H.C. Ibañez et al.

/ Science of the Total Environment 650 (2019) 1278-1291

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Science of the Total Environment

ELSEVIER E n d e r e ç o d o s i t e : w w w. e l s e v i e r. c o m / l o c a t e / s c i t o t e n v

Tentências espaciais em malformações congênitas e a química de cursos

d’água no Sul do Brasil.
Humberto C. Ibanez a,b, Viviane S. Melandac, Viviane K.Q. Gerber a,b, Otavio A.B. Lichtd, Marilea V.C. Ibanez a,
Terencio R. Aguiar Junior e, Rosiane G. Mello a,b, Heloisa Komechen a,e, Diancarlos P. Andrade a,b,
Gledson L. Picharskia,b, Damasio P.G. Figueiredo e, Mara A.D. Pianovskie,f, Mirna M.O. Figueiredo e,
Gislaine Custodio e, Ivy Z.S. Parise a,b, Laura M. Castilho a, Mariana M. Paraizo a,b, Chloe Edinger a,
Carmem M.C.M. Fiorig,h, Helio Pedrini Nilton Kiesel Filhoj, Ana Luiza M.R. Fabro aj, Rayssa D. Fachin a,
Karin R.P. Ogradowskia,b, Guilherme A. Parise e, Paulo H.N. Saldiva k, Edith F. Legalb, Roberto Rosatia,b, Carlos
Rodriguez-Galindo', Raul C. Ribeiro b,m, Gerard P. Zambettin, Enzo Lallio, Bonald C. Figueiredo a'b'e'p'*
a
Instituto de Pesquisa Pelé Pequeno Príncipe, Curitiba, PR, Brasil
b
Faculdades Pequeno Príncipe, Curitiba, PR, Brasil
c
Departamento de Vigilância Epidemiológica, Secretaria do Estado da Saude do Paraná, Curitiba, PR, Brasil
d
Instituto de Terras Cartografia e Geologia, Curitiba, PR, Brasil
e
Centro de Genética Molecular e Pesquisa do Câncer em Crianças (CEGEMPAC), Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil
f
Hospital Erasto Gaertner, Curitiba, PR, Brasil
g
União Oeste Paranaense de Estudos e Combate ao Câncer - UOPECCAN, Cascavel, PR, Brasil
h
Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, PR, Brasil
i
Instituto de Computação, Universidade de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
j
Hospital Pequeno Príncipe, Curitiba, PR, Brasil
k
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
l
Department of Global Pediatric Medicine, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA
m
Department of Oncology, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA
n
Department of Pathology, St. Jude Children's Research Hospital, Memphis, TN, USA
o
Institut de Pharmacologie Moleculaire et Cellulaire CNRS, 660 route des Lucioles, Sophia Antipolis, Valbonne, France
p
Departamento de Saúde Coletiva, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brasil

D E S TA Q U E S R E S U M O G R Á F I C O

• Poluição química em rios foi demonstrada

com base em níveis de DDT e íons de
Cloro (Cl−).
• Cl− correlacionado com DDT e
produtividade de agrícola (PA) em sub-
região como alta PA.
• Cl− e agricultura estão espacialmente
autocorrelacionados com malformação
congênita (MC).
• Aumento de 2.96 mg/L no Cl− foi associado
a aumento de 45% na densidade de kernel
da MC.
• Níveis de Cl− podem servir como
marcadores de longo prazo de degradação
de substancias químicas contendo Cl−.

* Correspondência para o autor em: Instituto de Pesquisa Pele Pequeno Principe, Avenida SilvaJardim, 1632, Agua Verde, 80.250-200, Curitiba, PR, Brazil. E-mail address: bonald@ufpr.br (B.C. Figueiredo).’

https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2018.09.061
0048-9697/© 2018 Published by Elsevier B.V.’
 I N F O R M A Ç Ã O
Histórico do Artigo:
Recebido em 21 Maio 2018
Receibido revisado em 17 Agosto 2018
Aceito em 4 Setembro 2018
Disponível online em 05 Setembro 2018
Editor: Ashantha Goonetilleke
Palavras-chave:
Produção agrícola
Pesticida
Organoclorado
Cloreto
Malformação congênita
Análise espacial
D O A R T I G O R E S U M O
A incidência de malformação congênita (MC) variável entre 399 municípios do estado do Paraná, Sul do Brasil, sugere o
papel etiológico de fatores ambientais. Este estudo examinou a) concentração ambiental de ânions de cloro (Cl −)
associados com organoclorados (OCs); e b) associação entre essas substâncias químicas e a produção agrícola com
MCs, usando um Sistema de informações geográficas. Em um dos três anos que durou a amostragem (2008, 2009 ou
2010) foram medidos os níveis de Cl −, dichlorodiphenyltrichloroethane (p,p'-DDT), dichlorodiphenyldichloroethylene (p,
p'-DDE), dichlorodiphenyldichloroethane (p,p'-DDD) e endosulfan em 465 (465/736, 63%) bacias hidrográficas. A
produtividade agrícola das colheitas entre 2006 e 2010 também foi avaliada (t/km 2). Mais, a densidade kernel de MC
para os 399 municípios do Paraná, durante o período de 2007 a 2014, foi investigada. Os níveis de Cl − aumentaram
significativamente em um dos três anos (2008, 2009 ou 2010) nas bacias hidrográficas do oeste, comparados com 1996
(p < 0,0001). Os múnicípios foram divididos de acordo com os níveis de Cl − encontrados, onde a sub-região C2 (centro-
sul) < 1.8 mg/L < sub-regiões C1 (noroeste) e C3 (leste-sudeste). Nós identificamos 8756 casos de MCs entre 1.221.287
recém-nascidos (RN) em todas as sub-regiões. C1 teve as mais altas concentrações de DDT-DDE-DDD (p,p'-DDT +
p,p'-DDE + p,p'-DDD), maior produtividade agrícola, e maior densidade kernel de CM. C2 e C3 tiveram menores
produtividade agrícola (por km quadrado) e densidade de MC. Um aumento de 2.96 mg/L no Cl− entre as sub-regiões
C1 e C2 foi co-localizada com um aumento de 45% na densidade de MC (risco relativo espacial = 1.45, CI95%: 1.36-
1.55). C1 teve os mais altos Log das Razões de Verossimilhança (p = 0,001) identificado via análise de agrupamento do
SaTScan. Organoclorados e outras substâncias tóxicas cloradas podem ter contribuído para MCs em humanos, e essas
substâncias químicas são, em última análise, transformadas e liberam Cl − nos rios. Níveis mais elevados de Cl − foram
significativamente correlacionados com maior produtividade agrícola, níveis de DDT-DDE-DDD, e MCs em algumas
partes das sub-regiões norte e oeste (C1).
© 2018 Published by Elsevier B.V.

