Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro de Ciências Da Saúde Programa de Pós-Graduação em Nutrição

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO
SEBASTIÃO ÂNDERSON DANTAS DA SILVA
MICROENCAPSULAÇÃO DE Lactobacillus acidophilus E Lactiplantibacillus

plantarum EM ALGINATO E GELATINA: ESTUDO DA PRODUÇÃO,
CARACTERIZAÇÃO E ESTABILIDADE VISANDO APLICAÇÃO EM ALIMENTOS
Natal/RN
2021
1

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da
Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, como requisito parcial à obtenção de
do titulo de Mestre em Nutrição.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de

Sousa Júnior
Coorientadora: Profa. Dra. Thaís Souza

Passos
Natal/RN
2021
2
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS
Silva, Sebastião Ânderson Dantas da.

Microencapsulação de Lactobacillus acidophilus e
Lactiplantibacillus plantarum em alginato e gelatina: estudo da
produção, caracterização e estabilidade visando aplicação em
alimentos / Sebastião Ânderson Dantas da Silva. - 2021.
77f.: il.
Dissertação (Mestrado em Nutrição) - Universidade Federal do

Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de
Pós-Graduação em Nutrição. Natal, RN, 2021.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.
Coorientadora: Profa. Dra. Thaís Souza Passos.
1. Alimentos funcionais - Dissertação. 2. Probiótico -

Dissertação. 3. Encapsulação - Dissertação. 4. Emulsificação -
Dissertação. I. Sousa Júnior, Francisco Canindé de. II. Passos,
Thaís Souza. III. Título.
RN/UF/BSCCS CDU 612.39
Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474
3

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção
do título de Mestre em Nutrição.
Aprovado em 30 de novembro de 2021.
Profa. Dra. Clelia de Oliveira Lyra

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Nutrição
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior

Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
Orientador
Profa. Dra. Thaís Souza Passos

Coorientadora
Profa. Dra. Karla Suzanne Florentino da Silva Chaves Damasceno

Membro Interno
Dr. Sérgio Dantas de Oliveira Júnior

Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA
Membro Externo
4
AGRADECIMENTOS
À Deus por sempre me ajudar em todos os momentos dessa breve jornada.

Por Ele me proporcionar acima de tudo, saúde, coragem e dedicação.
À minha mãe Ana, que sempre me ajudou em todos os aspectos de minha
vida, sempre garantiu apoio aos meus sonhos, tratando-me com muito amor e carinho.
Aos meus irmãos Álison e Carol, meus avôs e avós e demais familiares
que sempre me ajudaram de alguma forma ao longo do mestrado.
Ao meu orientador Prof. Francisco que sempre me guiou com maestria e
sabedoria ao longo desse mestrado. Ajudando diariamente na condução dessa
pesquisa, sempre com muito ânimo e humor. Meus sinceros agradecimentos!
À minha coorientadora Profa. Thaís, que com muito comprometimento me
ajudou ao longo do mestrado. Compartilhando conhecimentos e sabedoria. Obrigado
pela paciência e meus sinceros agradecimentos!
As minhas amigas e colegas do mestrado Sara e Neyna, que sempre
compartilharam muitos momentos ao longo desse mestrado. Obrigado pelas palavras
de apoio e incentivo que ajudaram a manter-me forte e coeso.
Aos alunos de iniciação científica Leonam e Dara e aos colegas do
PPGNUT, por dividirem momentos de alegrias e vitórias, com palavras de conforto
nos momentos de dificuldades.
Aos técnicos dos laboratórios que mesmo no comprimento de suas
atividades, sempre prestaram assistência na condução desta pesquisa.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil
(CAPES) – Código de Financiamento 001, pelo apoio parcial para realização deste
trabalho.
Ao PPGNUT e a UFRN pela oportunidade de aprofundar meus
conhecimentos e contribuir para minha formação profissional.
À todas as pessoas, me ajudaram na realização desta dissertação, meu
sincero agradecimento.
5
– O que significa “domesticar”? – disse o
pequeno príncipe.
– É uma coisa sempre esquecida – disse a
raposa. – Significa “criar laços...”
Antoine de Saint-Exupéry (1943)

