenciador modelo 3730XL
DNA analyzer (AB, USA) e o kit BigDye v3.1 (AB, USA). Foram sequenciados
os 576 clones resultantes referentes à biblioteca subtrativa da variedade cero-
sa e os 44 clones resultantes referentes à variedade não cerosa. As análises
de bioinformática das sequências obtidas do sequenciamento dos clones das
bibliotecas subtrativas foram realizadas segundo o seguinte protocolo: (1) os
eletroferogramas foram lidos e as sequências convertidas em formato Fasta;
(2) as sequências de maior qualidade (qualidade mínima de phred > 20) fo-
ram analisadas e processadas utilizando as ferramentas de bioinformática
como Lucy DNA sequence quality and vector trimming tool – SeqCleanLucy 8 ,
Cross_match e RepeatMasker, sendo as sequências de má qualidade, de
vetores ou repetitivas removidas; (3) caudas poli-A/T encontradas nas se-
quências foram recortadas para um tamanho mínimo de oito pares de base
(pb); (4) sequências menores que 100 pb foram descartadas, assim como
sequências compostas somente por repetições microssatélite; (5) o agrupa-
mento foi feito utilizando-se a ferramenta de bioinformática TGICL clustering
tool; (6) as sequências agrupadas foram submetidas à análise de similarida-
de, utilizando a ferramenta de bioinformática Basic Local Aligment Search
Tool (BLAST) no modo BLASTX contra os bancos de dados não redundante
(nr), Eukaryotic Orthologous Groups of Proteins (KOG), e Swiss-Prot Protein
Sequence Databank; (7) a anotação foi finalizada utilizando a Plataforma de
bioinformática Blast2GO – Functional Annotation and Genomics (https://www.
blast2go.com/), em que foi realizada as seguintes análises: (a) mapeamento
de termos de ontologia gênica (GO); (b) busca por domínios conservados via
InterProScan; e (c) por códigos EC (enzyme codes); (8) as anotações foram
alteradas manualmente, quando necessário; (9) os gráficos de dispersão de
termos GO, de espécies com os hits mais significativos na análise BLASTX e
8
http://sourceforge.net/projects/seqclean/
http://lucy.sourceforge.net/
sumários do processo de anotação também foram gerados com o programa

blast2go.
As amostras analisadas em RNA-seq foram as mesmas extraídas como

anteriormente, referentes aos genótipos selecionados com e sem cerosidade
(62M (EG), 62N (EG), 37E (EG), 37N (EG), 37E (ES) e 37N (ES) nas fases
fenológicas de espigamento (ES) e enchimento de grãos (EG).
Antes do sequenciamento, as amostras de RNA enviado à Macrogen fo-

ram analisadas em Bioanalyzer (Agilent) para verificação de qualidade na
própria empresa Macrogen. O sequenciamento de RNA-seq e posterior mon-
tagem e análises de bioinformática foram realizadas no serviço terceirizado
da empresa Macrogen da Korea utilizando o programa GS FLX (versão 2.6)
(Roche), seguindo as seguintes etapas:
Etapa 1 – para todas as amostras analisadas: as sequências geradas utili-

zando a plataforma 454 GS FLX (Roche) foram processadas e niveladas com
o mesmo background e foram corrigidos erros de imagem e sinal e, também,
as sequências relacionadas com primer e/ou sequências de má qualidade
foram removidas.
Etapa 2 – em cada biblioteca/amostra, o sequenciamento gerou sequências

que variaram de tamanho de <50 pb a ~600 pb aproximadamente, com pre-
dominância de sequências de 400 pb a 600 pb. As sequências foram ali-
nhadas pelo programa GS De novo Assembler (versão 2.6). O alinhamen-
to constituiu uma hierarquia de sequências agrupadas da seguinte forma:
Isogrups >Isotigs > Contigs, que representam o resultado da sobreposição
no alinhamento entre as sequências geradas. Os agrupamentos são devidos
a variantes de processamento de RNA mensageiro (RNAm) e, havendo RNA
ainda não processado nas amostras, alguns contigs também podem estar
relacionados com sequências de Intron ou terminais 5’; 3’. A opção no progra-
ma foi cDNA. Os parâmetros foram: seed step (12 pb); seed length (16 pb);
seed count (1) (referentes às melhores sequências raw); minimum overlap
length (40); minimum ovelap identity (90); aligment identy score (2); aligment
difference score (-3); Isogroup threshold (500 contigs); Isotig threshold (100
contigs); IsotigContig count threshold (100 contigs); IsotigContig Length thre-
shold (3 pb).
Etapa 3 – as sequências Singleton foram processadas pelo programa

