UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC

PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIA E COGNIÇÃO

Victor Distefano Wiltenburg

EFEITO DA AYAHUASCA EM MODELOS EXPERIMENTAIS

DE DEPENDÊNCIA AO ETANOL E ANÁLISE
IMUNOHISTOQUÍMICA EM ROEDORES

São Bernardo do Campo, SP

2021
 VICTOR DISTEFANO WILTENBURG

Efeito da ayahuasca em modelos experimentais de

dependência ao etanol e análise imunohistoquímica em
roedores

Dissertação apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Neurociência e Cognição da
Universidade Federal do ABC
(UFABC) como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Neurociência e Cognição.

Orientador: Fúlvio Rieli Mendes

São Bernardo do Campo

2021
 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
Fundação Universidade Federal do ABC
Avenida dos Estados, 5001 – Bairro Santa Terezinha – Santo André – SP
CEP 09210-580 · Fone: (11) 4996-0017

FOLHA DE ASSINATURAS

Assinaturas dos membros da Banca Examinadora que avaliou e aprovou a

Defesa de Dissertação de Mestrado do candidato, VICTOR DISTEFANO
WILTENBURG realizada em 19 de Julho de 2021:

Prof.(a) KARINA POSSA ABRAHÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Prof.(a) SILVIA HONDA TAKADA

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC

Prof.(a) FULVIO RIELI MENDES

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC - Presidente

Prof.(a) TATIANA LIMA FERREIRA

- Membro Suplente
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC

Prof.(a) FÁBIO CARDOSO CRUZ

– Membro Suplente
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

* Por ausência do membro titular, foi substituído pelo membro suplente descrito acima: nome completo, instituição e assinatura
AGRADECIMENTOS

O trabalho de pós-graduação no Brasil, mestrado ou doutorado nos últimos

anos tem se mostrado um grande desafio. Seja por falta de investimento
governamental e privado, seja pela situação atual da sociedade com o negacionismo
científico -negacionismo este que nós cientistas ajudamos a construir- ou seja pela
pandemia que abalou as estruturas sociais, culturais e econômicas do mundo todo.
Não posso deixar de manifestar que apesar de todas as dificuldades vivenciadas
neste ano que passou, inúmeras pessoas fizeram parte da minha jornada no mundo
acadêmico e na construção do meu pensamento científico.
Difícil é conseguir em poucas palavras agradecer todes que fizeram parte
dessa jornada, e sem dúvida, foram imprescindíveis para a conclusão dessa
dissertação, principalmente nesses momentos finais.
Agradeço ao divino, que através de mentores, divindades, orixás e a própria
conexão com a matriz espiritual me acompanhou nos momentos de meditação e
oração. Que me ajudaram a ter paciência, clareza e resiliência.
Aos meus pais, Jorge e Dinéa, por todos os ensinamentos, reflexões, “puxões
de orelha”, puxões para a própria realidade terrena e pela gigantesca paciência
comigo nesses momentos finais de conclusão da dissertação. Vocês são a razão de
eu estar terminando este trabalho e mais esta etapa da minha vida. Obrigado por
sempre me apoiarem, me acalmarem e me proporcionarem as melhores
oportunidades que vocês poderiam. Amo vocês. Obrigado por tudo.
A minha irmã Thaís e meu Cunhado Bruno, por estarem presentes na minha
vida, me apoiando incondicionalmente. Obrigado pelas conversas acadêmicas e não
acadêmicas, pela parceria e pela ajuda nas leituras, análises, correções e sugestões
em diversos momentos deste mestrado.
A minha parceira Júlia, pelo amor, companheirismo, amizade e todos os
conselhos e reflexões.
Ao meu orientador Fúlvio Rieli Mendes que participou da minha migração de
carreira desde o início com o estágio realizado pelo Bacharelado em Neurociências
e por todo esse período do meu mestrado. Sempre trazendo pontos de vistas
diferentes e um grande conhecimento experimental e de pesquisa, me auxiliando a
melhor entender esta nova carreira. Agradeço também imensamente pelo o auxílio
nesta dissertação com suas sugestões e críticas, que sem dúvida, foram
imprescindíveis para esta finalização.
Aos professores que fizeram parte da minha vida, me inspiraram a mudar de
carreira e migrar para as dificuldades do mundo acadêmico. Em especial a
professora Marcela Bermúdez Echeverry que re-despertou minha paixão pelo
conhecimento e estudo. E ao professor Elisaldo de Araújo Carlini que nos poucos
momentos que tive o prazer de vê-lo, me inspirou e também me re-despertou a esta
nova carreira.
Ao professor Fábio Cruz, que sempre foi solicito com as necessidades deste
projeto, sempre me tratou muito cordialmente e sempre me incentivou na realização
deste trabalho. Agradeço também a seus alunos, em especial a Gabrielle e Paola
que me receberam no laboratório da UNIFESP e colaboraram com a
imunohistoquímica. Obrigado professor Fábio pela colaboração e por disponibilizar
as arenas de PCL e campo aberto utilizadas no presente estudo.
A minha psicoterapeuta Tatiana que muito me ajudou neste momento final do
mestrado.
As professoras Karina Possa Abrahão, Camila Almeida, Raquel Fornari e
Silvia Honda Takada, pela participação em minha banca de qualificação e defesa, e
por todo o acolhimento, críticas e sugestões que foram determinantes para a
melhora e finalização deste trabalho.
Aos meus amigos e colegas que participaram ativamente no meu projeto, em
minha vida pessoal e acadêmica. Aos meus amigos da universidade, do grupo de
pesquisa e do laboratório 104, em especial a Aline e Moises que foram
imprescindíveis para me ajudar nas dificuldades da vida acadêmica no Brasil e
tantos outros amigos e familiares que fazem parte desta jornada terrena. Muito
obrigado!
"O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001
 RESUMO

A dependência ao etanol, ou transtorno por uso de álcool, é um problema que afeta

tanto a vida do dependente como a sociedade. A ayahuasca é uma bebida usada em
cerimônias religiosas, preparada a partir de duas plantas, a Psychotria viridis, que possui
DMT, e a Banisteriopsis caapi, que possui alcaloides β-carbolinas que inibem a
monoaminoxidase, diminuindo o metabolismo da DMT. Alguns estudos observacionais e
experimentais sugerem que a ayahuasca pode ser útil para prevenir ou tratar a dependência
de drogas. Este estudo investigou o efeito do pré-tratamento de ayahuasca em modelos
experimentais de dependência ao etanol e analisou a imunohistoquímica da proteína c-Fos
no Núcleo Accumbens em roedores. A quantificação dos alcaloides mostrou-se compatível
com as relatadas na literatura e a atividade inibidora da MAO-A pela amostra foi confirmada
in vitro. Para os testes comportamentais foram utilizados camundongos albinos swiss,
machos, com 3-5 meses de idade. As doses de ayahuasca utilizadas neste trabalho,
equivalentes as utilizadas nas cerimônias ayahuasqueiras, foram aptas e seguras para os
testes pré-clínicos por meio de testes de triagem e avaliação da coordenação motora dos
animais por rota-rod. O modelo de preferência condicionada ao lugar mostrou que a
ayahuasca foi capaz de bloquear a preferência condicionada ao lugar induzida por etanol,
em todas as doses testadas (130, 650 e 1950 mg/kg). O modelo de sensibilização
comportamental, utilizando 14 dias de sensibilização e doses de 2g/kg de etanol ou 0,9% de
salina associadas a doses de 650 ou 1950mg/kg de ayahuasca, não foi capaz de induzir a
sensibilização comportamental no grupo controle. Entretanto, foram observados alguns
efeitos pontuais, como a diminuição no tempo de permanência da zona central na arena de
campo aberto pelos grupos que receberam etanol. A análise histoquímica dos encéfalos dos
animais utilizados no protocolo crônico de sensibilização comportamental não mostrou
diferenças significativas na imunorreatividade da proteína c-Fos nas regiões Core e Shell do
núcleo accumbens. Apesar dos resultados inconclusivos no teste de sensibilização
comportamental, os resultados da preferência condicionada ao lugar sugerem que o
potencial do uso do chá de ayahuasca no tratamento da dependência ao etanol não deve
ser descartado. Contudo, é importante ressaltar a importância de outros estudos com
diferentes paradigmas experimentais, e diferentes concentrações dos alcaloides presentes
no chá.

Palavras-chave: ayahuasca; etanol; dependência; beta-carbolinas, DMT, PCL,

Sensibilização Comportamental, Campo aberto
Área de conhecimento: neuropsicofarmacologia
 ABSTRACT

Alcohol addiction, or alcohol use disorder, is a problem that affects both the addict's
life and the society. Ayahuasca is a beverage used in religious ceremonies, prepared using
two plants, Psychotria viridis, which has the psychedelic DMT, and Banisteriopsis caapi,
which has β-carboline alkaloids that inhibit monoaminoxidase, decreasing the metabolism of
DMT. Some observational and experimental studies suggest that ayahuasca may be useful
for preventing or treating drug addiction. This study investigated the effect of ayahuasca
pretreatment on animal models of ethanol addiction and analyzed the immunohistochemistry
of c-Fos protein at Nucleus Accumbens in rodents. The quantification of alkaloids present in
the ayahuasca was compatible with those reported in the literature, and in vitro assays
confirm MAO-A inhibitory activity. Male Swiss albino mice, aged 3-5 months, were used for
behavioral tests. The ayahuasca doses used in this work -equivalent to those used in
ayahuasca ceremonies- were suitable and safe for pre-clinical tests through screening tests
and evaluation of the animals’ motor coordination by rotarod. The conditioned place
preference model showed ayahuasca could block the ethanol-induced place conditioned
preference at all doses tested (130, 650 and 1950 mg/kg). The behavioral sensitization
model -using 14 days of sensitization and doses of 2g/kg of ethanol or 0.9% of saline
associated with doses of 650 or 1950mg/kg of ayahuasca- could not induce behavioral
sensitization in the control group. However, some punctual effects were observed, such as
the decrease in the permanence time of the central zone in the open field arena by the
groups that received ethanol. Histochemical analysis of animal’s brains used in the chronic
behavioral sensitization protocol showed no significant differences in the immunoreactivity of
c-Fos protein in the Core and Shell regions of the nucleus accumbens. Despite inconclusive
results in the behavioral sensitization test, the results of conditioned place preference
suggest that we should not discard the potential of using ayahuasca tea in the treatment of
alcohol addiction. However, it is important to emphasize the importance of other studies with
different experimental paradigms, and different alkaloids concentrations present in tea.

Keywords: ayahuasca; ethanol; drug addiction; beta-carbolines; DMT, CPP,

Behavioral sensitization.
Field of knowledge: neuropsychopharmacology
LISTA DE ABREVIAÇÕES

5-HT - Serotonina (5-Hidroxitriptamina)

BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro
BNST - Bed nucleus of the stria terminalis
CEBRID - Centro Brasileiro de Informações sobre Drogas Psicotrópicas
DA - Dopamina
DMT - N,N-dimetiltriptamina
GABA - Ácido Gamma-aminobutírico
I.P. - Intraperitoneal
MAO - Monoaminaoxidase
MDMA - 3,4-metilenodioximetanfetamina
NAc - Núcleo Accumbens
NMDA - Glutamatérgico N-metil-D-aspartato
PB – Tampão Fosfato
UDV – União do Vegetal
VTA - Área Tegmental Ventral
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1
1.1 A história do Álcool ........................................................................................ 1
1.2 O consumo de Álcool no Mundo e no Brasil .................................................. 2
1.3 Problemas associados ao consumo de bebidas alcoólicas e dependência ... 3
1.4 A dependência como um problema geral ....................................................... 4
1.5 Aspectos neurobiológicos da dependência .................................................... 5
1.6 O atual tratamento da dependência ao etanol ............................................. 13
1.7 A Ayahuasca ................................................................................................ 15
1.8 Química, farmacologia e mecanismos de ação da ayahuasca .................... 16
1.9 A ayahuasca como potencial terapêutico ..................................................... 20
1.10 Modelos em animais .................................................................................... 25

2. OBJETIVOS ................................................................................................ 27
2.1 Objetivo Geral ............................................................................................. 27
2.2 Objetivos Específicos .................................................................................. 27

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................ 28

3.1 Material botânico .......................................................................................... 28
3.2 Liofilização do Chá de Ayahuasca ............................................................... 29
3.3 Quantificação dos alcaloides presentes no chá de ayahuasca .................... 30
3.4 Condições cromatográficas do sistema UPLC-ESI-MS/MS ......................... 30
3.5 Quantificação de Etanol por GC-FID............................................................ 32
3.6 Animais ........................................................................................................ 32
3.7 Drogas ......................................................................................................... 33
3.8 Avaliação da inibição da enzima monoaminooxidase in vitro ...................... 33
3.9 Screening farmacológico inicial .................................................................... 34
3.10 Avaliação da atividade locomotora por Rota-Rod ........................................ 35
3.11 Preferência condicionada ao lugar ............................................................... 36
3.11.1 Pré-tratamento com ayahuasca ................................................................... 38
3.12 Sensibilização comportamental.................................................................... 40
3.13 Eutanásia, perfusão e seccionamento dos encéfalos .................................. 44
3.14 Procedimentos de imuno-histoquímica (IHQ) free-floating para proteína c-
Fos ..................................................................................................................... 45
3.14.1 Captura e Análise de imagem ...................................................................... 46
3.15 Análise estatística ........................................................................................ 50
4. RESULTADOS ............................................................................................. 51
4.1 Quantificação dos alcaloides presentes no chá de ayahuasca .................... 51
4.2 Quantificação de Etanol por GC-FID ............................................................ 51
4.3 Avaliação da inibição da enzima monoaminooxidase-A in vitro ................... 52
4.4 Screening farmacológico inicial .................................................................... 53
4.5 Avaliação da coordenação motora por Rota-Rod ......................................... 53
4.6 Preferência condicionada ao lugar (PCL) ..................................................... 54
4.7 Sensibilização comportamental .................................................................... 58
4.7.1 Distância percorrida (mm) ............................................................................ 58
4.7.2 Taxa de exploração da arena de campo aberto ........................................... 60
4.7.3 Tempo de permanência nas Zonas Central e Externa ................................. 61
4.8 Imunorreatividade da proteína c-Fos na sensibilização comportamental ..... 63
4.8.1 Matriz de correlação e K- Means .................................................................. 64

5. DISCUSSÃO ................................................................................................ 66

6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 84

7. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 86

8. APÊNDICE ................................................................................................. 102

8.1 Critérios CID-10 e DSM .............................................................................. 102
8.2 Material complementar Rota-Rod ............................................................... 104
8.3 Material complementar PCL ....................................................................... 107
8.4 Material complementar sensibilização comportamental – Distância percorrida
110
8.5 Material complementar sensibilização comportamental – Taxa de exploração
114
8.6 Material complementar sensibilização comportamental – Tempo de
permanência nas zonas da arena ........................................................................... 117
8.7 Material complementar imunorreatividade c-Fos ........................................ 121
8.8 Material complementar k-means................................................................. 124

9. ANEXOS .................................................................................................... 125

9.1 Certificado CEUA UFABC – Victor Wiltenburg ........................................... 125
 PRÓLOGO
A busca por bebidas alcoólicas parece ser intrínseca à vida humana, ao
menos na forma em que a temos hoje. Sabemos de relatos de seu consumo há
séculos. Consumimos bebidas alcoólicas para nos divertir, para desinibir, para fins
religiosos, para curar males, e até para “afogar” as mágoas da vida. Vejo, de forma
curiosa, como o álcool está presente na sociedade humana como um todo.
Alguns anos atrás assisti a um vídeo em que elefantes, macacos e outros
mamíferos consumiam as frutas caídas de uma árvore de Marula no continente
africano (https://youtu.be/AIDJ-sTuoO8). As frutas caídas entravam em processo de
fermentação, e nos divertíamos vendo os animais aparentando aproveitar o estado
em que se encontravam, visivelmente letárgicos e com suas formas de consciência
alteradas. Apesar do conteúdo e das hipóteses geradas por estes vídeos serem
criticadas pela comunidade científica, acredito que foi com este vídeo e pelo fato de
nesta época ser proprietário de um bar e marca de cerveja artesanal que comecei a
me interessar pelo assunto abordado no meu mestrado.
Assim, algumas questões pessoais surgiram: O álcool teve algum papel na
sociedade humana que transcende o seu uso social? E quanto a outros animais,
esses também têm interesse pelas bebidas alcoólicas, como no vídeo, ou este é um
fenômeno humano e o vídeo não passa de mais um exemplo das atuais “Fake
News”? E principalmente, teríamos saído de um consumo social e trivial do álcool
para um consumo abusivo e que traz malefícios para a sociedade e para o ser
humano?
Para ser honesto, essas perguntas não eram tão difíceis de serem
respondidas. Não se trata de uma dúvida que apenas eu possuía, mas sim, um ramo
da ciência que atravessa diversas áreas do conhecimento e se mostra
extremamente proeminente. No meu caso, pela minha graduação em Neurociências,
o assunto quanto às consequências do consumo do álcool e, principalmente, a
relação que este tem com o sistema nervoso central, mostrou-se muito interessante.
É interessante que, na verdade, não apenas o vídeo que eu vi, mas o
comportamento animal relacionado ao consumo do álcool é mais comum do que eu
imaginava. Tanto é, que há estudos que mostram essa perspectiva e teorizam que o
consumo do álcool precede a vida humana, resumidos em uma reportagem para a
BBC por Malhotra, (2017). Contudo, é com o ser humano moderno que o consumo e
produção do álcool se aperfeiçoou, intensificou e que serão melhor abordados na
presente dissertação.
 1 INTRODUÇÃO

1.1 A história do Álcool

A origem do consumo de bebidas alcoólicas pelos seres humanos ainda não

é bem estabelecida. Contudo, há vestígios de uma possível bebida fermentada
encontrada em um sítio arqueológico nas cavernas de Raqefet, perto de Haifa, na
atual Israel, datada de 13000 anos atrás (Ives, 2011; Liu et al., 2018). Outras regiões
ao redor do mundo também apresentam evidências do consumo de bebidas
alcoólicas em épocas bastante remotas. Análises de jarros e cerâmicas do período
neolítico na vila de Jiahu, província do nordeste chinês, revelam vestígios de uma
bebida fermentada produzida à base de uvas, frutas, mel e arroz, em 7000 a.C.
(McGovern et al., 2004). Vestígios de bebidas preparadas com estas fontes, além de
trigo, cevada e outras frutas e cereais foram encontrados em outros locais do
mundo, datados, aproximadamente, de 6000 a.C. (Chrzan, 2013; Gately, 2008).
Outras fontes sugerem o consumo de bebidas alcoólicas ao redor do globo em
diversos períodos da humanidade, como há 5000 a.C. no Irã (Guinness world
records, 2020), 3150 e 3000 a.C. no antigo Egito e Babilônia (Cavalieri et al., 2003),
2000 a.C. no México pré-hispânico (Erkmen & Bozoglu, 2016) e no Sudão em 1500
a.C. (Wood, 1994). O Guiness book reconhece a primeira produção de vinho da
humanidade datando de 6000 a.C. na Geórgia (Guinness world records, 2020).
O consumo de bebidas alcoólicas encontra-se também nas Américas, que
apesar de ter se intensificado com a chegada dos Europeus no século XVI, teria se
iniciado muito antes, conforme apontam inúmeros registros de rituais envolvendo
bebidas fermentadas entre os ameríndios. No continente americano, a fermentação
da cerveja não se dava apenas pela cevada. Antes de os portugueses introduzirem
a destilação no Brasil, os ameríndios utilizavam frutas e raízes para o preparo da
Cauim e da Chicha. As principais bebidas eram feitas com o caju, a macaxeira, a
pacova ou banana-da-terra, o milho, o ananás ou abacaxi, as batatas e até o
jenipapo, entre os quais se encontram ingredientes fundamentais das bebidas
fermentadas reconhecidas como as cervejas primitivas indígenas. Um dado curioso
é que essas bebidas eram fermentadas com o auxílio da maltose presente na saliva
humana, sendo os ingredientes mastigados para ativar esta enzima e auxiliar na

1
fermentação. Tanto a Cauim quanto a Chica foram muito importantes para os povos
tradicionais, sendo utilizadas nos contextos ritualísticos e sociais desses povos
(Cascudo, 2004; Macena, 2015).
Apesar da história sobre a descoberta das formas de produção do álcool ser
importante por ter envolvido questões territoriais, econômicas e o próprio
desenvolvimento da sociedade humana como hoje a temos (Ives, 2011), nesta
introdução será abordado um entendimento do outro lado de toda esta expansão
alcoólica: como a sociedade consome o álcool atualmente e quais os malefícios e
benefícios a ele associados?

1.2 O consumo de álcool no mundo e no Brasil

De acordo com o relatório da Organização Mundial da Saúde (OMS, em

inglês World Health Organization, WHO), Global status report on alcohol and health
(World Health Organization, 2018), o consumo mundial de álcool teve pouca
mudança na perspectiva Global nos últimos anos, mantendo-se nos mesmos níveis
em grande parte dos países avaliados segundo o relatório, o consumo global per
capita entre indivíduos acima de 15 anos é, em média, 6,4 litros de álcool por ano,
ou aproximadamente 17,5g de álcool puro por dia (o que equivale a uma lata de
cerveja ou uma taça de vinho, por exemplo). Contudo, é importante refletirmos que
este é o consumo médio per capita, sendo que o número de indivíduos que bebem
não representa a totalidade de habitantes. Quando avaliado apenas o consumo
médio dos indivíduos bebedores, a quantidade per capta salta para, em média, 33g
de álcool puro diário (o que é equivalente a aproximadamente duas a três latas de
cerveja, ou 2 a 3 taças de vinho por dia).
O consumo de bebidas alcoólicas no Brasil é monitorado por entidades
governamentais e de pesquisa. Segundo o Centro Brasileiro de Informações sobre
Drogas psicotrópicas (CEBRID), o álcool é droga mais consumida no Brasil
(CEBRID, 2005, 2010). De acordo com o 3º Levantamento Nacional sobre o Uso de
Drogas pela População Brasileira (ICICT/FIOCRUZ, 2017), os dados mais
preocupantes em relação aos padrões de consumo de drogas no território nacional
estão relacionados ao álcool, e não às drogas ilícitas, como se poderia pensar.

2
 Em torno de 46 milhões de brasileiros informaram ter consumido alguma
bebida alcoólica nos 30 dias anteriores à pesquisa, além de mais da metade da
população entre 12 e 65 anos declarar que já consumiu álcool ao menos uma vez na
vida. Outro dado alarmante é que aproximadamente 2,3 milhões de pessoas
apresentaram critérios para dependência de álcool nos 12 meses anteriores à
pesquisa.

1.3 Problemas associados ao consumo de bebidas alcoólicas e

dependência

Segundo o relatório da OMS (World Health Organization, 2018), em 2012,

cerca de 3,3 milhões de mortes, ou 5,9% de todas as mortes globais, foram
atribuídas ao consumo de álcool. Em 2016, a mortalidade associada ao consumo de
álcool superou a causada por doenças como tuberculose, HIV e diabetes.
Nos anos 90, a OMS desenvolveu uma métrica inovadora chamada de
DALYs, em tradução livre, anos de vida ajustados pela deficiência (Cherpitel et al.,
2013). O DALYs, na prática, é a soma dos potenciais anos de vida perdidos devido à
mortalidade prematura e os anos de vida produtivos perdidos por incapacidade. Em
2012, 139 milhões de DALYs, ou 5,1% da carga global de doenças e lesões, foram
atribuídos ao consumo de álcool.
Outras consequências importantes são as condições neuropsiquiátricas
associadas ao consumo de bebidas alcoólicas e sua dependência. A epilepsia, por
exemplo, é gravemente impactada pelo álcool, seja por ação direta ou pelo corte da
ação medicamentosa (Samokhvalov et al., 2010). Outras condições
neuropsiquiátricas estão associadas ao consumo de etanol, como a depressão ou
transtornos de ansiedade (Boden & Fergusson, 2011; Overstreet et al., 2004), que
infelizmente, devido à complexidade das vias de associação, não são incluídas nas
estimativas de carga de doenças atribuíveis ao álcool (Rehm et al., 2010). Outra
síndrome importante relacionada ao consumo de álcool, desta vez pelas mulheres
em período gestacional, é a síndrome alcoólica fetal, que pode gerar complicações
que vão desde um parto prematuro ao nascimento de crianças com retardo de
desenvolvimento e intelectual, entre outras condições prejudiciais à saúde do recém-
nascido e da própria mãe (Foltran et al., 2011). Além destas, também é importante

3
ressaltar o papel do consumo de álcool, principalmente dos bebedores pesados, no
contexto da violência e ao suicídio (Cherpitel et al., 2013). Globalmente, cerca de
240 milhões de homens e 46 milhões de mulheres possuem algum transtorno
relacionado ao uso de álcool (SENAD, 2017).
No Brasil, segundo o 3º levantamento sobre o Uso de Drogas pela População
brasileira realizado pela Fiocruz (ICICT/FIOCRUZ, 2017), aproximadamente 13%
dos homens brasileiros entre 18 e 65 anos dirigiram após consumir bebidas
alcoólicas e 4,4 milhões de pessoas reportaram ter discutido com alguém sob efeito
de álcool nos 12 meses anteriores à entrevista. Segundo o relatório da OMS (World
Health Organization, 2018), em 2016, de todas as mortes atribuídas ao consumo de
álcool no mundo, 28,7% foram por lesões, como as causadas por acidentes de
trânsito, autolesão e violência interpessoal; 21,3% por distúrbios digestivos; 19% por
doenças cardiovasculares; 12,9% por doenças infecciosas e 12,6% por câncer.
Além do espectro dos prejuízos à saúde física do usuário, o consumo de
álcool também está associado a consequências socioeconômicas, como o
desemprego, problemas familiares, perda de rendimentos e até a estigmatização do
acesso deste indivíduo aos cuidados de saúde

1.4 A dependência como um problema geral

Como observado pelos dados anteriores, os problemas associados ao uso de

álcool e a dependência ao etanol, geram diversos transtornos para o usuário, para a
família e para a sociedade como um todo. Dando enfoque a dependência de álcool,
esta passa a ser um problema que a sociedade precisa enfrentar, repensando as
políticas públicas, os hábitos alimentares, e até mesmo as características culturais e
o lobby da indústria de bebidas.
É sabido que a dependência é um fenômeno complexo que envolve questões
de ordem biopsicossocial. Contudo, uma boa definição sobre o tema é fornecida
pela ASAM (American Society of Addiction Medicine). Em tradução livre: “A
dependência é uma doença médica crônica tratável que envolve interações
complexas entre os circuitos cerebrais, a genética, o meio ambiente e as
experiências de vida de um indivíduo. Pessoas com dependência usam substâncias

4
ou se envolvem em comportamentos que se tornam compulsivos e frequentemente
continuam, apesar das consequências prejudiciais” (ASAM, 2017).
Além de definir o que é dependência, é importante que se entendam os
critérios necessários para que um profissional da saúde diagnostique o indivíduo
como dependente. Apesar de muitas vezes pouco precisos, esses critérios acabam
sendo um norte para compreender a complexidade dessa doença e para cruzar
aspectos que vão além dos prejuízos citados anteriormente, facilmente
identificáveis.
Apesar da dependência de drogas ser uma temática complexa, com uma
grande individualidade dos dependentes, é importante definir e adotar critérios para
a dependência, pois, desta forma, este fenômeno deixa de ser entendido como um
problema de ordem moral e social, e passa a ser caracterizado como uma doença
que pode ser tratada e estudada, retirando assim sua estigmatização.
Existem dois critérios mundialmente utilizados para classificar um
dependente. O primeiro é definido pela CID-10 (Classificação Internacional de
Doenças), organizada pela OMS e utilizada pelo nosso Sistema Único de Saúde, o
SUS. Enquanto o segundo, pelo DSM (Diagnostic and Statistical Manual, Manual de
Diagnóstico e Estatística), foi elaborado pela Associação Americana de Psiquiatria e
é mais utilizado em ambientes de pesquisa. Ambos os critérios podem ser
encontrados no apêndice 8.1 desta dissertação.