6
RESUMO
Os probióticos são definidos como microrganismos viáveis, os quais

ingeridos de maneira regular, proporcionam inúmeros benefícios à saúde. No entanto,
a viabilidade celular pode ser comprometida pela exposição ao armazenamento e ao
processo digestivo. Assim, a encapsulação surge como uma solução tecnológica
capaz de promover proteção, liberação controlada, e preservação dos efeitos
bioativos. Neste contexto, o presente estudo objetivou produzir, caracterizar e avaliar
a estabilidade de micropartículas à base de alginato de sódio e/ou gelatina suína
contendo Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 e Lactiplantibacillus plantarum
NRRL B-4496. A encapsulação foi realizada pela técnica de emulsificação óleo em
água (O/A), utilizando Tween 20 como tensoativo. Os encapsulados obtidos foram
caracterizados por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Difração a Laser,
Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourrier (FTIR) e Difração de
raio X (DRX). Além disso, foram avaliados quanto à viabilidade celular, eficiência de
incorporação, dispersibilidade em água, comportamento térmico e estabilidade
durante o armazenamento por 120 dias em diferentes condições de temperatura (5 °C
e 25 °C). Para os encapsulados em gelatina, as micrografias apontaram partículas
irregulares com superfície lisa, contendo microrganismos em suas estruturas, ao
contrário das partículas à base de alginato que apresentaram encolhimento e
ausência aparente de microrganismos. As formulações à base de gelatina contendo
L. acidophilus e L. plantarum apresentaram diâmetros médios de 26,08 (1,74) μm e
21,56 (4,17) μm, enquanto as partículas em alginato exibiram diâmetros de 5,24 (1,32)
μm e 5,52 (4,55) μm. O FTIR indicou interações químicas entre os constituintes das
formulações à base de gelatina, com a formação de novas bandas vibracionais e
visualização de bandas características dos probióticos, o que não foi observado para
os encapsulados em alginato. Os resultados de DRX mostraram que L. acidophilus e
L. plantarum encapsulados em gelatina apresentaram natureza semi-cristalina. Além
disso, os encapsulados em gelatina mostraram viabilidades de 10,9 (0,9) Log UFC/g
e 9,9 (0,8) Log UFC/g e eficiências de encapsulação de 89,6% (4,2) e 81,1% (9,7) (p
> 0,05). Contudo, a viabilidade celular e eficiência de incorporação das micropartículas
probióticas à base de alginato foram nulas. Uma dispersibilidade em água de 69,9%
(9,7) e 69,0% (8,4) foi encontrada para L. acidophilus e L. plantarum encapsulados
7
em gelatina. A análise térmica indicou estabilidade em temperatura inferior a 54 ºC,
sugerindo preservação das micropartículas a temperatura ambiente. Por fim, as
micropartículas de L. acidophilus em gelatina foram estáveis durante 120 dias de
armazenamento a 5 ºC [12,2 (0,1) Log UFC/g] e 25 ºC [10,7 (0,6) Log UFC/g] (p >
0,05). Assim, constatou-se que a microencapsulação em gelatina por emulsificação
O/A é uma estratégia adequada e favorável à proteção e estabilidade das bactérias
probióticas, viabilizando futuras aplicações na área de alimentos.
Palavras-Chave: Alimentos Funcionais, Probiótico, Encapsulação, Emulsificação.
8
ABSTRACT
Probiotics are defined as viable microorganisms when ingested regularly,