SeqCleanLucy9, em que foram removidas sequências muito pequenas, con-
sideradas problemáticas, sequências contaminantes, de baixa qualidade ou
complexidade.
Etapa 4 – as análises de similaridade totais dos Isogroups>Isotigs>
Contigs e Singletons resultantes nas amostras do genótipo com cerosidade
PF020037 (ES e EG) e sem cerosidade BRS020062 (EG) foram obtidas pelo
programa BLAST, utilizando como valor de corte o 1.0E-3.
Etapa 5 – as anotações de Gene Ontology (GO)10 realizadas. Esse tipo de
sequenciamento foi selecionado pelo fato de, na ocasião, não haver
disponível genoma completo do trigo e, esse sistema, gerando fragmentos
da ordem de 300 pb–400 pb em média, permitia uma montagem das
sequências de forma mais correta sem genoma de referência.
Resultados e Discussão
Os genótipos de trigo (PF020037 e BRS020062) foram cultivados no cam-
po experimental da Embrapa Cerrados sob regime hídrico de line source ou
gradiente linear. No decorrer do experimento, praticamente não ocorreram
precipitações e, como o experimento ocorreu no inverno, na antemanhã do
plantio, as temperaturas mínimas chegaram a 10 oC (Figura 2). Os genótipos
foram identificados por diferentes capacidades de produzir cerosidade foliar,
que representa um mecanismo de tolerância ao estresse hídrico. Essa ce-
rosidade foi observada de forma bastante clara visualmente e documentada
por foto.
Na Figura 3, demonstram-se as fases fenológicas da cultura do trigo, se-
gundo a escala de Zadoks (Zadoks et al., 1974) para a visualização daquelas
de coleta de material para as análises que foram realizadas (Espigamento
– 4.9 e Enchimento de grãos – 7.5) e, na Figura 4, pode ser observada uma
visão geral dos cultivos de trigo em plantio sob line source. A parte central
representa o ponto em que as plantas estão sendo irrigadas com quantidades
ótimas de água para o cultivo. Nas extremidades, observa-se as plantas que
9
http://sourceforge.net/projects/seqclean/
http://lucy.sourceforge.net/
10
http://www.geneontology.org/
estão submetidas ao máximo do estresse. Na Figura 5, é observado o deta-

lhe do vigor do genótipo ceroso (PF020037) no ponto com mais estresse, no
final da fase de enchimento de grãos.
120
Tmin °C Tmed °C Tmax °C UR % Chuva mm
100
80
60
40
20
0
1
11
11
11
1
1
20
20
20
20
20
20
20
20
20
0
/2
/2
/2
1/
1/
1/
1/
1/
1/
1/
1/
1/
/1
/1
/1
1/
2/
3/
4/
5/
6/
7/
8/
9/
10
11
12
Figura 2. Dados climatológicos da Estação Experimental da Embrapa Cerrados,
demonstrando a variação da umidade relativa, a temperatura e a precipitação pluvio-
métrica no ano e período do experimento (maio a setembro). De maio a setembro, a
precipitação foi ausente e a umidade relativa do ar decaiu de 92,8% a 30%. Dados
gentilmente fornecidos por Edson Sano.
Fonte: Silva et al. (2017).
Escala
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 principal
0,0–0,9 1,0–1,9 2,0–2,9 3,0–3,9 4,0–4,9 5,0–5,9 6,0–6,9 7,0–7,9 8,0–8,9 9,0–9,9 Subfase
Produção Produção Estado Amadure-

Bainha Estado
Germi- de folhas Produção de nós no
nação
engros- Espigado Antesis leitoso do pastoso cimento
no talo de brotos talo do grão completo
sada grão
principal principal
Figura 3. Esquema das fases fenológicas na cultura do trigo na escala e subescala de

aproximação da FAO para o trigo11. As setas vermelhas indicam as fases de coleta de
material foliar para os estudos moleculares.
Fonte: baseado em Zadoks et al. (1974).
11
https://pt.scribd.com/document/319732725/Escala-Zadoks-Trigo#logout
Foto: Maria Cristina Rocha Cordeiro

B A C
Figura 4. Área geral do experimento de cultivo do trigo no campo sob regime hídrico
de line source. O ponto A representa a área de maior irrigação (sem estresse hídrico)
e, os pontos B e C representam as áreas cujo estresse hídrico é máximo.
Figura 5. Detalhe do vigor do genótipo com maior cerosidade foliar (PF020037) na

região de maior estresse hídrico, na fase de enchimento de grãos, em relação a outros
genótipos avaliados na fenotipagem de 2011. A seta amarela indica o genótipo ceroso
(PF020037).
A fase de espigamento (ES) (Escala de Zadoks 4.9) foi escolhida pela

observação visual, clara, no genótipo PF020037 de cerosidade encontrada
na folha, a partir dessa fase, na planta sob estresse hídrico (Ribeiro Júnior
et al., 2006). As plantas presentes nos pontos com estresse já apresentavam
cerosidade e, aquelas presentes no ponto sem estresse não, vindo a aconte-

cer em uma fase mais tardia do ciclo. Porém, a comprovação química desta
observação ainda necessita ser obtida. A fase de enchimento de grãos (EG)
foi escolhida por se tratar da fase em que a diferença do potencial hídrico é
maior para as análises subsequentes de avaliação de produtividade, por ser
uma das fases críticas da cultura cultivada nos campos do Cerrado Brasileiro.
Na Tabela 1, são mostradas as quantidades iniciais e finais de tecido uti-

lizada, o RNA total e o RNA poliA+ obtidos de cada amostra utilizada. Esses
procedimentos de extração de RNA e seleção do RNA poliA+ demonstraram,
aproximadamente, o mesmo padrão de resultado com respeito à quantidade
de RNA resgatado/variedade/condição. A maior diferença foi com a varieda-
de mais cerosa na fase de enchimento de grãos que, mesmo sem estresse,
necessitou do dobro da quantidade de material para se obter a mesma quan-
tidade de RNA e a variedade sem cerosidade uma maior facilidade para a
obtenção de RNA nas mesmas condições ambientais. Não se sabe se esses
efeitos podem ser devido à ausência/presença de produção de cerosidade
ou a outros eventos moleculares presentes na cutícula da folha no genótipo
PF020037, sendo este dado considerado pontual devido ao genótipo dife-
rente ou a algum procedimento de coleta ou, ainda, o armazenamento dos
materiais vegetais. Todos os RNAs obtidos também demonstraram estarem
íntegros na análise em gel de agarose (Figura 6) como também sua qualida-
de foi confirmada em Bioanalyzer (Agilient).
Tabela 1. Resultado da eExtração do RNA dos genótipos de trigo.
Quantidade média Quantidade média