1. Introdução
Pesticidas contêm diversas substâncias químicas com níveis variáveis
de toxicidade. Pesticidas orgânicos incluem os pesticidas organoclorados
(OCs), organofosforados (OPs), carbamatos e piretroides sintéticos. Entre
estes OCs estão aqueles associados ao dichlorodiphenyldichloroethylene
(p,p '-DDE), 1 cloro 2 [2,2 dicloro 1 (4 chlorophenyl)ethyl]benzene (o,p '-
DDD) (também conhecido como mitotano), e café, no norte. Cabe realçar que o Paraná é o segundo maior estado
dichlorodiphenyldichloroethane (p,p'-DDD), que são os principais derivados
do dichlorodiphenyltrichloro- ethane (p,p'-DDT). Estes OCs já foram
utilizados livremente na agricultura antes de se tornarem parcialmente
proibidos por lei no Brasil em 1985 (Brasil, 1985); em seguida terem sido
totalmente banidos em 2009 (Brasil, 2009).
Santos et al. (2006) relatam concentrações de OC acima do limite
máximo legal em vários tipos de queijos produzidos no Rio Grande do Sul
(RS), um estado próximo ao Paraná e com fronteiras com Uruguai e
Argentina. Eles também descobriram que vários OCs foram encontrados
sendo mais prevalentes e com maior concentração no sangue (10%), leite
materno (78%), e tecido adiposo (100%) em habitantes do meio rural que
naqueles residentes em áreas urbanas, em 2003 e 2004. Não sendo
surpreendente, traços de p,p'- DDT, p,p'-DDD, e p,p'-DDE foram
encontrados em todas as amostras de água das bacias que suprem os 316
municípios do estado de RS em 2016 (Rubo, 2016).
A Pesquisa Geoquímica do Estado do Paraná, sob direção da
instituição do governo do Estado, Minerais do Paraná (MINEROPAR),
identificou níveis atípicos de ânion de cloro (Cl −) em cursos de água no
norte do estado do Paraná, e os pesquisadores elaboraram a hipótese de
que o excesso de Cl− pode ter derivado de processos de degradação de
pesticidas no local (Licht, 2005; MINEROPAR, 2001).
O acoplamento de dados de poluentes ambientais e malformação
congênita (MC) com outros dados espacialmente dependentes pode ajudar
a esclarecer os mecanismos de causalidade e ajudar na predição para
práticas de saúde pública (Fore et al., 2002; Dolk e Vrijheid, 2003; Brent,
2004). De Siqueira et al. (2010) relataram as quantidades de ingredientes
ativos de pesticidas agrícolas vendidos e consumidos em 2000 em
diferentes estados do Brasil. O estado de São Paulo teve o maior uso de
pesticidas (8,05 kg/ha/ano por área cultivada), enquanto o Paraná teve o
quarto maior uso de pesticidas (3,44 kg/ha/ano por área cultivada). Estes
autores compararam tais dados com a frequência média de MC em cada
estado, que variou de 0,15% a 0,.79%. A frequência média de MC no
Paraná foi de 0,66%. Zhang (2018) revisou o aumento dramático de
consumo de defensivos agrícolas no Brasil e outros principais países nos
últimos anos, sugerindo maior potencial para excessiva poluição e severo
impacto para saúde de fetos humanos.
O Paraná tem uma das mais produtivas áreas agrícolas do Brasil e,
historicamente, vem usando defensivos para reduzir perdas em lavouras,
uma solução que é adotada globalmente. O Paraná também (com 199.727
km2, 399 municípios, 10,5 milhões de habitantes) tem uma das maiores
produtividades agrícolas por quilômetro quadrado do planeta. Soja, milho e
trigo ocupam 85,7% das áreas de cultivo. Além disso, um grande número de
outros produtos agrícolas são cultivados, especialmente cana de açúcar e
produtor de soja do Brasil (IBGE, 2016; IPARDES, 2017).
Este é um dos primeiro estudos de larga escala sobre a associação do
meio ambiente e doenças no Brasil. Coletamos amostras de água de bacias
hidrográficas para medição de Cl − e defensivos agrícolas e analisamos suas
relações com a produtividade agrícola e taxas de MC (incidência e
densidade kernel ponderada), que foram calculadas utilizando dados
coletados da população geral. Demonstramos que os níveis de cloreto estão
correlacionados com a produtividade das lavouras e os níveis de defensivos
(p,p'-DDT e seus derivados) e então validamos essa correlação via um
processo de dois passos. Inicialmente, a análise de regressão espacial foi
realizada e, em seguida, a acuracidade dos resultados da primeira etapa foi
verificada com base nos log das razões de verosimilhança - log likelihood
ratios (LLR) a partir da análise de agrupamentos. O mais importante, nossa
abordagem efetivamente propõe o monitoramento de Cl − como uma
alternativa de pré-triagem para testes de larga escala em busca de
substancias tóxicas cloradas usadas na agricultura. Finalmente,
apresentamos fortes evidências que a suscetibilidade a MC esteja
associada com poluição ambiental causada pelo homem (antropogênica).
2. Materiais e métodos
2.1. Projeto do Estudo
Neste estudo, realizamos um estudo descritivo e analítico
epidemiológico ambiental. Postulamos que os níveis de Cl − em bacias
hidrográficas poderiam ser um marcador de quantidades anteriores de
organoclorados, fertilizantes e outros compostos clorados expostos à
população. Testamos a hipótese que os riscos de MC variam em diferentes
sub-regiões através da classificação das sub-regiões conforme os níveis de
Cl− nos rios. Para tanto, os municípios foram agrupados de acordo com os
níveis de Cl− acima ou abaixo de 1.8 mg/L; o quadro é apresentado na Fig.
1. Considerando todas as possíveis fontes de Cl −, o nível de produtividade
agrícola, número de instalações industriais e a proximidade a grandes áreas
urbanas também foram levados em conta no agrupamento dos municípios.
 H.C. Ibañez et al. / Science of the Total Environment 650 (2019) 1278-1291

Fig.1. Localização da área do estudo, e diagrama descrevendo o quadro geral para teste de aleatoriedade espacial entre variáveis independentes e dependentes. Cl − = níveis do
ânion cloro na água; CMs = malformações congênitas; PA = produtividade agrícola; DDT = níveis de DDT + DDE + DDD na água.