provide numerous health benefits. However, cell viability can be compromised by
exposure to storage and the digestive process. Thus, encapsulation appears as a
technological solution capable of promoting protection, controlled release, and
preservation of bioactive effects. In this context, the present study aimed to produce,
characterize and evaluate the stability of microparticles based on sodium alginate
and/or porcine gelatin containing Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 and
Lactiplantibacillus plantarum NRRL B-4496. Encapsulation was performed using the
oil-in-water (O/W) emulsification technique, using Tween 20 as a surfactant. The
encapsulates obtained were characterized by Scanning Electron Microscopy (SEM),
Laser Diffraction, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), and X-ray
Diffraction (XRD). Furthermore, they were evaluated for cell viability, incorporation
efficiency, water dispersibility, thermal stability, and stability during storage for 120
days under different temperature conditions (5 °C and 25 °C). For those encapsulated
in gelatin, the micrographs showed irregular particles with a smooth surface containing
microorganisms in their structures, unlike the sodium alginate-based particles, which
showed shrinkage and an apparent absence of microorganisms. Gelatin-based
formulations containing L. acidophilus and L. plantarum had mean diameters of 26.08
(1.74) μm and 21.56 (4.17) μm, while alginate particles exhibited diameters of 5.24
(1.32) μm and 5.52 (4.55) µm. The FTIR indicated chemical interactions between the
constituents of gelatin-based formulations, with new vibrational bands and visualization
of characteristic bands of probiotics, this being not observed in alginate encapsulates.
The XRD results showed that L. acidophilus and L. plantarum encapsulated in gelatin
presented a semi-crystalline structure. In addition, encapsulated in gelatin showed
viability of 10.9 (0.9) Log CFU/g and 9.9 (0.8) Log CFU/g and encapsulation
efficiencies of 89.6% (4.2) and 81.1% (9.7) (p > 0.05). However, the cell viability and
efficiency of incorporation of the alginate-based probiotic microparticles were null.
Water dispersibility of 69.9% (9.7) and 69.0% (8.4) were found for L. acidophilus and
L. plantarum encapsulated in gelatin was found for gelatin encapsulates. Thermal
analysis indicated stability at a temperature below 54 ºC, suggesting preservation of
the microparticles at room temperature. Finally, the L. acidophilus microparticles in
9
gelatin were stable for 120 days of storage at 5 ºC [12.2 (0.1) Log CFU/g] and 25 ºC
[10.7 (0.6) Log CFU/g] (p > 0.05). Thus, it was found that microencapsulation in gelatin
by O/W emulsification is an adequate and favorable strategy for the protection and
stability of probiotic bacteria, enabling future applications in the food area.
Key words: Functional Foods, Probiotics, Encapsulation, Emulsification.
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Representação de micropartículas funcionais (microcápsula e

microesfera) .................................................................................... 25
Figura 2 Complexos estruturais do alginato. GG: blocos do ácido L-
gulurônico (G) ................................................................................. 30
Figura 3 Microscopia Eletrônica de Varredura das formulações obtidas pela
técnica de emulsificação O/A utilizando gelatina suína, seguida de
secagem por liofilização .................................................................. 40
Figura 4 Espectros de FTIR dos encapsulados obtidos por emulsificação
O/A em gelatina suína e alginato de sódio, seguida de secagem
por liofilização ................................................................................. 46
Figura 5 Difratogramas de raios X das partículas em pó dos encapsulados
obtidos por emulsificação O/A em gelatina suína e alginato de
sódio, seguida de secagem por liofilização ..................................... 50
Figura 6 Termogramas e DTA dos matérias encapsulantes e encapsulados
por emulsão O/A, liofilizados ........................................................... 57
Figura 7 Viabilidade de micropartículas de L. acidophilus em gelatina suína
por emulsificação O/A (LAGE) durante 120 dias de
armazenamento sob diferentes temperaturas ................................. 59
Figura 8 Difratogramas das micropartículas de gelatina (LAGE) por 120
dias de armazenamento em diferentes temperaturas (T) ................ 61
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Descrição das diferentes fases envolvidas no preparo e obtenção

das formulações contendo probióticos microencapsulados ............ 33
Tabela 2 Diâmetro médio e índice de polidispersão das formulações à base
de alginato e gelatina contendo probióticos obtidas por
emulsificação O/A, seguida de secagem por liofilização ................. 43
Tabela 3 Contagem de células viáveis antes e após encapsulação dos
probióticos por emulsificação O/A e eficiência de incorporação
(EI%) ............................................................................................... 51
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 15
2 OBJETIVO ...................................................................................................... 18
2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 19
3.1 ALIMENTOS FUNCIONAIS ......................................................................... 19
3.2 PROBIÓTICOS ............................................................................................ 19
3.2.1 Família Lactobacillaceae ........................................................................ 21
3.2.1.1 Lactobacillus acidophilus ....................................................................... 22
3.2.1.2 Lactiplantibacillus plantarum .................................................................. 23
3.3 ENCAPSULAÇÃO ....................................................................................... 24
3.3.1 Técnicas de encapsulamento para probióticos .................................... 26
3.4 AGENTES ENCAPSULANTES .................................................................... 28
3.4.1 Alginato .................................................................................................... 29
3.4.2 Gelatina .................................................................................................... 30
4 METODOLOGIA ............................................................................................. 32
4.1 MATERIAIS .................................................................................................. 32
4.2 MICRORGANISMOS ................................................................................... 32
4.2.1 Ativação dos microrganismos ............................................................... 32
4.3 ENCAPSULAÇÃO DOS PROBIÓTICOS ..................................................... 33
4.3.1 Obtenção das formulações contendo os probióticos .......................... 33
4.4 CARACTERIZAÇÃO DAS FORMULAÇÕES OBTIDAS ............................... 35
4.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura .................................................... 35
4.4.2 Difração a laser ........................................................................................ 35
4.4.3 Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier
(FTIR) ................................................................................................................ 35
4.4.4 Difração de raio X (DRX) ......................................................................... 36
4.5 ENUMERAÇÃO DAS CÉLULAS VIÁVEIS E DETERMINAÇÃO DA
EFICIÊNCIA DE INCORPORAÇÃO .................................................................. 36
4.6 ENSAIO DE DISPERSIBILIDADE ................................................................ 37
13
4.7 TERMOGRAVIMETRIA (TG) E ANÁLISE TÉRMICA DIFERENCIAL (DTA) 38
4.8 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DOS PROBIÓTICOS ENCAPSULADOS