1.5 Aspectos neurobiológicos da dependência

Admite-se que todas as substâncias que possuem características que podem

gerar dependência ativam uma via comum denominada via de recompensa, que é
modulada pela dopamina (DA) e está relacionada à motivação, e expectativa à
recompensas. Os neurônios dopaminérgicos da via de recompensa projetam-se da
área tegmental ventral (VTA), no tronco encefálico, para o núcleo accumbens (NAc)
e outras regiões do sistema límbico, como amígdala, hipocampo, e também para o
córtex frontal. As chamadas drogas de abuso, quando ingeridas de forma aguda,
induzem um aumento da liberação de DA no sistema mesolímbico, ativando a via de

5
recompensa, que passa a reconhecer tais drogas como estímulos reforçadores
(Gonzales et al., 2004).
À medida que estas drogas são utilizadas repetidamente, o sistema límbico
sofre pequenas modificações e adaptações moleculares, atuando como um reforço
positivo para o consumo de drogas. Isso se reflete em um aumento do desejo e
necessidade de busca pela droga, a fim de que tal via de recompensa volte a ser
superestimulada (ativada), criando uma associação condicionada entre o consumo
de drogas e sua recompensa (Volkow et al., 2019). Contraintuitivamente, o uso
crônico atenua a liberação de DA induzida por drogas e reduz a experiência de
recompensa, resultando em tolerância e na necessidade de doses mais altas para
atingir o mesmo nível de satisfação (Volkow, et al., 2019).
Receptores dopaminérgicos modulam tanto a via de recompensa, com redes
que modulam o estriado e córtex, como também outra via, relacionada a
mecanismos da memória e condicionamento, envolvendo a amigdala, córtex orbito
frontal medial (OFCm) e hipocampo. As vias envolvidas no condicionamento e
memória possuem um papel crítico na dependência, principalmente porque
permitem que os indivíduos associem um estímulo específico a uma determinada
recompensa ou punição. Alguns estudos sugerem que drogas com potencial aditivo
não aumentam a dopamina em indivíduos dependentes, se comparados com grupos
controles (Volkow et al., 2014), o que pode ser mais uma evidência de que o sistema
nervoso de um dependente ou usuário crônico é diferente daquele de usuários que
não preenchem os critérios para dependência (Volkow et al., 2014).
Estudos mostram que dependentes, de forma geral, possuem menores
expressões de receptores dopaminérgicos D2 (Volkow et al., 2002). Essa redução
de receptores D2 entre indivíduos dependentes pode estar associada com a
diminuição da atividade do OFC, giro cingulado anterior e áreas corticais pré-frontais
dorsolaterais e áreas encefálicas envolvidas na regulação emocional e na tomada de
decisão (Volkow et al., 2002; 2019). Outro dado interessante é que, em estudos com
animais, o aumento de receptores D2, expressos no NAc, reduz o consumo de
drogas em modelos experimentais de dependência ao álcool (Thanos et al., 2001,
2004).
Dependendo dos efeitos farmacológicos da substância, outros sistemas além
do sistema dopaminérgico também sofrem neuroadaptações que podem levar a

6
dependência, dado seu papel regulador na recompensa e no reforço. Apesar de
serem diversos e envolverem diferentes regiões do SNC, alguns destes sistemas
estão de forma mais clara relacionadas com o presente estudo, e serão brevemente
comentados.
Sabe-se que o uso inicial e ocasional de substâncias se difere, em vários
aspectos, da dependência. Essa diferença tem correlatos com a mudança de
circuitaria cerebral envolvida nos mecanismos de dependência.
Quando ocorre esta migração do comportamento de busca inicial da
substância para um comportamento habitual, existe uma correspondência
neuroanatômica de migração da ativação da região ventral do estriado para a região
dorsal do estriado (Belin & Everitt, 2008). Estudos com cocaína e etanol mostraram
que as conexões entre a OFC e a região dorso medial do estriado (DMS) é crítica
para esse comportamento de busca inicial por recompensa (Gremel & Costa, 2013).
O cérebro tem diversos mecanismos que modulam as sinapses dessas regiões
OFC/DMS, e promovem ou inibem a formação de hábitos.
O estresse também é um fator importante no desenvolvimento e manutenção
da dependência. Neste sentido, é importante considerar que as áreas cerebrais
envolvidas na resposta ao estresse e a circuitaria da recompensa estão
correlacionadas. Sabe-se que algumas atividades que geram estresse moderado e
liberação de adrenalina, como saltar de paraquedas, por exemplo, podem também
gerar a ativação da via de recompensa. E, quando ocorre uma excessiva ativação
do sistema de recompensa, como nos processos de dependência de drogas, isso
pode envolver o sistema de resposta ao estresse do SNC. Indivíduos que se tornam
dependentes podem perder as funções normais e aspectos do sistema de
recompensa, ganhando ativação do sistema do estresse também.
O CRF (Corticotropin Releasing Factor, em tradução livre, Fator de liberação
de corticotrofinas) e a dinorfina possuem um papel essencial nesse sistema (George
& Koob, 2013). Quando um indivíduo passa por um momento de estresse agudo, o
peptídeo CRF é liberado na amígdala estendida. Curiosamente isso também ocorre
durante episódios de abstinência ao álcool (Merlo et al., 1995). Alguns estudos
corroboram essa hipótese, verificando que antagonistas de CRF diminuíram a
ansiedade gerada pela abstinência (Overstreet et al., 2004). Além disso,

7
antagonistas de CRF diminuíram o consumo de álcool de ratos dependentes, mas
não interferiram no consumo de animais não dependentes (Funk et al., 2007).
Essas mudanças na concentração de CRF extra hipotalâmica podem estar
relacionadas a uma resposta hormonal inicial e a um aumento na liberação de
glicocorticoides, diminuindo os níveis de CRF no núcleo paraventricular e
aumentando na amígdala (Koob & Le Moal, 2001). Um efeito similar é visto em
animais dependentes (Roberto et al., 2010). Outro dado importante é que hábitos
compulsivos de ingestão de drogas levam a um aumento dos níveis de CRF na
amígdala, PFC e VTA, contribuindo para a ocorrência de respostas estressantes e
estados emocionais negativos, que podem servir de contexto para o consumo
compulsivo, servindo como reforço negativo. Similar aos antagonistas de CRF,
antagonistas de glicocorticoides, como a mifepristona, também foram capazes de
diminuir o consumo de álcool em animais dependentes, mas não em animais não
dependentes (Vendruscolo et al., 2012, 2015). Translacionalmente, em um estudo
com humanos, observou-se que este antagonista de glicocorticoides (mifepristona)
foi capaz de diminuir a fissura e o consumo de bebidas alcoólicas, quando
comparado a um grupo controle placebo (Vendruscolo et al., 2015).
Aspectos da memória e das pistas sociais e ambientais também podem
interagir com o consumo de drogas. Um exemplo disso é quando indivíduos
dependentes recebem uma ligação de um colega para se encontrar no bar, ou
quando o dependente passa no ambiente em que usualmente consumia ou
consome a droga. No caso de animais de laboratório, podemos exemplificar citando
experimentos em que uma luz acende numa gaiola como pista ambiental ou o
animal é adicionado em um ambiente específico. Este ambiente (inicialmente um
estímulo neutro) passa a ser emparelhado (condicionado) com outro estímulo (a
droga) e, finalmente se torna um estímulo discriminativo para o comportamento de
usar a droga, pois sinaliza a disponibilidade do reforço. Nesse aspecto, o NAc possui
um papel importante, pois é nele que o ocorre um potencial de longa duração,
ativando essa região e afetando a resposta do próprio estímulo (Gipson et al., 2013).
Na dependência ao etanol, um tratamento coadjuvante e usual é a utilização
de antidepressivos. Sabemos que a diminuição dos níveis serotoninérgicos está, de
alguma forma, relacionado com transtornos depressivos, e estes têm sua relação
com a própria dependência; contudo, o próprio papel da serotonina no cérebro

8
merece mais estudos (Andrews et al., 2015; Thibaut, 2017). As projeções
serotoninérgicas do núcleo da rafe e do nervo vago estão relacionadas com diversas
funções cerebrais, além da grande quantidade de tipos de receptores de serotonina,
o que dificulta saber quais receptores estão envolvidos em que.
Diversas linhas de evidências sugerem que o aumento na excitação do
sistema serotoninérgico pode ser aversivo. O tratamento farmacológico com
inibidores da recaptação de serotonina (IRS), por exemplo, pode levar a ansiedade,
pânico e ideações suicidas (Burghardt & Bauer, 2013). A serotonina também
desempenha um papel importante na ansiedade induzida pela dependência ao
etanol. Agonistas serotoninérgicos, em indivíduos dependentes de álcool, podem
induzir estados de fissura (Krystal et al., 1994; Umhau et al., 2011), além dos IRS e
ISRS poderem aumentar a ansiedade e o próprio consumo em usuários com uso
pesado de álcool (Kranzler et al., 2011, 2012). Com estes resultados, alguns
pesquisadores continuam tentando elucidar o porquê desses efeitos sobre a
ansiedade, principalmente quando associados à alcoolistas. Em um modelo de
dependência em camundongos, no qual os animais eram expostos a álcool em
vapor e avaliados 24 horas e 7 dias após a abstinência, os animais mostraram
comportamentos associados à ansiedade (Lowery-Gionta et al., 2015). Esse efeito
aparenta ser dependente de serotonina, visto que, injetando nos animais
antagonistas de receptores serotoninérgicos, os comportamentos ansiogênicos
foram reduzidos (Marcinkiewcz et al., 2015).
Avançando nos aspectos neurobiológicos, o álcool é capaz de induzir uma
hiperexcitação tanto no núcleo dorsal da rafe quanto na região do Bed nucleus of the
stria terminalis (BNST), parte da amígdala estendida. Existe uma população de
neurônios que respondem à serotonina na região do BNST que expressa tanto CRF
quanto receptores serotoninérgicos 5HT2C. Quando ativados, esses neurônios
inibem as projeções para o VTA e hipotálamo lateral, inibindo o comportamento
dirigido pela recompensa e estados aversivos. É interessante que, silenciando os
neurônios de CRF no BNST, bloqueia-se o efeito da fluoxetina (um popular
antidepressivo da classe dos ISRS) de aumentar o aprendizado dependente de
memórias aversivas e ansiedade (Marcinkiewcz et al., 2016).
Como comentado anteriormente, o NAc é uma região importante para a
dependência de drogas e para o sistema de recompensa. O NAc é uma região no

9
prosencéfalo basal, rostral à área pré-óptica do hipotálamo, e faz parte do chamado
estriado ventral. O conjunto dos estriados (ventral e dorsal) forma o estriado, sendo
esta a principal região dos gânglios da base (Carlson, 2012). Essa região recebe um
grande número de projeções da via mesolímbica, integrando informações de
estruturas corticais e límbicas para mediar alguns comportamentos (Carlson, 2012;
Scofield et al., 2016). A estrutura do NAc no encéfalo é bilateral, sendo que cada
lado pode ser subdividido em subregiões. Apesar de atualmente o NAc ser subdivido
em mais de duas partes, neste trabalho será utilizada a subdivisão canônica em que
divide o NAc em core e shell. Essas regiões possuem morfologias e funções
diferentes, além de uma diferença na subpopulação de neurônios, por exemplo dos
tipos D1 e D2, sendo responsáveis por diferentes funções cognitivas.
De modo geral, a totalidade do núcleo accumbens possui funções
relacionadas ao processamento cognitivo da motivação, aversão, recompensa (de
uma forma mais específica na saliência de incentivo e nos reforços positivos), e na
aprendizagem por reforço (Saddoris et al., 2015, Ikemoto, 2010).
A diferença nas regiões shell e core, como comentado, se dá na parte
morfológica e funcional. A região Shell compreende a parte periférica do accumbens
e faz parte da amígdala estendida (Carlson 2012). Os principais tipos celulares do
NAc são em grande parte neurônios espinhosos médios sendo que, estes
expressam principalmente receptores dopaminérgicos da família D1 ou D2. É
interessante que uma porcentagem considerável (aproximadamente 40%) desses
neurônios expressa ambas famílias de receptores dopaminérgicos e estão em
maiores concentrações na região shell (Yager et al., 2015, Nishi et al., 2011).
Já a região core representa a parte central (interna) do NAc. Essa região
possui predominantemente neurônios espinhosos médios com expressão de
receptores dopaminérgicos da família D1 ou D2. Há evidências de que os neurônios
que expressam a família D1 mediam comportamentos relacionados a recompensa,
enquanto os neurônios espinhosos médios que expressam a família D2 podem estar
mais relacionados a mediação de processos cognitivos relacionados a aversão.
(Dumitriu et al., 2012; Saddoris et al., 2015). Também na região core, ocorrem
projeções para o globo pálido e substância nigra. É interessante que na região core
também existe uma abundância de receptores gabaérgicos (Meredith et al., 1992,
1993; Saddoris et al., 2015).

10
 Quando explorado mais especificadamente as funções das regiões do NAc, o
shell aparentemente está relacionado com o processo cognitivo de recompensas,
como estímulos prazerosos, saliência motivacional e reforços positivos (Baliki et al.,
2013; Dumitriu et al., 2012; Saddoris et al., 2015). Também é na região shell em que
aparentemente ocorre uma maior liberação de dopamina com o consumo de drogas
de abuso, se comparado a região core (Hyman et al., 2006). Já a região core
aparentemente está relacionada aos processos cognitivos das funções motoras
relacionadas a recompensa e reforço, além da regulação do sono de ondas lentas
(Oishi et al., 2017; Saddoris et al., 2015; Valencia Garcia & Fort, 2018).
Outros dados que auxiliam os pesquisadores a desvendar os mecanismos
envolvidos com os testes comportamentais e a administração de substâncias, é a
análise de biomarcadores periféricos e centrais, além da ativação de regiões
específicas por proteínas. Estudos de biologia molecular têm apontado algumas
proteínas que parecem estar envolvidas com os mecanismos de dependência. O
recrutamento de regiões encefálicas envolve a ativação de diferentes mecanismos
para processar e transmitir a informação intracelular e intercelular. Essa ativação
pode ocorrer de formas diversas, como por alterações da atividade eletrofisiológica
neural ou por alterações na cascata de mensageiros celulares que evocam a
produção de fatores de transcrição. Esses fatores podem induzir ou inibir a
transcrição de genes (Herdegen & Leah 1998, Robison & Nestler, 2011).
Os genes ativados pelos fatores de transcrição podem produzir diferentes
proteínas, como as que constituem receptores de membrana, transportadores e
enzimas de síntese de neurotransmissores. Entre os fatores de transcrição mais
estudos está a família FOS, principalmente a FOSB, ΔFOSB e o c-Fos.
O ΔFosB talvez seja o fator de transcrição de gene mais significativo no
processo de dependência, visto que a superexpressão deste fator no NAc está
relacionado com adaptações neurais e efeitos comportamentais, como o aumento da
expressão de ΔFosB em modelos de auto-administração de drogas e de
sensibilização comportamental (Robison & Nestler, 2011; Ruffle, 2014). A
superexpressão de ΔFosB também é observada no processo de dependência ao
etanol e outras drogas de abuso, além de estar relacionada a respostas
comportamentais frente as recompensas naturais, tais como alimentação, sexo e
atividades físicas (Blum et al., 2012; Robison & Nestler, 2011; Ruffle, 2014).

11
 Já a proteína c-Fos é um proto-oncogene que pertence a uma família de
genes de expressão imediata. Esses genes são fatores de transcrição de ativação
rápida e passageira na cascata inicial da expressão gênica que é responsável pelo
início do processo de mudanças adaptativas induzidas por estímulos extracelulares
(Davis et al., 2003). O c-Fos é induzido rapidamente após a ativação sináptica e
atinge o pico de expressão entre 90 e 120 minutos após ocorrer uma estimulação
(Grzanna & Brown, 1993; Robison & Nestler 2011). Essa proteína é um produto do
gene c-Fos e tem papel regulatório em conjunto com outros membros das famílias
FOS e JUN, que formam um complexo heterodimérico AP1, posteriormente ligando-
se ao DNA para controle da expressão gênica. Adicionalmente, o complexo AP1
liga-se a locais específicos presentes no interior de regiões regulatórias de diversos
genes, que incluem os relacionados com o comportamento e com a plasticidade
neural (Nye & Nestler, 1996; Robison & Nestler, 2011).
Animais que não sofreram qualquer estímulo e estão sujeitos apenas a
processos fisiológicos contínuos apresentam níveis considerados basais de c-Fos.
Contudo, a expressão desta proteína cresce rapidamente no SNC quando recebem
estímulos variados, como substâncias de abuso e características associadas à
novidade (Duncan 1996; Morrow, 2000). A exposição aguda e crônica ao álcool e
outras drogas também proporciona uma série de respostas adaptativas na via
mesolímbica do sistema dopaminérgico, incluindo mudanças nos fatores de
transcrição e genes de expressão imediata (Clapp et al., 2008, Cruz et al., 2015,
Nestler, 2011). Em resumo, a expressão de c-Fos indica que o neurônio está
submetendo-se a um processo de adaptação e possivelmente plasticidade advindo
de estímulos neuronais. Usualmente, ela está associada à ativação neuronal.
Neste sentido, Faria et al., (2008) observaram que a administração aguda de
etanol aumentou a expressão de c-Fos em regiões como PFC, córtex motor,
amígdala, hipocampo e NAc de camundongos. Já a administração crônica em
animais avaliados em modelo de sensibilização ao etanol produziu efeito contrário,
ou seja, ocorreu uma baixa expressão de c-Fos (Faria et al., 2008).
Além destes fatores de transcrição imediatos, outras alterações são mais
tardias e duradouras, como modificações na expressão e localização de
transportadores e enzimas de sínteses. A figura 1 mostra como respostas imediatas
podem modular vias com efeito tardio. Observa-se no painel A que a ativação do

12
receptor dopaminérgico D1 leva a uma ativação da via da proteína quinase A (PKA),
que estimula a formação do CREB (cAMP response element-binding), produzindo
como resultado um aumento da expressão da dinorfina e da atividade do neurônio
GABAérgico. No painel B pode ser observado como o ΔFosB pode modular a
expressão da dinorfina no neurônio no NAc, um evento resultante da ação de
opioides ou agonistas indiretos da dopamina (cocaína). Acredita-se também que
estes substratos celulares contribuam no aspecto emocional e motivacional da
abstinência e abuso de drogas (Hyman et al., 2006; Nestler & Lüscher, 2019).

Figura 1 Relação do sistema dopaminérgico (DA) via dinorfina (DYN), no estriado dorsal e
ventral (NAc) na adição a drogas. Modificado de (Hyman et al., 2006; Nestler, 2001).

1.6 O tratamento da dependência ao etanol

Entender a dependência como um problema complexo de saúde pública e

que merece todo o cuidado possível é o primeiro passo para se pensar em
tratamentos. Grande parte das abordagens atuais para o tratamento da dependência
consiste em diminuir o desejo pela droga (fissura ou “craving”), diminuir ou evitar o
seu poder reforçador e amenizar ou abolir os sintomas desagradáveis decorrentes
da interrupção do uso, que caracterizam a síndrome de abstinência (Kreek et al.,
2002). Além disso, grande parte dos tratamentos baseiam-se no conceito de
manutenção da abstinência, ou seja, práticas para evitar a recaída, para que o
usuário não faça o consumo da substância (Schuckit, 2009).
Uma abordagem geralmente necessária e paralela é o tratamento
farmacológico, infelizmente ainda de eficácia questionável na maioria dos casos,
sendo importante a busca por novas alternativas farmacológicas. Entre estas

13
alternativas, destaca-se nos últimos anos o uso de produtos naturais ou substâncias
ativas isoladas de plantas (Mendes & Prado, 2017).
Poucos fármacos são utilizados como coadjuvantes no tratamento da
dependência e, por não se tratar do foco deste estudo, não serão aprofundados
aqui. Já as plantas medicinais, como comentado, são alternativas muito usuais pela
população brasileira. Fazendo uma busca na literatura, não é difícil encontrar
estudos pré-clínicos, clínicos e principalmente etnoantropológicos da utilização de
plantas medicinais para a dependência (Singh et al., 2020). Dentre as plantas mais
citadas, destaca-se a Erva de São João (Hypericum perforatum L.), planta conhecida
pelo sucesso no combate à depressão (Uzbay, 2008). Outro exemplo é a iboga
(Tabernanthe iboga Baill.), arbusto cuja raiz tem sido muito utilizada, sendo seu
potencial terapêutico avaliado para a dependência ao etanol por Rezvani et al.,
(1995), além de sua utilização ser popular em clínicas pelo Brasil e pelo mundo. A
iboigaína é uma triptamina (alcaloide monoamínico encontrado em plantas, fungos e
animais e quimicamente relacionado ao aminoácido triptofano) e age em diferentes
sistemas de neurotransmissão no SNC. Apresenta afinidade pelo receptor NMDA,
receptores opioides do tipo kappa, receptores do tipo sigma e receptores nicotínicos,
além de ser agonista de receptores 5-HT2A (Glick et al., 2001; Popik & Glick, 1996).
Outra bebida a base de plantas medicinais, a ayahuasca, vem chamando a
atenção da comunidade acadêmica-científica nas últimas décadas. Seu uso tem
crescido bastante e fomentado diversas pesquisas acadêmicas, principalmente no
território brasileiro (Barbosa et al., 2018), como será discutido nas próximas sessões.

14
 1.7 A Ayahuasca

Ayahuasca (do quíchua “Vine of Souls '') é o nome comumente usado na

literatura para caracterizar uma bebida botânica psicodélica usada para rituais e fins
terapêuticos por diferentes povos tradicionais da Amazônia (McKenna & Riba, 2015).
No contexto religioso ou tradicional, o uso da ayahuasca é amplamente
difundido nas tribos endêmicas da bacia amazônica, sob diferentes nomes. Apesar
de não se ter muitas informações quanto a sua origem, nas últimas décadas, seu
uso moderno e sincrético se intensificou e o consumo da bebida se popularizou
(Callaway, 2005; Luna, 1984, 1996).
Das doutrinas sincréticas ayahuasqueiras no Brasil, a União do Vegetal, a
Barquinha, e o Santo Daime são as mais conhecidas. Para melhor compreensão,
uma religião ou doutrina sincrética é aquela que é gerada pela incorporação de um
sistema de crenças por outro. Em outras palavras, quando uma doutrina junta
elementos de crenças, por exemplo xamânicas, com crenças espíritas e católicas,
formando uma nova doutrina. Além disso, no contexto folclórico medicinal o chá de
ayahuasca é visto como uma medicina, um remédio para enfermidades físicas e
principalmente para enfermidades espirituais, além da divinação e como mecanismo
de conexão com o divino e com planos espirituais. No contexto sincrético, os
membros dessas doutrinas consomem (consagram) o chá em intervalos regulares,
que se assemelham a eucaristia católica.
É importante enfatizar que o uso da ayahuasca com fins ritualísticos e
religiosos é legalizado no Brasil, facilitando seu estudo por grupos científico-
acadêmicos. A UDV e o Santo Daime são considerados as maiores doutrinas
ayahuasqueiras no Brasil (McKenna, 2004). A UDV atualmente possui uma melhor
organização estrutural, tendo núcleos ao redor do Brasil e em outros países.
Segundo o site da organização, em seus 59 anos de existência, ela possui 216
núcleos, localizados em todos os estados brasileiros e em dez países, com mais de
27 mil membros (UDV, 2020).
No contexto tradicional, a ayahuasca é uma bebida preparada usualmente
pelo cozimento (cocção) da casca e caule do cipó Banisteriopsis caapi com outras
plantas amazônicas (diversas combinações são encontradas na literatura e nos

15
grupos que utilizam o chá, e apesar da Banisteriopsis caapi aparentemente ser a
planta comum nestes, há combinações substituindo-a também). Comumente, uma
dessas plantas adicionadas na mistura é do gênero Psychotria, particularmente a
Psychotria viridis. Nas folhas de P. viridis são encontrados os alcaloides N, N-
dimetiltriptamina (DMT) e em menor quantidade N-metiltriptamina, agonistas
serotoninérgicos com ação alucinógena no SNC (Callaway et al., 1999; Callaway,
2005; McKenna et al., 1984). Já o cipó (tronco) de B. caapi possui alcaloides com
estrutura β-carbonílicas, tais como harmina, harmalina e tetra-hidroharmina (THH)
com potente ação inibidora reversível sobre a monoamina oxidase (MAO) hepática e
intestinal.
É importante ressaltar que a associação das plantas utilizadas na preparação
do chá é fundamental para se obter os efeitos psicoativos esperados. O DMT não é
ativo oralmente quando ingerido individualmente, contudo, isso pode ser contornado
quando se utiliza em conjunto com os inibidores periféricos da MAO, como as β-
carbolinas. Essa interação e sinergia é a base da ação psicotrópica e farmacológica
da ayahuasca (McKenna & Towers, 1984). Devido ao DMT ser um alcaloide
encontrado em abundância em diversas outras espécies da flora, outras plantas
também são utilizadas na preparação de bebidas análogas. Um exemplo é a
utilização de espécies conhecidas como Jurema no vinho de Jurema.