Da mesma forma, os municípios podem ser classificados em três sub-
regiões (C1, C2 e C3). Adicionalmente, C0 foi classificada como o grupo
de 66 múnicípios para os quais a análise de água não seria realizada.
Maiores detalhes são apresentados nos Resultados (Seção 3.1).
Os níveis de Cl− e OCs (p,p'-DDT, p,p'-DDD e p,p'-DDE) foram
medidos em locais estratégicos dentro das bacias, (georreferenciados por
latitude e longitude). Primeiramtente, usamos estes dados para avaliar as
correlações entre eles (de acordo com os pontos de coleta); em segundo,
os dados georreferenciados à área da bacia foram usados para estimar seus
níveis proporcionais no município. Em seguida, essas estimativas foram
utilizadas para avaliar as correlações com as variáveis georreferenciadas
pela área tais como produtividade agrícola (t/km 2) ou densidade kernel de
MC.
2.2. Análise do Cl−
2.2.1. Bacias coletoras e amostragem da água
Em bacias de rios, a água flui de acordo com o declive das montanhas
para as planícies. A água coletada em um local onde um tributário encontra
um rio principal pode ser usada para determinar a caracteristic de todos os
rios drenando para uma determinada bacia coletora. A fração de um
elemento ou substância química em particular na água coletada naquele
ponto (meio do canal do rio, onde a água flui regularmente) deveria ser
considerada como a fração média de todos os rios que compreendem a
bacia coletora. Para comparar a composição química das amostras de
água de um dado território, as bacias coletoras devem ter áreas similares.
Em 1996, a MINEROPAR delimitou 736 bacias coletoras com uma média
de área de coleta de 225-km2 cobrindo 199.727 km2 estado do Paraná.
Água corrente de cada estação de amostragem foi coletada em 697
bacias (a área amostrada corresponde a 165.646 km2 ou 83% do Paraná) e
analizadas para determinação do conteúdo iônico incluindo Cl − (Licht,
2005; MINEROPAR, 2001). Os resultados de Cl− de 1996 foram fornecidos
pela MINEROPAR, um parceiro neste estudo. As amostras de água foram
coletadas apenas uma vez para cada bacia, em 2008, 2009 ou 2010, sob
supervisão da MINEROPAR, em 63% dessas estações de campo
(465/736) no meio do canal dos rios. Cada amostra de água (1 L) foi
filtrada a vácuo usando filtros Millipore (tamanho do poro: 45 μm) e
armazenadas em garrafa de de vidro pré-higienizada e esterilizada. Todas
as amostras de água foram mantidas congeladas a -20 °C por tempo de 1
a 3 anos antes das análises.
2.2.2. Cromatografia Iônica
As análises de Cl− foram coordenadas pela MINEROPAR (Curitiba,
Brasil) e processadas pelo Laboratório de Análise Mineral (LAMIN, Rio de
Janeiro, Brasil) da CPRM: Companhia de Pesquisa de Recursos Minerais,
que também havia realizado a pesquisa geoquímica multi-elementar em
1996 (Licht, 2005; MINEROPAR, 2001). O cloreto foi quantificado por
cromatografia iônica usando o método EPA 300.1/USEPA adaptado de
estudos anteriores (APHA Method, 1992; Edgell et al., 1994). Água
ultrapurificada com condutância <0,1 μS/cm (Purelab™ Maxima, Elga Lab
Water, UK) foi usada para a preparação de todas as soluções, que foram
filtradas através de uma membrana de poro de 0,2 μm. Uma solução
padrão foi preparada utilizando cloreto de sódio (Merck, Germany). A
solução eluente (Na 2CO3 9.0 mM) foi injetada em uma taxa de fluxo de 0,8
mL/min. Separação ótima foi obtida por otimização de temperatura, pH, e
taxa de fluxo da fase móvel, e pela plotagem do gráfico entre potencial do
eletrodo e concentração. Áreas de pico e alturas de todas as amostras
foram medidas (uma concentração próxima da mínima detectável, i.e., 0,01
mg/L). Curvas de calibração foram construídas pela plotagem das áreas de
pico para cada íon versus a concentração. A acuracidade do método era
verificada periodicamente. O controle de qualidade foi realizado pela
checagem dos níveis de concentração contra a solução padrão calibrada
no meio da curva de calibração. O sistema de cromatografia iônica incluiu
um aparelho Thermo Scientific Dionex™ modelo 5000 (USA), um detetor
de condutividade (Alltech Model 650, USA), uma coluna de guarda de
ânion (protetor) (Dionex AG9-HC, 2 mm, model 52248, USA) e uma coluna
separadora de ânion (Dionex AS9-HC, 2 mm, 160 52244, USA).
2.3. Análises de p,p'-DDT, p,p'-DDE, p,p'-DDD e endosulfan
2.3.1. Extração de amostras
O protocolo de extração foi estabelecido pela optimização do protocolo
proposto por Lacorte et al. (2000) e modificado por Aguiar et al. (2015). As
amostras foram inicialmente filtradas usando membranas de celulose com
tamanho de poro de 0,45 μm e diâmetro de 47 mm (Merck Millipore -
Darmstadt, Germany) e congeladas a -20 °C por um período de um a três
anos. Antes da extração, 0,1 μg de Atrazine-D5 (pureza 99%, Bellefonte,
PA, USA) foi adicionada a 500 mL de amostra de água como padrão
substituto. Para calcular perdas durante o processo de extração, o
endosulfan, p,p'-DDT, p,p'-DDE e p,p'-DDD foram extraídos de cada
amostra de água (500 mL) utilizando cartuxos C18 de extração de fase
sólida adquirido de Waters (Milford, MA, USA). Cada cartuxo foi
primeiramente limpo com 6 mL de acetato de etila , metanol, e água Milli-Q
ultrapure (Millipore, Bedford, MA), depois que as amostras foram
percoladas através dos cartuxos usando um sistema de vácuo (JT Baker -
Phillipsburg, NJ) a um fluxo de 6 mL/min. Os cartuxos foram então secos
sob vácuo por 15 min para remoção do excesso de água, e a extração
realizada com 6 mL de cada de acetato de etila e metanol. O extrato foi
seco sob um leve fluxo de nitrogênio utilizando um bloco seco a 40 °C
(Marconi, SP, Brazil) e reconstituído em 50 μL acetato de etila. As amostras
foram, então, transferidas para ampolas para análise de cromatografia
gasosa-espectometria de massa.
2.3.2. Cromatografia gasosa-espectometria de massa
(Gas chromatography-mass espectometry, (GC-MS))
Os p,p'-DDT, p,p'-DDE e p,p'-DDD foram extraídos utilizando método
proposto por Lacorte et al. (2000) e Aguiar et al. (2015) de acordo com os
protocolos SANCO/10232/2006 EU (EURL, 2006). A análise GC-MS foi
realizada utilizando um cromatógrfo de gás Varian 431-GC acoplado a um
Varian 220 MS, um espectrômetro de massa de porta de íon equipado com
uma coluna capilar VF-5 ms (30 m x 0,25 mm, com espessura de filme de
25 μm). A temperatura do forno GC foi programada para aumentar de 90
°C (mantida por 0,5 min) a 160 °C (mantida por 4 min) a 15 °C min -1, e
então para 280 °C (mantida por 10 min) a 20 °C min -1. As temperaturas da
interface GC e das fontes de íons eram 280 °C e 200 °C, respectivamente.
O espectrômetro de massa de porta de íons foi acionado no modo de
impacto do elétron de ionização a uma energia de ionização de 70 eV e
corrente de emissão de 300 mA. Gás hélio foi utilizado como gás condutor
a um fluxo constante de 1.0 mL/min. A injeção de volume foi de 1 μL em
modo sem divisão (1 min) com injetor à temperatura de 250 °C. Da
dissociação induzida por colizão (MS/MS), três íons de fragmentos de
massa foram selecionados para cada composto: endosulfan--β (m/z 269*,
263 e 400), endosulfan α (m/z 263*, 269 e 400), endosulfan-sulphate (m/ z
291*, 285 e 421), 4,4 p,p'-DDT (m/z 199*, 165 e 342), 4,4 p,p'- DDD (m/z
199*, 165 e 320) e 4,4 p,p'-DDE (m/z 246*, 316 e 318), que inclui os
principais íon de fragmentos de massa utilizados como precursores (*). Os
íons de fragmento de massa selecionados foram utilizados para a
quantificação e os outros compostos foram utilizados para confirmação de
estrutura. Soluções padrão foram preparadas para todos os agroquímicos
(pureza 99%, Sigma-Aldrich, Missouri, USA) a concentrações de 10 mg
mL-1 em acetato de etila e foram armazenados a -4 °C. O Atrazine-D5 foi
determinado utilizando os íons m/z 127, 139, e 205. Uma curva de
calibração com padrões diluídos (0,01-30 μg/L) foi elaborada. As curvas de
Calibração tinham coeficientes de correlação de 0,99 e desvios padrão
relativos <9% (n = 4) para todos os compostos. O limite inferior de
quantificação foi de 0,01 μg/L, no qual todos os compostos tinham sinais
significativos. Estudos de recuperação foram realizados com uma mistura
de agroquímicos a uma concentração de 1 μg/L água de solo livre de
agroquímicos; valores de recuperação ficaram no intervalo entre 83 e 97%
com desvio padrão de <12% (n = 5) para todos os compostos. Os