Quantidade de
Variedade de RNA total final de RNA poliA+ final
material vegetal (g)
(mg) (µg)
37E (EG) 2 1,5 3,3
37N (EG) 4 1,7 2,0
62E (EG) 2 2,8 2,3
62N (EG) 2 2,6 4,5
37E (ES) 2 1,0 _
37N (ES) 2 2,5 _
Obs. Genótipo 37 (PF020037), Genótipo 62 (BRS020062); ES – espigamento (escala de Zadoks 4.9); EG –
enchimento de grãos (escala de Zadoks 7.5), N – não estresse; E – com estresse.
a b c d e f
Figura 6. Gel de agarose 1,5% demonstrando a in-

tegridade do RNA extraído das plantas para constru-
ção de bibliotecas de cDNA e sequenciamento na
Plataforma 454 GS FLX Roche. (a) amostra 37
E(ES); (b) amostra 37 N (ES); (c) amostra 62 E
(EG); (d) amostra 62 N (EG); (e) amostra 37 E (EG);
(f) amostra 37 N (EG). ES – fase de espigamento;
EG – fase de enchimento de grãos. O ponto Verme-
lho demonstra a ausência de DNA genômico conta-
minante no poço (alto do gel) e os pontos em ama-
relo destacam as bandas referentes a RNA ribosomal
ou menores, RNA transportador (baixo do gel), que
normalmente são visualizados nesse perfil.
O resultado das bibliotecas subtrativas demonstrou que, na biblioteca do

genótipo ceroso (PF020037), o número de sequências resultantes após a
subtração foi muito superior do que o da biblioteca genótipo não ceroso (576:
44, respectivamente – Tabela 2). Não se sabe se esses resultados foram de-
vidos a algum problema relacionado com a subtração da biblioteca ou podem
estar expressando uma situação durante o estresse no genótipo PF020037.
Para a biblioteca do genótipo ceroso, foram observadas muitas sequências
relacionadas com retrotransposons. Praticamente dois terços da biblioteca foi
representada por essas sequências e, mesmo com procedimentos para lim-
peza com programas de análise específicos, ainda permaneceu com algum
residual. Esse tipo de sequências parece ser normal de serem encontradas
em cereais e já foram relacionadas como presentes e coadjuvantes durante
uma grande indução de expressão de genes. A presença de transposons foi
confirmada com o recente sequenciamento genômico do trigo, pois foi com-
provado que realmente existem muitas sequências de transposons nesse
genoma (Walkowiak et al., 2020). Assim, o observado nessa análise parece
estar expressando, ao menos de forma parcial, a realidade desse genoma,
nesse transcriptoma. Na análise em RNA-seq, foi demonstrado que o número
de sequências nos genótipos sob estresse, tanto nas fases de espigamento
(escala de Zadoks 4.9) quanto no enchimento de grãos (escala de Zadoks
7.5), é superior com relação ao número de sequências obtidas das plantas
sem estresse em todos os casos analisados (Tabela 2). Esse resultado quan-
titativo está em acordo com o resultado que obtivemos com as bibliotecas

subtrativas de cDNA.
Tabela 2. Resultado Geral das Análises de Sequenciamento das bibliotecas subtrati-

vas de cDNA e RNA-seq (Plataforma 454 GS FLX Roche).
Número de sequência total

(análise) Tamanho
Fase
médio da
Genótipo fenológica Condição Bibliblioteca
read obtida
(pB) subtrativa de RNAseq (pB)
cDNA
PF020037 ES NE - 249.318 391.509
PF020037 ES E - 336.116 396.128
PF020037 EG NE 319.590 418.811
576 (9)
PF020037 EG E 403.929 418.988
BRS020062 EG NE 200.874 419.21
44 (24)
BRS020062 EG E 478.302 398.78
Obs. NE – não estressada; E- estressada; ES – espigamento; EG – enchimento de grãos. Em vermelho, são
destacados o número de sequências consistentes totais das bibliotecas subtrativas de cDNA.
De 576 cDNAs sequenciados resultantes da biblioteca subtrativa no ge-

nótipo ceroso PF020037, após a análise de bioinformática, somente 35 se-
quências puderam ser anotadas, das quais, nove foram consideradas con-
sistentes; 16 não consistentes; e dez sequências caracterizadas como no hit
(sem homologia conhecida) (Figura 7). Assim, o número final de sequências
anotadas e efetivamente caracterizadas foram somente nove sequências
(Tabela 2). O ponto de corte foi com Evalue e 10-4.
Na biblioteca subtrativa do genótipo não ceroso BRS020062, foram obti-
dos 44 cDNAs totais na biblioteca, dos quais, de 32 sequências anotadas, 24
foram consideradas consistentes; 7, inconsistentes; e 1 considerada no hit
(Figura 7). As sequências geradas na biblioteca subtrativa do genótipo não
ceroso foram consideradas, de uma maneira geral, melhores do que as do
genótipo ceroso, porque demonstraram maior qualidade; o número quantita-
tivo final de sequências consistentes, 24 sequências, superior em relação ao
número da biblioteca subtrativa do genótipo ceroso PF020037 (9) (Tabela 2,
Figura 7). A presença de sequências consideradas no hit em ambas as biblio-
tecas expressa sequências gênicas potenciais novas que ainda não foram
caracterizados e/ou relacionados com algum processo ou sistema ainda au-