1.8 Química, farmacologia e mecanismos de ação da ayahuasca

Entender a farmacologia da Ayahuasca será imprescindível para melhor

discutir os futuros resultados deste trabalho. Contudo, é relevante mencionar que
será focado apenas nos componentes das duas plantas mais comumente utilizadas.
A B. caapi contém como principais constituintes os alcaloides β-carbolínicos
harmina, harmalina e THH (Callaway et al., 1996). Outros alcaloides β-carbolínicos e
constituintes de classes químicas distintas também foram reportados (McKenna et
al., 1984), mas é consenso na literatura que os três primeiros alcaloides citados são
os principais responsáveis pelo efeito sinérgico da ayahuasca. Já a P. viridis possui
o DMT como principal constituinte, além da N-metiltriptamina e da metil-tetrahidro-β-
carbolina, também encontrada em quantidades traço, bem como diversos outros

16
constituintes que provavelmente não participam do efeito farmacológico (McKenna &
Towers, 1984). Na figura 2 é possível observar as estruturas moleculares dos
alcaloides citados e suas semelhanças com o neurotransmissor serotonina.

Figura 2 Esquema ilustrativo das estruturas moleculares dos principais alcaloides da

ayahuasca e do neurotransmissor serotonina.

Neste momento é importante mencionar dois aspectos fundamentais, muitas

vezes menosprezados pela literatura. O primeiro é o fato de o chá ayahuasca
eventualmente possuir outras plantas aditivas, sendo assim, outras substâncias
ativas podem estar presentes no produto final. Talvez então, num futuro, será
possível identificar outros constituintes do chá que sejam tão importantes para seu
efeito quanto os canonicamente associados. Outro fator relevante para qualquer
estudo com o chá ayahuasca é o fato das plantas apresentarem diferentes
quantidades dos alcaloides, sendo que, em algumas situações, certos alcaloides
podem não estar presentes (Callaway et al., 1996; McKenna et al., 1984; Rivier &
Lindgren, 1972). Callaway (2005) encontrou diferentes quantidades dos alcaloides
nas amostras obtidas em diferentes regiões amazônicas e essas diferenças foram
atribuídas a características distintas entre variedades das espécies, locais de plantio,
proporções de plantas utilizadas, momento da colheita, tempo de cozimento do chá,
entre outras. Isso faz com que seja imprescindível que qualquer trabalho acadêmico
com o chá realize a quantificação dos principais alcaloides, para assim ser possível
identificar correlações e quiçá causalidades.

17
 As β-carbolinas, por serem inibidores da MAO, também tem potencial de
apresentar atividade psicoativa, mas é difícil atribuir suas ações isoladas aos efeitos
alucinógenos ou psicodélicos (Shulgin & Shulgin, 1997). A ação primária das β-
carbolinas, quando a ayahuasca é consumida por via oral, é a inibição da MAO
periférica (presente em altas concentrações no trato gastrointestinal). Por outro lado,
há evidências de que as β-carbolinas atravessem a barreira hematoencefálica
produzindo também, em menor grau, inibição da MAO central (He et al., 2015a;
Meinguet et al., 2015). Ademais, existem evidências de que a THH, um dos mais
abundantes alcaloides β-carbolínicos da bebida, age como um inibidor da
recaptação de serotonina, aumentando o tempo da serotonina e possivelmente do
DMT na fenda sináptica, podendo gerar um efeito de “disputa” com o DMT nos
receptores pós-sinápticos, e atenuando os efeitos subjetivos da ingestão oral do
DMT (Callaway et al., 1999).
O principal efeito sinérgico entre os constituintes da ayahuasca se dá pela
inibição da MAO periférica pelas β-carbolinas presentes no preparado. Com isso,
previne-se que ocorra a oxidação periférica do DMT, de modo que este consegue
ser oralmente ativo e produz sua ação no SNC (McKenna & Towers, 1984). É
importante ressaltar que o DMT sozinho é inativo quando administrado oralmente,
mesmo em doses muito altas como 1000 mg (McKenna, 1998; Nichols, 2004).
Contudo, outras formas de administração são utilizadas por usuários que preferem
ter a ação do DMT isolada, normalmente por via parenteral utilizando a DMT
(substância pura e isolada), ou a Changa, mistura de plantas que contém DMT,
sendo tais misturas fumadas ou inaladas, como no caso dos Rapés indígenas. Estas
formas alternativas de administração possuem uma ação instantânea e de curta
duração (em torno de 15 minutos) (McKenna, 1998; Smith et al., 2014; Stafford,
2013). Apesar destas formas alternativas, apenas o chá de ayahuasca é oralmente
ativo e promove uma ação prolongada, além de efeitos diferentes daqueles de
quando consumidos de forma parenteral. Consumido na forma de chá, o efeito inicial
ocorre aproximadamente após 40 minutos da ingestão e com longa duração (horas),
produzindo geralmente efeitos mais brandos (Callaway et al., 1999).
Os efeitos observados pelo consumo da ayahuasca geralmente incluem
visualização de mandalas e outra imagens de fosfenos, essas podendo ser vistas
com os olhos fechados, estado mental alterado, com contexto onírico exacerbado,

18
além de sentimento de estimulação e estado de alerta (Callaway et al., 1999). Além
do efeito alucinógeno, náuseas, vômito e diarreia estão relacionados com a ingestão
de ayahuasca, que pode induzir taquicardia, tremores, midríase, euforia e excitação
(Costa et al., 2005).
As β-carbolinas são altamente sensíveis ao subtipo MAO-A, forma da enzima
com maior afinidade na degradação de serotonina e outras aminas (Yasuhara,
1974). Antidepressivos inibidores da MAO aumentam os níveis cerebrais de
serotonina e outras aminas, como a dopamina e adrenalina, pois bloqueiam uma das
vias de metabolização dessas aminas. Em altas doses, também pode ocorrer uma
certa inativação da MAO-B pelas β-carbolinas. Este fato, aliado com a baixa
afinidade da MAO-B presente no fígado, mostra uma característica muito peculiar do
chá, e pode explicar o porquê não é comum relatos sobre crises no sistema
autonômico periférico, principalmente quando o chá é consumido
concomitantemente com alimentos ricos em tiramina (Callaway et al., 1999).
Numa perspectiva bioquímica, as β-carbolinas são alcaloides tricíclicos
indolicos com estrutura relativamente próxima das triptaminas, tanto na sua
biossíntese quanto farmacologicamente. (McKenna et al., 1984; McKenna & Towers,
1984). Já o DMT, como comentado previamente, é considerado um psicodélico
clássico (as estruturas moleculares dos psicodélicos clássicos e da serotonina
podem ser observadas na figura 3). Desta forma, é importante serem abordados os
efeitos admitidos para os alucinógenos clássicos e em seguida, as particularidades
do DMT em si. De uma perspectiva biológica, estudos pré-clínicos e em humanos
consideram que a alteração mental induzida pelos alucinógenos pode estar
associada a ação agonista sobre receptores serotoninérgicos corticais, em especial
o 5-HT2A. Essa ativação é interessante, pois estudos recentes mostram que a
ativação desses receptores gera a ativação de receptores glutamatérgicos do tipo
AMPA (alpha-amino-3-hidroxy-metil-5-4-isoxazolpropionico), aumentando a ativação
cortical e o fluxo de informação (Bouso et al., 2018; Murnane, 2018). Estes mesmos
estudos, além do trabalho realizado por Nichols (2016), também sugerem que essas
substâncias podem estimular a neuroplasticidade, principalmente estimulando a
expressão de c-Fos no córtex pré-frontal medial (mPFC) e córtex cingulado anterior
(ACC), além do aumento da expressão de BDNF no PFC. Esse aumento agudo
(24h) favorece a neuritogênese, espinogênese e sinaptogênese no PFC sendo

19
mediados pelo agonismo de receptores 5-HT2A e pela ativação dos receptores
tirosina kinase B (TrkB) pela alta afinidade de BDNF e mTOR, sendo muito
interessante que essa classe é até “apelidada” por alguns pesquisadores, como
“psicoplastógenos” (Murnane, 2018).
Além de potente agonista 5-HT2A, o DMT também apresenta afinidade por 5-
HT1A, 1B, 1D, 5-HT2c (Callaway et al., 1996; Grob et al., 1996; Nichols, 2016) e 5-HT7
(Speranza et al., 2017), este último, envolvido na modulação da sinaptogênese e
neuritogênese. Por fim, também é visto uma afinidade da DMT com os receptores
Sigma-1, o que pode estar relacionado com um possível efeito neuroprotetor da
ayahuasca (Bouso et al., 2012; dos Santos & Hallak, 2020).

Figura 3 Estrutura moleculares de diferentes psicodélicos clássicos. Todas as moléculas são

triptaminas próximas à mescalina, que é uma fenetilamina. A serotonina (embaixo à esquerda) é uma
triptamina endógena e outras triptaminas se assemelham à serotonina na estrutura. Retirado de
Nichols (2004).

1.9 A ayahuasca como potencial terapêutico

Os possíveis benefícios do uso ritualístico observados desde os estudos

pioneiros com a ayahuasca, impulsionado pelo conhecimento indígena aliado ao uso
sincrético contribuíram para que boa parte dos estudos explorasse o seu potencial

20
terapêutico. Diversos trabalhos sugerem o potencial terapêutico da ayahuasca para
transtornos como depressão, ansiedade, transtornos de uso de substâncias, em
especial o alcoolismo e tabagismo (dos Santos & Hallak, 2020; Labate, 2000;
Wiltenburg et al., 2021).
Segundo Labate (2000), os movimentos religiosos que utilizam o chá de
ayahuasca têm recebido um número crescente de usuários de drogas de abuso
interessados em participar dos seus rituais, e esses indivíduos procuram tais
movimentos para auxílio no abandono da dependência. Integrantes e ex-integrantes
das religiões ayahuasqueiras relatam que a participação nos cultos contribuiu
significativamente para a diminuição do uso de drogas e melhora de problemas
psiquiátricos (Halpern et al., 2008; McKenna, 2004). Isso pode estar relacionado ao
contexto social em que o chá é consumido, mas não se pode descartar a hipótese
de que os componentes da ayahuasca exerçam um efeito farmacológico
antidependência per se. Por outro lado, é bem conhecido que o chá possui
propriedades psicoativas e, portanto, seu uso deve ser feito com cautela, pautado
em estudos científicos.
Nesta perspectiva em que o contexto social e as vivências psicológicas que o
chá proporciona são fatores importantes no processo terapêutico, Barbosa et al.,
(2018) realizaram uma pesquisa quantitativa e qualitativa em membros da UDV com
problemas associados ao álcool e tabaco. A pesquisa envolveu mais de 1900
pessoas e trouxe dados muito interessantes quanto ao potencial terapêutico do chá
para a dependência. Os pesquisadores mostraram que o sucesso da terapêutica
antidependência entre participantes nos rituais da ayahuasca foi superior ao
encontrado em outras religiões que atuam com dependentes, mas que não tem a
ayahuasca como parte da intervenção. Este fato reforça os achados que sugerem
que a ayahuasca pode ter potencial terapêutico por si só, além do contexto
ritualístico.
No estudo de Barbosa, foram avaliados mais de 1947 membros da UDV,
maiores de 19 anos, em termos de anos de membresia na UDV e frequência nas
reuniões periódicas nos últimos 12 meses. O estudo mostrou que transtornos
relacionados ao consumo de álcool e tabaco foram significativamente menores nos
membros da UDV do que se comparados às médias da população brasileira. Vale
ressaltar que esse resultado apresenta uma forte correlação com o número de

21
participação nos rituais dos últimos 12 meses, e também há quanto tempo já
participa da UDV, frequência de participações nos encontros periódicos, sendo que
os membros mais antigos da UDV mostraram uma diferença ainda maior se
comparados a normalidade brasileira (Barbosa et al., 2018).
A potencialidade da ayahuasca em tratar a dependência de drogas, com
ênfase na harmina, foi discutida em uma revisão publicada por Brierley & Davidson,
(2012). Os estudos apoiam, pelo menos em parte, as alegações de que o chá de
ayahuasca seria benéfico no tratamento da dependência de drogas.
A maioria dos estudos clínicos disponíveis sobre a ayahuasca são estudos
observacionais e retrospectivos com frequentadores das religiões ayahuasqueiras.
Grob et al. (1996) avaliaram um grupo de quinze usuários de ayahuasca, no qual
onze relataram ter um histórico de uso moderado a grave de álcool e outras drogas
antes de entrar na União do Vegetal e todos eles descontinuaram o uso das drogas
de abuso, sem relatos de recaídas, pouco tempo depois do início do uso recorrente
de ayahuasca. Labigalini Junior (1998) avaliou um grupo de quatro indivíduos que
haviam apresentado dependência e que também descontinuaram o uso das drogas
de abuso após começarem a frequentar os rituais. Em outro trabalho, adolescentes
pertencentes a uma religião ayahuasqueira apresentaram menor uso de álcool e
outras drogas em relação a jovens de mesma faixa etária que nunca fizeram uso do
chá de ayahuasca (Doering-Silveira et al., 2005).
Em um outro estudo observacional foi avaliado o efeito da participação em
duas sessões de terapia assistida com ayahuasca em combinação com quatro
sessões em grupos de aconselhamento sobre o consumo de substâncias de abuso
e outros parâmetros. Foi relatado diminuição do uso de álcool, tabaco e cocaína
pelos participantes, mas não de maconha e morfina (Thomas et al., 2013). Também
foi observada melhora nas escalas de humor e qualidade de vida e foi sugerido que
a terapêutica empregada produziu mudanças psicológicas e comportamentais
positivas nos participantes. Mercante (2013) realizou o estudo em três comunidades
no Brasil que utilizam a ayahuasca para tratar a dependência e através das
observações e entrevistas relata que o tratamento com ayahuasca se difere de uma
terapia de substituição, como por exemplo, a terapia com metadona para
dependentes de heroína, pois no tratamento com ayahuasca também são
trabalhadas questões sociais. Portanto, este tratamento proporciona uma

22
transformação social e pessoal, o que diminui as chances de recaída. Em uma
pesquisa recente, Jiménez-Garrido et al. (2020) realizaram um estudo longitudinal
com dois subgrupos de usuários de ayahuasca: novos usuários (näive) e usuários
de longo prazo. O estudo mostrou que os usuários novos apresentaram melhora
clínica em quadros psiquiátricos após 6 meses, avaliada por questionários, enquanto
os usuários de longo prazo apresentaram menores índices de depressão e maior
escore para qualidade de vida, comparado ao grupo näive. O potencial terapêutico
da ayahuasca no tratamento da dependência de drogas também foi avaliado em um
estudo qualitativo realizado com profissionais de saúde e curandeiros indígenas e
apontou evidências da efetividade da ayahuasca (Loizaga-Velder & Verres, 2014).
Além destas pesquisas, outras pesquisas pré-clínicas vem surgido nos
últimos anos para somar a esses dados clínicos. Oliveira-Lima et al. (2015),
realizaram um estudo com camundongos por meio do desenvolvimento de
sensibilização comportamental induzida por etanol, avaliando a atividade locomotora
dos animais. O trabalho mostrou que a ayahuasca foi capaz de bloquear a
sensibilização ao etanol em camundongos. Outro estudo deste laboratório avaliou o
efeito da ayahuasca, assim como os efeitos isolados das espécies que constituem a
bebida, P. viridis e B. caapi, em camundongos, sobre o teste de preferência
condicionada ao lugar induzido por etanol (Cata-Preta et al., 2018). Ayahuasca ou o
extrato de cada espécie foram administrados antes do etanol durante as sessões de
condicionamento, sendo observado que a ayahuasca foi capaz de bloquear o
desenvolvimento da preferência condicionada, enquanto que separadamente os
extratos não exerceram efeitos significativos. Além disso, os efeitos de um
tratamento pós-condicionamento foram avaliados no ambiente pareado com etanol e
todos os extratos bloquearam a preferência condicionada ao lugal induzida por
etanol. Outros estudos pré-clínicos também apresentam resultados que nos ajudam
a elucidar seus mecanismos e o potencial terapêutico na dependência de drogas da
ayahuasca (dos Santos & Hallak, 2020; Nunes et al., 2016).
Os dados apresentados sugerem que a ayahuasca pode ser um forte aliado
no tratamento da dependência química, entretanto é necessário reforçar que ainda
há a necessidade de estudos clínicos controlados que comprovem a eficácia e
segurança desta bebida para o tratamento da dependência química, além da
reprodução de estudos pré-clínicos. A reprodutibilidade dos estudos é um fator

23
imprescindível para aumentar a robustez dos dados experimentais, principalmente
no caso da ayahuasca, em que existe uma grande variabilidade da quantidade dos
princípios ativos nos diversos chás utilizados, tanto nos grupos de pesquisas, quanto
pelas doutrinas sincréticas. Desta forma, também é fundamental avaliar qual a
importância da religião e contexto de uso no tratamento dos indivíduos dependentes.
Possíveis mecanismos de ação da ayahuasca na dependência de drogas,
considerando tanto seus efeitos bioquímicos como os efeitos psicológicos, são
discutidos por Liester & Prickett, (2012). Resumidamente, são apresentadas quatro
hipóteses, que se complementam, para explicar os possíveis mecanismos
bioquímicos, fisiológicos, psicológicos e transcendentais. A hipótese bioquímica
sugere que a ayahuasca tem propriedades antidependência por meio da redução de
dopamina na via mesolímbica, como resultado dos efeitos em receptores
serotoninérgicos, pois sendo o DMT um potente agonista de receptores 5-HT2A, sua
ação resulta em uma diminuição na liberação de dopamina nas vias mesolímbica,
mesocortical e nigroestriatal. Além disso, usuários de ayahuasca apresentam níveis
elevados de prolactina, sendo esse um possível indicativo da redução de dopamina,
que modula negativamente a liberação desse hormônio. A hipótese fisiológica
sugere que a redução dos níveis de dopamina na via mesolímbica interfere na
plasticidade sináptica associada com o desenvolvimento e manutenção da
dependência. A hipótese psicológica sugere que a ayahuasca trata a dependência
por meio da resolução de traumas, encorajando a compreensão do potencial de
escolha e aperfeiçoando tomadas de decisão. Por último, a hipótese transcendental
sugere que a ayahuasca trata a dependência por meio da experiência
transcendental facilitada; sendo que esses aspectos da experiência podem incluir
visões de uma realidade espiritual, alteração de noção do tempo e espaço,
inefabilidade, insights intuitivos e sentimentos de unidade com o universo (Liester &
Prickett, 2012).
Por fim, ainda são carentes estudos controlados, em especial estudos com
animais de laboratório, além da reprodutibilidade destes estudos, que permitam
induzir um quadro experimental de dependência e avaliar a participação de
proteínas-chave nas vias moduladoras da dependência química.

24
 1.10 Modelos em animais

No estudo das drogas de abuso, um grande desafio dos pesquisadores é

utilizar modelos pré-clínicos que mimetizem em animais as ações e efeitos das
drogas em humanos. Inúmeros modelos comportamentais foram desenvolvidos, e
apesar de suas restrições inevitáveis, tais modelos têm se mostrado eficazes em
modelar aspectos específicos dos comportamentos relacionados ao consumo de
drogas (Koob, 2006). Os paradigmas experimentais mais utilizados baseiam-se em
modelos de autoadministração e modelos de condicionamento.
Os modelos de autoadministração são uma forma direta e eficaz para avaliar
as propriedades de reforço de uma substância. Em geral, quando uma substância
possui propriedade reforçadora, o animal tende a aumentar a frequência do
comportamento no qual ele recebe a droga como consequência, seja, por exemplo,
apertar uma barra, realizar alguma tarefa ou ingeri-la diretamente. Entretanto,
existem algumas limitações para esse modelo, pois eles são relativamente difíceis e
demorados se comparados a outros protocolos.
O etanol apresenta gosto amargo, levemente aversivo para os animais, e
potencial reforçador lento, e por este motivo geralmente se utilizam linhagens que
possuem uma preferência natural pelo etanol. Por outro lado, os protocolos de
preferência condicionada ao lugar mostram-se muito eficazes (Bardo & Bevins,
2000), possuem custo reduzido, facilidade de utilização e são bem caracterizados e
consolidados. Outra abordagem constitui-se na administração forçada de etanol por
um período de tempo que simula a ingestão crônica de etanol no dependente. A
vantagem deste modelo é que ele permite controlar a quantidade de etanol
administrada e observar os efeitos decorrentes da administração a longo prazo, tais
como a sensibilização comportamental e a resposta do animal após a interrupção do
tratamento e reexposição ao etanol. Os modelos utilizados neste projeto serão
descritos em detalhe na sessão de materiais e métodos.
A sensibilização comportamental, ou seja, quando o consumo repetido e
intermitente produz uma resposta comportamental progressivamente maior e
duradora. Apesar de apresentar limitações nas pesquisas em humanos, os
resultados desses estudos sugerem que, semelhante aos estudos em animais,
respostas comportamentais aumentadas ocorrem após a administração repetida de

25
substâncias, em especial os estimulantes, que se assemelham a sensibilização.
Contudo, mais pesquisas são necessárias para examinar as características da
sensibilização em humanos, incluindo os sistemas neurobiológicos envolvidos
(Steketee & Kalivas, 2011).
Por fim, a necessidade de tratamentos complementares que possam auxiliar
os processos terapêuticos na dependência, em especial a dependência ao etanol,
mostra-se essencial. Entender os mecanismos de funcionamento desses agentes
farmacológicos e da própria dependência apresenta-se como um caminho sólido e
necessário a ser trilhado nas pesquisas desta área do conhecimento.

26
 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Avaliar o potencial efeito bloqueador do chá de ayahuasca sobre o

desenvolvimento da dependência experimental ao etanol e a imunoreatividade à
proteína c-Fos no núcleo accumbens dos animais submetidos aos testes
comportamentais

2.2 Objetivos Específicos

1. Obter o chá de ayahuasca, liofilizar e quantificar os seus principais

alcaloides.

2. Confirmar se a amostra do chá de ayahuasca e seu liofilizado

apresentam atividade inibidora sobre a monoaminoxidase A, conforme
descrito na literatura, bem como comparar a concentração inibitória
efetiva (CI50) do chá e do liofilizado.

3. Avaliar o perfil farmacológico e efeitos gerais da ayahuasca após

administração por via oral de doses crescentes em camundongos, com
o intuito de determinar as doses adequadas para o estudo e descartar
aquelas que produzam sedação, agitação excessiva ou toxicidade nos
animais.

4. Avaliar o efeito do pré-tratamento com a ayahuasca sobre a

preferência condicionada a lugar induzida pelo etanol.

5. Avaliar o efeito do pré-tratamento com a ayahuasca sobre a

sensibilização comportamental produzida pelo etanol.

6. Avaliar a imunorreatividade da proteína c-Fos na resposta a

sensibilização comportamental por meio de imuno-histoquímica na
região do Núcleo Accumbens core e shell.
27
 3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material botânico

O chá de ayahuasca utilizado neste estudo foi cedido pela Comissão

Científica da União do Vegetal, sendo sua preparação realizada em uma unidade
localizada no município de Mogi das Cruzes utilizando material botânico cultivado no
local (figura 4). Amostras floridas das plantas utilizadas na preparação da bebida
foram coletadas e identificadas como Banisteriopsis caapi e Psychotria viridis. As
exsicatas do material testemunha foram depositadas no herbário da UFABC sob
números F.R.Mendes 18 e F.R.Mendes 19, respectivamente.
Este estudo seguiu as orientações da legislação brasileira no que se refere ao
estudo de componentes do patrimônio genético nacional e está cadastrado no
Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional
Associado (SISGEN) sob o número AF827A4.

(a) (b) (c)

Figura 4 Material botânico e preparo do chá de ayahuasca na sede da UDV em Mogi das
Cruzes - SP. (a) Banisteriopsis caapi; (b) Psychotria viridis; (c) Decocção da Ayahuasca.

A amostra de chá de ayahuasca obtida em Mogi das Cruzes foi armazenada

em recipiente de vidro e mantida sob refrigeração até o processo de liofilização e
dosagens de seus alcaloides.

28
 3.2 Liofilização do Chá de Ayahuasca

Neste estudo foram utilizados o chá na sua forma original e também a

amostra liofilizada. A liofilização é um processo importante para pesquisas
acadêmicas e consiste na desidratação por sublimação. Neste processo a água
contida nos produtos que estão sendo liofilizados passa diretamente do estado
sólido para o gasoso - sem passar pelo estado líquido. Existe diversas vantagens no
processo de liofilização, entre elas: manutenção de todas as características e
propriedades, estruturas físicas e nutricionais do produto; facilidade de
armazenamento; facilidade na quantificação e mensuração das doses apropriadas
para o estudo, podendo utilizar amostras mais concentradas, se comparadas a
amostra original pré liofilizada.
Uma porção do chá foi concentrada em rota-evaporador até que o volume
fosse reduzido, num primeiro momento, em aproximadamente 1/10 do inicial. Em
seguida, o material foi distribuído em placas de petri e tubos falcons, congelado e
então colocado em um liofilizador (Liotop k105). Paralelamente, foi retirada uma
alíquota de 5ml da amostra inicial para ser liofilizada de forma separada em placa de
petri previamente pesada. Com este procedimento foi possível determinar a
concentração original do chá. O resíduo seco (1,78 g) foi utilizado para o cálculo da
concentração original do chá, determinada em 356 g/L.
O cálculo da concentração original do chá é importante, pois serviu de base
nas escolhas das doses a serem utilizadas. A partir da concentração original (356
g/L, ou 356 mg/mL) e da quantidade em que normalmente é ingerido nas cerimônias
da UDV (128 mL em média para um adulto com 70 kg), foi calculado a dose
equivalente do chá em 65,1 mg/mL. O volume de 128 mL foi determinado a partir de
uma marcação em um copo descartável, feita por um mestre ayahuasqueiro, da
quantidade média do presente lote de ayahuasca consumida durante os rituais.
Por fim, o liofilizado total obtido foi armazenado em dessecador e
ressuspendido para os ensaios nas concentrações necessárias no momento dos
testes.

29
 3.3 Quantificação dos alcaloides presentes no chá de ayahuasca

O DMT e as ꞵ-carbolinas harmina, harmalina e tetrahidroharmina foram

quantificados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência ligada a
espectrofotômetro de massa (LC-MS/MS). A análise foi realizada por colaboradores
no Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da USP, conforme metodologia descrita a seguir (Pires et al, 2009;
Pires et al, 2018):
A quantificação de alcaloides foi realizada na amostra original do chá não
liofilizado e também para o liofilizado, após este ser ressuspendido em água
destilada na concentração original. Para quantificação as amostras foram
inicialmente diluídas até uma proporção final de 1:5000 por meio de diluição seriada
em três etapas (1:10 x 1:10 x 1:50). Primeiro, diluiu-se 100 µL das alíquotas em 900
µL de fase móvel A (tampão formiato de amônio com 0,1% ácido fórmico). Desta,
foram retirados mais 100 µL e diluídos com 900 µL de fase móvel A e, por fim, 100
µL da última foram diluídos em 4900 µL da solução de fase móvel A. A cada etapa
de diluição a solução foi submetida à agitação em vórtex para melhor
homogeneização. Em 90 µL da solução final adicionaram-se 10 µL do padrão interno
(DMT-d6 1 µg/mL) para concentração final de 100 ng/mL. Por fim, 5 µL desta solução
foram injetados no sistema de cromatografia em fase líquida de ultra eficiência,
modelo Acquity System, acoplado à espectrofotômetro de massas triplo quadrupolo
no modo tandem, modelo Quattro Premier, com ionização por eletrospray (UPLC-
ESI-MS/MS). Após quantificação, o valor obtido com a equação da reta foi
multiplicado por 5000 para correção da diluição.