compostos alvo foram identificados e confirmados baseado nos seguintes
critérios: (I) desvio de tempo de retenção em relação ao padrão <2 s, (II)
três valores m/z característicos e (III) variação de intensidade nas
características m/z <15% comparadas com o m/z padrão.
2.4. Teoria e Cálculo
2.4.1. Medidas de CI-, p,p'-DDT, p,p'-DDE, p,p'-DDD e endosulfan em
bacias hidrográficas dentro de um município
Para desenvolver uma referência comum para estatísticas (áreas
administrativas dos municípios), a soma dos níveis de p,p'-DDT + p,p'-DDE
+ p,p'- DDD (DDT-DDD-DDE) e CI - foram proporcionalmente distribuídos
entre os municípios contidos ou parcialmente cobertos pelas respectivas
bacias hidrográficas. Para cada bacia, calculamos um coeficiente de
interseção com a área administrativa do município. Essa referência comum
possibilitou a avaliação das variáveis de relacionamento atribuídas à área
física (bacia hidrográfica) com variáveis econômicas ou demográficas
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referenciadas por toda área administrativa (município). Os níveis estimados
das substâncias químicas CI- ou DDT-DDD- DDE (LcXm) no município (m)
pode ser expresso como
onde LcXm é o nível estimado da substância química X no município m,
LcXw é o nível da substância X na bacia hidrográfica w, N é o número total
de bacias que se interseccionam à área administrativa do município.
icfmw é o coeficiente de interseção entre o município e a bacia hidrográfica,
e stjntersection e st_area são funções do sistema PostGIS (PostGIS,
2017). st_intersection produz uma geometria que representa a porção
superposta dos polígonos m e polígonos w; st_area produz uma área de
geometria cartesiana bidimensional.
2.4.2. Produtividade agrícola no Paraná
Para avaliar se as variações nos níveis de Cl − estão associadas com
as principais culturas (soja, milho, trigo, feijão, cana de açúcar e café) em
dada região, a média anual em toneladas (t) de produtos agrícolas colhidos
em cada município (Tapm) obtida a partir do registro público (IPARDES,
2017) foi dividida pela área total do município (Aream) (IBGE, 2016). Isso
nos permitiu calcular a produtividade das (Cpm, t/km2) da seguinte forma:
onde Tmy é a quantidade de toneladas (tons) de soja + milho + trigo +
feijão + cana + café colhidos no município m no ano y, e Ny é o número de
anos (Ny = 5) usado para obter a média anual.
2.4.3. Incidência de malformação congênita e densidade de kernel
ponderada
Foram considerados todos os novos casos de MC listados na
Classificação de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde, 10ª
Revisão (Capítulo XVII, ICD-10,2012). Os dados de MC foram obtidos junto
à base de dados de nascimentos do Programa de Vigilância da Secretaria
do Estado da Saude do Parana (SESA) para todos os 399 municípios, que
são habitados por grande proporção de indivíduos com ancestrais
europeus. Nascimentos em óbito e abortos espontâneos foram excluídos.
O período de levantamento de dados inclui o intervalo 1° de Janeiro de
2007 a 31 de Dezembro de 2014. Aprovação foi obtida do Comitê de Ética
da SESA (Hospital do Trabalhador de Curitiba). A Taxa Média Ponderada
da incidência anual de malformações congênitas (CMwair) entre nascidos
vivos pode ser expressa como
onde m é o município, y é o ano, CM representa malformação congênita, e
LB representa o número de nascidos vivos.
Os endereços dos recém-nascidos diagnosticados com MCs foram
geograficamente codificados pela API Geocoding do Google Maps (Google
Developers, 2017). Essa abordagem foi útil para descartar tendências de
referência associadas com endereços de centros clínicos. Depois da
codificação geográfica, os dados pontuais onde viveram durante a gravidez
foram convertidos para uma grade de densidade de MC, usando o
estimador de densidade de kernel (núcleo) 2D de pontos em uma função
de área com um núcleo normal bivariado alinhado ao eixo; esses resutados
foram avaliados em uma grade quadrada com o pacote R MASS (Venables
and Ripley, 2002) e foram adaptadas para tratamento de ponderação dos
pontos pela função kde2d.weighted no pacote R ggtern (Hamilton, 2017).
De forma similar às variáveis físicas (Cl − e DDT-DDD-DDE), foi necessário
transformar os pontos da grade (grid points (gp)) para obter uma referência
comum (área administrativa do município). Transformamos a grade em
área fazendo a média dos pontos dentro de cada município. A densidade
ponderada kernel no município m (CMwkdem) pode ser expressa como
segue:
onde m é o município; N é o número de pontos da grade dentro do
município obtidos pela função st_within (PostGIS, 2017); x e y representam
as coordenadas UTM Leste e Norte respectivamente (unidade UTM =
metro; as coordenadas UTM foram geo codificadas a partir do endereço da
mãe); n = 150 para o número de pontos de grade em cada direção; w é o
peso da ponderação; LBmp é o número de nascidos vivos no município m
em um dado período p de anos; e PRe = c(135977, 799877, 7044829,
7509602) para a extensão do Paraná (zona UTM 22S). Designando o valor
1 para os casos e considerando suas respectivas localizações, a
densidade kernel de eventos espaciais (territoriais) em uma malha regular
pôde ser obtida. Para as MCs, a chance de ocorrência do evento também
está associada ao tamanho da população. Assim, também foi necessário
um fator de ponderação para cada ponto e esse foi determinado como
sendo inversamente proporcional ao número de recém-nascidos durante o
período (caso de MC/Σnascimentos).
Embora os casos de MC serem georreferenciados por pontos
(endereços) o total de nascimentos foi georreferenciado por área
(municípios). Isso nos impediu de normalizarmos a densidade de MC pela
densidade geral de nascimentos vivos (Svechkina e Portnov, 2017). Apesar
de essa limitação reduzir a resolução da análise de densidade, o poder da
análise permanece o mesmo.
2.4.4. SIG e análise estatística
Usamos o Sistema de Informações Geográficas (SIG) para Internet
Geomedicina® (Instituto de Pesquisa Pelé Pequeno Principe, 2007,
Curitiba, Brazil), o MapServer 6.4 (MapServer, 2017) e o PostGIS 2.1
(PostGIS, 2017) para construir os mapas contendo as camadas de dados
ambientais (níveis de substâncias químicas e produtividade agrícola)
superpostos pela ocorrência de MCs. O SIG para Internet Geomedicina®
incorpora software livre da Open Source Geospatial Foundation (OSGeo,
2017). Geomedicina® e Quantum GIS® 2.4 (QGIS, 2016) foram utilizados
para gerar os mapas mostrados nas figuras, e o software R (R 3.2) foi
utilizado para realizar todas as análises estatísticas (R Development Core
Team, 2011).
2.4.4.1. Correlações Lineares. Para as interações avaliadas com
Geomedicina®, foram feitas análises de correlações através da seleção de
retângulo incluindo um conjunto de localizações (pontos ou áreas) de
interesse e, então, submentendo seus atributos ao teste de associação
entre amostras pareadas, o que foi conduzido seja pelo coeficiente de
correlação produto-momento de Pearson, pelo tau Kendall, ou pelo rho de
Spearman em conjunto como a função cor.test do pacote R stats (Best and
Roberts, 1975; Hollander e Wolfe, 1973).
2.4.4.2. Análise de regressão de múltiplas varáveis. Para poder explicar
os níveis de Cl− nos municípios, criamos modelos que incorporam as
variáveis candidatas explanatórias DDT-DDD-DDE, endosulfan, e
produtividade agrícola (crop productivity, CP) em conjunto com a
classificação das sub-regiões dos municípios (grupos C1, C2 ou C3).
Começando a partir de um modelo inicial linear sem variáveis, adicionamos
as variáveis ao modelo e o avaliamos por meio de um teste de análise de
variância (ANOVA), para levantar se a inclusão resultava em um ganho de
informação que justificasse o aumento de complexidade e dos graus de
liberdade. Utilizando o princípio da parcimônia, selecionamos o modelo
mais simples e informativo. Um processo similar foi seguido para criar o
modelo de malformações congênitas (congenital malformation (CM)), com
a inclusão do Cl− no conjunto de variáveis explanatórias. O Endosulfan foi
excluído das análises subsequentes porque não apresentou diferenças com a máxima probabilidade juntamente com métodos de matrizes densas,
significativas entre as sub-regiões. Os modelos lineares finais para Cl − (a) e expressos como
CM (b) foram empregados na regressão espacial como