sente no banco de dados disponível utilizado para a análise BlastX.
Genótipo não Ceroso Quantidade Genótipo Ceroso Quantidade
sequências anotadas totais
sequências anotadas consistentes
sequências anotadas não consistentes
sem hits em Blast
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Figura 7. Resultado da anotação das sequências encontradas nas biblio-

tecas subtrativas de cDNA.
A maior parte dos top hits encontrados em ambos os casos tiveram maior
homologia com Triticum (T. aestivum, T. monococcum), Hordeum vulgare e
Oryza sativa mas, também, houve sequências com homologia a outros or-
ganismos como o Harpegnathos saltador (inseto) e outras, especialmente
entre as sequências resultantes da biblioteca subtrativa do genótipo ceroso
demonstrando, mais uma vez, uma certa inconsistência de dados (Figura 8).
Com o resultado de um número quantitativamente menor de sequências
consistentes na biblioteca subtrativa do genótipo ceroso foi observado que,
no genótipo não ceroso (BRS020062), os resultados das possíveis relações
de componentes funcionais em nível molecular também apresentaram dados
mais enriquecedores de informações (Figuras 9 e 10).
Nicotiana langsdorffil
Triticum turgidum
Prunus dulcis
Candida albicans
Mus musculus
Drosophila yakuba
Clavispora lusitaniae Blast-Top hits Genótipo não ceroso
Medicago truncatula quantidade total
Brachypodium dystachion Blast Top-hits Genótipo Ceroso
Corynebacterium matruchotli quantidade total
Pseudoalteronomas sp.
Trichinella spirallis
Ajellomyces syringae
Plasmodium reichenowi
Puccinia graminis
Microcosmus sulcatutus
Tripanosoma vivax
Dictyostellium fasciculatum
Salmonella enterica
Triticum aestivum
Yersinia enterocolitica
Maritimibacter alkaliphilus
Schistosoma japonicum
Melampsora larici-populina
Acetonema longum
Streptomyces cacaoi
Oryza sativa
Harpegnathus saltator
Hordeum vulgare
Triticum monococcum
0 2 4 6 8 10 12
Figura 8. Distribuição dos Blast-Top hits por espécies das sequências encontradas
nas bibliotecas subtrativas de cDNA do genótipo ceroso e não ceroso.
Atividade de Transferase Ligação ao DNA

Grupos de transferência (4)
de fósforo (4)
Ligação de Cátions Ligação de RNA

(4) (4)
Figura 9. Resultado da análise do componente de função molecular

das sequências na biblioteca subtrativa de cDNA no genótipo ceroso
PF020037.
Atividade transportadora
transmembrana (1)
Atividade de transferase (4) Atividade hidrolase (4)
Ligação de tetrapirrole (2)
Constituição estrutural
de ribossoma(1) Ligação de íon (8)
Ligação a proteína (2)
Atividade de
peroxidase (2)
Atividade isomerase (2)
Atividade lyase (2)

Atividade de
oxido-redutase (8)
Atividade de ligação a
ácidos nucleicos (4)
Ligação a nucleotídeo (6)
Figura 10. Resultado da análise do componente de função molecular das sequências

na biblioteca subtrativa de cDNA no genótipo não ceroso BRS020062.
Foram observadas sequências, por exemplo, possivelmente relaciona-

das com sistemas de oxidorredução ou ação de peroxidase, que são con-
sistentes com os sistemas de defesa da planta submetida a diferentes tipos
de estresse, entre outros possíveis processos metabólicos constituintes na
planta (Abid et al., 2018). No resultado da biblioteca do genótipo ceroso, foi
observado expressão de genes possivelmente relacionados à regulação da
expressão de genes (ligação a DNA e RNA) ou a cadeia respiratória (re-
lacionados com os processos metabólicos ou fotossintético), que, também,
tem fundamento na literatura, pois, hoje, já é bem conhecido que, durante os
diferentes processos de estresses vegetais, esses sistemas biológicos são
afetados (Bhatla et al., 2018; QIU et al., 2017; Zhang et al., 2018).
Em comparação com as análises com bibliotecas subtrativas de cDNA,

a análise do RNA-seq expressou um poder muito superior em demonstrar a
expressão gênica durante o processo de estresse de seca em condição de
campo, nos dois genótipos.
O número de sequências gênicas geradas (potenciais genes) foi muito

maior em todas as amostras: 62M (EG), 62N (EG), 37E (EG), 37N (EG), 37E
(ES) e 37N (ES) analisadas, (da ordem de, ao menos, 104 vezes superior),
como pode ser observado na Tabela 2. Assim, a análise de RNA-seq demons-