DURANTE O ARMAZENAMENTO .................................................................... 38
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................. 39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 40
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS FORMULAÇÕES OBTIDAS ............................... 40
5.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura .................................................... 40
5.1.2 Difração a laser ........................................................................................ 42
5.1.3 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier
(FTIR) ................................................................................................................ 46
5.1.4 Difração de raio X (DRX) ......................................................................... 49
5.2 ENUMERAÇÃO DAS CÉLULAS VIÁVEIS E EFICIÊNCIA DE
INCORPORAÇÃO ............................................................................................. 51
5.3 DISPERSIBILIDADE .................................................................................... 54
5.4 ANÁLISE TÉRMICA DAS PARTÍCULAS ................................................... 55
DURANTE O ARMAZENAMENTO .................................................................... 58
6 CONCLUSÃO ................................................................................................. 62
REFERÊNCIAS ................................................................................................. 64
14
1 INTRODUÇÃO
A preocupação com a alimentação está cada vez mais presente na
população mundial nas últimas décadas. Tal fato é atribuído aos inúmeros benefícios
que os alimentos podem exercer sobre a saúde dos indivíduos. Diante dessa
realidade, o setor de alimentos funcionais ganhou destaque, representando uma das
categorias mais dinâmicas e inovadoras da indústria de alimentos 1, principalmente
quando se trata de probióticos.
Probióticos são definidos pela Organização das Nações Unidas para a
Alimentação e Agricultura (FAO) como "microrganismos viáveis que, quando
administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do
hospedeiro"2. Entre os microrganismos comumente utilizados pela indústria de
alimentos destacam-se os gêneros Bifidobacterium e Lactobacillus2.
Para produzir os efeitos benéficos à saúde, os probióticos precisam ser
capazes de sobreviver e se multiplicar no hospedeiro3. Assim, devem ser
metabolicamente estáveis e ativos durante toda a vida de prateleira do produto, além
de sobreviver à passagem pelo trato gastrointestinal (TGI) em número mínimo de 107
a 109 de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por grama (g) ou mililitro (mL)4.
Contudo, após a administração de um probiótico, muitas linhagens podem apresentar
perdas consideráveis de viabilidade à medida que encontram as condições adversas
do TGI, como pH ácido do estômago, presença de enzimas digestivas e sais biliares 5.
Além disso, ao se multiplicarem na matriz alimentar, as linhagens probióticas podem
produzir atributos sensoriais indesejados, o que implica em produtos com menor
aceitação6.
Considerando as limitações de sobrevivência dos probióticos livres, a
encapsulação apresenta-se como uma solução simples e eficiente para melhorar a
sobrevivência desses microrganismos em produtos alimentícios, tanto durante o
processamento e armazenamento, quanto durante a passagem pelo TGI 7. Nesse
contexto, a encapsulação é uma estratégia capaz de promover a proteção de
substâncias bioativas frente a fatores extrínsecos, tais como temperatura, pH,
presença de oxigênio e luz, digestão enzimática, além de evitar a multiplicação
probiótica no alimento e as alterações dos atributos sensoriais deste8. Ademais, a
encapsulação pode proporcionar a liberação em local específico a uma velocidade
15
controlada, bem como preservar ou potencializar o efeito das substâncias
encapsuladas9.
A seleção da técnica de encapsulação depende de fatores, tais como
características físicas e químicas do núcleo, e dos materiais de revestimento ou da
matriz alimentar a ser utilizada10. Dentre as técnicas, a extrusão, emulsificação e
secagem por spray-dryer são as mais utilizadas para encapsulamento de bactérias
ácido lácticas (LAB)10. Por meio da técnica de emulsificação é possível aumentar a
escala de produção com facilidade, além disso, a mesma contribui para a alta taxa de
sobrevivência bacteriana em partículas com menor diâmetro (25 µm - 2 mm)10.
Muitos agentes encapsulantes, como pectina, alginato, carragenina,
quitosana, proteínas do soro de leite, gelatina e amido têm sido usados para
encapsulação de bactérias probióticas e outros componentes bioativos 9. Neste
sentido, o alginato é um biopolímero derivado de algas marrons (Kelp), formado
principalmente pelos ácidos β-D-manurônico e α-L-gulurônico10. Esse polímero
apresenta simplicidade estrutural, ausência de toxicidade, biocompatibilidade e baixo
custo. Com isso, é uma matriz amplamente utilizada para encapsular probióticos por
diferentes técnicas, como emulsificação ou extrusão.
A gelatina é formada por uma mistura complexa de polipeptídeos de fita
simples ou múltipla, que também pode ser utilizada na encapsulação probiótica 10. Na
forma pura, apresenta-se translúcida, quebradiça, incolor ou levemente amarelada,
insípida e inodora10. É útil como um agente gelificante termicamente reversível para
encapsulação, devido à natureza anfotérica, e possibilidade de cooperação com
polissacarídeos aniônicos11, como o alginato.
Estudos anteriores mostram que a encapsulação representa a principal
alternativa para preservação da viabilidade probiótica em produtos alimentícios 9,12,13.
Além disso, a adequada seleção de agentes encapsulantes e técnicas de
encapsulação torna-se crucial para garantir a preservação das características
morfológicas e funcionais dos probióticos14, principalmente quando aplicados a
matrizes alimentares. Porém, existem poucos estudos descritos na literatura que
promovam a encapsulação de probióticos por emulsificação óleo em água (O/A).
Neste sentido, o presente estudo partiu da hipótese que os polímeros
alginato de sódio e gelatina suína são potenciais agentes para promover a
microencapsulação de Lactobacillus acidophilus e Lactiplantibacillus plantarum por
16
emulsificação O/A. Assim, espera-se que os microrganismos encapsulados
apresentem estabilidade durante o período de armazenamento.
17
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL

Produzir e caracterizar micropartículas à base de alginato e/ou gelatina
contendo Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 e Lactiplantibacillus plantarum
NRRL B-4496, e avaliar a estabilidade frente a diferentes condições de
armazenamento.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

● Promover a encapsulação de L. acidophilus e L. plantarum em alginato de sódio e
gelatina suína por meio de emulsificação óleo em água (O/A).
● Caracterizar as formulações obtidas por diferentes métodos físicos e químicos.
● Determinar a eficiência de incorporação dos probióticos nas partículas obtidas.
● Avaliar os encapsulados quanto à dispersibilidade em água.
● Investigar a estabilidade térmica dos encapsulados contendo os microrganismos.
● Avaliar a estabilidade dos probióticos microencapsulados durante 120 dias de
armazenamento.
18
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 ALIMENTOS FUNCIONAIS

O termo “alimentos funcionais” foi descrito pela primeira vez por Roberfroid
(1999), como “Alimentos semelhantes em aparência aos alimentos convencionais que
se destinam a ser consumidos como parte de uma dieta normal, mas foram
modificados para manter funções fisiológicas além da simples provisão de
nutrientes”15.
Em outras palavras, seriam aqueles alimentos que podem fornecer
benefícios para a saúde além da nutrição básica, aumentando também a ingestão de
nutrientes específicos15.
Os alimentos funcionais são a categoria de maior participação no mercado
de produtos naturais, seguidos por bebidas funcionais e suplementos alimentares 16.
Entre os alimentos funcionais emergentes no mercado, os alimentos e bebidas à base
de probióticos são um dos grupos que mais se destacam, apresentando ampla
aceitação entre os consumidores17.
O mercado global de probióticos foi contabilizado por 48,4 bilhões de
dólares em 201918 e espera-se que chegue a 94,48 bilhões de dólares em 2024 19. A
Ásia se configura como o maior mercado para produtos probióticos e também com a
maior taxa de crescimento20.
O uso de probióticos pelas indústrias farmacêutica e alimentícia é bastante
versátil, pois podem ser administrados na forma de medicamentos, alimentos,
alimentos médicos, suplementos dietéticos, fórmulas infantis ou rações para
animais21.
3.2 PROBIÓTICOS
Probióticos são definidos como “microrganismos vivos que, quando
administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do
hospedeiro”, de acordo com a Organização para a Alimentação e Agricultura (FAO)
das Nações Unidas e a Organização Mundial da Saúde (OMS)22. Os mesmos estão
disponíveis na forma de pó, líquido, grânulos, gel, pasta e geralmente são
apresentados na forma de cápsulas, sachês, entre outros23.
19
Binda et al. (2020)24 destacaram critérios mínimos necessários para o uso
adequado do termo probiótico. Todavia, para ser considerada com uma cepa
probiótica, um microrganismo deve:
a) Ser suficientemente caracterizado de acordo com a nomenclatura bacteriana
atualmente vigente;
b) Ser seguro para o uso pretendido, mediante a história documentada de uso;
c) Ter pelo menos um ensaio clínico positivo em humanos conduzido de acordo
com os padrões científicos geralmente aceitos com base em protocolos e
diretrizes;
d) Estar vivo em número suficiente no produto com dose eficaz ao longo da vida
útil.
O consumo de probióticos está associado a muitas vantagens para a