(a)
onde lmModel vem da equação anterior (b), nb se refere ao método de
(b) objeto de vizinhança e MC é o método de Monte Carlo para aproximação
do log-determinante.
onde a função scale foi utilizada para compensar as diferenças entre a
magnitude da densidade de MC (10 -12) quando comparada a (10 -0) das
demais variáveis (CP, Cl− e DDT-DDD-DDE). 2.4.4.5. Risco espacial relativo. Para podermos comparar a suscetibilidade
a MCs nas sub-regiões C1, C2 e C3, calculamos o risco espacial relativo
2.4.4.3. Autocorrelação Espacial. O teste do Índice Global de Moran (spatial relative risk (SRR)) entre elas, expresso como
(Moran Global Index (MGI)) foi realizado para avaliar a autocorrelação
espacial, utilizando a função moran.test no pacote R spdep (Bivand et al.,
2008). A variância foi determinada de acordo com Cliff e Ord (1981). A
matriz de vizinhança foi construída por contiguidade, na qual um vizinho
era definido como compartilhando pelo menos um ponto de fronteira com a
matriz. O parâmetro S também foi empregado, assim foi reproduzido o
esquema de codificação de estabilização de variância proposto por
Tiefelsdorf et al. (1999). Carregamos os polígonos dos municípios com a
função readShapePoly do pacote R maptools (Bivand e Lewin-Koh, 2015).
Construímos a lista de vizinhanças a partir de tais polígonos, por meio da
função poly2nb do pacote R spdep (Bivand e Piras, 2015). Essa lista de onde m é o município pertencente a uma das sub-regiões, X e Y são
vizinhanças foi complementada por ponderação espacial com estilo de conjuntos de municípios, N é o número de municípios em cada conjunto e
relação padronizada (soma de todas as ligações a n). SARARX e SARARY vêm da equação sacsarlm(lmModel,datam,listw =
nb,type = sac,method = MC).