tra que supera, em muito, a análise com as bibliotecas subtrativas de cDNA.
As análises de bioinformática do RNAseq identificaram que o tamanho
médio de reads consideradas consistentes para alinhamento em isogrupos,
isotigs e contigs foi aproximadamente o mesmo de 400 pB (Tabela 2). Os
isogrupos ocorrem devido a variantes de processamento de RNA mensageiro
(RNAm).
Com base na análise da montagem das sequências realizada no RNAseq,
os resultados obtidos foram categorizados a partir de Isotigs constituídas
(que representam sequências homólogas que se sobrepõem para constituir
sequências gênicas maiores ou completas e/ou sequências do tipo Singleton,
que representam sequências que não tem sobreposição com nenhuma outra,
para a genótipo ceroso PF020037 nas fases de espigamento na escala de
Zadoks 4.9) e de enchimento de grãos (escala de Zadoks 7.5) e, o genótipo
não ceroso, BRS020062, nessas mesmas fases respectivamente.
Para os componentes principais, como genes associados a processos
biológicos, componentes celulares, de função molecular específica ou sem
função definida, foi observado que, nessa análise total, apenas no genótipo
não ceroso, o componente do número de genes sem função definida (genes
novos) obtidos é consideravelmente superior. Sendo o percentual dos demais
componentes categorizados bastante semelhantes (Figura 11).
Na análise em que se refina um pouco a primeira informação sobre com-
ponentes e já separa as sequências encontradas com possíveis funcionali-
dades moleculares, observa-se que, na análise das Isotigs e Singleton totais,
as funcionalidades gênicas potenciais mais presentes em todas as fases e os
genótipos estudados estão relacionadas com atividades catalíticas, de liga-
ção, genes/proteínas não classificadas (genes novos) e de ligação de fatores
de transcrição aos ácidos nucleicos. Todas essas atividades estão mais pre-
sentes nas amostras em enchimento de grãos (escala de Zadoks 7.5) quan-
do comparada à fase de espigamento (escala de Zadoks 4.9). Somente nas
sequências singleton essas funcionalidades, na fase de espigamento (escala
de Zadoks 4.9), são expressas em maior quantidade. Também, em uma es-
cala abaixo de cem sequências totais, observa-se atividade molecular estru-
tural, atividade de regulação enzimática, atividade carreadora de elétrons,
atividade de transdução molecular, atividade receptora e atividade antioxida-
tiva. As atividades relacionadas com processos moleculares estruturais e as

relacionadas com receptores aparecem em maior quantidade nas amostras
em enchimento de grãos (escala de Zadoks 7.5), independente do teor de
cerosidade na folha do genótipo estudado. Há também, em baixa quantidade,
atividades relacionadas com metalo chaperonas que normalmente se expres-
sam sob situações de estresse (Figuras 12 e 13).
Isotigs GO Singletons GO
12%
26% 26% 8%
PF020037 ES 68% 12%

26% 22%
13%
26% 26% 9%
PF020037 EG 65% 13%
26% 22%
10%
24% 7%
32%
9%
PF020062 EG 74%
20%
24%
Figura 11. Componentes principais totais Gene Onthology (GO) das sequências
Isotigs e Singleton para os genótipos ceroso (PF020037) e não ceroso (BRS020062),
durante as fases de espigamento (ES) e enchimento de grãos (EG) na análise do
RNAseq. Legenda: azul escuro – componente biológico; azul claro – componente
celular; verde claro – componente molecular; verde escuro – sem função definida.
Todas essas atividades são perfeitamente coerentes com a resposta de

defesa de plantas a estresses ambientais. Como parte do arsenal de defesa,
existem uma aumentada expressão de genes e de ação de fatores de trans-
crição, pois, são esses, acompanhados por micro RNAs (miRNA), os grandes
mediadores deste processo (El-Esawi et al., 2019; Li et al., 2019). A ação de
transportadores diferentes, como, por exemplo, aqueles presentes em canais

de cálcio, bomba de sódio:potássio:ATPases, que modificam o padrão iônico
meio extra/intracelular alterando os processos de oxidorredução relaciona-
dos à homeostase intracelular. Esses processos oxidativos ocorrem devido
à intensificação de múltiplas ações enzimáticas como ação de fosforilases
e fosfatases entre outras (Cui et al., 2018; Chen et al., 2017; Hossain et al.,
2016). Além disso, a resposta de defesa de plantas requer um grande consu-
mo energético, o que poderia justificar a presença de componentes relaciona-
dos com atividade de reserva de nutrientes. Esse componente, contudo, está
presente em muito baixa quantidade e muito pouco visível (somente traços)
nas Figuras 12 e 13 quando comparado aos demais.
Número total de isotigs 62 EG Número total de isotigs 37 EG

Número total de isotigs 37 ES
Atividade de proteínas ligantes a FT

Atividade catalítica
Atividade de molécula estrutural
Atividade de regulação de tradução
Ligação
Atividade de regulação de canal
Atividade de transdução molecular
Atividade de carreadora de elétrons
Sem classificação
Tag de proteína
Atividade antioxidante
Atividade de regulação enzimática
Atividade de regulação receptor
Atividade de receptor
Atividade de ligação de FT a ácidos nucleicos
Atividade de reserva de nutrientes
Atividade metalochaperona
0 500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500
Figura 12. Análise total GO dos componentes principais de funcionalidade mo-

lecular potencial das sequências Isotigs (número total) obtidos no transcriptoma
de trigo nas amostras ES (espigamento – escala de Zadoks 4.9), EG (enchimen-
to de grãos – escala de Zadoks 7.5) nos genótipos PF020037 e BRS020062.
Legenda: Cinza – representa a variedade cerosa PF020037 na fase de espigamento;
Azul – representa a variedade cerosa PF020037 na fase de enchimento de grãos;
e Verde – representa a variedade não cerosa PF020062 na fase de enchimento de
grãos.
Número total de isotigs 62 EG Número total de isotigs 37 EG