3.4 Condições cromatográficas do sistema UPLC-ESI-MS/MS

As análises foram realizadas em modo positivo (ESI+, [M+H]+) para todos os

analitos. Foram utilizados os seguintes parâmetros otimizados: fluxo do gás do cone,
2 L/min; fluxo do gás de dessolvatação, 10 L/min; temperatura da fonte, 100 ºC;
temperatura de dessolvatação, 350 ºC. O seguinte sistema cromatográfico foi
utilizado: Coluna Acquity UPLC BEH C18 2,1 mm x 100 mm, ID 1,7 µm (Waters
Corporation, Milford, MA) eluída com um gradiente de tampão formiato de amônio 2

30
mM com 0,1% de ácido fórmico (Solução A) e metanol 0,1% ácido fórmico (Solução
B), a um fluxo de 300 µL/min, 40 ºC, nas seguintes condições: 0-7 min, 90-50% A; 7-
8 min, 50-90% B. O tempo total de corrida foi de 8 minutos. As fragmentações
utilizadas no MRM e os tempos de retenção de cada analito são descritos na tabela
1.
Tabela 1 Descrição dos íons precursores, íons produto, tempo de retenção, voltagem do cone e energia de colisão
no método por UPLC-ESI-MS/MS.

Analito Tempo de Íon precusor (m/z) Íon produto (m/z) Voltagem Energia
retenção (min.) do cone de colisão

DMT-d6 2,87 195,1 63,9 15 14

(PI)

195,1 114,9 15 36

195,1 143,8* 15 22

DMT# 2,88 188,9 57,8 25 11

188,9 116,7 25 29

188,9 143,8* 25 17

THH* 4,37 217,1 172,8 25 29

217,1 187,9 25 17

217,1 200,0* 25 13

HRL** 5,27 215,2 130,4 50 41

215,2 171,7 50 33

215,2 199,9* 50 25

HRM*** 5,56 213,2 143,8 50 41

213,2 169,8 50 33

213,2 198,0* 50 25

– dimetiltriptamina; * THH - tetrahidroharmina; ** HRL - harmalina; *** HRM - harmina.

#DMT

* Transição utilizada para quantificação dos analitos. PI - Padrão interno. m/z - Razão
massa/carga.

31
 3.5 Quantificação de Etanol por GC-FID

A presença e concentração de etanol na amostra de ayahuasca foi avaliada

por meio da técnica de headspace com detecção por cromatografia gasosa com
detector de ionização por chama (GC-FID). Para verificar o efeito do armazenamento
do chá em geladeira, a dosagem foi realizada com uma alíquota da amostra assim
que recebida, outra após três meses de armazenamento em geladeira. e outra com
a amostra liofilizada.
Para dosagem, uma alíquota de 0,5 mL de amostra e 0,5 mL de água
destilada foi adicionada a um frasco de headspace de 10 mL e 1 mL de uma solução
padrão de n-propanol 0,6 g/L foi adicionada. O frasco foi então lacrado com lacre de
prata e septo de borracha e incubado em estufa a 70ºC por 30 minutos, quando foi
retirado 0,5 mL do vapor com auxílio de seringa gastight para injeção em GC-FID.
O método cromatográfico utilizou os seguintes parâmetros: temperatura do
injetor de 250°C, temperatura do detector de 280°C e forno a 150°C por 15 minutos.
Utilizou-se o modo de injeção de Split com fluxo de gás de 1,8 mL/min. O tempo de
retenção para o etanol foi de 1,4 minutos e do n-propanol 3,8 minutos.

3.6 Animais

Para a realização deste estudo foram utilizados 135 camundongos Swiss,

albinos machos, adultos jovens (2-5 meses). Destes, 35 animais foram provenientes
do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME) da UNIFESP
e foram utilizados na realização do screening toxicológico e avaliação no Rota-Rod.
Os demais, provenientes do biotério de criação da UFABC, foram utilizados nos
demais estudos comportamentais. Os animais foram habituados ao local do estudo
por ao menos 15 dias antes do início dos testes para evitar interferências referentes
ao transporte e condições de alojamento. Durante este período, e no decorrer dos
experimentos, os animais foram alojados em caixas micro-isoladoras com água e
ração ad libitum Nuvilab ® em salas com ciclo claro-escuro controlado (12h) e
controle de temperatura em estantes ventiladas.
Também foram utilizados encéfalos de ratos Wistar, com os quais foram
preparados homogenatos para avaliação da inibição da ayahuasca sobre a atividade

32
da enzima monoaminooxidase in vitro. Este estudo foi aprovado pela Comissão de
Ética em Uso Animal da Universidade Federal do ABC (CEUA - UFABC) sob número
do processo 2502090217 (Anexo 9.1).

3.7 Drogas

Foram empregados sais e reagentes analíticos da Sigma ou de outras marcas

equivalentes. Anticorpos e reagentes específicos utilizados na imunohistoquímica
estão descritos na seção apropriada.
Para a administração dos animais, álcool etílico absoluto (Synth) foi diluído
em salina 0,9% na concentração 20% e administrado por via i.p. em volume de
0,13 mL/10g de peso do animal para atingir a dose de 2 mg/kg. O chá de ayahuasca
foi empregado na sua forma original, enquanto a amostra liofilizada (seca) foi
solubilizada em água potável e reconstituída na concentração a ser avaliada.
Ayahuasca ou água foram administrados aos animais por via oral (v.o.), por
gavagem em volume de 0,1 mL /10g de peso.

3.8 Avaliação da inibição da enzima monoaminooxidase in vitro

A atividade inibidora in vitro da MAO-A foi avaliada segundo o método

descrito por Amaral (2013). Para a realização do ensaio, cérebros de ratos foram
extraídos e transferidos para um meio gelado com tampão Na 2HPO4/KH2PO4
(0,15M), pH 7,4, isotônico com 0,13M de sacarose. Os cérebros foram inicialmente
dissecados para remoção dos vasos sanguíneos e da membrana da pia matter e em
seguida homogeneizados no tampão anteriormente descrito, isotônico com KCl, em
homogenizador ultra-turrax. Os homogenatos foram inicialmente centrifugados à
1900g para remoção do material mais denso, lavado uma vez e, em seguida, o
sobrenadante foi centrifugado a 11.800g. O pellet mitocondrial bruto obtido foi lavado
novamente com o tampão e por fim ressuspendido em um volume definido de
tampão, em função do volume de pellet final. A concentração de proteína foi
determinada segundo o método de Bradford (Bradford, 1976), utilizando albumina de
soro bovino como padrão e o material foi armazenado a -80°C até o uso.

33
 O ensaio foi realizado em microtubos, utilizando 200 µL da fração proteica (na
concentração de 1,0 mg/mL) contendo a enzima MAO e tampão de ensaio. Foram
acrescentados 50 µL de selegilina para uma concentração final de 250 nM
(concentração que inibe especificamente a MAO-B) e os tubos foram pré-incubados
a 37 oC por 5 minutos. Em seguida, o chá de ayahuasca e o seu liofilizado diluído
foram pipetados em diferentes concentrações, incubados por 5 minutos e, por
último, acrescentados 20 µL do substrato quinuramina (90 µM) seguido de incubação
por 30 minutos a 37oC, encerrando-se a reação com a adição de 300 µL de TCA. Os
tubos foram centrifugados por 5 minutos a 16.000g em 4 oC e 800 µL do
sobrenadante foram transferidos para outro tubo de ensaio contendo 1 mL de NaOH
1M.
A atividade enzimática foi medida pela formação de 4-hidroxiquinolina (4-OH)
em espectrofluorímetro com faixa de excitação de 320 nm e emissão em 560 nm. A
porcentagem de inibição de cada concentração de ayahuasca foi obtida utilizando
um ensaio da amostra da ayahuasca liofilizada e um ensaio da amostra original. Até
a conclusão desta tese, somente foi possível realizar um ensaio. O cálculo de CI50
será realizado futuramente, quando outros ensaios forem realizados. Clorgilina
(inibidor da MAO-A) foi empregada como controle positivo do teste.

3.9 Screening farmacológico inicial

O screening farmacológico inicial é importante para estabelecer as doses

adequadas para o estudo e para traçar um perfil geral dos efeitos produzidos pela
droga a ser estudada, neste caso o chá de ayahuasca. Trata-se de um modelo
bastante simples, com caráter qualitativo, mas essencial quando não se conhece a
potência, toxicologia e efeitos produzidos pela droga em questão.
Grupos de 5 camundongos receberam, por via oral, água (controle) e o
liofilizado de ayahuasca nas doses de 650, 3560 e 5000 mg/kg, bem como o chá de
ayahuasca (650 mg/kg) na sua forma original não liofilizada. Essas doses foram
escolhidas com base na dose média aproximada (650 mg/kg) que os membros da
UDV (onde adquirimos o chá) ingerem em um ritual, conforme explicado
anteriormente. Já a dose de 3560mg/kg refere-se dose obtida ao administrar para
camundongos o chá sem diluição, ou seja, na concentração de 356mg/mL. Após a

34
administração, os animais foram imediatamente colocados em gaiolas de arame e
observados e monitorados nos seguintes intervalos de tempo: 0-15 minutos, 15-30
minutos, 30-60 minutos, 1-2 horas, 2-4 horas e 24 horas, registrando-se as
alterações comportamentais que foram identificadas, de acordo com protocolo já
bem estabelecido para esta finalidade (Carlini, 2011). Os sinais avaliados foram
micção, defecação, “writhing” (contração do abdômen com distensão das patas
dianteiras), pelos arrepiados, ptose palpebral, atividade motora (aumento, igualdade
ou diminuição e permanência no canto da gaiola), tônus muscular, tremores ou
convulsões, ataxia, sensibilidade dolorosa, sinais de estereotipia, sono, “grooming”
(auto limpeza), lacrimejamento, exoftalmia e salivação. Na figura 5 é possível
observar um exemplo de gaiolas para screening farmacológico inicial.

Figura 5 Exemplo de gaiola utilizada para screening farmacológico. (Imagem retirada de

Carlini (2011)

3.10 Avaliação da coordenação motora por Rota-Rod

O teste do Rota-Rod (Panlab® modelo LE8500) foi empregado para a

avaliação da coordenação motora dos animais sob efeito da ayahuasca. O objetivo
principal deste teste foi certificar que as doses a serem testadas de ayahuasca não

35
interferem na coordenação e na atividade locomotora dos animais, o que
comprometeria a avaliação nos demais testes comportamentais.
Foram utilizadas três doses crescentes do liofilizado re-solubilizado (650,
3560 e 5000 mg/kg), uma dose do chá não liofilizado (650 mg/kg), e água por via
oral. Grupos de 7 camundongos (sendo 5 animais usados simultaneamente no
screening farmacológico) foram avaliados quanto à capacidade de se manterem
sobre barras girando a uma velocidade de 12 rpm nos tempos 0 min (desempenho
basal) e após 45, 90 e 180 minutos do tratamento. Foi avaliada a latência da queda
do animal e a média de tempo de permanência após 3 reposições, com período de
corte de 60 segundos (Carlini, 2011).
Na figura 6 é possível observar uma ilustração do RotaRod Panlab® modelo
LE8500 utilizado.

Figura 6 Ilustração de camundongos no Rota Rod Panlab® modelo LE8500

3.11 Preferência condicionada ao lugar

Este modelo é apropriado para avaliar drogas que induzem dependência

química (que possuem um efeito reforçador), sendo também útil para avaliar a
capacidade de uma determinada droga interferir no efeito condicionante da outra. O
paradigma experimental de preferência condicionada ao lugar (PCL) é amplamente
utilizado e recomendado nos estudos de drogas de abuso e modelos de
dependência (Bardo & Bevins, 2000; Lucke-Wold, 2011; Risinger et al., 2002).

36
 O teste consistiu em avaliar o efeito da ayahuasca sobre a preferência de
local induzida por etanol em camundongos expostos a uma caixa de madeira com
três ambientes distintos (como pode ser observado na figura 7 e esquematizado na
figura 8), separados por portas-guilhotina cuja abertura foi controlada pelo
pesquisador. Cada um destes compartimentos possui características que o
discriminam dos demais, por exemplo, quanto à cor das paredes, tipo de piso,
tamanho e textura. Inicialmente, os animais passaram por um período de 15 minutos
de ambientação (Habituação) em que foram colocados no compartimento central
(compartimento neutro) com todas as portas-guilhotina abertas, de forma que os
camundongos tivessem livre acesso para explorar os três ambientes. Este
procedimento foi realizado nos três primeiros dias, sendo que no terceiro dia os
animais foram filmados por 15 minutos, para contabilizar o tempo gasto em cada
compartimento (Pré-Teste), como pode ser observado na figura 8. A partir destes
dados, a preferência natural dos animais entre os compartimentos foi definida. Existe
uma diferença de tempo de permanência natural entre os animais. Desta forma, para
diminuir vieses experimentais, os animais foram distribuídos de forma que metade
dos animais foram pareados com etanol no compartimento com menor tempo de
permanência e a outra metade no compartimento com maior tempo de permanência
no teste basal
A fase de condicionamento (Condicionamento) foi realizada nos 8 dias
subsequentes, sendo 4 sessões de pareamento com etanol (2,0 g/kg i.p. na
concentração de 20%) e 4 com salina (0,9% i.p.), em dias alternados e com a
primeira sessão de pareamento definida de forma aleatória. Os animais receberam
as injeções em suas gaiolas moradias, 5 minutos antes de cada pareamento. Após
as injeções, foram confinados em um dos dois compartimentos por 5 minutos antes
de retornarem para a caixa-moradia. Para evitar qualquer viés experimental, em
cada grupo, metade dos animais injetados com etanol foram confinados no
compartimento de preferência natural e a outra metade confinados no
compartimento no qual não apresentaram preferência natural (Yim Junior et al.,
2006; Lee et al., 2016). O tempo em que os animais permaneceram no
compartimento no qual receberam o etanol (Ambiente Pareado) e no compartimento
que receberam salina (Não-Pareado) foi chamado de “Tempo de permanência”,
representado em segundos (s).

37
 No dia do teste de preferência (Pós-Teste), 24 horas após a última sessão de
pareamento, cada animal foi colocado no compartimento central neutro, sem ter
recebido nenhuma droga e com todas as portas abertas, e então tiveram livre
acesso aos três ambientes. Os animais foram filmados e o tempo gasto em cada
compartimento foi medido, durante 15 minutos, conforme descrito anteriormente.

Figura 7 Fotografia das arenas de PCL utilizadas na pesquisa (Nesta imagem é possível
observar três arenas utilizadas simultaneamente e dispostas encostadas lateralmente).

Figura 8 Ilustração esquemática da caixa utilizada para a preferência condicionada ao

lugar. É possível observar na imagem a distinção expressiva dos ambientes opostos. Ambos os
3.11.1
lados Pré-tratamento
são conectados com ayahuasca
por um espaço neutro (retirado de www.conductscience.com).

Para a avaliação do efeito da ayahuasca sobre o condicionamento de lugar,

os animais foram separados em 5 grupos experimentais (n = 9-10/grupo):
Controle ÁguaxEtanol (CTR);
AyahuascaCha650xEtanol (AC 650mg/kg);
AyahuascaLio130xEtanol (AL 130mg/kg);
AyahuascaLio650xEtanol (AL 6500mg/kg);
AyahuascaLio1950xEtanol (AL 1950mg/kg);

38
 O chá de ayahuasca e três concentrações do liofilizado foram administradas
por via oral 30 minutos antes do etanol em cada sessão de condicionamento com
esta droga. O grupo controle recebeu água por via oral como pré-tratamento 30
minutos antes do etanol. No dia do teste de preferência, os animais não receberam
nenhuma droga e foram colocados no compartimento central (neutro) do aparelho
com as portas abertas, e o tempo gasto em cada compartimento foi registrado.
Após 24 horas da realização do teste os animais foram submetidos a
eutanásia e perfusão para a retirada de tecidos, conforme será descrito mais a frente
(ver seção 4.15). Este protocolo permitiu avaliar a capacidade do pré-tratamento
com a ayahuasca bloquear o efeito reforçador (dependência) do etanol. Nas figuras
9 e 10, pode-se observar o esquema ilustrativo do protocolo de preferência
condicionada ao lugar e a sequência intercalar de administração diária.

Figura Esquema do protocolo utilizado na preferência condicionada ao lugar.

Figura 9 Esquema ilustrativo do protocolo de preferência condicionada ao

lugar.

Figura 10 Esquematização das administrações intercalares entre Salina e Etanol

39
 3.12 Sensibilização comportamental

Este teste se baseia no fato de que algumas drogas de abuso produzem

sensibilização em alguns efeitos comportamentais, como é o caso do etanol que,
com a administração repetida, induz um aumento da atividade locomotora de
camundongos. O protocolo adotado baseou-se em um estudo do efeito da
ayahuasca sobre a sensibilização induzida por etanol (Oliveira-Lima et al., 2015) e
foi sujeito a pequenas alterações, conforme descrito a seguir.
Todos os camundongos foram inicialmente colocados em um campo aberto
(figura 11) para livre exploração (habituação) durante 30 minutos e tiveram a
atividade locomotora registrada em vídeo e analisada no software ToxTrac
(https://toxtrac.sourceforge.io). Os parâmetros avaliados na atividade locomotora
serão melhor explicados em seguida. Posteriormente, os animais foram divididos em
grupos balanceados, de forma que a atividade basal dos diferentes grupos fosse
similar. Para o desenvolvimento da sensibilização, os animais receberam doses
diárias de etanol (2,0 g/kg), na concentração de 20%, intraperitoneamente, pelo
período de 14 dias (fase de sensibilização). Os animais foram divididos em 6 grupos
experimentais (n = 7-8).
Grupo 1: controle negativo - ÁguaxSalina;
Grupo 2: controle - ÁguaxEtanol;
Grupo 3: Ayahuasca650mgxSalina;
Grupo 4: Ayahuasca650mgxEtanol;
Grupo 5: Ayahuasca1950mgxSalina;
Grupo 6: Ayahuasca1950mgxEtanol.

Os grupos receberam água ou ayahuasca por via oral 30 minutos antes das
administrações diárias de etanol ou salina 0,9%.
O desenvolvimento da sensibilização foi registrado nos dias 01, 05, 09 e 14
por meio da avaliação da atividade locomotora dos animais em um campo aberto
(Quantificação do Campo Aberto, QCA). Nos dias de observação da atividade
locomotora, os animais foram retirados da caixa moradia 20 min após a
administração de ayahuasca ou água e habituados ao aparato por 10 minutos. Em
seguida, esses animais receberam etanol ou salina 0,9%. Uma vez recebida a

40
substância, os animais foram colocados novamente no aparato pelo período de 30
minutos, e tiveram a atividade locomotora gravada em vídeo e analisada durante os
11 minutos iniciais, sendo o primeiro minuto descartado das análises (totalizando 10
minutos de análise dos 30 minutos totais), conforme previamente descrito. Após o
período de teste, os animais eram retornados para às caixas moradias. Nos demais
dias, ou seja, nos dias em que os camundongos não eram expostos ao campo
aberto, os animais recebiam os tratamentos em suas gaiolas moradias. Por se tratar
de um teste crônico, também houve a monitoração diária do peso dos animais
durante os períodos de adaptação e experimental.
Noventa minutos após o término do período de exposição no campo aberto,
no décimo quarto dia de tratamento e gravação, os animais foram anestesiados e
perfundidos. Os cérebros foram retirados, fixados e, posteriormente, congelados,
seguindo protocolo descrito mais à frente na sessão 4.13.
Para facilitar o entendimento do protocolo, nas figuras 12 e 13 é possível
observar um esquema com a distribuição dos dias de sensibilização.
Os parâmetros de atividade locomotora avaliados, com o auxílio do software
ToxTrac (https://toxtrac.sourceforge.io), foram: distância percorrida, taxa de
exploração, e tempo de permanência na zona periférica e central dos animais na
arena de campo aberto no período de exposição. A distância percorrida foi
mensurada em milímetros totais que os animais ambulavam na arena, como
observados na figura 14a. A taxa de exploração da arena representa em
porcentagem a divisão do número zonas pelas quais o animal passou em relação ao
número total de zonas geradas pelo software ToxTrac, conforme exemplificado na
figura 14b. O tempo de permanência representa em segundos o tempo total em que
os animais permaneceram em duas zonas das arenas de campo aberto: uma zona
central e outra periférica (externa), como pode ser observado na figura 14c.

41
 Figura 11 Fotografia de quatro arenas de campo aberto utilizadas simultaneamente no
experimento.

Figura 12 Esquema ilustrativo do protocolo de sensibilização comportamental. QCA –

Quantificação do Campo aberto, ou seja, dias em que os animais foram expostos ao campo
aberto e a distância percorrida foi analisada.

Figura 13 Esquema ilustrativo das administrações nos dias de quantificação em campo aberto
(QCA). Nos demais dias, os animais foram submetidos ao mesmo esquema de administração, mas,
não foram expostos a arena de campo aberto.

42
 a) b) c)

Figura 14 Exemplo gráfico dos parâmetros utilizados na análise da sensibilização

comportamental na arena de campo aberto. Os animais foram analisados em todos os dias em que
ocorreu a gravação, basal, dia01, dia05, dia09 e dia 14. a) Exemplo de Caminho da distância
percorrida por um animal. b) Exemplo de zonas criadas pelo software ToxTrac, e das zonas no qual o
animal explorou. As cores representam um mapa de temperatura, quanto mais escura, maior a
exploração do animal nesta zona. c) Exemplo da marcação da zona central e periférica (externa. As
zonas foram adicionadas manualmente no software ToxTrac, utilizado para as análises de vídeo.

Figura Esquema ilustrativo do protocolo de sensibilização. *QCA - Quantificação do

Campo Aberto

43
 3.13 Eutanásia, perfusão e seccionamento dos encéfalos

Ao término dos experimentos comportamentais, os camundongos foram

submetidos à perfusão para a retirada de encéfalos. No protocolo de preferência
condicionada ao lugar (PCL), 24 horas após o término do teste, os animais foram
submetidos à anestesia profunda com Uretana 30% (1ml/kg) administrada
intraperitoneamente. Em seguida, os animais foram perfundidos com salina
fosfatada tamponada (PBS) 0,01M ou salina 0,9% (NaCl). Este procedimento foi
realizado de forma manual, utilizando uma seringa de 10mL e por perfusão cardíaca.
Em seguida, os encéfalos foram retirados e pós-fixados em paraformaldeído (PFA)
4% por 24 horas. Então, os encéfalos foram transferidos para sacarose 30% trocada
após 24h, onde permaneceram por 48 horas, sendo após este prazo armazenados
em freezer à - 80 ºC. Este material será analisado futuramente e permanece
armazenado em freezer -80ºC.
No protocolo de sensibilização, 90 minutos após o último dia de teste e
gravação, os animais foram submetidos ao processo de anestesia profunda, de
forma equivalente ao utilizado no PCL. Foi realizada punção cardíaca para retirada
de aproximadamente 1mL de sangue do animal para análises posteriores. Em
seguida, os animais foram perfundidos com salina fosfatada tamponada (PBS)
0,01M ou salina 0,9%, seguido de PFA 4% para fixação dos tecidos. Este
procedimento também foi realizado de forma equivalente e manual, como citado
anteriormente. Após a perfusão, os encéfalos fixados foram retirados e
armazenados em sacarose 30%, onde permaneceram por 48 horas, sendo trocada a
sacarose 30% após as primeiras 24 horas. Por fim, os encéfalos foram congelados
em isopentano e gelo seco à -40º, seguindo protocolo utilizado no laboratório, e
armazenados em freezer com temperatura de -80ºC.
Antes de iniciar o processo de corte os encéfalos foram mantidos em freezer
à -20ºC overnight e então seccionados em fatias coronais de 30 μm no criostato
(Leica, modelo CM1850, figura 15a, b) a uma temperatura de -20°C. As fatias foram
seccionadas em cortes seriados e distribuídas em microtubos contendo solução anti-
freezing para, ao término dos cortes, serem obtidas 4 representações do encéfalo
inteiro ou das regiões de interesse de cada animal. Os microtubos contendo os

44
encéfalos seccionados foram mantidos em freezer à -20ºC até o momento de
realização dos procedimentos de imuno-histoquímica.
a. b.

Figura 15 a. Modelo do criostato utilizado para secção dos encéfalos. b. Encéfalo fixado no
criostato para secção coronal

3.14 Procedimentos de imuno-histoquímica (IHQ) free-floating para

proteína c-Fos

Nos animais do experimento de sensibilização, secções contendo a região do

Núcleo Accumbens foram separadas e submetidas ao protocolo de imuno-
histoquímica. Os cortes contendo a região do NAc foram escolhidos manualmente
com auxílio do Atlas Paxinos (Paxinos & Franklin, 2012). Neste protocolo, foram
utilizados os suportes (“redinhas”) em placa petri de seis poços.
No primeiro dia de IHQ, os cortes já separados foram lavados em solução
tampão fosfato (PB) 0,1M por 5 vezes de 5 minutos (5x5´) sob agitação para a
retirada da solução anticongelante. Em seguida, foi realizada a recuperação
antigênica com citrato de sódio por 20 minutos em banho-maria à 70ºC.
Posteriormente, as amostras ficaram 30 minutos descansando sob temperatura
ambiente e lavadas por 5x5´ com PB 0,1M. Após as lavagens, foi realizado o
bloqueio com Normal Goat Sérun (NGS) (3%) + Triton 0,25% por 60 minutos em
45
temperatura ambiente. Por fim, as amostras foram transferidas novamente para os
microtubos e a incubação do anticorpo primário foi realizada (c-Fos; rabbit; Cell
Signaling Technology, ref. 22509; diluição 1:1000) por 18 horas sob agitação em
temperatura de 4ºC.
No segundo dia de IHQ, o anticorpo primário foi retirado e as amostras foram
lavadas 5x5´ com PB 0,1M. Foi adicionado e incubado o anticorpo secundário (Anti
rabbit, Vector laboratories, Inc, 1:600) com NGS (3%) +0,25 Triton por 2 horas em
temperatura ambiente em microtubos. Posteriormente, as amostras foram lavadas
5x5’ nas redinhas com PB 0,1 M. Foi colocado o complexo Avidina-Biotina-
Peroxidase (Kit ABC Vectorstain®) em microtubos por 1h e, em seguida, as
amostras foram lavadas por 3x10’ com PB 0,1M.
Por fim, as amostras foram reveladas com Diaminobenzidina (DAB) e lavadas
5x5’ com PB 0,1 M. Após finalizadas as lavagens, as lâminas foram montadas e
postas a secar. Vinte e quatro horas depois, com as lâminas secas, foi realizada a
diafanização das lâminas por uma série de concentração crescente de água e
álcoois (Água-3min; Água-3min; etanol 30%-2min; 60%-2min; 90%-2min; 95%-2min;
100%-3min30sec; Xilol-20min). Finalmente, as lâminas foram cobertas com as
lâminulas, coladas com entellan ®️.