saúde, como, estimular o crescimento da microbiota intestinal, produzir substâncias
antimicrobianas que eliminem bactérias potencialmente nocivas, reforçar o sistema
imunológico do corpo25, entre outros benefícios.
Neste sentido, cepas probióticas podem interagir com a microbiota
intestinal por meio da competição por nutrientes, antagonismo, entre outras 26. O
antagonismo acontece em parte devido ao metabolismo sacarolítico, que produz
ácidos, mas também pela produção de bacteriocinas27. Esses compostos
antimicrobianos podem ser ativos contra patógenos em muitos locais, incluindo o trato
urinário humano e o intestino de humanos e animais28,29.
Enzimas microbianas, como β-galactosidase30 e hidrolases de sais
biliares31, produzidas e liberadas por algumas linhagens probióticas, atuam
melhorando a digestão da lactose e o perfil lipídico em humanos32. Além disso, alguns
probióticos aumentam a fagocitose ou atividade de células do tipo natural killer (NK),
e interagem diretamente com células dendríticas33. Algumas linhagens também
demonstram capacidade de regular positivamente a produção de anticorpos
traduzindo-se em melhor defesa contra patógenos, aumentando as respostas às
vacinas34–36. Cepas probióticas podem aumentar os níveis de citocinas anti-
inflamatórias, como Fator de Necrose Tumoral (TNF) com implicações na redução do
câncer de cólon e colite33,37.
Outro mecanismo de atuação probiótica é a produção de ácidos orgânicos.
Espécies pertencentes aos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium produzem ácido
20
láctico e ácido acético como produtos do metabolismo de carboidratos 32. Esses ácidos
orgânicos, quando produzidos localmente diminuem o pH luminal, e
consequentemente, limitam o crescimento de patógenos no TGI32.
Uma das inúmeras aplicações dos probióticos inclui o tratamento não
farmacológico das doenças inflamatórias intestinais38. Além disso, os efeitos
modulatórios na resposta imune sistêmica podem levar a resultados positivos em
casos como distúrbios sistêmicos (alergias)39, doenças inflamatórias40, síndrome do
intestino irritável41, infecções por Helicobacter pylori e diarreia associada a
antibióticos42.
Alguns benefícios dos probióticos em humanos já foram mostrados em
vários ensaios clínicos randomizados, como, prevenção de enterocolite necrosante43,
dermatite atópica/hipersensibilidade alimentar em bebês44, melhora de sintomas de
constipação ocasional45, redução de incidência e duração de doenças infecciosas
comuns (trato respiratório superior e gastrointestinal) de adultos e crianças 46, redução
do colesterol LDL47 e melhoria de sintomas de intolerância à lactose em crianças e
adultos48.
Os microrganismos com propriedades probióticas pertencem a diferentes
gêneros e espécies de bactérias como, Bifidobacterium (B. adolescentis, B. animalis,
B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudolongum)49, Lactobacillus
(L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. delbrueckii subsp. Bulgaricus,
L. gasseri L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus, L.
salivarius)49, e leveduras (Saccharomyces spp., Saccharomyces boluradii)50 sendo
seus efeitos dependentes da linhagem. No gênero Lactobacillus51, a família
Lactobacillaceae destaca-se por apresentar várias espécies com potencial probiótico,
proporcionando benefícios à saúde para o hospedeiro51.
3.2.1 Família Lactobacillaceae