Número total de isotigs 37 ES
Atividade de proteínas ligantes a FT

Atividade catalítica
Atividade de molécula estrutural
Atividade de regulação de tradução
Ligação
Atividade de regulação de canal
Atividade de transdução molecular
Atividade de carreadora de elétrons
Sem classificação
Tag de proteína
Atividade antioxidante
Atividade de regulação enzimática
Atividade de regulação receptor
Atividade de receptor
Atividade de ligação de FT a ácidos nucleicos
Atividade de reserva de nutrientes
Atividade metalochaperona
0 1.000 2.000
Figura 13. Análise total GO dos componentes principais de funcionalidade mole-

cular potencial das sequências Singleton (número total) obtidas no transcriptoma
de trigo nas amostras ES (espigamento – escala de Zadoks 4.9), EG (enchimen-
to de grãos – escala de Zadoks 7.5) nos genótipos PF020037 e BRS020062.
Legenda: Cinza – representa a variedade cerosa PF020037 na fase de espigamento;
Azul – representa a variedade cerosa PF020037 na fase de enchimento de grãos
e Verde – representa a variedade não cerosa PF020062 na fase de enchimento de
grãos.
A demanda de expressão de genes na fase de espigamento (escala de

Zadoks 4.9) do genótipo PF020037 (Figuras 12 e 13), além da situação de
estresse hídrico e outros no campo pode ser também devido ao fato de que a
planta ainda está em desenvolvimento e, por isso, requerendo o aumento de
expressão de vários genes e, talvez, inclusive, aqueles relacionados com a
biossíntese de cerosidade como um fator protetor ao estresse de seca (Bi et
al., 2017; Xue et al., 2017; Patwari et al., 2019).
Por não apresentar cerosidade na cutícula e ser mais sensível por outras
características, o genótipo BRS020062 necessita incrementar os processos
de expressão gênica para superar o estresse (Figuras 12 e 13). O desvio do
consumo energético causado para incrementar a resposta de defesa da plan-
ta ao estresse à seca resulta na diminuição da taxa de crescimento da planta,
bem como na redução da produtividade ou perda de qualidade, de modo que
a planta possa ainda conseguir sobreviver (Ullah et al., 2018).
Um número superior de expressão gênica na fase mais tardia (enchimento

de grãos) (Figuras 12 e 13) pode ser atribuído também ao fato de que esta úl-
tima é aquela em que a planta incrementa a sua produtividade. Os grãos (se-
mentes) contêm uma grande quantidade de energia “embutida” na forma de
proteínas, de enzimas e de outros fatores para atender as necessidades de
desenvolvimento do embrião (futura nova planta). Para que isso aconteça, é
necessário incrementar a síntese de proteína nessa fase e todos os sistemas
biológicos e enzimáticos para esse fim. Além disso, a planta ainda necessita
incrementar a atividade dos sistemas biológicos e fisiológicos relacionados
às diversas respostas de defesa aos estresses ambientais da planta em cam-
po (seca, calor, salinidade, patógenos) para conseguir superar e sobreviver
com uma boa produtividade (Ullah et al., 2018).
A seguir, são apresentadas outras considerações possíveis com o resulta-

do da análise de RNAseq.
O gene mais expresso no genótipo ceroso na fase de espigamento (esca-

la de Zadoks 4.9) é potencialmente uma proteasome alfa subunidade A1 de
atividade transportadora. Esta é expressa 900 vezes mais do que na planta
sem estresse. Os oito genes subsequentes encontrados não apresentam ho-
mologia conhecida e variam de expressão de 600 a 200 vezes em relação à
planta não estressada (Tabela 3).
Na fase de enchimento de grãos, os top 10 genes mais expressos no

genótipo ceroso também têm homologia desconhecida (no hit) e suas expres-
sões variam de 500 a 200 vezes em relação a planta não estressada.
Como já mencionado, a presença de sequências gênicas sem classifica-

ção (no hit) expressa o poder da metodologia do RNAseq na identificação de
potenciais sequências gênicas novas para compreensão dos diversos siste-
mas e processos na planta durante o estresse hídrico no campo. Este resul-
tado está presente neste transcriptoma e em acordo com o encontrado na

análise com bibliotecas subtrativas de cDNA (Figuras 7, 12 e 13).
Tabela 3. Potenciais sequências gênicas com expressão significativa durante o

estresse à seca na Análise 454 GS FLX (Roche).
Genótipo ceroso Genótipo não ceroso

Escala Zadoks 4.9 Escala Zadoks 7.5 Escala Zadoks 7.5
Proteasome Alfa Subunit
– –
A1(+900X)
Sequência de homologia Sequência de homologia
Sequência de homologia
não identificada (Top 8 não identificada (Top 10
não identificada (+600X)
genes -+200-600X) genes -+200-500X)
DREB 2A DREB 2A DREB
WRKY WRKY WRKY
MYB MYB –
Genes relacionados com a Genes relacionados com a
–
biosíntese de cera biosíntese de cera
–
biosíntese de cutina biosíntese de cutina
–
biosíntese de suberina biosíntese de suberina
Biosíntese de etileno e
citocianinas (Isopentenil
biosíntese de etileno biosíntese de etileno
transferase – IPT)
Na variedade cerosa, nas duas fases fenológicas analisadas, foram en-

contrados genes relacionados com potenciais fatores de transcrição como,
por exemplo, DREB 2A, WRKY, MYB, o que demonstra a expressão de genes
relacionados com regulação ou expressão de genes ser importante nesse
sistema, corroborando ao já relatado na literatura corrente (El-Esawi et al.,
2019; Li et al., 2019). Também foi possível observar genes relacionados com
biossíntese de cera, formação de cutina, suberina ou parede celular, o que
corrobora com a observação morfológica visual para este genótipo, em que
se identifica a presença de cerosidade em folhas a partir da fase de espiga-
mento (escala de Zadoks 4.9) (BI et al., 2017; Ribeiro Junior et al., 2006).
Esse deve ser, certamente, um de seus mecanismos de resposta de defesa
expressando em um fenótipo mais tolerante. Outros genes de controle hormo-