3.14.1 Captura e Análise de imagem

As imagens foram capturadas utilizando uma câmera de vídeo DFC295,

acoplada ao microscópio Leika DM5500 com as objetivas 1,25x/0,0375 e 10x/0,30.
Para quantificação das proteínas por imunoreatividade, imagens de diferentes
distâncias em relação ao bregma que continham o NAc foram fotografadas. Na
análise, foram diferenciados NAc Core e NAc Shell. O Atlas Paxinos foi utilizado
para auxílio na seleção e categorização das regiões e distância em relação ao
bregma. Na figura 16, estão esquematizadas as regiões dos cortes analisadas
neste estudo (foi utilizado as distâncias em relação ao bregma entre 1,74 – 0,62
mm), e nas figuras 17a, b, exemplos dos tecidos utilizados e das regiões marcadas.
A quantificação de proteína c-Fos das imagens foi feita de forma manual utilizando o
software ImageJ (https://imagej.nih.gov/). Foram considerados positivos apenas os

46
núcleos que se destacavam do ruído de fundo produzido pelo método da
imunoperoxidase conforme pode ser observado na figura 18c. É importante
enfatizar, que paralelamente a contagem manual, foi realizada a contagem dos
núcleos positivos de forma automática pelo mesmo software. Contudo, a
comparação da quantificação manual com a automática não foi equivalente, desta
forma, optou-se por utilizar a contagem manual por ser uma mensuração mais
congruente com a realidade. Foi realizada a contagem do máximo de cortes
disponível para cada animal.
Para realizar a análise quantitativa da expressão de c-Fos no NAc, foi
utilizado a concentração de núcleos marcados por 0,1 mm². Ou seja, após a
padronização da escala utilizada -para padronização, foi selecionada uma imagem
de referência no aumento de 10x com uma escala referente a 100µm- a medida final
utilizada foi a quantidade de proteínas (contagem dos núcleos) c-Fos, por 0,1mm². A
quantificação foi realizada em diferentes distâncias em relação ao bregma e
bilateralmente, quando possível. Posteriormente, foi tirada a média de cada animal e
posteriormente calculada a média dos grupos.
A área utilizada para análise do NAc core foi considerada dependendo da
altura em relação ao bregma e a área total foi calculada subtraindo a área da
comissura anterior, como observado na figura 18a. Para o cálculo do NAc shell foi
utilizado a mesma dinâmica, onde por meio do atlas Paxinos, foi dimensionada a
região de interesse e após calibração de escala, separado a área de interesse, como
pode ser observado na figura 18b.

47
 Figura 16 Representação das regiões analisadas para a proteína c-Fos. Nas regiões com
aproximação, estão representadas o corte utilizado para análise de NAc core e NAc shell. O valor no
canto inferior direito representa a distância em relação ao Bregma de cada corte. As ilustrações
retiradas do atlas paxinos a. distância em relação ao bregma 1.70; b. distância em relação ao bregma
1,54; c. distância em relação ao bregma 1,18; d. distância em relação ao bregma 0,86;

48
 a. b.

Figura 17 Exemplos de cortes utilizados para quantificação da imunorreatividade da proteína

c-Fos; a) Corte do hemisfério direito em aumento 1,25x e com distância em relação ao bregma de
1,18; b) Corte bilateral em aumento de 1,25x e com distância em relação ao bregma de 1,30.

a. c.

b.

Figura 18 a) Exemplo de corte contendo a região do NAc Core e comissura anterior. Corte do
hemisfério direito em aumento de 10x e com distância em relação ao bregma de 1,18. A área total do
NAc Core compreende a totalidade da imagem diminuindo a região da comissura anterior; b) Exemplo
de corte contendo uma parte da região do NAc Core e a delimitação utilizada para o NAc Shell, além
da comissura anterior. Corte do hemisfério direito em aumento de 10x e com distância em relação ao
bregma de 1,30. A região parcial do NAc Core compreende a linha trastejada amarela, diminuindo a
comissura anterior direita. A região delimitada em vermelho compreende o NAc Shell. O espaço entre
ambas as regiões não foi utilizado pela incerteza de delimitação precisa entre as duas regiões;49c)
Exemplo de marcações para contagem manual da imunorreatividade da proteína c-Fos na região do
NAc Shell. Corte com aumento de 10x. Na ampliação, é possível melhor observar as marcações dos
núcleos de c-Fos.
 3.15 Análise estatística

Os dados dos experimentos foram analisados utilizando-se os softwares

JAMOVI (https://www.jamovi.org/) e GraphPad Prism (https://www.graphpad.com/).
Dependendo do número de grupos e medidas, Teste-t de student, ANOVA de
medidas repetitivas ou não, foram utilizados para análises dos comportamentos sob
o efeito da droga, ao longo do tempo, quando estes se mostraram paramétricos.
Quando os dados se comportaram de forma não-paramétrica, foram utilizados testes
equivalentes. Para análise da normalidade dos dados, foi utilizado o teste Shapiro-
Wilk e analisado o gráfico Q-Q gerado. Os dados foram considerados com tendência
a normalidade quando apresentavam a maioria dos resultados do teste de Shapiro-
Wilk sem rejeição da hipótese nula do teste. Complementarmente sempre foi
avaliado o gráfico Q-Q gerado. Também foi avaliada a homogeneidade dos dados
por meio do teste de Levene’s. Foi utilizado o Teste de Tukey para comparação
múltipla a posteriori. Para a imuno-histoquímica, ANOVA foi utilizado para
comparação dos diferentes grupos experimentais seguidos de Tukey como análise
post hoc. Também foi utilizada uma matriz de correlação Spearman para relacionar
os dados da imuno-histoquímica com os dados comportamentais da sensibilização.
Adicionalmente foi utilizado o método k-means de mineração de dados como forma
complementar de análise. Foram consideradas diferenças estatisticamente
significantes quando p < 0.05.

50
 4. RESULTADOS

4.1 Quantificação dos alcaloides presentes no chá de ayahuasca

O doseamento dos principais compostos presentes no chá foi realizado por

meio de cromatografia líquida ligada à espectrofotômetro de massa. A quantificação
dos alcaloides encontra-se na tabela 2, junto com valores de referência, que foram
retirados de um estudo de doseamento entre diferentes cerimônias de grupos
ayahuasqueiros (Callaway, 2005). As concentrações de dimetiltriptamina,
tetrahidroharmina, harmalina e harmina encontradas nesta amostra estão dentro das
quantidades observadas em outros trabalhos, apesar da concentração de DMT ser
relativamente baixa.

Tabela 2 Concentração de DMT e β-carbolinas na amostra original e liofilizada em comparação às concentrações

encontradas na literatura.

Concentração (mg/ml)

Amostra DMT THH* HRL** HRM***

Amostra original 0,07 1,66 0,21 2,19

Liofilizada 0,08 1,86 0,18 1,4
Callaway, 2005 0,00-14,15 0,48-23,80 0,01-0,90 0,45-22,85
* THH - tetrahidroharmina; ** HRL - harmalina; *** HRM - harmina.

4.2 Quantificação de Etanol por GC-FID

A GC-FID não identificou traços de etanol nas amostras recém abertas,

contudo, detectou uma pequena quantidade de álcool na amostra que permaneceu
por três meses armazenada em geladeira, e que era utilizada para realização dos
testes comportamentais, como pode ser observado na tabela 3.

51
 Tabela 3 Concentração (mg/ml) de etanol na amostra original recém aberta, amostra liofilizada, e
amostra original armazenada por três meses em geladeira.

Concentração (mg/ml)

Amostra EtOH

Original recém aberta Não detectado

Liofilizada Não detectado

Armazenada por 3 meses 5,1

* EtOH – Etanol

4.3 Avaliação da inibição da enzima monoaminooxidase-A in vitro

A análise da inibição da monoaminooxidase-A in vitro mostrou que tanto a

amostra de ayahuasca liofilizada quanto a amostra original do chá de ayahuasca
foram capazes de inibir a MAO-A nas concentrações avaliadas (figura 19). O gráfico
mostra o resultado de apenas um ensaio com cada amostra e indica que
concentrações acima de 100 ng/mL são suficientes para inibir pelo menos 50% da
atividade da MAO-A. Novos ensaios serão conduzidos com concentrações menores
da ayahuasca para permitir o cálculo da concentração que inibe 50% da atividade da
MAO-A (CI50).

100
100.0
97.9

Aya Liofilizada
92.4
% inibição da MAO-A

88.9

86.4

Aya Chá
82.7
81.0

75.3
64.2

55.6

50

0
100 ng/ml 250 ng/ml 1 ug/ml 2,5 ug/ml 10 ug/ml

Figura 29 Porcentagem de Inibição da MAO-A por concentrações crescentes de ayahuasca

liofilizada e amostra original do chá de ayahuasca.

52
 Testes farmacológicos

4.4 Screening farmacológico inicial

As doses empregadas nesta pesquisa foram determinadas baseando-se no

consumo médio utilizado nas cerimônias da União do Vegetal, apontada por
integrantes da UDV com a marcação do volume em um copo descartável. Um adulto
de 70kg consome aproximadamente 128ml ou 45,5g da droga seca, o que equivale
à dose unitária de 651 mg/kg do chá. Esta dose serviu como base de cálculo para os
estudos subsequentes onde foram empregadas doses maiores, considerando que
os roedores possuem metabolismo mais rápido que os humanos.
A fase de triagem inicial ou screening farmacológico é uma etapa fundamental
neste trabalho, pois é nela que se pode observar, pesquisar e estabelecer as doses
adequadas para o estudo e para traçar um perfil geral dos efeitos produzidos pela
droga a ser estudada, neste caso o chá de ayahuasca e o seu liofilizado. Trata-se de
um modelo bastante simples, com caráter qualitativo, mas essencial quando não se
conhece a potência, toxicologia e efeitos produzidos pela droga em questão.
Para o teste de screening foram utilizadas 4 doses do chá e o grupo controle
que recebeu água potável. Nesta análise inicial qualitativa os diferentes grupos
experimentais, com exceção do grupo com a maior dose do liofilizado (5000 mg/kg),
não apresentaram comportamentos destoantes quando comparados com o grupo
controle. O grupo de maior dose apresentou, nas horas iniciais, sinais de
estereotipia, cauda de Straub, além de tremores e pelo eriçado. Contudo, estes
comportamentos diminuíram nas horas finais e após 24h já não apresentavam
nenhum dos comportamentos atípicos.

4.5 Avaliação da coordenação motora por Rota-Rod

A análise descritiva dos dados mostrou que as variáveis majoritariamente

apresentam tendência a normalidade, o que validou o uso de testes paramétricos.
Para as comparações múltiplas intergrupos foi realizada análise de variância
(ANOVA) com medidas repetidas (Tempo*Grupo, df = 12, F = 3.19, p < 0,001)

53
seguida de teste post hoc de Tukey Na Figura 20 é possível observar que, nas
quatro avaliações (0min, 45min, 90min e 180min), apenas o grupo tratado com a
maior dose (5000 mg/kg) mostrou perceptível déficit da coordenação motora na
observação de 45 minutos (df = 30, p= 0,016 em relação ao controle e df = 30,
p < 0,001 em relação ao tempo basal), o que corrobora os dados do screening
farmacológico. Nas rodadas posteriores, o desempenho dos animais foi recuperado.
Os descritivos completos, assim como testes estatísticos, testes de normalidade, e
outras representações gráficas, encontram-se no Apêndice 8.2 – Material
complementar Rota-Rod.

Figura 20 Tempo de permanência (segundos) na barra giratória (12 RPM) de camundongos

administrados por via oral com água (controle), chá de ayahuasca (AC) na dose de 650 mg/kg ou
ayahuasca liofilizada (AL) nas doses de 650, 3560 e 5000 mg/kg. Os pontos representam as médias
e as barras o desvio padrão. * p<0,05 – estatisticamente diferente do controle; # p<0,05 –
estatisticamente diferente do basal (0 min). ANOVA de medidas repetidas seguida de Tukey
(n = 7/grupo).

4.6 Preferência condicionada ao lugar (PCL)

A análise descritiva dos dados de preferência condicionada ao lugar mostrou

que as variáveis majoritariamente apresentam tendência a normalidade, o que
validou o uso de testes paramétricos (os descritivos e análises podem ser
54
encontrados no apêndice 8.3). As comparações intragrupos foram realizadas com
teste t-Student. Para as comparações múltiplas intergrupos foi realizada análise de
variância (ANOVA) com medidas repetidas ou não, e teste de Tukey post hoc,
quando necessário.
No período de Pré-Teste, ou seja, na análise inicial antes do pré-tratamento
com ayahuasca e etanol (análise basal), nenhum grupo apresentou diferença entre
os tempos de permanência em que os animais permaneceram nos dois
compartimentos da arena (p>0,05), ou seja, nas áreas que posteriormente foram
pareadas ou não pareadas com etanol, tanto nas análises intergrupo como
intragrupo (figura 21a)
Por outro lado, o teste realizado após o protocolo de PCL (pós-teste, figura
21b) mostrou que o etanol induziu aumento do tempo dos animais do grupo controle
(pré-tratado com água) no compartimento pareado (p<0,05; Student’s t 0,046),
enquanto o pré-tratamento com ayahuasca, em todas as doses testadas, não
induziu o aumento no compartimento pareado (p>0,05) nas análises intragrupos. A
ANOVA não mostrou diferença significativa na análise intergrupos. ANOVA de
medidas repetidas, considerando o compartimento (Pareado e não pareado), o
período (pré-teste e pós-teste) e os grupos experimentais não mostraram diferença
significativa. Resultados dos testes estatísticos encontram-se nos apêndices 8.3.

55
 Figura 21 Tempo de permanência (segundos) nos compartimentos Não-Pareado e Pareado
de camundongos administrados por via oral com água (CTR), chá de ayahuasca (AC) na dose de 650
mg/kg ou ayahuasca liofilizada (AL) nas doses de 130, 650 e 1950 mg/kg e por via i.p com salina
0,9% (Não-Pareado) e etanol 2,0 g/kg (Pareado). As colunas representam as médias e as barras o
desvio padrão dos dados. Os pontos representam dados individuais. a) Antes do pareamento com
etanol, ANOVA = NS (n = 9-10/grupo). b) Após o pareamento com etanol, t-Student * p<0,05 –
estatisticamente diferente – comparação intragrupo (n = 9-10/grupo).

Análises complementares foram realizadas utilizando diferentes formas de

expressar os resultados, com o intuito de verificar a interação entre os grupos
experimentais (intergrupo). Foram utilizadas manipulações das variáveis
dependentes, tais como: Taxa de crescimento do tempo de permanência nos
compartimentos do período pré-teste para o período pós-teste; diferença no tempo
de permanência entre os compartimentos no período pré-teste e pós-teste; e tempo
de permanência nos compartimentos, expresso em porcentagem do tempo total,

56
sem considerar o tempo dos que os animais permaneciam no compartimento neutro
(central). A taxa de crescimento foi calculada seguindo a fórmula expressa em
porcentagem

DadoAnimalPósTeste−DadoAnimalPréTeste
𝑇𝑥. 𝐶𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 = .
𝐷𝑎𝑑𝑜𝐴𝑛𝑖𝑚𝑎𝑙𝑃𝑟é𝑇𝑒𝑠𝑡𝑒

Os descritivos, testes estatísticos e gráficos complementares podem ser

encontrados no apêndice 8.3. Apesar das diferentes formas de expressão dos
resultados, não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa nas
análises intergrupos. Na figura 22 é possível observar a análise da diferença do
tempo de permanência no compartimento pareado antes e após o pareamento. A
ANOVA não mostrou diferença significativa na análise intergrupos.

Figura 22 Diferença no tempo de permanência (segundos) no compartimento pareado antes e

depois do pareamento de camundongos administrados por via oral com água (CTR), chá de
ayahuasca (AC) na dose de 650 mg/kg ou ayahuasca liofilizada (AL) nas doses de 130, 650 e 1950
mg/kg e por via i.p com salina 0,9% (Não-Pareado) e etanol 2,0 g/kg (Pareado). As caixas
representam as médias e as barras o intervalo de mínimos e máximos. Os pontos representam dados
individuais. ANOVA=NS (n = 9-10/grupo).

57
 4.7 Sensibilização comportamental

No protocolo de sensibilização comportamental, os animais foram avaliados

na arena de campo aberto nos dias 0 (realização da medida basal - pré-teste), 01,
05, 09, e 14. Foram avaliados a distância percorrida (em mm), taxa de exploração da
arena e tempo de permanência em zona periférica (externa) e zona central da arena.
A análise descritiva dos dados mostrou que as variáveis majoritariamente
apresentaram tendência a normalidade, o que validou o uso de testes paramétricos
(os descritivos e análises se encontram no apêndice 8.4-8.6).

4.7.1 Distância percorrida (mm)

A análise da distância percorrida foi realizada de duas formas. Na primeira, os

dados foram normalizados quanto ao tamanho das arenas, pois apesar das arenas
serem iguais, a câmera utilizada para a gravação poderia ter criado alguma
distorção (embora pequena) no tamanho das arenas. Nesta primeira análise foi
medida a distância percorrida em milímetros pelos animais (ambulação). A análise
da distância percorrida entre os grupos está representada na figura 23. As
diferenças estatísticas foram analisadas por ANOVA de medidas repetidas,
utilizando como fatores o dia da análise e os grupos experimentais. Teste de Tukey
foi utilizado em seguida como análise Post Hoc. A comparação foi feita nos
diferentes grupos do mesmo dia de tratamento e com o mesmo grupo experimental
nos diferentes dias de tratamento (a análise estatística, descritivo e gráficos
adicionais encontram-se no apêndice 8.4)
Na primeira análise, a ANOVA de medidas repetidas (Dia*Grupo) não mostrou
diferença estatisticamente significativa (F = 0,931, df = 20, p= 0,555). para os grupos
AYA650-SAL e AYA650-EtOH quando comparado o dia 14 com o Basal (Pré-teste)
(df = 36; p <0,001 e p = 0,004) – dados não indicados na figura – caso houvesse
diferença estatisticamente significativa pela ANOVA.

58
 Figura 23 Distância percorrida (milímetros) na arena de campo aberto de camundongos
administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950
mg/kg e por via i.p. com salina 0,9% (SAL) ou etanol 2,0 g/kg (EtOH). Os pontos representam as
médias e as barras o desvio padrão dos dados. Animais avaliados por 10 minutos nos diferentes dias,
basal (sem tratamento), e dia 01 a dia 14. (ANOVA, p>0,05, n = 6-8/grupo).

Para a segunda análise foi utilizada a taxa de crescimento da distância

percorrida dos animais. A taxa de crescimento foi calculada para cada animal, desta
forma normalizando o desempenho individual dos animais e, em seguida, foi
calculada a média das taxas individuais pelos grupos. A fórmula a seguir, representa
o cálculo utilizado para o crescimento do dia 1 em relação ao basal:
DadoAnimalDia01−DadoAnimalBasal
𝑇𝑥. 𝐶𝑟𝑒𝑠𝑐𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 = . A mesma lógica foi utilizada nas
𝐷𝑎𝑑𝑜𝐴𝑛𝑖𝑚𝑎𝑙𝐵𝑎𝑠𝑎𝑙

avaliações posteriores, sempre subtraindo e dividindo pela medida anterior.

O crescimento das taxas no decorrer dos dias foi analisado por ANOVA
de medidas repetidas seguido de teste de Tukey como post Hoc (figura 24). A
ANOVA de medidas repetidas (Dia*Grupo) não mostrou diferença estatisticamente
significativa (F = 1,29, df = 15, p = 0,223). Apesar da ausência de diferença significa
na ANOVA, foi realizado uma análise Post Hoc desprotegida com o intuito de melhor
explorar os resultados. Esta análise desprotegida mostrou que haveria diferença
estatisticamente significativa no teste de Tukey apenas no grupo AYA1950-EtOH
quando comparada a taxa de crescimento do dia 9 em relação ao dia 5 (Dia09/05)
com a taxa do dia 1 em relação ao basal (Dia01/Basal) (df = 33, p = 0.007) – dados

59
não indicados na figura - caso a ANOVA mostrasse diferença estatisticamente
significativa.
. Os descritivos e análises estatísticas encontram-se no apêndice 8.4.

Figura 24 Taxa de crescimento (porcentagem) da distância percorrida na arena de campo

aberto de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA)
nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p com salina 0,9% (SAL) e etanol 2,0 g/kg (EtOH). Os
pontos representam as médias e as barras o desvio padrão dos dados (ANOVA, p>0,05,
n = 6-8/grupo).

4.7.2 Taxa de exploração da arena de campo aberto

Na análise da taxa de exploração, ANOVA de medidas repetidas (Dia*Grupo)

mostrou diferença significativa entre os grupos (F = 1,76, df = 20, p = 0,031). O teste
de Tukey como post hoc mostrou diferença estatisticamente significativa dos grupos
AYA1950-EtOH e AYA1950-SAL no dia 01 na comparação com o Basal (p < 0,001 e
p = 0,005). Os resultados podem ser observados na figura 25.
Descritivos, gráficos adicionais e análise estatística encontram-se no
apêndice 8.5.

60
 Figura 25 Taxa de exploração (porcentagem) da arena de campo aberto de camundongos
administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950
mg/kg e por via i.p com salina 0,9% (SAL) e etanol 2,0 g/kg (EtOH). Os pontos representam as
médias e as barras o desvio padrão dos dados. * p <0,05 – estatisticamente diferente do Basal.
ANOVA de medidas repetidas seguida de Tukey (n = 6-8/grupo).

4.7.3 Tempo de permanência nas Zonas Central e Externa

Na análise do tempo de permanência dos animais na zona central a ANOVA

de medidas repetidas (Dia*Grupo, F = 1,78, df = 20, p = 0,03) seguida de post hoc
de Tukey mostrou diferença estatisticamente significativa nos grupos ÁGUA-EtOH e
AYA650-EtOH em todos dias experimentais em relação ao Basal. Também foi
observada diferença estatisticamente significativa do grupo AYA1950-EtOH no dia
01 em relação ao Basal. Por fim, há diferença estatisticamente significativa do grupo
AYA1950-EtOH com todos os outros grupos experimentais - com exceção de
AYA1950-SAL - no dia 14. Os descritivos, gráficos adicionais e análise estatística
encontram-se no apêndice 8.6. A representação gráfica do tempo de permanência
na zona central encontrasse na figura 26a.
De forma complementar ao dado anterior, o tempo de permanência na zona
periférica (externa) também foi analisado. A ANOVA de medidas repetidas
(Dia*Grupo) não indicou diferença significativa entre os grupos na comparação de
cada grupo ao longo do tempo (F = 1.23, df = 20, p = 0.241). Mesmo assim, foi
realizada uma análise post hoc de Tukey na tentativa de melhor explorar os
resultados deste experimento. Esta análise desprotegida mostrou que haveria
61
diferença estatisticamente significativa entre os grupos AGUA-EtOH no dia 01 em
relação ao Basal, AYA650-SAL nos dias 01, 09 e 14 em relação ao basal, e
AYA1950-EtOH em relação a todos os grupos no dia 14 caso a ANOVA tivesse sido
significativa. Na figura 26b, pode ser observado o resultado gráfico destes dados.

Figura 26 Tempo de permanência (segundos) nas zonas da arena de campo aberto de

camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses
de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p com salina 0,9% (SAL) e etanol 2,0 g/kg (EtOH). Os pontos
representam as médias e as barras o desvio padrão dos dados. * p <0,05 – estatisticamente diferente
do Basal. # p <0,05 – estatisticamente diferente dos demais grupos -com exceção de AYA1950-SAL-.
a) Tempo de permanência (segundos) na zona central da arena de campo aberto, ANOVA de medidas
repetidas seguida de Tukey (n = 6-8/grupo). b) Tempo de permanência (segundos) na zona periférica
(externa) da arena de campo aberto, diferença não significativa segundo a ANOVA de medidas repetidas
seguida de Tukey (n = 6-8/grupo).

62
 4.8 Imunorreatividade da proteína c-Fos na sensibilização
comportamental

A análise descritiva dos dados mostrou que as variáveis apresentam

tendência a normalidade, o que validou o uso de testes paramétricos (os descritivos
e análises se encontram no apêndice 8.7). A análise da imunorreatividade da
proteína c-Fos na região do núcleo accumbens Core e Shell, por ANOVA, não
mostrou diferença estatisticamente significativa intergrupos, tanto na região Core
(F = 2,006, df = 34, p > 0,103) quanto na região Shell (F = 0,987, df = 32 p > 0,441).
Como análise complementar foi realizada a comparação da imunorreatividade de
c-Fos nas regiões Core e Shell do NAc. A ANOVA de medidas repetidas não indicou
diferença significativa entre as regiões (F = 0,659, df = 5, p = 0,657), no entanto foi
realizada uma análise post hoc de Tukey desprotegida para melhor explorar o
resultado e nesta análise foi verificada diferença estatisticamente significativa entre o
grupo AGUA-SAL na região core em relação a região Shell (df = 32, p = 0,002)
- dado não indicado na figura. A representação gráfica dos resultados pode ser
observada na figura 27. Descritivos e as análises estatísticas, bem como análises
complementares, encontram-se no apêndice 8.7.