2.4.4.4. Modelos de Regressão Espacial (SAR e SARAR). Para

2.4.4.6. Agrupamentos mais prováveis. Para validar nossos achados,
determinar se nossos achados se encaixariam em um modelo espacial,
identificamos os agrupamentos mais prováveis (most likely clusters (MLC))
testamos duas diferentes abordagens. A primeira era achar a existência de
utilizando o software SaTScan 9.4.4, que é amplamente usado em serviços
autocorrelação espacial através da análise do Índice Global de Moran
de saúde para detectar agrupamentos de doenças com forma geométrica
seguida do teste multiplicador de Lagrange (Anselin, 1988). A segunda
circular (Kulldorff, 1999). Foi preparado um arquivo de entrada de casos,
abordagem seguiu a proposta de Anselin (Anselin, 2003), a qual é
no qual o número de casos de MC por ano, e a densidade de kernel
estruturada com base em análise de regressão linear de múltiplas
ponderada (descrita na Seção 2.4.3) para cada município, no respectivo
variáveis. Finalmente, ambas abordagens foram consideradas para
ano, foi usada como atributo. A linha de tempo do MLC calculado
confirmar que o modelo autorregressivo espacial (spatial autoregressive
correspondeu ao período estudado (2007-2014). Parametrizamos uma
(SAR) model) deveria ser aplicado, o que permite o uso de uma variável
análise baseada em 10% da população sob risco, como tamanho máximo
principal como componente espacial do modelo. A análise de regressão foi
do agrupamento espacial. Todos demais parâmetros foram mantidos em
feita para estimar as relações espaciais entre resultados ambientais e de
seus valores básicos (default). Realizamos uma análise puramente
saúde para o período 2007-2014.
espacial, varrendo agrupamentos com altos valores e modelo de
A dependência espacial nos dados residuais do modelo de regressão
probabilidade normal. O formato do resultado forneceu identificadores de
linear foi testada utilizando os testes MGI e Lagrange (LT). Este último
localização incluídos em cada um dos dez MLCs. Geramos, com o
emprega um modelo autorregressivo espacial (SAR (c)) para o modelo de
Quantum GIS® 2.4, um mapa coroplético, utilizando os identificadores de
ânions de cloro e um modelo espacial autorregressivo combinado (SARAR
localização e os log das razões de verossimilhança (log likelihood ratios
(d)) para o modelo de malformação congênita, que são expressos como
(LLR)) os quais estão apresentados no mapa.

(c) 3. Resultados

(d) As proporções de produtividade agrícola (t/km 2) nas sub-regiões

onde pWY é o efeito de interação endógena, λWu é o efeito de interação revelaram uso intensivo da terra na sub-região C1 (Tabela 1). O quadro
entre termos de erro, e W é a matriz de vizinhanças por contiguidade. designado (Fig. 1) envolveu um processo de dois passos: 1) o passo
Ambos os modelos (SAR e SARAR) foram verificados utilizando o método ambiental que focou no teste da hipótese se Cl −, DDT-DDE-DDD, e
de critério de informação Bayesiano (Bayesian Information Criterion (BIC)). produtividade agrícola eram significativamente associadas em qualquer
Utilizamos a função sacsarlm do pacote R spdep para o SARAR, de acordo sub-região, e 2) o passo da variável dependente (MC) que concentrou-se
em identificar se a densidade kernel de MC mais elevada estava associada
a qualquer dos parâmetros ambientais.
Tabela 1
Dados Globais e proporções
Ano ou período C1 dp C2 dp C3 dp
Cl− (NM) 2010 114 - 200 - 19 -
DDT + DDD + DDE (NM) 2010 110 - 160 - 13 -
Lavouras em Municípios (NM) 2010 114 - 200 - 19 -
Produção Agrícola (t) 2006-2010 30.384.039 343.596 30.386.579 213.717 501.985 43.598
Area (km2) - 38.374,3 - 123.674,0 - 10.282,2 -
Produitividade Agrícola (PA) (t/km2) 2006-2010 791,78 995,6 245,0 483,01 48,82 89,00
Nascimentos vivos (N) 2007-2014 289.530 - 490.545 - 381.551 -
- -
MCs (N) 2007-2014 2044 - 3625 2728
MCs = Malformações congênitas; N = número total de casos; NM = número total de municípios investigados; t = toneladas; dp = desvio padrão.
Grupo C0, mostrado nas Figs. 4, 5 e 6 corresponde a 66 municípios sem dados de Cl − em 2010, e tais dados não estão incluídos nesta tabela.
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3.1. Cl− , DDT-DDE-DDD e produtividade agrícola DDT-DDE-DDD e Cl− e (Fig. 2f) (p = 0,0003). Os Municípios foram
agrupados de acordo com o nível de Cl − (abaixo ou acima de 1,81 mg/L) e
Os dados de Cl− de 1996 (Fig. 2a, da MINEROPAR) e de 2008, 2009 ou
de acordo com a atividade regional predominante (agricultura ou industrial).
2010 (Fig. 2b, presente estudo, em colaboração com MINEROPAR)
A última dessas categorias inclui refinarias de óleo, empresas de extração,
estavam positivamente correlacionados (p = 0,0001) (Fig. 2d e 2e). A mais
indústrias de manufatura e metalúrgicas, que são reconhecidas por
importante elevação de Cl − foi encontrada nos municípios do Oeste. As
estarem concentradas mais próximas da capital do estado, mas essas não
mais altas concentrações de DDT-DDE-DDD foram encontradas em 2008,
foram quantificadas.
2009 ou 2010 nas bacias hidrográficas do norte (Fig. 2c), onde
significativas correlações positivas foram observadas entre os níveis de

Fig. 2. Cloreto (Cl−) e DDT + DDD + DDE (DDT) em bacias hidrográficas do estado do Paraná, Brasil (esquerda) e correlações (direita). (a) níveis de Cl − em miligramas por litro
(mg/L) coletado em 1996 de 95% das bacias coletoras (697/736); (b) Cl− (mg/L) no presente estudo coletado em 2008, 2009 ou 2010 (2008/2009/2010) de 63% das bacias,
sobrepondo a camada de dados de Cl − de 1996; (c) níveis de DDT em microgramas por litro (µg/L) coletados em 2008/2009/2010, sobrepondo os dados de Cl − de 2008/2009/2010.
(d, e) Correlações entre níveis log-transformados (Log) de Cl − (1996 vs. 2008/2009/2010); (f) correlações entre níveis Log Cl − e Log DDT em 2008/2009/2010. As áreas em branco
em (b) e (c) representam localidades sem análise de resíduos de Cl− ou DDT.
 C1 (114 municípios), C2 (200 municípios) e C3 (19 municípios) na Fig.
3a apresentam níveis de Cl− dentro do aceitável para a saúde humana. O
nível máximo de contaminante Cl − na água potável é 250 mg/L (Lei
Brasileira 9.443/1997), o que é amplamente aceito em diversas regulações,
incluindo a Organização Mundial de Saúde (World Health Organization
(WHO, 2003)). A Fig. 3b apresenta as áreas com produtividade agrícola
mais forte, que corresponderam a áreas com os níveis mais elevados de
Cl− mostrados na Fig. 3a. As principais características para cada sub-
região são agricultura forte e níveis de Cl − altos (>1,81 mg/L) em C1, a
produtividade agrícola mais fraca e níveis de Cl − altos (>1,81 mg/L) em C3,
que inclui a capital, e agricultura média com os menores níveis de Cl −
(<1,81 mg/L) em C2.
A maioria dos municípios de C1 apresentaram produtividade agrícola
mais forte (Fig. 3b). Um agrupamento de bacias hidrográficas com os
menores níveis de Cl− (<1.81 mg/L) foi identificado no centro do estado e
na área que se extende ao sul, e essa foi classificada como a sub-região
C2. Uma pequena porção ao norte da sub-região C1, que divide os
campos agrícolas do norte e oeste, é mais dedicada à criação do que à
agricultura. Bacias hidrográficas com níveis de Cl − >1.81 mg/L e a maior
atividade industrial no estado, combinadas com menor atividade agrícola
que as sub-regiões norte e oeste, foram classificadas como C3 (Fig. 3a e
b). Terras de produção bovina e suína estão concentradas entre o norte e
oeste, e esse tipo de terra é também muito comum em C2. MGIs para Cl−
em C1 e C3 eram compatíveis com níveis mais elevados de Cl − detectados
na área, em comparação com C2. Os resultados estimados de MGI
indicaram que existia significativa autocorrelação espacial para a
distribuição de Cl− (mediana MGI = 0,518; p < 0,0001; ou mediana MGI =
0,625; p = 0,0005, excluindo C3).

Fig. 3. Sub-regiões do estado do Paraná classifcadas de acordo com os níveis de cloreto (Cl−) (C1, C2 e C3) e a predominância de atividade agrícola (C1 e C2) ou industrial (C3).
(a) Níveis de Cl− em municípios: em C1 (norte e oeste) e C3 (principalmente sudeste), Cl− > 1,81 mg/L; em C2 (central e sul), Cl− < 1,81 mg/L. (b) Produtividade agrícola média (PA)
em toneladas por quilômetro quadrado (t/km2) em municípios. C0 refere-se a municípios onde os níveis de Cl− em 2010 são desconhecidos. (c, d) Correlações entre níveis de Cl− e
PA.