O gênero Lactobacillus foi proposto por Beijerinck em 1901, incluindo
microrganismos Gram-positivos, fermentativos, facultativamente anaeróbios e não
formadores de esporos52. Este gênero foi classificado no filo Firmicutes, classe Bacilli,
ordem Lactobacillales, família Lactobacillaceae, que contém os gêneros Lactobacillus,
Paralactobacillus e Pediococcus. Esta primeira taxonomia foi baseada em
características fenotípicas, incluindo temperatura ótima de crescimento, utilização de
21
açúcares e espectro de metabólitos produzidos53. No século 20, os critérios
genotípicos, quimiotaxonômicos e a estrutura química do peptidoglicano foram usados
para o delineamento de novas espécies bacterianas 52. No entanto, nos últimos 16
anos, o sequenciamento de genomas bacterianos inteiros tornou-se amplamente
disponível e os valores médios de identidade de nucleotídeos de genes
compartilhados entre os genomas bacterianos foram introduzidos como o padrão ouro
para delineamento de novas espécies bacterianas54,55.
Em relação à biossegurança dos microrganismos probióticos, a maioria das
bactérias ácido-lácticas são reconhecidas como de qualidade alimentar, raramente
relacionadas a infecções em humanos56. Eles são microorganismos "geralmente
reconhecidos como seguros" (GRAS) afirmados pela FAO57,58.
Nos últimos 20 anos, observou-se um aumento de aproximadamente 160%
no número de espécies descritas no gênero Lactobacillus, chegando a um total de 261
espécies em março de 202052. Desta forma, o aprimoramento na área da taxonomia
permitiu a caracterização mais detalhada destes microrganismos, sendo possível
verificar a grande heterogeneidade das espécies que até então estavam inseridas
dentro do gênero.
Com base nisso, Zeng et al. (2020)52 analisaram diversos marcadores
genéticos de semelhanças fisiológicas, ecológicas e metabólicas entre as espécies do
gênero e propuseram uma nova classificação para a família Lactobacillacea. Assim, o
então gênero Lactobacillus passou a ser dividido em 25 gêneros, um deles mantendo-
se como Lactobacillus, além de novos gêneros: Paralactobacillus, Holzapfelia,
Amylolactobacillus, Bombilactobacillus, Companilactobacillus, Lapidilactobacillus,
Agrilactobacillus, Schleiferilactobacillus, Loigolactobacilus, Lacticaseibacillus,
Latilactobacillus, Dellaglioa, Liquorilactobacillus, Ligilactobacillus, Lactiplantibacillus,
Furfurilactobacillus, Paucilactobacillus, Limosilactobacillus, Fructilactobacillus,
Acetilactobacillus, Apilactobacillus, Levilactobacillus, Secundilactobacillus e
Lentilactobacillus. Também houve a inclusão de gêneros antes pertencentes à família
Leuconostocaceae.
3.2.1.1 Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus são bacilos Gram-positivos com dimensões na
faixa de 0,5 a 10 µm, ocorrendo em pares ou cadeias curtas 59. Classificam-se como
22
homofermentadores obrigatórios, em que hexoses são fermentadas principalmente
a ácido láctico (>85%) pela via de Embden–Meyerhof–Parnas (EMP)59. Os
representantes desta espécie possuem aldolase e não são capazes de fermentar
gluconato, pentoses e produzem isômeros do ácido lático59 a partir de celobiose,
galactose, lactose, maltose, manose, sacarose e trealose, mas não de manitol 60,61. Os
mesmos são isolados do trato intestinal de humanos e animais, boca humana, vagina
humana, massa fermentada e vinho52.
Esta espécie produz uma variedade de metabólitos com antividade
antimicrobiana, incluindo ácido lático, peróxido de hidrogênio e numerosas
bacteriocinas peptídicas59. Em ensaios de triagem de atividades antimicrobianas, os
impactos de ácido e peróxido de hidrogênio devem ser eliminados por neutralização
do sobrenadante da cultura para pH 6,0-7,0 ou pela adição de catalase (3%),
respectivamente59. As culturas de L. acidophilus são conhecidas por produzir peróxido
de hidrogênio, mas a quantidade produzida varia consideravelmente entre as
linhagens59. A produção de bacteriocinas por estas culturas é considerada um fator
competitivo forte e vantajoso em um ambiente ecológico como o trato
gastrointestinal59.
3.2.1.2 Lactiplantibacillus plantarum