nal, tais como os relacionados com a biossíntese de etileno ou com a biossín-
tese de citocianinas, como a isopentenil transferase (IPT), que já foi relatado,
em arroz, como um gene capaz de induzir uma certa tolerância à seca, pois
garante uma homeostasia entre os processos source: sink (Ullah et al., 2018;
Hossain et al., 2016; Reguera et al., 2013; Peleg et al., 2011). Esse gene
também foi encontrado nesse transcriptoma. Porém, somente foi encontrado
na fase de enchimento de grãos (escala de Zadoks 7.5), aparentemente em
baixa expressão e somente na planta não estressada. Esse achado poderia
ser um indicativo de que, apesar da cerosidade cuticular observada nesse
genótipo, o efeito da biossíntese de citocianinas – mantendo a homeostase
entre os processos de fotossíntese e metabolismo (especialmente síntese de
proteínas na fase de enchimento de grãos, escala de Zadoks 7.5), descritos
em plantas de arroz tolerante (REGUERA et al., 2013; PELEG et al., 2011)
–, pode não estar presente nessa cultivar. Porém, mais experimentos são
necessários para responder completamente essa questão.
No genótipo não ceroso, o gene mais abundante também não tem homolo-
gia conhecida (no hit) e está expresso 600 vezes a mais do que na planta não
estressada. Outros genes relacionados com fatores de transcrição DREB,
WRKY também podem ser encontrados, mas não foi encontrado isopentenil
tranferase ou genes relacionados com controle hormonal. Somente genes
relacionados com a biossíntese de etileno. Esse dado também pode ser ex-
plicado porque este fitormônio está associado à condição de senescência,
que representa a fase final nas plantas suscetíveis ou não tolerantes ao baixo
teor de umidade ou outros estresses abióticos e bióticos (Ullah et al., 2018).
O resultado gerado na análise de RNA-seq é bastante complexo e todos

os resultados apresentados aqui necessitam ser estudados e validados com
mais experimentos. Inclusive, a demonstração do aumento da cerosidade
em folhas do genótipo ceroso aqui estudado. Entretanto, com o exposto, é
possível observar o poder que a metodologia oferece para novos estudos e
para a elucidação de processos e mecanismos biológicos complexos como
a tolerância à seca em plantas. Todos esses estudos são necessários na
inovação de melhores tecnologias capazes de superar possíveis ameaças à
produtividade agrícola devido às mudanças climáticas.
Ressalta-se, com o sequenciamento completo do genoma do trigo, o re-

sultado do sequenciamento deste transcriptoma em genótipos de respostas
contrastantes à seca, fenotipadas em campo no Cerrado Brasileiro, pode
servir para subsidiar novos trabalhos a partir de uma nova montagem des-
se transcriptoma. Entre estes, aqueles com o objetivo de identificação dos
principais mecanismos fisiológicos em nível genético de tolerância à seca em
plantas cultivadas nessa região, que é considerada uma área de expansão
para a cultura, bem como, caracterização de novos genes e marcadores para
serem utilizados em processo de genotipagem e fenotipagem nessa cultura
em campo, agregando informações nos mapas genéticos ou auxiliando análi-
ses de sintenia entre genótipos relacionados ou, ainda, subsidiar estratégias
para o desenvolvimento de plantas mais tolerantes pelas metodologias do
DNA recombinante.
O estudo de fenotipagem de plantas tolerantes à seca em campo, ainda,
subsidia decisões para o uso eficiente de água de irrigação para a cultu-
ra do trigo plantado em safrinha ou na estação seca do Cerrado brasileiro,
contribuindo para a prática de cultivo sustentável em atenção aos objetivos
do desenvolvimento sustentável da Organização das Nações Unidas (ONU),
Agenda 2030.
De uma forma geral, comparando-se o resultado da funcionalidade dos
genes potenciais resultantes, gerados nas bibliotecas subtrativas com a aná-
lise total de potenciais genes do RNAseq, pode ser dito que as sequências
gênicas consistentes resultantes das bibliotecas subtrativas de cDNA pare-
cem estar englobadas no resultado das possíveis funções ou relação de pro-
cessos fisiológicos-genéticos resultantes da montagem realizada na análise
de RNAseq. Entretanto, essa segunda análise amplia muito essa categori-
zação. Talvez, uma única vantagem da análise com bibliotecas subtrativas
seja a de maximizar a identificação de genes mais específicos e diferenciais,
mas, não necessariamente, aqueles que ocorrem em baixa expressão. Mas
essa abordagem deve ser superada por meio do sequenciamento RNAseq
em uma única célula (Shulse et al., 2019).
Os avanços ainda mais prementes da metodologia do RNAseq e o se-
quenciamento completo do genoma do trigo, com os sistemas Ilumina
(Illumina Inc.) e Pacific Bioscience Company (PacBio) ou outros, associados
com os marcadores caracterizados em vários mapas genéticos e outras aná-
lises, permitem dizer que o potencial do RNAseq em gerar informações de

expressão gênica e serem identificadas sequências gênicas novas para a
compreensão dessa complexa resposta de defesa da planta (estresse hídrico
no campo associado com o de calor, salinidade e de patógenos) é enorme
e é uma metodologia indispensável para ser integrada nos projetos com a
finalidade de geração de inovações para a tolerância à seca em vista das
mudanças climáticas.
Conclusões
Este trabalho permite concluir que:
As estratégias de construção de bibliotecas subtrativas de cDNA e se-