3.2. Degradação ambiental dos Organoclorados e liberação de HCl na ilustrar combinações dessas três substâncias químicas com os níveis de
água Cl−, também será importante analisar outros grupos de OC.

A estimativa de correlação espacial nos conjuntos de dados de Cl − e
DDT-DDE-DDD mostrados na Fig. 2 foi computacionalmente e
matematicamente formulada, o que possibilitou cálculos diretos. A perda de
uma molécula de HCl por degradação ambiental ou biológica transforma
p,p'- DDT em p,p'-DDE. Outro derivado importante formado é o DDD
(IPCS, 1989). Apesar da ênfase ter sido colocada nos DDT-DDE-DDD para
3.3. Incidência e densidade de malformações congênitas no Paraná
Para avaliar se o padrão de distribuição espacial permanece
relativamente constante ao longo do tempo, calculamos a incidência média
de MC em todos os municípios durante dois períodos de tempo (2007-2010
e 2011-2014, mostrados nas Fig. 4a e 4c, respectivamente). Entre as MC
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mais comuns identificadas estão sindrome de Down, hidrocefalia
congênita, gastroquise, lábio leporino, palato fendido, polidactilismo, outras
deformidades congênitas dos pés, malformações congênitas cardíacas e
hipospádia. Contudo, não encontramos diferenças de incidência de MC ou
densidade de MC entre as 3 sub-regiões estudadas. A densidade média de
MC nos municípios (Fig. 4b e 4d) mostrou uma grande disparidade
regional, e os valores estavam significativamente associados com áreas de
altos níveis de Cl− nos rios (R2 (Spearman) = 0,7154, p < 0,0001) (Fig. 5a,
5d, e 5f), onde os níveis de Cl− estavam também correlacionados com
níveis mais elevados de DDE-DDD-DDT (R 2 (Pearson) = 0,5519, p <
0,0001) (Fig. 2c e 2f) e produção agrícola (R 2 (Spearman) = 0,5596, p =
0,0141) (Fig. 3b e 3d); ambas as correlações foram corroboradas pela
correlação entre productividade agrícola e a densidade de MCs (R 2
(Spearman) = 0,7279, p < 0,0001) (Fig. 5b e 5e). Observamos significativas
correlações para todos os municípios do Paraná entre PA e densidade de
MC ((R2 (Pearson) = 0,5022, p < 0,0001) (Fig. 5c) e entre níveis de Cl − e
densidade de MC (R2 (Spearman) = 0,4524, p < 0,0001) (Fig. 5f). A maior
incidência de MC observada em C1 não é discriminada no que diz respeito
a um tipo particular de MC em excesso comparada com lugares de mais
baixa incidência (C2). A falta de correlações estatísticas significativas entre
níveis de DDT-DDE-DDD e a densidade de MC identificada pode indicar
que as influências de outros OCs ou outros agentes tóxicos usados na
agricultura são importantes.

Fig. 4. Taxa de incidência (TI) de malformações congênitas (MC) (média ponderada no período) por 1000 nascidos vivos (NV) e estimativa da densidade de kernel ponderada
(edkp) por NV em municípios do estado do Paraná, superpondo as sub-regiões C0, C1, C2 e C3. (a, b) TI de MC e edkp para o período 2007-2010; (c, d) TI de CM e edkp para o
período 2011-2014. Para TI, o (N = número) é a contagem de municípios no respectivo intervalo.
3.4. Regressão espacial e risco relativo era apropriado para o modelo de ânions de cloro (LMerr = 27,131, LMlag =
62,1, RLMerr = 0,437, RLMerr = 35,406) e que SARAR era apropriado para
Durante o desenvolvimento dos modelos lineares, detectamos a
o modelo de MC (LMerr = 372,603, LMlag = 401,007, RLMerr = 1,784,
existência de dependência espacial baseada nos resultados obtidos no
RLMlag = 30,188). A Tabela 2 mostra que DDT-DDE-DDD e PA estão
teste MGI (cloreto: MGI = 0,214 (p < 0,001) e Moran I = 0,752 (p < 0,001)
relacionados a mudanças de Cl−, embora Cl− predominasse em C3 (média
para MCs). Os resultados dos testes de Lagrange sugeriram que o SAR
6,02 mg/L, dp 5,69), seguido por C1 (média 3,85 mg/L, dp 2,43).
Tabela 2
Modelo Espacial Autorregressivo (Spatial autoregressive (SAR)) para anions de cloro.
Variável Coeficiente de regressão Direto Indireto Total
C1 0,3639 (<0,001) 0,3914 (<0,001) 0,3331 (<0,001) 0,7245 (<0,001)
C2 -0,3723 (<0,001) -0,4005 (<0,001) -0,3408 (<0,001) -0,7413 (<0,001)
C3 0,8739 (<0,001) 0,9401 (<0,001) 0,8000 (<0,001) 1,7401 (<0,001)
scale (DDT-DDE-DDD) 0,1365 (<0,001) 0,1468 (<0,001) 0,1249 (0,003) 0,2717 (<0,001)
scale (PA) 0,0619 (0,093) 0,0666 (0,082) 0,0567 (0,090) 0,1233 (0,081)
Valores de p dados entre parêntesis.
 Além disso, os DDT-DDE-DDD tiveram um impacto direto mais baixo Comparando valores nas sub-regiões com a atividade
nas MCs (0,08, p = 0,03) que a produtividade agrícola (0,1, p = 0,03). predominantemente agrícola (C1 e C2), um aumento de 2,96 mg/L no
Ânions de cloro, DDT-DDE-DDD, e PA claramente contribuíram para a cloreto em C1, em relação a C2, concorre com um aumento da densidade
explicação da distribuição de MCs (Tabela 3) no modelo. Assim, níveis de de MC de 45% (SRR = 1,45, 95% CI 1,36-1,55) (Tabela 4).
ânions de cloro associados a níveis de DDT-DDD-DDE e PA foram
significativamente implicados na densidade de MC.
Tabela 3
Modelo Espacial Autorregressivo Combinado (Spatial autoregressive combined (SARAR)) para malformação congênita.
Variável Coeficiente de Regressão Direto Indireto Total
(Intercepto) -0,0559 (0,351)
scale (Cl−) 0,1265 (<0,001) 0,1614 (<0,001) 0,4688 (0,196) 0,6303 (0,121)
scale (DDT-DDE-DDD) 0,0681 (0,042) 0,0868 (0,049) 0,2522 (0,247) 0,3391 (0,182)
scale (PA) 0,0884 (0,023) 0,1128 (0,019) 0,3276 (0,326) 0,4403 (0,253)
−
scale (Cl ). (PA) -0,1062 (0,006) -0,1356 (0,005) -0,3938 (0,269) -0,5294 (0,193)
−
scale (DDT-DDE-DDD) . (Cl ) -0,1176 (0,002) -0,1501 (0,004) -0,4360 (0,162) -0,5861 (0,098)
−
Valores de p dados entre parêntesis. Cl = Cloreto; PA = Produtividade Agrícola

Tabela 4
Diferenças, razões e risco especial relativo (spatial relative risk (SRR)) entre grupos.
Diferença [D] ou razão [R] Malformação Congênita (Densidade de kernel)
Cl− [D] (mg/L) DDT [D] (µg/L) PA [R] (t/km2) Risco Espacial Relativo (SRR) (IC 95%)
C1 x C2 2,96 12,50 3,22 1,45 (1,36-1,55)
C1 xC3 -2,17 20,10 16,22 1,34 (1,25-1,42)
C3 x C2 5,13 -7,60 0,20 1,09 (0,93 1,24)
IC = Intervalo de confiança

3.5. Agrupamento espacial utilizando SaTScan log das razões de verossimilhança (log likelihood ratios (LLR)), 323,32 >
LLR > 689,28 (p = 0,001) estavam agrupados dentro da sub-região C1
A distribuição espacial das densidades de kernel ponderadas (dkp)
(municípios marcados com H na Fig. 6). Isso sugere que, em C1, a intensa
sugeriu que os municípios com mais altas densidades de MCs estão dentro
produtividade agrícola (PA), o mais alto nível de Cl − e DDT-DDD-DDE estão
da sub-região C1. Os achados de agrupamento pelo SaTScan corroboram
co-localizados com os mais elevados LLRs detetados para MC.
com as dkp, mostrando que sete de nove municípios com os mais elevados