Figura 27 Densidade de c-Fos (núcleos/mm²) na região do Núcleo accumbens de

camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses
de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p com salina 0,9% (SAL) e etanol 2,0 g/kg (EtOH) e que passaram
pelo protocolo de sensibilização comportamental. As colunas representam as médias e as barras o
desvio padrão dos dados. (ANOVA, p>0,05, n = 6-8/grupo)

63
 4.8.1 Matriz de correlação e K- Means

Para complementar os dados experimentais, foram utilizadas matrizes de

correlação de Spearman’s para analisar a correlação entre a imunorreatividade da
proteína c-Fos no NAc com todas as variáveis avaliadas no protocolo de
sensibilização comportamental. Contudo, não foi identificada nenhuma correlação
significativa da imunorreatividade da proteína c-Fos com os dados comportamentais,
tais como: tempo de permanência, distância percorrida e taxa de exploração.
Por outro lado, foi observada correlação significativa da densidade da
imunorreatividade da proteína c-Fos entre as duas regiões do NAc analisadas
(figura 28). NAc Shell e NAc Core Rho de Spearman = 0.608, p <0.001.
O método de mineração de dados “k-means” foi utilizado como análise
adicional nos resultados experimentais da sensibilização comportamental e da
expressão da imunorreatividade de c-Fos. O método baseia-se no agrupamento de
dados pelo conceito de similaridade, ou seja, a ideia principal é encontrar itens
semelhantes de acordo com seus atributos. Esses agrupamentos são chamados de
“clusters”. A ideia foi utilizar a formação dos “clusters” e compará-los com os grupos
originais, considerando os seis grupos experimentais, o tratamento, ou a droga
utilizada, a fim de verificar se o k-means era capaz de predizer algum desses
grupos. Contudo, devido à alta dispersão dos dados (heterogeneidade dos
resultados e sobreposição dos desvios padrões) não foi encontrada nenhuma
similaridade entre os grupos originais e os gerados pelo k-means. Pela ausência de
resultados significativos, estes resultados não estão dispostos nesta seção, mas um
exemplo encontra-se nos apêndices 8.8.

64
 Figura 28 Representação gráfica da matriz de correlação da densidade de c-Fos
(núcleos/mm²) na região do Core e Shell do Núcleo accumbens de camundongos que passaram pelo
protocolo de sensibilização comportamental. p < 0,001, Rho = 0,608, Matriz de correlação de Spearman
(n = 38).

65
 5. DISCUSSÃO

O álcool é a droga psicotrópica mais utilizada no Brasil e em muitos outros

países, e apesar de ser um problema crônico e sério; os distúrbios relacionados ao
seu consumo possuem limitadas opções farmacológicas para seu tratamento, sendo
muitas com resultados moderados e, em alguns casos, pouco ou nada eficazes. A
busca por alternativas terapêuticas colocou a ayahuasca, uma bebida com
propriedades psicodélicas, no radar das pesquisas acadêmicas, devido a um
conjunto de estudos observacionais que sugerem que a mesma possui efeitos anti-
dependência, entre outras propriedades terapêuticas. Desta forma, compreender os
possíveis mecanismos de ação da ayahuasca sobre o desenvolvimento da
dependência podem abrir novas portas para pesquisas futuras e possíveis caminhos
para a elaboração de novos fármacos para o tratamento da dependência.
Após a obtenção do chá de ayahuasca com a União do Vegetal, parte da
amostra foi concentrada e liofilizada, enquanto parte foi mantida no seu estado
original (chá) em geladeira. Esta etapa é importante neste tipo de estudo pois auxilia
na conservação e estabilidade dos princípios ativos presentes na droga. A análise
dos constituintes presentes nas amostras do chá de ayahuasca, tanto na amostra
liofilizada quanto na forma original, revelou a presença das β-carbolinas em
concentrações compatíveis e semelhantes às encontradas na literatura. Contudo, a
quantidade de DMT, apesar de estar dentro do intervalo reportado na literatura, foi
encontrada abaixo dos valores médios usualmente reportados. Neste aspecto,
quando conversado com o mestre da União do Vegetal que forneceu a amostra a
ser usada no presente projeto, este relatou que a preparação produziu os efeitos
subjetivos esperados.
Sabe-se que as concentrações de DMT e β-carbolinas podem variar muito
dependendo da amostra, mesmo quando preparadas por um mesmo grupo, pois
inúmeros fatores são responsáveis pela quantidade destes alcaloides, como tempo
de cocção do chá, época de colheita e até a hora de coleta das plantas (Callaway,
2005). Desta maneira, deve-se ressaltar a importância da reprodutibilidade de
trabalhos que utilizam a ayahuasca na forma original e liofilizada. Na presente
amostra, a quantidade de harmalina foi ligeiramente superior àquela observada em
outros estudos do grupo, podendo-se sugerir que a maior concentração de

66
harmalina ajudou a compensar o nível reduzido de DMT, no que se refere às
sensações subjetivas experimentadas pelos participantes do ritual. Também é
relevante comentar que a liofilização não alterou significativamente a quantidade de
DMT, mas observou-se uma diminuição dos níveis de harmina acompanhada por
uma ligeira elevação da concentração de THH. Já foi descrito que quantidades
adicionais de THH podem ser formadas a partir da harmina e harmalina durante a
preparação da bebida (Callaway, 2005; McIlhenny et al., 2009) e o efeito da
liofilização sobre as β-carbolinas não pode ser desprezado. Por outro lado, estudos
anteriores desse grupo sugerem que o processo de liofilização não causa alterações
consideráveis dos alcaloides.
Outro aspecto interessante é a formação de etanol por meio da fermentação
do chá, quando este é utilizado nas ritualísticas das doutrinas ayahuasqueiras.
Normalmente a bebida é armazenada em garrafas pet, que são utilizadas em
diversas ocasiões. É sugerido que a fermentação da ayahuasca possa interagir com
os constituintes e seus efeitos esperados. Nas amostras analisadas, tanto na
amostra original quanto na liofilizada, não foram detectados traços de etanol. Já na
amostra que ficou armazenada em geladeira apresentou uma pequena quantidade
de etanol, contudo, é um valor pequeno comparado a uma dose padrão de álcool.
Além da quantificação de DMT e β-carbolinas, o material utilizado neste
estudo também foi avaliado quanto a capacidade de inibição da MAO-A in vitro. A
análise neste projeto determinou que tanto a amostra de ayahuasca liofilizada
quanto a amostra do chá de ayahuasca original foram capazes de inibir a MAO-A
confirmando que os princípios ativos, no caso as e β-carbolinas, mantiveram-se
ativos nas amostras utilizadas, seja na forma original (chá) como liofilizada. A
confirmação da presença dos princípios ativos e a atividade inibitória sobre a MAO-A
qualificaram o material obtido para ser utilizado nos testes biológicos in vivo.
No screening farmacológico, apenas a concentração do chá de 5000 mg/kg
(maior dose testada) induziu diferenças comportamentais expressivas nos animais,
entre elas cauda de Straub, tremor e aumento da sensibilidade. Estes
comportamentos podem ser caracterizados pela chamada "síndrome serotonérgica”
(Carlini, 2011). Apesar da ayahuasca apresentar alguns efeitos tóxicos na dose mais
alta, nenhum animal foi a óbito no screening farmacológico, e as mudanças

67
comportamentais neste grupo foram diminuindo com o tempo, sendo que 24 horas
depois não houve mais nenhuma característica comportamental tóxica aparente.
Esses resultados estão em concordância com os dados da literatura e
corroboram a baixa toxicidade do chá de ayahuasca quando administrado por via
oral e em doses consideradas baixas a moderadas. Morais (2014) analisou a
toxicidade aguda e crônica da ayahuasca e comparou com estudo similar de Pires et
al. (2010), mostrando que óbitos gerados pelo chá de ayahuasca, em ratas, ocorriam
em doses superiores a 50 vezes as doses utilizadas nas doutrinas ayahuasqueiras
O trabalho de revisão realizado por Gable (2007) quanto a toxicidade do chá e seus
componentes, além de ambos os trabalhos citados previamente (Morais, 2014; Pires
et al., 2010), ratificam a segurança dessas substâncias.
Como parte da avaliação toxicológica inicial, também foi utilizado o teste de
rota-rod, que mede a coordenação motora (equilíbrio) dos animais em uma barra
giratória. Este comportamento exige um controle proprioceptivo, vestibular e de
habilidades motoras finas.
Assim como ocorreu no screening farmacológico, apenas a dose mais alta de
ayahuasca (5000 mg/kg) foi capaz de alterar o desempenho dos animais nos
minutos iniciais no rota-rod. Esse resultado é importante pois mostra que, em doses
elevadas, o chá pode interferir em testes comportamentais que requerem
coordenação motora preservada. Contudo, nos minutos posteriores, o desempenho
dos animais foi sendo recuperado, e no período final da análise (180 min) os animais
não apresentavam mais déficit motor.
Assim, a avaliação conjunta dos resultados obtidos nesta etapa inicial indicou
a ausência de efeitos neurotóxicos do chá e de efeito depressor ou estimulante.
Esse conjunto de informações permitiu a definição das doses consideradas seguras
para serem utilizadas nos testes subsequentes. Adotou-se também a administração
por via oral (gavagem) com intuito de reproduzir a forma de ingestão pela população,
além de aumentar a segurança para os animais.
Com as doses escolhidas e compatíveis com a literatura, o teste realizado em
seguida foi o de preferência condicionada ao lugar (PCL). Este paradigma
experimental é um método capaz de mensurar as propriedades reforçadoras de
drogas psicotrópicas. Inúmeros trabalhos mostraram sua eficácia nesta área de
estudo, sendo uma das grandes vantagens da PCL seu relativo baixo custo

68
experimental, fácil observação de resultados, além de fácil realização (Bardo &
Bevins, 2000; Lucke-Wold, 2011; Risinger et al., 2002).
No teste de PCL, inicialmente foi observado que os animais não possuíam
uma preferência por algum dos compartimentos. Este dado foi confirmado
comparando o tempo bruto que os animais permaneceram em cada compartimento
antes do pareamento com as drogas. Contudo, é relevante mencionar que, apesar
destas diferenças de tempo não serem estatisticamente significativas para os
grupos, existe uma diferença de tempo de permanência natural entre os animais.
Assim, com o intuito de diminuir quaisquer vieses experimentais, os animais foram
distribuídos de forma que metade dos animais foram pareados com etanol no
compartimento com menor tempo de permanência e a outra metade no
compartimento com maior tempo de permanência no teste basal
Na avaliação pós-pareamento com etanol, foi observado um aumento no
tempo de permanência no lado pareado com a droga apenas no grupo controle, ou
seja, o grupo que não recebeu a ayahuasca, mas recebeu etanol. Já nos demais
grupos experimentais, pré-tratados com a ayahuasca, todas as doses foram
suficientes para bloquear a instalação da preferência pelo compartimento pareado
com etanol, embora tenha sido observada uma tendência de aumento no lado
pareado no grupo ayahuasca chá 650 mg/kg.
Outra forma de avaliação entre os grupos experimentais foi por meio de
índices que relacionam ou o resultado pré-teste com o pós-teste e suas diferenças,
ou as diferenças no compartimento pareado com o não-pareado. Contudo, nenhuma
diferença significativa foi encontrada entre os grupos. Um dos fatores que contribuiu
para esta ausência de diferenças significativas pode ter sido a alta variabilidade dos
resultados (ver apêndice 8.3). Sabe-se que testes comportamentais produzem
naturalmente uma grande variabilidade, ainda mais quando se utilizam animais
heterogênicos, como foi o caso do presente estudo.
Uma limitação apresentada no PCL foi a falta de um grupo controle da
ayahuasca, para saber se nestes aparatos e condições experimentais, apenas a
ayahuasca seria capaz de instalar a preferência por um dos compartimentos. O
bloqueio da preferência condicionada ao etanol pela ayahuasca é descrito em outros
trabalhos na literatura. Cata-Preta et al. (2018) observaram que a ayahuasca foi
capaz de bloquear a PCL em diversas doses de ayahuasca, contudo, o chá per se

69
foi capaz de induzir o PCL em uma dose média, e não induziu condicionamento com
doses consideradas pequenas ou altas. Neste trabalho (Cata-Preta et al., 2018),
além de ter sido analisado um grupo tratado apenas com ayahuasca, foram também
testados os extratos de Psychotria viridis e Banisteriopsis caapi individualmente. Os
extratos isolados não geraram PCL per se, tampouco foram capazes de bloquear a
PCL induzida pelo etanol, o que reforça a importância da ação sinérgica dos
princípios ativos da ayahuasca. Gianfratti (2009) também observou o bloqueio da
PCL pela ayahuasca ao etanol, bem como observou o efeito reforçador da
ayahuasca quando administrada sozinha na mesma dose, ou seja, a ayahuasca
produziu preferência condicionada no teste.
Apesar destes trabalhos terem envolvido ayahuasca e etanol, é importante
ressaltar a importância de realizar outros estudos similares, pois como descrito
anteriormente, o chá de ayahuasca pode apresentar uma grande variabilidade na
quantidade de seus constituintes, dependendo de como é preparado, e também
porque pequenas variações metodológicas podem levar a resultados distintos, tal
como o presente estudo apresentado nesta dissertação.
O modelo de PCL também foi utilizado para avaliar o efeito da ayahuasca
sobre o condicionamento de outras drogas. Reis et al. (2020) mostraram que o chá é
capaz de bloquear a reinstalação da PCL com metilfenidato, contudo, ambas as
substâncias sozinhas também foram capazes de induzir a PCL. Outro estudo do
nosso grupo sugere que a ayahuasca na forma de chá foi capaz de bloquear a
preferência condicionada ao lugar induzida por morfina (Prado et al., 2016). Em
outro trabalho, diferente dos resultados encontrados no presente estudo e dos
previamente citados, Jones et al. (2010) observaram que o álcool, quando associado
com o MDMA (3,4 – metilenodioxi metanfetamina), que também é uma droga com
ação nos receptores serotonérgicos, induz o condicionamento em ratos no
compartimento associado à droga. Este resultado, segundo os autores, pode ser
atribuído à liberação de dopamina através da associação das duas drogas, o que
causaria essa diferença de poder reforçador.
O segundo estudo comportamental realizado foi baseado no fato que algumas
respostas comportamentais exibidas por animais de laboratório a estimulantes
dopaminérgicos indiretos e diretos são intensificadas após a administração repetida
dessas substâncias (tais como anfetaminas, cocaína, apomorfina entre outras)

70
(Robinson & Becker, 1986; Wise & Hoffman, 1992). Esse fenômeno tem recebido
diversas terminologias para sua descrição, como por exemplo tolerância reversa,
facilitação comportamental e sensibilização comportamental, sendo este último
atualmente o mais utilizado (Everitt & Wolf, 2002; Oliveira-Lima et al., 2015;
Szechtman et al., 1994).
Apesar de outros comportamentos serem observados por meio da utilização
de moduladores dopaminérgicos, tais como comportamento rotacional e
responsividade a estímulos acústicos (Robinson & Becker, 1986), é notável que a
hiperatividade locomotora é um dos fatores mais dramaticamente afetados pela
administração repetida de drogas capazes de aumentar a função dopaminérgica.
Desta forma, a locomoção constitui um parâmetro comportamental quantificável e
amplamente utilizado em estudos relacionados a estudos de sensibilização
comportamental (Godinho, 2017; Nascimento Alvarez et al., 2006; Oliveira-Lima et
al., 2015; Robinson & Becker, 1986; Wise, 1996).
Em revisões realizadas pelos pesquisadores Phillips et al. (1997a,b) é
sugerido que grande parte das substâncias com potencial de abuso é capaz de
estimular a atividade locomotora em roedores, provavelmente por modulação
dopaminérgica. Este dado gerou, nos últimos anos, uma investigação detalhada da
estimulação psicomotora induzida por drogas. Com isso, tem-se postulado que
modelos animais de estimulação locomotora induzida poderiam ter uma correlação
com a ação euforizante e reforçadora de drogas de abuso. Nessa circunstância, o
tratamento crônico com diversas drogas de abuso é capaz de promover
sensibilização ao seu efeito estimulante motor (Araujo et al., 2006; 2009; Robinson &
Becker, 1986).
Segundo alguns autores, a administração aguda de 1 a 2 g/kg de etanol,
apresenta um efeito controverso, podendo ou não resultar em aumento da atividade
motora, enquanto a administração repetida pode produzir o aparecimento de
sensibilização comportamental, normalmente caracterizada pelo aumento
progressivo da atividade locomotora em camundongos (Masur et al, 1986;
Cunningham & Noble, 1992; Phillips et al., 1995; Didone et al., 2019).
Apesar de existirem diversos trabalhos na literatura avaliando a sensibilização
comportamental induzida pelo etanol, poucos trabalhos avaliaram o efeito do pré-
tratamento com outras substâncias sobre a sensibilização comportamental ao

71
etanol. No caso da ayahuasca, Oliveira-Lima et al. (2015) demonstraram que doses
de ayahuasca entre 30 e 500 mg/kg foram capazes de bloquear a sensibilização
induzida pelo etanol. Tal estudo foi utilizado como referência no nosso trabalho, com
algumas modificações do desenho experimental. No nosso estudo, a sensibilização
comportamental foi analisada não apenas pela distância percorrida pelos animais na
arena, mas também utilizando outros parâmetros com o intuito de melhor explorar os
dados comportamentais.
Na análise da distância percorrida, apenas os grupos que receberam
ayahuasca na dose intermediária (AYA650-SAL e AYA650-EtOH) mostraram uma
diminuição na distância percorrida quando o último dia experimental (Dia 14) foi
comparado com o dia basal (pré-teste). Já ao avaliar taxa de crescimento do dia 9
em relação ao dia 5 (Dia09/05) com a taxa do dia 1 em relação ao basal
(Dia01/Basal) foi observado um aumento desde crescimento no grupo AYA1950-
EtOH. Entretanto, o grupo controle positivo, ou seja, o grupo que recebeu etanol e
foi pré-tratado com água, em ambas as comparações, não apresentou diferença
estatisticamente significativa, sugerindo a ausência de sensibilização nos animais
testados, tornando os demais resultados pouco conclusivos.
Na análise da taxa de exploração da arena de campo aberto, os grupos que
foram tratados com a maior dose de ayahuasca (1950 mg/kg), tanto os que
receberam salina quanto os que receberam etanol, tiveram uma diminuição na taxa
de exploração da arena comparando o primeiro dia experimental com a ambulação
basal, sugerindo a capacidade da alta dose do chá ser capaz de influenciar
negativamente a exploração da arena. No entanto, observa-se que houve pequena
redução da taxa de exploração (não significativa) no dia um nos demais grupos
experimentais, bem como não houve diferença entre os grupos, tornando difícil
atribuir o efeito ao chá de ayahuasca.
Outra forma utilizada para explorar os dados da sensibilização foi a análise do
tempo de permanência dos animais nas zonas periférica e central da arena de
campo aberto. Esta análise é bem conhecida em estudos com roedores, sendo que
animais com comportamentos ansiogênicos tendem a ficar nas zonas periféricas da
arena, enquanto a permanência em zona central da arena pode sugerir
comportamento ansiolítico.

72
 Neste trabalho, aparentemente existiu uma tendência majoritária dos grupos
em diminuir o tempo na zona central após receberem as drogas, tratamentos, e
serem expostos a arena de campo aberto. Contudo, apenas os grupos que
receberam etanol apresentaram diminuição estatisticamente significativa da
permanência na zona central em relação ao basal, sendo que o grupo AYA1950-
EtOH diferiu apenas no dia 1, enquanto os grupos AGUA-EtOH e AYA650-EtOH
mantiveram a diminuição de permanência em todos os dias experimentais. Além
disso, o grupo AYA1950-EtOH, no último dia, apresentou maior tempo de
permanência na zona central comparado aos demais grupos.
A ausência da sensibilização comportamental na distância percorrida e os
poucos resultados encontrados no presente estudo podem ser justificados por
algumas hipóteses. Alguns autores sugerem que a sensibilidade comportamental
está correlacionada à predisposição de alguns animais a auto-administração da
droga. Grahame et al. (2000) mostraram que camundongos geneticamente
selecionados para maior preferência ao álcool desenvolveram a sensibilização
comportamental, enquanto que animais geneticamente selecionados para uma baixa
preferência ao álcool não desenvolveram a sensibilização. Isto indica uma possível
relação genética positiva entre o comportamento de sensibilização comportamental
e as propriedades reforçadoras do álcool. Corroborando esta hipótese, Lessov et al.
(2001) verificaram que uma linhagem de camundongos que possuía uma alta
preferência ao etanol apresentou um aumento no consumo voluntário da droga
posteriormente ao desenvolvimento da sensibilização comportamental. De forma
concomitante, os autores também verificaram que o consumo voluntário prévio de
álcool era capaz de promover o aumento da sensibilização do efeito estimulante
induzido pela droga. Didone et al. (2019) também mostraram que, em protocolos
crônicos de sensibilização, camundongos fêmeas Swiss atingiram o pico de
sensibilização em 40 dias de administração, enquanto que camundongos fêmeas
DBA/2AJ atingiram o pico de sensibilização em 20 dias, sugerindo que fatores
genéticos de cada linhagem devem ser importantes para o mecanismo de
sensibilização.
Estes estudos são relevantes, pois uma característica provavelmente inerente
ao estudo com animais e visivelmente expressa nestes experimentos é a alta
variabilidade de resultado intragrupos, expressa na variância dos resultados e desvio

73
padrão. Neste sentido, alguns estudos sugerem que camundongos outbred possuem
uma variabilidade considerável e podem não apresentar sensibilização
comportamental (De Pauli et al., 2014; Quadros et al., 2002).
Nesta linha de pesquisa, muitas vezes, ocorre a utilização de camundongos
fêmeas. Alguns trabalhos sugerem que fêmeas apresentam um desenvolvimento da
sensibilização comportamental mais robusto à psicoestimulantes, quando
comparadas a camundongos machos (Becker & Hu, 2008), achado que estimula a
utilização de fêmeas em estudos com este paradigma (Didone et al., 2008; Phillips et
al., 1997; Quoilin et al., 2012).
Outra hipótese levantada refere-se ao local do tratamento e quantidade de
exposições dos animais ao campo aberto, ou seja, ao contexto ambiental. É visto
que o contexto ambiental no qual a substância é administrada influencia de modo
expressivo a progressão da sensibilização comportamental. Desta forma, nos
paradigmas experimentais de sensibilização em que é feito um teste após a fase de
sensibilização ou condicionamento, a sensibilização pode não ocorrer, ou pode
sofrer uma diminuição caso o teste de sensibilização ocorra em contextos
ambientais diferentes daquele no qual os animais foram primeiramente
sensibilizados (Crombag & Robinson, 2004; Badiani et al 1995). No trabalho de
Robinson et al. (1998) é sugerido que a sensibilização comportamental pode não ser
uma consequência direta da administração da substância psicoestimulante em
doses diárias e fixas, mas sim, um resultado de interações entre estas manipulações
farmacológicas e o ambiente em que elas são realizadas (Anagnostaras et al., 1995;
Crombag & Robinson, 2004).
Em um experimento realizado por Badiani et al. (1995) foi observado que,
quando os animais recebiam a administração de uma droga (neste caso anfetamina
ou cocaína) em sua própria caixa-moradia e eram testados posteriormente na arena
de campo aberto, a sensibilização desenvolvida era menor do que quando os
animais recebiam a droga e logo em seguida eram expostos à arena de campo
aberto. Ou seja, parece que o tratamento com exposição simultânea ao campo
aberto é importante para o desenvolvimento da sensibilização comportamental. Além
do número de exposições à arena, as condições das caixas-moradias parecem ser
um fator determinante para a sensibilização ou não dos animais (Araujo et al., 2005).