quenciamento de trancriptomas (RNA-seq) permitem a seleção e a caracteri-
zação de genes relacionados em processos fisiológicos-genéticos intracelu-
lares. Entretanto, a estratégia do RNA-seq é consideravelmente muito mais
eficiente para seleção, identificação e caracterização.
As análises realizadas com os dados das sequências categorizadas, de

uma forma total, e por funcionalidade molecular potencial, permitem demons-
trar uma grande expressão gênica entre os genótipos estudados. Sendo os
potenciais genes mais expressos apresentam atividade em processos rela-
cionados com atividade de expressão e regulação gênica; ligação à fatores
de transcrição (FT) em ácidos nucleicos ou proteínas à FT, atividade cata-
líticas ou de regulação enzimática e proteínas receptoras, transportadoras
e relacionadas com o sistema de oxidorredução. Todos esses já bem ca-
racterizados na literatura para o estresse ambiental. Esses dados, contudo,
representam um potencial e necessitam mais experimentos e estudos com o
objetivo de comprovar e validar em condições de campo.
Este resultado de sequenciamento de transcriptoma em genótipos de trigo

em condição de estresse hídrico em campo na região do Cerrado brasileiro
pode servir para subsidiar novos trabalhos, pois as informações geradas po-
dem ser utilizadas para uma montagem mais fidedigna, como também, para
a comprovação dos principais mecanismos de tolerância à seca em plantas
cultivadas nessa região para serem utilizados em processo de genotipagem
e fenotipagem em campo.
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tb01084.x.
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Estudo de Expressão Gênica para

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

Estudo de Expressão Gênica para a Seleção de

Maria Cristina Rocha Cordeiro

Projeto gráfico da coleção

Todos os direitos reservados.

E82 Estudo de Expressão gênica para a seleção de genótipos de trigo contrastante na

34 p. (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Cerrados, ISSN

1. Seleção fenótipa. 2. Seca. 3. Mudança climática. I. Cordeiro, Maria

Shirley da Luz Soares Araújo (CRB-1/1948) © Embrapa, 2021

Estudo de Expressão Gênica para a Seleção

Resumo – A seca é uma ameaça mundial à produção de alimentos e pode

Termos para indexação: fenotipagem; campo; cera; sequenciamento; mu-

Gene Expression in Contrasting Wheat

marcadores genéticos (Microsatélites, SNPs, KASPs); a revisão e a correção

Figura 1. Precipitação pluviométrica média mensal observados na Estação Principal

de fósforo; 32,5 g/dm3 de matéria orgânica (MO); 200 g/kg-1 de areia,

derado um mecanismo de tolerância à seca) em ponto referente à planta com

e transformados por eletroporação em células de Escherichia coli (E. coli)

sumários do processo de anotação também foram gerados com o programa

As amostras analisadas em RNA-seq foram as mesmas extraídas como

Antes do sequenciamento, as amostras de RNA enviado à Macrogen fo-

Etapa 1 – para todas as amostras analisadas: as sequências geradas utili-

Etapa 2 – em cada biblioteca/amostra, o sequenciamento gerou sequências

Etapa 3 – as sequências Singleton foram processadas pelo programa

estão submetidas ao máximo do estresse. Na Figura 5, é observado o deta-

Produção Produção Estado Amadure-

Figura 3. Esquema das fases fenológicas na cultura do trigo na escala e subescala de

Foto: Maria Cristina Rocha Cordeiro

Foto: Maria Cristina Rocha Cordeiro

Figura 5. Detalhe do vigor do genótipo com maior cerosidade foliar (PF020037) na

A fase de espigamento (ES) (Escala de Zadoks 4.9) foi escolhida pela

cerosidade e, aquelas presentes no ponto sem estresse não, vindo a aconte-

Na Tabela 1, são mostradas as quantidades iniciais e finais de tecido uti-

Tabela 1. Resultado da eExtração do RNA dos genótipos de trigo.

Quantidade média Quantidade média

Figura 6. Gel de agarose 1,5% demonstrando a in-

O resultado das bibliotecas subtrativas demonstrou que, na biblioteca do

titativo está em acordo com o resultado que obtivemos com as bibliotecas

Tabela 2. Resultado Geral das Análises de Sequenciamento das bibliotecas subtrati-

Número de sequência total

De 576 cDNAs sequenciados resultantes da biblioteca subtrativa no ge-

caracterizados e/ou relacionados com algum processo ou sistema ainda au-

Genótipo não Ceroso Quantidade Genótipo Ceroso Quantidade

sequências anotadas totais

sequências anotadas consistentes

sequências anotadas não consistentes

sem hits em Blast

Figura 7. Resultado da anotação das sequências encontradas nas biblio-

Atividade de Transferase Ligação ao DNA

Ligação de Cátions Ligação de RNA

Figura 9. Resultado da análise do componente de função molecular

Atividade lyase (2)

Figura 10. Resultado da análise do componente de função molecular das sequências

Foram observadas sequências, por exemplo, possivelmente relaciona-

Em comparação com as análises com bibliotecas subtrativas de cDNA,

O número de sequências gênicas geradas (potenciais genes) foi muito

como pode ser observado na Tabela 2. Assim, a análise de RNA-seq demons-

tiva. As atividades relacionadas com processos moleculares estruturais e as

PF020037 ES 68% 12%

Todas essas atividades são perfeitamente coerentes com a resposta de