Fig. 6. Agrupamentos mais prováveis para malformações congênitas gerados pelo SaTScan (v 9.4.4). A escala de tons de marron indica os maiores log das razões de
verossimilhança (log likelihood ratios (LLR)), cada uma com p = 0,001. Múnicipios marcados com H representam aqueles que têm correlação com os três LLRs mais elevados
(variando de 323,23 a 689,28). As sub-regiôes C1, C2 e C3 estão demarcadas; C1 (contorno azul escuro) engloba 77,8% dos municípios com mais elevados LLRs. C0 foi excluída
da análise porque suas amostras de água não foram avaliadas. (Para interpretação das referências para as cores na legenda desta figura, o leitor pode ser referir à versão da web
deste artigo.)
 H.C. Ibañez et al. / Science of the Total Environment 650 (2019) 1278-1291
4. Discussão
Muitos estudos têm relatado sobre o papel de fatores ambientais e
genéticos na explicação da etiologia de MC. Causas monogênicas de MCs
representam 25%, etiologias ambientais 10%, e a interação entre fatores
genéticos e ambientais parece ser responsável por quase 65% (Brent,
2004). Ambos p,p'-DDT e p,p'-DDE podem facilmente penetrar a barreira
placentária (Al-Saleh et al., 2012; Bergonzi et al., 2009; Cohn et al., 2003).
Dependendo da dose e tempo de gravidez, esses e outros OCs podem ser
presumivelmente implicados em um amplo espectro de malformações
(Brent, 2004). Baixos níveis de p,p'-DDE no sangue do cordão umbilical
(0,197 ± 0,961 µg/L) foram associados com efeitos de detrimento de
crescimento fetal na Arábia Saudita (Al-Saleh et al., 2012). Outras
implicações toxicológicas foram relatadas, incluindo hormônios esteroides
debilitados e outras funções moleculares de sinalização (Matsushima,
2017), funções cognitivas prejudicadas (Patandin et al., 1999), e defeitos
do tubo neural (Kalra et al., 2016), entre outros. Notavelmente, apoptose
induzida por p,p'-DDE durante os estágios iniciais de desenvolvimento de
células neurais embrionárias de camundongos é mediada por receptor de
ácido retinoico mais do que por mecanismos tóxicos (Wnuk et al., 2016).
Nossos achados suportam Cl − como um marcador plausível para o uso
crônico de p,p'-DDT e outros OCs, e exposição crônica a essas
substâncias pela população do norte do Paraná (C1), e os dados
mostraram boa combinação com a produção agrícola (comparando Figs. 2
e 3). Apesar dos altos níveis de Cl− na região sudeste (C3), as bacias
hidrográficas desta região não são correlatas com altos níveis de DDT-
DDE-DDD; assim, diferenças nos níveis de Cl− podem ter sido derivadas de
outros pesticidas, maior atividade industrial, do mar, produtos de limpeza e
outras fontes. Contudo, a maioria das ocorrências de Cl − parecem ser não
relacionadas com origens geológicas em C1, por causa das concentrações
aumentadas e outras flutuações observadas em várias bacias hidrográficas
de 1996 a 2008, 2009 ou 2010 (período de amostragem); portanto, os
níveis de Cl− poderiam indicar muitos anos de uso intensivo de OCs e/ou
outros compostos químicos tóxicos clorados. O cloro é um ânion
comumente encontrado na água. É altamente solúvel em água e é mais
comumente detectado em áreas urbanas e produtos de instalações
industriais, tais como água sanitária doméstica, produtos de limpeza,
químicos, borrachas e solventes, que são mais frequentemente utilizados
para tratamento de resíduos industriais e esgotos (Bertrand et al., 2016).
Tais fontes podem ser responsáveis pelos altos níveis de Cl − nas amostras
da sub-região C3. O Cl − pode também originar-se de outros contaminantes
ambientais muito presentes incluindo dibenzo-p-dioxinas policloradas
(polychlorinated-p-dibenzodioxins, PCDDs) e dibenzofurano policlorados
(polychlorinated di-benzofurans, PCDFs) (USEPA, 2006). Os maiores
valores para PCDDs e PCDFs medidos em amostras de leite de vaca do
Paraná e seis outros estados do Brasil foram coletados de regiões onde a
principal atividade econômica era relacionada com variados processos
industriais tais como incineração de matéria orgânica; em contraste, os
níveis mais baixos foram encontrados em regiões agrícolas (Rocha et al.,
2016). De acordo com estes autores, todas as amostras apresentaram
concentrações de PCDD e PCDF abaixo do limite estabelecido pela União
Europeia para leite de vaca, o que sugere que estes compostos podem
não ter representado um papel mais importante na carga de MC nestes
sete estados brasileiros.
Generalização dos resultados para áreas rurais é provável em países
com baixo status socioeconômico, onde a atividade rural é a principal fonte
de renda. Em rios de tais áreas rurais, o Cl − poderia ser usado como
marcador do uso crônico de OC. Para lidar com a não conformidade
relativa à legislação existente dessa e de outras regiões similares mundo,
facilitada pela falta de pessoal e infraestrutura adequada de vigilância, o
monitoramento de custo efetivo de rios e alimentos poderia ser implantado
à luz dos resultados deste estudo. Recentemente, Wang et al. (2018)
relataram a distribuição, composição e concentração de 15 OCs em
amostras de superfície da água de toda a bacia do rio Yongding (China) e
identificaram sua característica sazonal de poluição. Os autores estimaram
que a concentração total de OC variou no intervalo de <0,08 a 197,71 ng/L.
Mais, considerando o acúmulo em lipídios, a exposição diária estimada a
p,p'-DDT e p,p'-DDE era entre 10 e 42 µg/kg do peso corporal de crianças
em amamentação, em Bangladesh (Bergkvist et al., 2012).
Como nossas amostras de água foram coletadas do meio dos rios,
presumimos que, sob tais condições, a meia vida do p,p'-DDT não é tão
longa quanto no solo (20-30 anos, de acordo com Dimond and Owen,
1996), mas não tão curta quanto na atmosfera (~2,5 anos, Cortes et al.,
1998). Da mesma forma, concluímos que o período de toxicidade do p,p'-
DDT e seus derivados durou ao menos até 2014 quando os casos de MC
foram incluídos no estudo. Trinta e três anos atrás, o p,p'-DDT foi banido
da agricultura no Brasil (Brasil, 1985); contudo, o banimento total foi
implementado apenas em 2009 (Brasil, 2009), sugerindo que o
fornecimento de p,p '-DDT, p,p'-DDE e p,p'-DDD poderia ter sido
oficialmente aprovado. Note-se que o uso de OCs por agências públicas
tem sido permitido em campanhas de saúde pública para combate
específico de vetores que servem como agentes etiológicos de doenças
tais como malária e dengue (Chanon et al., 2003). Por exemplo, o Aedes
aegypti, o principal portador do vírus da dengue, é encontrado nas regiões
norte e oeste do Paraná (Fares et al., 2015).
Postulamos que as diferenças regionais em Cl − poderiam refletir
exposição anterior a compostos químicos tóxicos contendo Cl −, que são
transformados e liberam HCl e ânions de cloro na água. Uma importante
característica desse composto é ser encontrado em altos níveis próximo
aos locais de aplicação por causa de sua baixa volatilidade e baixo
potencial de lixiviação; assim, ele permanece praticamente imóvel nos
locais de aplicação (De Andrea et al., 1991). O uso inapropriado do p,p'-
DDT, que pode levar à contaminação da água potável e alimentos, tem
sido relatado em vários continentes (Bhattacharya et al., 2003; Kannan et
al., 2004; Naso et al., 2004). Os 399 municípios analisados neste estudo
mostraram uma modesta taxa média de MC, mas amplas variações 0,6 a
>30,0 casos por 1000 recém-nascidos, por ano, foram mais frequentes em
alguns municípios de C1.
O custo/benefício médio anual de 2010 a 2014 no Brasil foi o mais
elevado (1.883 g defensivo usado/kg produção agrícola), enquanto seu uso
médio anual de defensivos foi o quarto mais elevado (6.166 kg/ha) entre os
principais países do mundo (Zhang, 2018).
De Siqueira et al. (2010) relataram que em 2000, diferentes estados
brasileiros tiveram frequência média de MC variando entre 1,5 e 7,9 por
1000 recém-nascidos por ano. Apesar de estas médias serem similares
àquelas relatadas para Oklahoma, USA (Janitz et al., 2016) e outros
países, elas podem não ser discriminatórias no nível de macro-região
(estado ou país). É altamente significativo avaliar frequências de MC em
nível de microrregião (distrito, município ou regiões menores), como
observado em alguns municípios localizados em C1. Contudo, há
exceções, por exemplo, a prevalência de MC é alta (21,6/1000) na
província de Shaanxi (macro-região >40 milhões de habitantes) localizada
no Noroeste da China, onde serviços de saúde e condições econômicas
são piores que em outras regiões da China (Pei et al., 2015). Tomadas em
conjunto, a variável de risco mundial de MC está relacionada com muitas
combinações de suscetibilidades genéticas, diferenças de exposição
cultural, social e ambiental, como relatado entre crianças nascidas nos
Estados Unidos em 2008 (Egbe et al., 2015). A população do estado do
Paraná é predominantemente de ancestralidade europeia, onde diferenças
genéticas relacionadas com diferenças raciais são menos comuns que nas
áreas do norte do Brasil, mas as condições de vida são variáveis entre
todos os 399 municípios do estado do Paraná.
Nossos achados excluem inferências significativas relacionadas com o
envolvimento de fatores ambientais em municípios que apresentam
incidência de MC mais alta. Isso poderia incluir a influência de p,p'-DDT,
seus derivados e outros OCs, especificamente na parte norte do estado,
que teve altos níveis de Cl− correlacionados com maior produtividade
agrícola (dados recalculados do IPARDES, 2017) e taxas de incidência de
MC mais altas. A Fig. 3 mostra uma forte relação entre níveis de Cl− e a
produção agrícola na região norte. Interessante, o MGI = 0,518 (p =
0,0001) suporta a existência de agrupamentos espaciais de níveis mais
elevados de Cl− em C1, que é mais forte para o MGI = 0,625 (p = 0,0005)
calculado sem C3. Este MGI pode ter sido influenciado pelas diferenças
nas fontes de água em municípios vizinhos, políticas de uso de defensivos
para pequenos e grandes fazendeiros e tipos de cultura. A hipótese de que
valores mais elevados de Cl − em C1 poderiam indicar maiores exposições
a OC, como encontrado para DDT-DDE-DDD, foi apoiada pela notável
produção agrícola e ocorrência de mais elevado risco espacial relativo
quando comparado com a sub-região C2 (Tabela 4). Risco espacial relativo
entre as densidades de MC de C1 e C2 indicou que a ocorrência dessas
anomalias foi significativamente mais elevada em C1, onde o Cl −, que
hipoteticamente representa produtos específicos contendo Cl −, usados na
agricultura, foi espacialmente associado com atividade agrícola. Isso
sugere que existe uma tendência para que a densidade de MC siga a
variação espacial dos níveis de Cl− e PA.
Outra abordagem seria identificar agrupamentos de MC (por exemplo,
como proposto por Kulldorff et al., 2006), seguido pelo cálculo de
probabilidade de possíveis “pontos quentes” (hot spots) de MC
(agrupamentos positivos) que sejam significativamente diferentes dos
agrupamentos negativos de localizações de MC, no que diz respeito a
níveis de Cl−, DDT-DDE-DDD, e/ou de produção agrícola. Notavelmente, os
resultados de nossas análises SaTScan confirmaram que os LLR de MC
estão fortemente concentrados dentro da sub-região C1, onde os níveis de
Cl− estão correlacionados com os níveis de DDT-DDE-DDD e
espacialmente associados com PA. Por outro lado, C2 foi considerada uma
região rural com menos poluição e menor risco de desenvolvimento de
MCs.
Variações geográficas de MCs específicas são um fenômeno
estabelecido. Por exemplo, a incidência média de defeito no tubo neural na
China exibe uma grande variação regional com uma incidência
desproporcionada na província de Shanxi, que é atribuível a fatores
genéticos e ambientais (Yu e Zhang, 2011). Estudos têm documentado que
muitas substâncias químicas estão relacionadas com MCs, incluindo p,p'-
DDT e seus derivados (Grandjean e Landrigan, 2014). Para comparação,
as mais altas incidências de MC observada em nosso estudo foram pelo
menos dez vezes mais altas que a média anual de incidência de MC em
Oklahoma, USA (Janitz et al., 2016).
Em nosso estudo, os altos níveis de DDT-DDE-DDD em algumas
regiões pode refletir a economia altamente dependente da agricultura e
possível uso para controle da dengue. Países que experimentam impacto
muito mais baixo de substâncias químicas usadas na agricultura podem
ainda estar sujeitos a diferentes categorias de fatores ambientais
associados com suscetibilidades genéticas. Esse poderia ser caso para a
associação relatada entre câncer materno e MCs em uma coorte de
estudos englobando todo o território dinamarquês (Momen et al., 2017),
e/ou os resultados de Oklahoma, onde risco de câncer infantil foi
significativamente mais alto entre crianças com anomalias congênitas
(Janitz et al., 2016). Apesar da falta de provas de uma relação causa e
efeito para explicar a complexa rede de substâncias químicas associadas
com MCs, nossa hipótese é de que os habitantes de C2 enfrentam risco
mais baixo de MC induzida por produtos agro-químicos que aqueles
residentes em C1 e C3. Exposição prolongada a DDT-DDE-DDD via
exposição dérmica, inalação e/ou ingestão na dieta podem ocorrer durante
várias práticas agrícolas. Além disso, dado a sua resistência à degradação
e sua hidrofobicidade, esses pesticidas podem apresentar bioacumulação
em lipídios de indivíduos contaminados. Consequentemente, eles podem
ser associados a potenciais resultados crônicos a saúde humana (Eskenazi
et al., 2009).
Este estudo está limitado pelo pequeno tamanho da amostra e
limitações temporais associadas com os casos retrospectivos adicionados
ao conjunto de dados prospectivos para incremento do poder estatístico.
Por todas as amostras de água terem sido congeladas antes das análises,
diferenças importantes na resistência à degradação entre p,p'-DDT, p,p'-
DDE e p,p'-DDD não puderam ser quantificadas (Peterson e Robinson,
1964). Consequentemente, as proporções entre o p,p'-DDT e seus
derivados não pôde ser determinada com acuracidade. Por exemplo,
apesar do Endosulfan poder ser bem menos resistente à degradação que o
DDT e seus derivados, não foram encontradas diferenças significativas no
Endosulfan entre as sub-regiões estudadas. Reconhecemos nossas
limitações em avaliar completamente o papel dos fatores ambientais na
provável etiologia multifatorial das MCs.
5. Conclusões
Registramos 8756 casos de MCs entre 1.221.287 recém-nascidos em
399 municípios ao longo de um período de 8 anos. Com relação aos altos
níveis de DDT-DDE-DDD e extensas áreas de cultivo contaminadas por
p,p'-DDT em muitos rios, este OC barato, eficiente, mas altamente tóxico
poderia ter sido usado em uma tentativa de controlar mosquitos vetores de
doenças como a Dengue e/ou para outros propósitos agrícolas até seu
banimento total em 2009. Estudos de coortes amplas e estudos de casos-
controle poderiam determinar mais definitivamente o risco cumulativo do
pesticida e validar as medidas de Cl− como parâmetro de triagem
juntametne com outras substâncias químicas em populações expostas.
Estudos mais profundos são necessários para avaliar doenças congênitas
e subtipos de MCs em crianças nascidas de mães com níveis aumentados
de organoclorados para melhor elucidar o papel dos diferentes tipos de
organoclorados nas populações expostas.
Declaração de interesses
Nenhum interesse declarado ou interesse financeiro concorrente.
Reconhecimentos (Agradecimentos)
Estamos em débito com Ety Cristina Forte Carneiro, Jose Alvaro
Carneiro, os empregados da antiga agência do Paraná, MINEROPAR
(extinta desde 2017, mas legalmente representada pelo Instituto de Terras
Cartografia e Geologia), o Laboratório de Análises Minerais (LAMIN, Rio de
Janeiro), o Instituto de Pesquisa Pele Pequeno Principe, o Laboratorio de
Pesquisas Hidrogeologicas (LPH; Universidade Federal do Paraná,
Curitiba, Brasil), Dr. Lauro Mera de Souza e Dra. Fernanda Cunha por suas
contribuições com este estudo.
Recursos
Este projeto foi custeado por doações da Secretaria de Estado de
Ciência, Tecnologia e Ensino Superior do Estado do Paraná (No.
026/06/SET1/ Geomedicina, 2006-2011), Conselho Nacional de Pesquisa e
Desenvolvimento (CNPq, 2016-2018) e Coordenadoria de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Ensino Superior (CAPES, 2011-2018).
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