74
 Apesar do desenho experimental empregado no presente trabalho apresentar
certas limitações, é importante mencionar que a escolha desse formato experimental
e dos animais foi baseada no fato deste projeto ser o início de uma nova linha
experimental no presente grupo de pesquisa, servindo para familiarizar com os
procedimentos e para propor adaptações do protocolo para testes futuros em função
das condições laboratoriais, dificuldades encontradas e resultados obtidos. Além
disso, o desenho experimental e uso destes animais foram fundamentados em
protocolos utilizados e consolidados por grupos de pesquisa parceiros.
No que tange a imunorreatividade da proteína c-Fos, Faria et al. (2008)
observaram que a administração aguda de etanol aumentou a expressão de Egr-1 e
c-Fos em regiões como PFC, córtex motor, amígdala, hipocampo e NAc de
camundongos. Já a administração crônica em animais avaliados em modelo de
sensibilização ao etanol produziu efeito contrário, ou seja, ocorreu uma baixa
expressão de c-Fos (Faria et al., 2008).
Esse dado é interessante, pois aparentemente ocorre uma diminuição da
expressão de c-Fos em protocolos crônicos, que apresentam sempre a mesma fonte
de estímulo em todo o protocolo. Isto ocorreria, possivelmente, devido a essa
proteína estar associada aos processos de plasticidade neural, e, nesses casos,
pode já ter ocorrido o aprendizado e a plasticidade relacionada ao estímulo que se
manteve igual e sem novidade. Walter et al. (2017) mostraram que a administração
aguda de álcool associada a estímulos estressores aumentou os níveis de c-Fos em
diferentes regiões do SNC, enquanto a administração crônica mudou essa
expressão da proteína c-Fos. Apesar desta distinção entre exposição aguda e
crônica, Sharma et al. (2014) mostraram um aumento significativo da expressão de
c-Fos no NAc em ratos expostos ao álcool após infusão direta na área do gânglio
basal. Contudo, Jaramillo et al. (2016) obtiveram resultados contrários, observando
diminuição da expressão de c-Fos no PFC medial e no NAc em ratos que foram
administrados de forma aguda com 1 g/kg intragastrico de álcool.
Além da diferença entre tempo de exposição (agudo ou crônico), Badiani et
al. (1998) demonstraram que a expressão da proteína c-Fos no córtex pré frontal, no
núcleo Caudado e no NAc, região de interesse deste estudo, é significativamente
diferente quando administrações de anfetamina ocorrem envolvendo contextos
ambientais em comparação com o que ocorreu em animais que receberam a mesma

75
dose de anfetamina na caixa moradia. Também é interessante que, aparentemente,
os contextos ambientais podem modular o estágio inicial que posteriormente leva à
expressão de genes imediatamente precoces (Crombag, 2001). Outro estudo,
realizado por Uslaner et al. (2001), ratifica estes resultados, mostrando que a
administração de anfetamina e cocaína associadas à pistas ambientais aumentou a
expressão de RNAm para c-Fos em relação ao que ocorreu com os animais que
recebiam o mesmo tratamento na caixa moradia. Estes estudos apontam que a
expressão de c-Fos possivelmente está vinculada à exposição do animal à arena
(novo contexto ambiental) ou à moradia.
Com base nos estudos mencionados, fica evidente que os fatores
farmacológicos e extra-farmacológicos são importantíssimos para a modulação dos
efeitos de desenvolvimento e de expressão da sensibilização comportamental.
A análise da quantificação de c-Fos em animais submetidos ao teste de
sensibilização comportamental neste estudo não indicou diferença significativa na
expressão da proteína c-Fos entre os grupos experimentais, tanto na região Core
quanto Shell do NAc. Apesar de apresentar uma alta variabilidade, este resultado
negativo está de acordo com a literatura no que se refere ao fato de que
procedimentos crônicos e com pouca ou nenhuma alteração contextual não
aumentam a expressão de c-Fos, possivelmente por uma estabilização dos
mecanismos adaptativos neuronais. Também não foi verificada diferença de
densidade de c-Fos entre as regiões Core e Shell do NAc, exceto no grupo AYA650-
SAL que apresentou maior densidade na região do NAc Shell. De forma adicional, a
matriz de correlação de Spearman mostrou uma correlação positiva forte entre as
regiões do NAc, o que indica que uma alta densidade de c-Fos na região Core
sugere uma alta densidade de c-Fos na região Shell.
Existe uma relação entre os tipos de estímulos, protocolos experimentais, e
quais sub-regiões do NAc apresentam maior imunorreatividade de c-Fos (Brenhouse
& Stellar, 2006; Di Chiara, 2002; Úbeda-Contreras et al., 2018). Apesar dos artigos
não serem uniformes quanto a qual sub-região do NAc está relacionada ao
desenvolvimento da dependência e da sensibilização comportamental, parece que a
região Shell tem um papel predominante (Brenhouse & Stellar, 2006; Cruz et al.,
2015; McReynolds et al., 2018). Neste sentido, a ausência de diferença na
densidade de proteína c-FOS entre as sub-regiões do NAc neste projeto sugere

76
ausência do efeito de sensibilização comportamental ou da administração de
ayahuasca sobre a expressão de c-FOS.
Por fim, os resultados experimentais da sensibilização comportamental e da
expressão da imunorreatividade de c-Fos foram explorados pelo método de
mineração de dados “k-means”. O intuito de utilizar a mineração de dados para
analisar o grupo de resultados foi buscar nesse método o “clustering” dos resultados
e compará-los com os grupos originais, considerando os seis grupos experimentais,
o tratamento, ou a droga utilizada. Apesar da tentativa, os grupos gerados pelo
método não foram compatíveis com os grupos originais em todos os parâmetros
analisados, indicando que os resultados dos grupos não apresentam formatos de
“clusters” bem definidos, provavelmente pela alta heterogeneidade dos dados e alta
sobreposição dos intervalos de confiança dos grupos.
Uma das motivações da realização deste projeto foi a ampla quantidade de
evidências terapêuticas e que sugerem o benefício do chá de ayahuasca para ajudar
a combater a dependência de substâncias, em especial o álcool (Nunes et al., 2016;
Wiltenburg et al., 2021). Existe uma grande variedade de mecanismos fisiológicos e
psicológicos pelos quais a ayahuasca efetivamente pode interagir com a
dependência. O fato dos efeitos do chá de ayahuasca resultarem da ação sinérgica
de duas plantas complexas utilizadas na cocção, cada uma contendo alcaloides
próprios, provê uma grande variedade de mecanismos de ação diretos e indiretos,
tanto no sistema dopaminérgico quanto serotonérgico. Como visto anteriormente, o
DMT, pertencente à classe das triptaminas, parece ter seu papel terapêutico
compartilhado com os efeitos gerais dessa classe, aliado a algumas características
únicas, que vão além das triptaminas, como sua relação com os receptores Sigma-1.
Já os alcaloides β-carbolínicos apresentam características especiais e devem ser
estudados também de forma separada. Um bom exemplo é a harmina, que nos
últimos anos vem apresentando diversas evidências de sua potencialidade per se.
Para melhor avaliar o efeito e interação do chá de ayahuasca sobre o efeito
reforçador do etanol, é importante entender as hipóteses de como a ayahuasca
interage na dependência ao álcool. Liester & Prickett (2012) propõem uma
categorização dos mecanismos em que a ayahuasca atua sobre a dependência. Os
pesquisadores categorizaram os mecanismos da ayahuasca sobre a dependência
dentro de quatro teorias: bioquímica, fisiológica, psicológica e transcendental. Duas

77
destas teorias abrangem aspectos da psique humana e serão comentadas mais
superficialmente.
A teoria psicológica sugere que a ayahuasca trata a dependência por meio da
resolução de traumas, encorajando a compreensão do potencial de escolha e
aperfeiçoando as tomadas de decisão. Já a teoria transcendental sugere que a
ayahuasca trata a dependência por meio da experiência transcendental facilitada;
esses aspectos da experiência podem incluir visões de uma realidade espiritual,
alteração de noção do tempo e espaço, inefabilidade, insights intuitivos e
sentimentos de unidade com o universo. Este mesmo tipo de abordagem é utilizado
para explicar a ação de outras substâncias com efeito alucinógeno no tratamento da
dependência, como por exemplo a psilocibina (de Veen et al., 2017; Garcia-Romeu
et al., 2015). Apesar do foco deste trabalho residir em estudos experimentais in vivo
e in vitro, é importante a menção dessas teorias, pois outros estudos como o de
Barbosa et al., (2018) evidenciam a importância do contexto ritualístico acerca das
doutrinas sincréticas ayahuasqueiras.
Além desse ambiente, o efeito do chá sobre a psique é evidente para
qualquer usuário e faz parte fundamental deste processo terapêutico. É importante
ressaltar que esse processo é necessário para o ser humano e pode ajudar a
explicar o porquê de alguns trabalhos com animais não apresentarem respostas tão
fidedignas quanto as encontradas em humanos. Nesta linha, também é relevante
mencionar que o uso da ayahuasca sozinha, ou seja, sem as adequadas condições
internas do usuário (set) e do ambiente em que ele está inserido (setting), parece
estar associado com a ausência de resultados eficazes em diminuir a dependência
em humanos (Barbosa et al., 2018). Segundo Stanislav Grof, em seu último livro “O
Caminho do Psiconauta”, um ponto de virada decisivo no fracasso ou sucesso de
um experimento terapêutico depende criticamente de fatores extra-farmacológicos,
chamados de set and setting. Estes incluem quem administra a substância, a
personalidade do experienciador, a intenção e o propósito do experimento, o
ambiente interpessoal e físico, além do conjunto de pessoas envolvidas (Grof, 2020).
Diferente das duas primeiras teorias já comentadas, a teoria bioquímica e a
fisiológica apresentam grande correlação com estudos translacionais em animais e
in vitro. A primeira baseia-se em uma das teorias mais consolidadas sobre a
dependência, que é a capacidade de drogas com propriedades reforçadoras

78
aumentarem a liberação de dopamina na via mesolímbica e estimularem a busca por
esta droga com o intuito de reativar esta via. Essa ideia, revisada por Pierce &
Kumaresan, (2006), ainda sugere que a ativação dessa via é o mecanismo comum,
direta ou indiretamente, de todas as substâncias com potencial de abuso. Outros
nomes comumente utilizados para essa via são “via da recompensa” ou “circuito de
recompensa” e “via do prazer/circuito do prazer”. É importante ressaltar que essa
circuitaria é importante para o corpo humano e também está envolvida nos
mecanismos do prazer, motivação e recompensa (Koob, 2006; Volkow et al., 2019).
Algumas evidências sugerem que a ayahuasca tem a capacidade de reduzir
os níveis de dopamina na via mesolímbica, mediada pela sua ação sobre a
serotonina. Como visto previamente, o DMT é um potente agonista serotonérgico 5-
HT2A e as β-carbolinas também são agonistas parciais de 5-HT2A (Glennon et al.,
2000; McKenna & Towers, 1984). Estudos recentes mostram que a harmina é capaz
de atravessar a barreira hematoencefálica e também possui ação no SNC,
aumentando indiretamente, via inibição da MAO-A, a quantidade de serotonina
disponível na fenda sináptica (He et al., 2015).
O sistema serotonérgico tem um papel importante na comunicação celular
entre regiões encefálicas, tais como a associação entre córtex pré-frontal e
amígdala. Também tem um papel importante na mediação e regulação de estados
afetivos, comportamentos sociais e alguns mecanismos relacionados à dependência
(Wolf et al., 2018).
Aparentemente a estimulação de receptores 5-HT2A e 5-HT2C modula a
liberação de dopamina nas vias dopaminérgicas (mesolímbica, nigroestriatal e
mesocortical) (Sullivan et al., 2015). Essa modulação ocorre por alguns mecanismos;
um deles envolve a conexão direta entre neurônios dopaminérgicos e
serotonérgicos. Outro mecanismo conhecido envolve a ação indireta desta relação
pela mediação de interneurônios gabaérgicos. A ação da serotonina nos receptores
5-HT2A e 5-HT2C dos neurônios dopaminérgicos e a relação com a modulação da
liberação de dopamina não estão consolidadas. Aparentemente, agonistas de
receptores 5-HT2A e 5-HT2C induzem o aumento da liberação de dopamina (Howell &
Cunningham, 2015; Sari et al., 2011). Já a estimulação dos receptores
serotonérgicos pós-sinápticos parece excitar os interneurônios gabaérgicos, e

79
consequentemente esses neurônios inibem a liberação de dopamina (Howell &
Cunningham, 2015; Sari et al., 2011).
É possível que a ação inibidora pelos interneurônios gabaérgicos ocorra pela
ativação dos receptores 5-HT2C, que são expressos em maior quantidade nos
neurônios gabaérgicos (Howell & Cunningham, 2015). É interessante que o DMT
possui maior afinidade pelos receptores 5-HT2A, sendo assim, maiores doses de
DMT seriam necessárias para ativar ambos os receptores. Maiores doses também
poderiam ativar o receptor 5-HT1B, importante na inibição pré-sináptica.
Este fato pode ser uma limitação deste trabalho, pela baixa concentração de
DMT no chá utilizado. Apesar deste fato, é possível hipotetizar que a maior
concentração de harmalina no chá pode ter compensando a baixa concentração de
DMT e ajudado nos resultados de bloqueio da preferência condicionada ao lugar em
todas as doses testadas. Além disso, o mestre da união do Vegetal relatou que a
preparação utilizada neste estudo produziu os resultados esperados nas cerimônias
desempenhadas pela UDV. Contudo, nestas cerimônias, existe o envolvimento de
diversos fatores extra-farmacológicos e não se pode reduzir os efeitos observado em
humanos apenas a quantidade dos alcaloides presentes.
Esta teoria da redução dos níveis de dopamina cerebral também é sustentada
por evidências encontradas em estudos com membros dos grupos ayahuasqueiros.
McKenna et al. (1998) encontraram níveis aumentados de prolactina entre usuários
de ayahuasca. A dopamina é conhecida por ser um dos principais reguladores de
prolactina no organismo, pois a dopamina tem ação inibitória sobre a liberação de
prolactina. Existe uma hipótese de que, agonistas de receptores 5-HT2A/2c promovem
liberação de prolactina pelas glândulas pituitárias (Liester e Pricket 2012), indicando
que os altos níveis de prolactina encontrados nos usuários de ayahuasca se devem
a uma diminuição dos níveis de dopamina, e possivelmente pela ação agonista de
receptores 5-HT2A/2c. Esse efeito da ayahuasca nos neurônios dopaminérgicos
sugere a redução da ativação da circuitaria da recompensa no cérebro, diminuindo
os efeitos associados às substâncias com potencial adictivo.
É interessante que o possível potencial de diminuição de níveis de dopamina
em neurônios pós sinápticos pela ação conjunta do DMT e β-carbolinas também é
observada em drogas antipsicóticas. Medicamentos antipsicóticos têm sido
estudados para o tratamento de dependência pela capacidade de bloquearem

80
receptores dopaminérgicos na via mesolímbica (Ray et al., 2010). Antipsicóticos
atípicos aparentemente apresentam mecanismos de ação similares, afetando ambos
os sistemas de neurotransmissão – serotonérgico e dopaminérgico – gerando
propriedades anti-dependência (Sullivan et al., 2015).
Liester & Prickett (2012) também sugerem que existem três formas que os
neurônios dopaminérgicos podem ser influenciados. A primeira tendo maior
disponibilidade de DA liberada dos neurônios pré-sinápticos, a segunda pelo número
de receptores de dopamina em neurônios pós-sinápticos e, por fim, além da
quantidade de receptores de dopamina pós-sináptica, também é importante se
esses receptores estão disponíveis ou bloqueados por alguma substância. Essa
relação entre mecanismos complementares pode ajudar a explicar os diferentes
efeitos da ayahuasca e dos antipsicóticos clássicos e atípicos entre si.
A outra teoria hipotetizada pelos autores é a teoria fisiológica. Ainda no que
se refere à dopamina, esse neurotransmissor possui efeitos variados no sistema
nervoso central, dependo da região envolvida, dos tipos de receptores que estão
sendo ativados e da própria quantidade de dopamina disponível. Um exemplo é a
redução da síntese de dopamina na via nigro-estriatal e sua relação com a doença
de Parkinson. Já a diminuição no córtex pré frontal parece estar relacionada com
uma diminuição da atenção e hiperatividade (Stahl, 2008). De forma interessante, o
aumento dos níveis de dopamina pode amenizar tais efeitos, entretanto, o excesso
desse neurotransmissor pode levar a surtos psicóticos.
Na via mesolímbica, o papel da dopamina tem se mostrado associado à
plasticidade neural. Desta forma, a redução dos níveis de dopamina nesta via
interfere na plasticidade sináptica associada com o desenvolvimento e manutenção
da dependência.
No geral, os efeitos antidependência associados a ayahuasca, pelo menos
numa perspectiva farmacológica, são atrelados aos sistemas dopaminérgico e
serotonérgico. Contudo, é importante ressaltar que o efeito do chá não se reduz
apenas a esses dois sistemas e ainda existe um grande caminho a trilhar,
explorando outros sistemas e suas relações com o potencial antidependência. A
interação com os receptores Sigma 1 está relacionada a processos neuro
inflamatórios e merece maiores estudos em um futuro. Além disso, nos últimos anos
algumas pesquisas mostraram o potencial de neurogênese desempenhado por

81
psicodélicos, incluindo a ayahuasca (Morales-García et al., 2017; Murnane, 2018), e
este potencial também precisa ser melhor estudado e entendido.
Além do potencial antidependência amplamente discorrido neste trabalho,
estudos sugerem que a ayahuasca apresenta potencial terapêutico para transtornos
de ansiedade e depressão, além de um papel importante relacionado a memória
(dos Santos & Hallak, 2020; Wiltenburg et al., 2021). Estudos observacionais em
humanos sugerem que usuários adultos com consumo de longo-prazo de ayahuasca
apresentam melhora no aprendizado, memória e desempenho de funções
executivas quando comparados a grupos de controle que não usam o chá (Bouso et
al., 2012, 2015; Grob et al., 1996). Estudos com animais mostraram que o chá de
ayahuasca e suas β-carbolinas possuem características neuroprotetoras e podem
ser benéficos à memória, aprendizagem, e na melhora de seus déficits. Trabalhos
sugerem que a harmina melhorou a memória em vários modelos experimentais
como: tarefa de reconhecimento de objetos (Moura et al., 2006), teste de labirinto de
Morris (He et al., 2015b; Zhong et al., 2015) e teste de memória de curto-prazo
(Delayed-match-to-sample asymmetrical 3-choice task, sem tradução (Mennenga et
al., 2015).
Os resultados da sensibilização comportamental, apesar de serem distintos
do esperado, mostraram uma pequena recuperação do grupo que recebeu a maior
dose de ayahuasca associada ao etanol nos parâmetros de taxa de exploração e
tempo de permanência na zona central da arena. O aumento do tempo de
permanência na zona central e na taxa de exploração deste grupo no último dia
experimental, apesar de pouco conclusivo, pode estar relacionado a um potencial
ansiolítico e benéfico para a memória da ayahuasca. No entanto, esta possibilidade
precisa ser melhor estudada já que o modelo de sensibilização comportamental
usado no nosso estudo não tinha este objetivo e não produziu o resultado esperado,
no que se refere a indução de sensibilização pelo etanol.
Por fim, a presente pesquisa, dentro de suas limitações, parece corroborar a
ideia de que o chá de ayahuasca pode sim ter um potencial terapêutico na
dependência de etanol, dada pelo bloqueio da ayahuasca sobre a preferência
condicionada ao lugar induzida por etanol. Contudo, a heterogeneidade de
resultados observada, tanto em humanos quanto nos animais, enaltece a
necessidade de um ambiente de utilização adequado e maiores estudos em

82
ambientes controlados para aumentar o leque e arcabouço de conhecimento sobre
esta substância.

83
 6. CONCLUSÕES

Os resultados encontrados nesta pesquisa, permitiram concluir que:

1. A quantidade de alcaloides presentes no chá de ayahuasca empregado

está de acordo com o encontrado na literatura, apesar de considerarmos uma
baixa concentração de DMT. Não foi identificado traços de etanol nas
amostras avaliadas.

2. As amostras empregadas (chá e liofilizado) apresentaram inibição sobre a

enzima monoaminaoxidase tipo A, conforme esperado.

3. Com base em nossa triagem inicial e na literatura científica, o chá se

mostrou relativamente seguro com doses de até 1950 mg/kg, ao menos numa
perspectiva toxicológica. Apenas doses expressivamente superiores às
utilizadas nos rituais das doutrinas sincréticas foram capazes de alterar
características fisiológicas aparentes nos animais.

4. A ayahuasca foi capaz de bloquear a preferência condicionada ao lugar

induzida por etanol em todas as doses testadas sugerindo um potencial efeito
anti-dependência, que, no entanto, precisa ser melhor investigado.

5. O efeito da sensibilização comportamental não pode ser observado, apesar

dos resultados obtidos apresentarem alguns efeitos pontuais. Tais resultados,
ainda que diferentes do esperado, podem ser explicados por limitações no
protocolo utilizado.

6. O protocolo crônico de sensibilização comportamental não produziu

diferenças significativas na imunorreatividade da proteína c-Fos nas regiões
analisadas.

Em resumo, os resultados deste estudo, apesar de modestos, corroboram

com a literatura quanto ao potencial do uso do chá de ayahuasca no tratamento do
alcoolismo. Contudo, é importante ressaltar a importância de outros estudos com
84
diferentes paradigmas experimentais, além de diferentes concentrações dos
alcaloides presentes no chá e ambientes controlados, tanto para estudos pré-
clínicos quanto clínicos. Por fim, sugere-se que outros estudos devem ser
conduzidos para melhor entender a dinâmica entre os efeitos farmacológicos e
extra-farmacológicos (como o set and settings) das substâncias psicodélicas, em
especial a ayahuasca, além de estudos investigativos utilizando a ayahuasca per se
a fim de melhor entender os mecanismos de ação celulares e moleculares da
ayahuasca.

85
 7. REFERÊNCIAS

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101
 8. APÊNDICE

8.1 Critérios CID-10 e DSM

Retirados de SENAD (2017)

Pelo CID-10 a dependência é caracterizada se pelo menos três das
características a seguir forem exibidas pelo indivíduo nos últimos 12 meses:
1. Forte desejo ou senso de compulsão para consumir a substância;
2. Dificuldades em controlar o comportamento de consumir a substância, em
termos de início, término e níveis de consumo;
3. Estado de abstinência fisiológica, quando o uso da substância cessou ou
foi reduzido, como evidenciado por síndrome de abstinência característica para a
substância, ou o uso da mesma substância com a intenção de aliviar ou evitar
sintomas de abstinência;
4. Evidência de tolerância, de tal forma que doses crescentes da substância
psicoativa são requeridas para alcançar efeitos originalmente produzidos por doses
mais baixas;
5. Abandono progressivo de prazeres e interesses alternativos, em favor do
uso da substância psicoativa, aumento da quantidade de tempo necessário para
obter ou ingerir a substância ou para se recuperar de seus efeitos;
6. Persistência no uso da substância, a despeito de evidência clara de
consequências manifestamente nocivas, tais como: danos ao fígado por consumo
excessivo de bebidas alcoólicas; estados de humor depressivos, consequentes a
períodos de consumo excessivo da substância; ou comprometimento do
funcionamento cognitivo relacionado à droga. Nesse caso, deve-se fazer esforço
para determinar se o usuário estava realmente (ou se poderia esperar que
estivesse) consciente da natureza e extensão do dano.

Segundo o DSM, o usuário é considerado dependente se manifestar ao

menos duas das seguintes características, ocorrendo durante um período de 12
meses:
1. Tolerância, definida por qualquer um dos seguintes aspectos: necessidade
de quantidades progressivamente maiores da substância para atingir a intoxicação

102
ou o efeito desejado; acentuada redução do efeito com o uso continuado da mesma
quantidade de substância;
2. Síndrome de abstinência, manifestada por qualquer um dos seguintes
aspectos: síndrome de abstinência característica para a substância; a mesma
substância (ou uma substância estreitamente relacionada) é consumida para aliviar
ou evitar sintomas de abstinência;
3. Existe um desejo persistente ou esforços mal sucedidos no sentido de
reduzir ou controlar o uso da substância;
4. A substância é frequentemente consumida em maiores quantidades ou por
um período mais longo do que o pretendido;
5. Muito tempo é gasto em atividades necessárias para a obtenção da
substância, na utilização ou na recuperação de seus efeitos;
6. Fissura ou um forte desejo ou necessidade de usar a substância;
7. Uso recorrente da substância, resultando no fracasso em desempenhar
papéis importantes no trabalho, na escola ou em casa;
8. Uso continuado da substância, apesar de problemas sociais ou
interpessoais persistentes ou recorrentes causados ou exacerbados por seus
efeitos;
9. Importantes atividades sociais, profissionais ou recreacionais são
abandonadas ou reduzidas em virtude do uso da substância;
10. Uso recorrente da substância em situações nas quais isso representa
perigo para a integridade física;
11. O uso da substância é mantido apesar da consciência de ter um problema
físico ou psicológico persistente ou recorrente que tende a ser causado ou
exacerbado pelo uso da mesma.

103
 8.2 Material complementar Rota-Rod

Descritivos dos dados do Rota-Rod

Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados do rota-rod.

Descriptives

Grupo 0Min 45Min 90Min 180Min

Mean Controle 41.0 53.0 48.4 48.4

AC650 48.3 36.6 42.6 46.0
AL650 51.1 37.3 37.3 32.0
AL3560 41.9 33.3 32.6 33.1
AL5000 46.6 14.1 33.1 44.1

Standard deviation Controle 13.0 11.6 14.0 12.2

AC650 15.5 20.4 23.1 21.5
AL650 12.7 17.7 18.8 19.7
AL3560 13.5 21.5 20.2 25.9
AL5000 13.6 8.73 16.6 15.6

Shapiro-Wilk p Controle 0.590 0.003 0.108 0.138

AC650 0.023 0.427 0.022 0.009
AL650 0.014 0.704 0.385 0.347
AL3560 0.117 0.263 0.332 0.039
AL5000 0.143 0.646 0.942 0.313

ANOVA de medidas repetidas seguido de post hoc de Tukey

Tabela da Anova de medidas repetidas considerando os quatro momentos em que os animais eram
testados na barra giratória (Tempo) e os grupos experimentais: água (CTRL), chá de ayahuasca (AC) na dose de 650
mg/kg ou ayahuasca liofilizada (AL) nas doses de 650, 3560 e 5000 mg/kg.

Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

Tempo 2161 3 720 5.18 0.002

Tempo ✻ Grupo 5313 12 443 3.19 < .001
Residual 12507 90 139

Note. Type 3 Sums of Squares

104
Tabela post hoc da Anova de medidas repetidas. Comparação dos diferentes grupos no mesmo tempo e mesmo
grupo nos diferentes tempos por Tukey..

Tempo Grupo Tempo Grupo Mean Difference SE df t ptukey

0Min CTRL - 0Min AC650 -7.286 7.32 30.0 -0.9953 1.000

- 0Min AL650 -10.143 7.32 30.0 -1.3855 0.996

- 0Min AL3560 -0.857 7.32 30.0 -0.1171 1.000

- 0Min AL5000 -5.571 7.32 30.0 -0.7611 1.000

- 45Min CTRL -12.000 5.68 30.0 -2.1120 0.827

- 90Min CTRL -7.429 6.52 30.0 -1.1401 1.000

- 180Min CTRL -7.429 6.40 30.0 -1.1613 1.000

AC650 - 0Min AL650 -2.857 7.32 30.0 -0.3903 1.000

- 0Min AL3560 6.429 7.32 30.0 0.8782 1.000

- 0Min AL5000 1.714 7.32 30.0 0.2342 1.000

- 45Min AC650 11.714 5.68 30.0 2.0617 0.851

- 90Min AC650 5.714 6.52 30.0 0.8770 1.000

- 90Min AL650 11.000 8.79 30.0 1.2509 0.999

- 180Min AC650 2.286 6.40 30.0 0.3573 1.000

AL650 - 0Min AL3560 9.286 7.32 30.0 1.2685 0.998

- 0Min AL5000 4.571 7.32 30.0 0.6245 1.000

- 45Min AL650 13.857 5.68 30.0 2.4388 0.632

- 90Min AL650 13.857 6.52 30.0 2.1268 0.819

- 180Min AL650 19.143 6.40 30.0 2.9925 0.297

AL3560 - 0Min AL5000 -4.714 7.32 30.0 -0.6440 1.000

- 45Min AL3560 8.571 5.68 30.0 1.5085 0.989

- 90Min AL3560 9.286 6.52 30.0 1.4252 0.994

- 180Min AL3560 8.714 6.40 30.0 1.3623 0.997

< .00
AL5000 - 45Min AL5000 32.429 5.68 30.0 5.7073
1

- 90Min AL5000 13.429 6.52 30.0 2.0610 0.851

- 180Min AL5000 2.429 6.40 30.0 0.3797 1.000

45Min CTRL - 45Min AC650 16.429 8.96 30.0 1.8336 0.936

- 45Min AL650 15.714 8.96 30.0 1.7538 0.956

- 45Min AL3560 19.714 8.96 30.0 2.2003 0.779

- 45Min AL5000 38.857 8.96 30.0 4.3368 0.016

- 90Min CTRL 4.571 5.93 30.0 0.7715 1.000

- 180Min CTRL 4.571 7.64 30.0 0.5981 1.000

AC650 - 45Min AL650 -0.714 8.96 30.0 -0.0797 1.000

- 45Min AL3560 3.286 8.96 30.0 0.3667 1.000

- 45Min AL5000 22.429 8.96 30.0 2.5032 0.590

- 90Min AC650 -6.000 5.93 30.0 -1.0126 1.000

- 180Min AC650 -9.429 7.64 30.0 -1.2336 0.999

AL650 - 45Min AL3560 4.000 8.96 30.0 0.4464 1.000

- 45Min AL5000 23.143 8.96 30.0 2.5829 0.538

- 90Min AL650 -1.11e−15 5.93 30.0 -1.87e−16 1.000

- 180Min AL650 5.286 7.64 30.0 0.6916 1.000

AL3560 - 45Min AL5000 19.143 8.96 30.0 2.1365 0.814

- 90Min AL3560 0.714 5.93 30.0 0.1205 1.000

- 180Min AL3560 0.143 7.64 30.0 0.0187 1.000

AL5000 - 90Min AL5000 -19.000 5.93 30.0 -3.2065 0.203

- 180Min AL5000 -30.000 7.64 30.0 -3.9251 0.044

90Min CTRL - 90Min AC650 5.857 10.05 30.0 0.5826 1.000

- 90Min AL650 11.143 10.05 30.0 1.1084 1.000

105
Tempo Grupo Tempo Grupo Mean Difference SE df t ptukey

- 90Min AL3560 15.857 10.05 30.0 1.5774 0.983

- 90Min AL5000 15.286 10.05 30.0 1.5205 0.988

- 180Min CTRL -1.42e−14 5.39 30.0 -2.64e−15 1.000

AC650 - 90Min AL650 5.286 10.05 30.0 0.5258 1.000

- 90Min AL3560 10.000 10.05 30.0 0.9947 1.000

- 90Min AL5000 9.429 10.05 30.0 0.9379 1.000

- 180Min AC650 -3.429 5.39 30.0 -0.6361 1.000

AL650 - 90Min AL3560 4.714 10.05 30.0 0.4689 1.000

- 90Min AL5000 4.143 10.05 30.0 0.4121 1.000

- 180Min AL650 5.286 5.39 30.0 0.9807 1.000

AL3560 - 90Min AL5000 -0.571 10.05 30.0 -0.0568 1.000

- 180Min AL3560 -0.571 5.39 30.0 -0.1060 1.000

AL5000 - 180Min AL5000 -11.000 5.39 30.0 -2.0408 0.861

180Min CTRL - 180Min AC650 2.429 10.45 30.0 0.2324 1.000

- 180Min AL650 16.429 10.45 30.0 1.5724 0.984

- 180Min AL3560 15.286 10.45 30.0 1.4631 0.992

- 180Min AL5000 4.286 10.45 30.0 0.4102 1.000

AC650 - 180Min AL650 14.000 10.45 30.0 1.3400 0.997

- 180Min AL3560 12.857 10.45 30.0 1.2306 0.999

- 180Min AL5000 1.857 10.45 30.0 0.1778 1.000

AL650 - 180Min AL3560 -1.143 10.45 30.0 -0.1094 1.000

- 180Min AL5000 -12.143 10.45 30.0 -1.1622 1.000

AL3560 - 180Min AL5000 -11.000 10.45 30.0 -1.0529 1.000

Distribuição em gráfico de violino do tempo de permanência (segundos) na barra giratória (12 RPM) de
camundongos administrados por via oral com água (controle), chá de ayahuasca (AC) na dose de 650 mg/kg ou ayahuasca
liofilizada (AL) nas doses de 650, 3560 e 5000 mg/kg. Cada ponto representa a média do grupo no tempo. barra vertical
representa a média do grupo.

106
 8.3 Material complementar PCL

Descritivos dos dados PCL

Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados do PCL.

NãoPareado-PréTeste = Tempo bruto lado não pareado antes do condicionamento com etanol,
Pareado-PréTeste = Tempo bruto lado pareado antes do condicionamento com etanol, NãoPareado-PósTeste =
Tempo bruto lado não pareado depois do condicionamento com etanol, Pareado-PósTeste = Tempo bruto lado
pareado antes do condicionamento com etanol, TaxCresc.NãoPar.Pós/Pré = Taxa de crescimento do lado não
pareado do préTeste para o pósTeste, TaxCresc.Par.Pós/Pré = Taxa de crescimento do lado pareado do
préTeste para o pósTeste,, DiferençaPréTrat = diferença no tempo bruto do lado pareado com lado não pareado
no préTeste, DiferençaPósTrat = diferença no tempo bruto do lado pareado com lado não pareado no pósTeste,

Teste t de student
Pré - Teste Pós - Teste
Grupo Teste p value Grupo Teste P value
Controle Student's t 0.532 Controle Student's t 0.046
Aya 130 Student's t 0.287 Aya 130 Student's t 0.802
Aya 650 Student's t 0.824 Aya 650 Student's t 0.940
Aya Chá Student's t 0.223 Aya Chá Student's t 0.085
Aya 1950 Student's t 0.535 Aya 1950 Student's t 0.916
Tabelas com os valores de p do teste t pareado comparando o tempo bruto no lado não-pareado com o lado
pareado no período Pré e Pós-Teste; teste de hipótese M1≠M2

ANOVA de uma via seguido de post hoc de Tukey

Além da análise do tempo bruto no lado pareado e não pareado, foram

utilizados manipulações das variáveis depentendes, tais como: Taxa de crescimento

107
do período pré-teste para o período pós-teste no compartimento Não pareado
(TaxCresc.NãoPar.Pós/Pré) e Pareado (TaxCresc.Par.Pós/Pré); diferença no tempo
de permanência entre o ambiente Não Pareado e Pareado no período Pré-Teste
(DiferençaPréTrat) e Pós-Teste (DiferençaPósTrat).
A seguir encontra-se todas as análises da ANOVA e em seguida os testes
post hoc de Tukey para comparação entre os grupos. A ANOVA só foi significativa
na Taxa de crescimento no lado pareado do PósTeste em relação ao PréTeste,
contudo não foi encontrado diferença entre os grupos pelo post hoc de Tukey

Tabela com valores das ANOVAS

108
109
 8.4 Material complementar sensibilização comportamental – Distância
percorrida

Descritivos dos dados Distância percorrida

Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados da distância percorrida.

ANOVA de medidas repetidas seguido de post hoc de Tukey

Tabela da ANOVA de medidas repetidas seguida de Tukey (n = 6-8/grupo), distância percorrida (milímetros) na
arena de campo aberto de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA)
nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p. com salina 0,9% (SAL) ou etanol 2,0 g/kg (EtOH).

Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

Dia 2.69e+9 4 6.73e+8 23.118 < .001

Dia ✻ Grupo 5.42e+8 20 2.71e+7 0.931 0.550

Residual 4.19e+9 144 2.91e+7

Note. Type 3 Sums of Squares

110
 Foi mantido na tabela apenas os valores estatisticamente significativos.

Post Hoc Comparisons - Dia ✻ Grupo

Comparison

Dia Grupo Dia Grupo Mean Difference SE df t ptukey

Basal AYA650-SAL - Dia 05 AYA650-SAL 11229.2 2629 36.0 4.27083 0.030

- Dia 14 AYA650-SAL 10924.4 1925 36.0 5.67570 < .001

AYA650-EtOH - Dia 14 AYA650-EtOH 10369.1 2058 36.0 5.03929 0.004

Descritivos dos dados da taxa de crescimento da distância percorrida

Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados da taxa de crescimento da
distância percorrida.

Tabela da ANOVA de medidas repetidas seguida de Tukey (n = 6-8/grupo), taxa de crescimento distância
percorrida (porcentagem) na arena de campo aberto de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e
ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p. com salina 0,9% (SAL) ou etanol 2,0 g/kg
(EtOH).

Foi mantido na tabela apenas os valores estatisticamente significativos.

Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

Dia 107123 3 35708 18.74 < .001

Dia ✻ Grupo 36844 15 2456 1.29 0.223

Residual 188590 99 1905

Note. Type 3 Sums of Squares

Post Hoc Comparisons - Dia ✻ Grupo

Comparison

Dia Grupo Dia Grupo Mean Difference SE df t ptukey

Dia.01/Basal AYA1950-EtOH - Dia.09/05 AYA1950-EtOH -138.971 29.6 33.0 -4.7029 0.007

111
 ANOVA de uma via seguido de post hoc de Tukey

Tabela das anovas de uma via seguidas de teste de Tukey. Foi considerado a comparação dos
diferentes grupos experimentais considerando a taxa de crescimento do dia 01 e dia 14 em relação ao dia basal
e taxa de crescimento do dia 14 em relação ao dia 01.

112
 Taxa de crescimento (porcentagem) da distância percorrida na arena de campo aberto de camundongos
administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p com
salina 0,9% (SAL) e etanol 2,0 g/kg (EtOH). As caixas representam as médias e as barras os mínimos e máximos. *, # p<0,05
– estatisticamente diferente entre grupos. ANOVA de medidas repetidas seguida de Tuckey (n = 6-8/grupo).

113
 8.5 Material complementar sensibilização comportamental – Taxa de
exploração

Descritivos dos dados Taxa de exploração

Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados da taxa de exploração.

ANOVA de medidas repetidas seguido de post hoc de Tukey

Tabela da ANOVA de medidas repetidas seguida de Tukey (n = 6-8/grupo), taxa de exploração na arena de
campo aberto de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses
de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p. com salina 0,9% (SAL) ou etanol 2,0 g/kg (EtOH). Foi mantido na tabela apenas os
valores estatisticamente significativos.

Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

Dia 11951 4 2988 10.09 < .001

Dia ✻ Grupo 10448 20 522 1.76 0.031

Residual 39089 132 296

Note. Type 3 Sums of Squares

Post Hoc Comparisons - Dia ✻ Grupo

Comparison

Dia Grupo Dia Grupo Mean Difference SE df t ptukey

Basal AYA1950-EtOH - Dia 01 AYA1950-EtOH 41.5263 6.34 33.0 6.55238 < .001

AYA1950-SAL - Dia 01 AYA1950-SAL 36.6033 7.32 33.0 5.00182 0.005

Descritivos dos dados da taxa de crescimento da taxa de exploração

114
 Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados da taxa de crescimento da
taxa de exploração

ANOVA de uma via seguido de post hoc de Tukey

Tabela das anovas de uma via seguidas de teste de Tukey. Foi considerado a comparação dos
diferentes grupos experimentais considerando a taxa de crescimento do dia 01 e dia 14 em relação ao dia basal
e taxa de crescimento do dia 14 em relação ao dia 01.

One-Way ANOVA (Fisher's)

F df1 df2 p

Tx.Explor.01/Basal 3.679 5 37 0.008

Tx.Explor.14/Basal 0.676 5 38 0.644

Tx.Explor.14/01 2.705 5 37 0.035

115
116
Taxa de exploração (porcentagem) arena de campo aberto de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e
ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p com salina 0,9% (SAL) e etanol 2,0 g/kg (EtOH). As
colunas representam as médias e as barras o intervalo de confiança dos dados. * p <0,05 – estatisticamente do grupo
marcado. ANOVA de medidas repetidas seguida de Tuckey (n = 6-8/grupo).

8.6 Material complementar sensibilização comportamental – Tempo de

permanência nas zonas da arena

Descritivos dos dados tempo de permanência

Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados do tempo de permanência
nas zonas da arena.

117
 ANOVA de medidas repetidas seguido de post hoc de Tukey

Tabela da ANOVA de medidas repetidas seguida de Tukey (n = 6-8/grupo), tempo de permanência na zona
central na arena de campo aberto de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca
liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p. com salina 0,9% (SAL) ou etanol 2,0 g/kg (EtOH).

Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

Dia 134323 4 33581 53.56 < .001

Dia ✻
22384 20 1119 1.78 0.031
Grupo

Residual 67719 108 627

Note. Type 3 Sums of Squares

Post Hoc Comparisons - Dia ✻ Grupo

Comparison

Dia Grupo Dia Grupo Mean Difference SE df t ptukey

Basal AGUA-EtOH - Basal AGUA-SAL 37.1250 26.98 27.0 1.37623 1.000

- Basal AYA650-EtOH 17.2500 28.44 27.0 0.60664 1.000

- Basal AYA650-SAL 48.9500 29.55 27.0 1.65648 0.995

- Basal AYA1950-EtOH 20.9500 29.55 27.0 0.70895 1.000

- Basal AYA1950-SAL 59.9500 29.55 27.0 2.02872 0.950

- Dia 01 AGUA-EtOH 99.2500 22.06 27.0 4.49824 0.024

- Dia 05 AGUA-EtOH 107.5000 24.36 27.0 4.41239 0.029

- Dia 09 AGUA-EtOH 111.7500 24.39 27.0 4.58150 0.019

- Dia 14 AGUA-EtOH 113.7500 24.08 27.0 4.72388 0.014

AGUA-SAL - Basal AYA650-EtOH -19.8750 23.79 27.0 -0.83542 1.000

- Basal AYA650-SAL 11.8250 25.11 27.0 0.47087 1.000

- Basal AYA1950-EtOH -16.1750 25.11 27.0 -0.64408 1.000

- Basal AYA1950-SAL 22.8250 25.11 27.0 0.90888 1.000

- Dia 01 AGUA-SAL 37.6250 15.60 27.0 2.41159 0.801

- Dia 05 AGUA-SAL 48.1250 17.23 27.0 2.79352 0.567

- Dia 09 AGUA-SAL 59.7500 17.25 27.0 3.46428 0.208

- Dia 14 AGUA-SAL 70.7500 17.03 27.0 4.15518 0.051

AYA650-EtOH - Basal AYA650-SAL 31.7000 26.67 27.0 1.18840 1.000

- Basal AYA1950-EtOH 3.7000 26.67 27.0 0.13871 1.000

- Basal AYA1950-SAL 42.7000 26.67 27.0 1.60078 0.997

- Dia 01 AYA650-EtOH 89.1667 18.02 27.0 4.94949 0.008

- Dia 05 AYA650-EtOH 96.1667 19.89 27.0 4.83432 0.011

- Dia 09 AYA650-EtOH 94.6667 19.92 27.0 4.75339 0.013

- Dia 14 AYA650-EtOH 94.5000 19.66 27.0 4.80646 0.011

AYA650-SAL - Basal AYA1950-EtOH -28.0000 27.86 27.0 -1.00500 1.000

- Basal AYA1950-SAL 11.0000 27.86 27.0 0.39482 1.000

- Dia 01 AYA650-SAL 45.8000 19.73 27.0 2.32077 0.847

- Dia 05 AYA650-SAL 59.6000 21.79 27.0 2.73506 0.605

- Dia 09 AYA650-SAL 57.2000 21.82 27.0 2.62187 0.678

- Dia 14 AYA650-SAL 64.4000 21.54 27.0 2.99012 0.444

AYA1950-
- Basal AYA1950-SAL 39.0000 27.86 27.0 1.39982 1.000
EtOH

- Dia 01 AYA1950-EtOH 91.6000 19.73 27.0 4.64154 0.017

- Dia 05 AYA1950-EtOH 70.0000 21.79 27.0 3.21232 0.319

- Dia 09 AYA1950-EtOH 90.2000 21.82 27.0 4.13449 0.054

- Dia 14 AYA1950-EtOH 52.0000 21.54 27.0 2.41438 0.800

AYA1950-SAL - Dia 01 AYA1950-SAL 53.0000 19.73 27.0 2.68561 0.637

118
 Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

- Dia 05 AYA1950-SAL 47.4000 21.79 27.0 2.17520 0.907

- Dia 09 AYA1950-SAL 47.4000 21.82 27.0 2.17267 0.908

- Dia 14 AYA1950-SAL 43.6000 21.54 27.0 2.02437 0.951

Dia 01 AGUA-EtOH - Dia 01 AGUA-SAL -24.5000 12.43 27.0 -1.97125 0.962

- Dia 01 AYA650-EtOH 7.1667 13.10 27.0 0.54703 1.000

- Dia 01 AYA650-SAL -4.5000 13.61 27.0 -0.33052 1.000

- Dia 01 AYA1950-EtOH 13.3000 13.61 27.0 0.97687 1.000

- Dia 01 AYA1950-SAL 13.7000 13.61 27.0 1.00625 1.000

- Dia 05 AGUA-EtOH 8.2500 15.19 27.0 0.54325 1.000

- Dia 09 AGUA-EtOH 12.5000 12.72 27.0 0.98235 1.000

- Dia 14 AGUA-EtOH 14.5000 12.34 27.0 1.17500 1.000

AGUA-SAL - Dia 01 AYA650-EtOH 31.6667 10.96 27.0 2.88902 0.506

- Dia 01 AYA650-SAL 20.0000 11.57 27.0 1.72854 0.991

- Dia 01 AYA1950-EtOH 37.8000 11.57 27.0 3.26695 0.292

- Dia 01 AYA1950-SAL 38.2000 11.57 27.0 3.30152 0.276

- Dia 05 AGUA-SAL 10.5000 10.74 27.0 0.97779 1.000

- Dia 09 AGUA-SAL 22.1250 9.00 27.0 2.45897 0.775

- Dia 14 AGUA-SAL 33.1250 8.73 27.0 3.79614 0.110

AYA650-EtOH - Dia 01 AYA650-SAL -11.6667 12.29 27.0 -0.94930 1.000

- Dia 01 AYA1950-EtOH 6.1333 12.29 27.0 0.49906 1.000

- Dia 01 AYA1950-SAL 6.5333 12.29 27.0 0.53161 1.000

- Dia 05 AYA650-EtOH 7.0000 12.40 27.0 0.56453 1.000

- Dia 09 AYA650-EtOH 5.5000 10.39 27.0 0.52937 1.000

- Dia 14 AYA650-EtOH 5.3333 10.08 27.0 0.52932 1.000

AYA650-SAL - Dia 01 AYA1950-EtOH 17.8000 12.84 27.0 1.38670 1.000

- Dia 01 AYA1950-SAL 18.2000 12.84 27.0 1.41786 0.999

- Dia 05 AYA650-SAL 13.8000 13.58 27.0 1.01596 1.000

- Dia 09 AYA650-SAL 11.4000 11.38 27.0 1.00165 1.000

- Dia 14 AYA650-SAL 18.6000 11.04 27.0 1.68515 0.994

AYA1950-
- Dia 01 AYA1950-SAL 0.4000 12.84 27.0 0.03116 1.000
EtOH

- Dia 05 AYA1950-EtOH -21.6000 13.58 27.0 -1.59020 0.997

- Dia 09 AYA1950-EtOH -1.4000 11.38 27.0 -0.12301 1.000

- Dia 14 AYA1950-EtOH -39.6000 11.04 27.0 -3.58774 0.166

AYA1950-SAL - Dia 05 AYA1950-SAL -5.6000 13.58 27.0 -0.41227 1.000

- Dia 09 AYA1950-SAL -5.6000 11.38 27.0 -0.49204 1.000

- Dia 14 AYA1950-SAL -9.4000 11.04 27.0 -0.85164 1.000

Dia 14 AGUA-EtOH - Dia 14 AGUA-SAL -5.8750 8.70 27.0 -0.67541 1.000

- Dia 14 AYA650-EtOH -2.0000 9.17 27.0 -0.21813 1.000

- Dia 14 AYA650-SAL -0.4000 9.53 27.0 -0.04198 1.000

- Dia 14 AYA1950-EtOH -40.8000 9.53 27.0 -4.28184 0.039

- Dia 14 AYA1950-SAL -10.2000 9.53 27.0 -1.07046 1.000

AGUA-SAL - Dia 14 AYA650-EtOH 3.8750 7.67 27.0 0.50513 1.000

- Dia 14 AYA650-SAL 5.4750 8.10 27.0 0.67611 1.000

- Dia 14 AYA1950-EtOH -34.9250 8.10 27.0 -4.31292 0.036

- Dia 14 AYA1950-SAL -4.3250 8.10 27.0 -0.53410 1.000

AYA650-EtOH - Dia 14 AYA650-SAL 1.6000 8.60 27.0 0.18602 1.000

- Dia 14 AYA1950-EtOH -38.8000 8.60 27.0 -4.51099 0.023

- Dia 14 AYA1950-SAL -8.2000 8.60 27.0 -0.95335 1.000

AYA650-SAL - Dia 14 AYA1950-EtOH -40.4000 8.98 27.0 -4.49705 0.024

- Dia 14 AYA1950-SAL -9.8000 8.98 27.0 -1.09087 1.000

119
 Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

AYA1950-
- Dia 14 AYA1950-SAL 30.6000 8.98 27.0 3.40618 0.231
EtOH

ANOVA de medidas repetidas seguido de post hoc de Tukey

Tabela da ANOVA de medidas repetidas seguida de Tukey (n = 6-8/grupo), tempo de permanência na zona
periférica (externa) na arena de campo aberto de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e
ayahuasca liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p. com salina 0,9% (SAL) ou etanol 2,0 g/kg
(EtOH). Foi mantido na tabela apenas os valores estatisticamente significativos.
Within Subjects Effects

Sum of Squares df Mean Square F p

Dia 161937 4 40484 42.45 < .001

Dia ✻ Grupo 23540 20 1177 1.23 0.241

Residual 102990 108 954

Note. Type 3 Sums of Squares

Post Hoc Comparisons - Dia ✻ Grupo

Comparison

Dia Grupo Dia Grupo Mean Difference SE df t ptukey

Basal AGUA-EtOH - Dia 14 AGUA-EtOH -106.600 23.88 27.0 -4.46362 0.026

AYA650-SAL - Dia 01 AYA650-SAL -92.833 22.12 27.0 -4.19675 0.047

- Dia 09 AYA650-SAL -103.000 24.34 27.0 -4.23216 0.043

- Dia 14 AYA650-SAL -107.167 21.80 27.0 -4.91565 0.009

Dia 14 AGUA-EtOH - Dia 14 AYA1950-EtOH 44.200 7.74 27.0 5.70704 0.001

AGUA-SAL - Dia 14 AYA1950-EtOH 38.900 6.98 27.0 5.57220 0.002

AYA650-EtOH - Dia 14 AYA1950-EtOH 43.400 8.21 27.0 5.28326 0.004

AYA650-SAL - Dia 14 AYA1950-EtOH 44.400 7.42 27.0 5.98778 < .001

AYA1950-EtOH - Dia 14 AYA1950-SAL -35.200 7.74 27.0 -4.54497 0.021

120
 8.7 Material complementar imunorreatividade c-Fos

Descritivos dos dados da imunorreatividade do c-Fos

Tabela contendo média, desvio padrão e teste de Shapiro-Wilk dos dados da imunorreatividade do c-
Fos

ANOVA de medidas repetidas seguido de post hoc de Tukey

Tabela da ANOVA de medidas repetidas para a imunorreatividade de c-Fos (núcleos/mm²) na

região do Núcleo accumbens de camundongos administrados por via oral com água (AGUA) e ayahuasca
liofilizada (AYA) nas doses de 650 e 1950 mg/kg e por via i.p com salina 0,9% (SAL) e etanol 2,0 g/kg (EtOH) e
que passaram pelo protocolo de sensibilização comportamental.

Sum of Squares df Mean Square F p

Região NAc 109520 1 109520 62.347 < .001

Região NAc ✻ Grupo 5787 5 1157 0.659 0.657

Residual 56212 32 1757

Note. Type 3 Sums of Squares

Post Hoc Comparisons - Região NAc ✻ Grupo

Comparison

Região NAc Grupo Região NAc Grupo Mean Difference SE df t ptukey

NAc Core AGUA-EtOH - NAc Core AGUA-SAL -45.69 23.8 32.0 -1.923 0.737

- NAc Core AYA1950-EtOH -29.77 23.8 32.0 -1.253 0.980

- NAc Core AYA1950-SAL -62.07 24.7 32.0 -2.517 0.366

121
Post Hoc Comparisons - Região NAc ✻ Grupo

Comparison

Região NAc Grupo Região NAc Grupo Mean Difference SE df t ptukey

- NAc Core AYA650-EtOH -6.80 23.8 32.0 -0.286 1.000

- NAc Core AYA650-SAL -9.95 25.9 32.0 -0.385 1.000

- Nac Shell AGUA-EtOH -72.92 24.2 32.0 -3.013 0.151

AGUA-SAL - NAc Core AYA1950-EtOH 15.92 22.8 32.0 0.697 1.000

- NAc Core AYA1950-SAL -16.38 23.8 32.0 -0.689 1.000

- NAc Core AYA650-EtOH 38.89 22.8 32.0 1.703 0.854

- NAc Core AYA650-SAL 35.74 25.0 32.0 1.429 0.949

- Nac Shell AGUA-SAL -105.08 22.4 32.0 -4.691 0.002

AYA1950-EtOH - NAc Core AYA1950-SAL -32.30 23.8 32.0 -1.359 0.963

- NAc Core AYA650-EtOH 22.97 22.8 32.0 1.006 0.996

- NAc Core AYA650-SAL 19.81 25.0 32.0 0.792 1.000

- Nac Shell AYA1950-EtOH -73.65 22.4 32.0 -3.288 0.085

AYA1950-SAL - NAc Core AYA650-EtOH 55.27 23.8 32.0 2.326 0.480

- NAc Core AYA650-SAL 52.12 25.9 32.0 2.015 0.681

- Nac Shell AYA1950-SAL -46.28 24.2 32.0 -1.912 0.743

AYA650-EtOH - NAc Core AYA650-SAL -3.15 25.0 32.0 -0.126 1.000

- Nac Shell AYA650-EtOH -77.64 22.4 32.0 -3.466 0.057

AYA650-SAL - Nac Shell AYA650-SAL -83.45 26.5 32.0 -3.148 0.114

Nac Shell AGUA-EtOH - Nac Shell AGUA-SAL -77.86 39.2 32.0 -1.988 0.698

- Nac Shell AYA1950-EtOH -30.50 39.2 32.0 -0.779 1.000

- Nac Shell AYA1950-SAL -35.43 40.6 32.0 -0.872 0.999

- Nac Shell AYA650-EtOH -11.52 39.2 32.0 -0.294 1.000

- Nac Shell AYA650-SAL -20.49 42.6 32.0 -0.481 1.000

AGUA-SAL - Nac Shell AYA1950-EtOH 47.35 37.6 32.0 1.258 0.979

- Nac Shell AYA1950-SAL 42.43 39.2 32.0 1.083 0.993

- Nac Shell AYA650-EtOH 66.33 37.6 32.0 1.763 0.825

- Nac Shell AYA650-SAL 57.37 41.2 32.0 1.392 0.957

AYA1950-EtOH - Nac Shell AYA1950-SAL -4.93 39.2 32.0 -0.126 1.000

- Nac Shell AYA650-EtOH 18.98 37.6 32.0 0.504 1.000

- Nac Shell AYA650-SAL 10.01 41.2 32.0 0.243 1.000

AYA1950-SAL - Nac Shell AYA650-EtOH 23.90 39.2 32.0 0.610 1.000

- Nac Shell AYA650-SAL 14.94 42.6 32.0 0.351 1.000

AYA650-EtOH - Nac Shell AYA650-SAL -8.96 41.2 32.0 -0.217 1.000

ANOVA de uma via seguido de post hoc de Tukey

One-Way ANOVA (Fisher's)

F df1 df2 p

Média Core 2.006 5 34 0.103

Média Shell 0.987 5 32 0.441

122
 Tabela das anovas de uma via seguidas de teste de Tukey para a média da imunorreatividade da
proteína c-Fos nas regiões Core e Shell do Núcleo Accumbens.

123
 8.8 Material complementar k-means

Exemplos da representação em figuras dos agrupamentos (“cluterização”) por

k-means considerando a matriz de correlação entre as sub-regiões do núcleo
accumbens core e shell. Neste exemplo estão dispostos os grupos originais (a), os
seis grupos gerados pelo método (b), os três grupos gerados pelo método (c) e os
dois grupos gerados pelo método (d).

a) b)

c) d)

124
9. ANEXOS

9.1 Certificado CEUA UFABC – Victor Wiltenburg

125