Lactiplantibacillus plantarum (anteriormente Lactobacillus plantarum) são
bacilos Gram-positivos, não formadores de esporos, homofermentativos e não
móveis52. As espécies Lactiplantibacillus fermentam uma ampla variedade de
carboidratos, a maioria das espécies metaboliza ácidos fenólicos por atividades de
esterase, descarboxilase e redutase52. Lactiplantibacillus plantarum é atípico por sua
atividade de pseudocatalase e redução de nitrato52.
As cepas de Lactiplantibacillus produtoras de exopolissacarídeos (EPS)
impactaram as propriedades físico-químicas e funcionais de alimentos62–64. Estes EPS
exibem várias bioatividades como antitumoral, antioxidante, imunomoduladora,
biocompatibilidade e inibição da formação de biofilmes por bactérias patogênicas 65.
As espécies de Lactiplantibacillus são isoladas de diversos alimentos
fermentados, tais como vegetais, carnes, produtos lácteos e cereais66,67. Além disso,
também são encontrados em habitats associados a insetos ou como residentes
temporários da microbiota intestinal de vertebrados, e são caracterizados por um
23
comportamento trasitório68. L. plantarum tem sido amplamente utilizada como espécie
modelo para estudos metabólicos, ecológicos e genéticos, apresentando também
importância comercial como cultura inicial para múltiplas fermentações de alimentos,
sendo utilizada como cultura probiótica52.
Todavia, os probióticos como L. acidophilus e L. plantarum são vulneráveis
às condições adversas de processamento, armazenamento e passagem pelo TGI, o
que pode resultar em uma redução significativa na contagem de células viáveis 69.
Portanto, a atividade funcional está estreitamente relacionada à quantidade e
viabilidade durante o processamento, vida de prateleira e passagem pelo TGI 70,71.
3.3 ENCAPSULAÇÃO
O processo de encapsulamento envolve o aprisionamento da substância
ativa em um material de parede, produzindo partículas em escalas variáveis10. No
encapsulamento, há duas partes bem definidas, a substância encapsulada que é o
material do núcleo, e a matriz que é o revestimento ou invólucro (material da parede)
atuando como uma barreira para proteger a substância encapsulada72.
O encapsulamento é utilizado nos setores de alimentos como uma barreira
eficaz para ingredientes líquidos e sólidos contra diversos parâmetros ambientais
(oxigênio, luz, radicais livres etc.)73. Com base no tamanho obtido, as formulações
podem ser classificadas em micropartículas, que geralmente variam de 1 a 1000 μm74,
e nanopartículas, que se referem a materiais funcionais em uma escala de diâmetro
inferior a 100 nm75,76.
Além disso, podem ser classificadas quanto ao tipo da partícula, ou seja,
cápsulas ou esferas. Como mostrado na Figura 1, as cápsulas são partículas
constituídas por um núcleo interno, substancialmente central, contendo a substância
ativa, que é recoberta por uma camada de agente encapsulante que constitui a
membrana da cápsula77. Podem ser ainda do tipo mononucleares e polinucleares
diferenciadas pela divisão do núcleo78. Em contraste, as esferas são sistemas de
matriz em que o núcleo está uniformemente disperso e/ou dissolvido em uma rede
polimérica (agente encapsulante)77. As esferas podem ser homogêneas ou
heterogêneas dependendo se o núcleo está no estado molecular (dissolvido) ou na
forma de partículas (suspensas), respectivamente79.
24
Figura 1. Representação de micropartículas funcionais (microcápsula e microesfera). Fonte: autoria
própria.
Neste sentido, para que o material do núcleo tenha a funcionalidade

preservada, precisam ser considerados fatores como a estrutura molecular (peso e
carga elétrica), o estado físico (ponto de ebulição e fusão), a bioatividade, solubilidade
e atividade de superfície, as propriedades ópticas e a estabilidade química (oxidação
e hidrólise)74.
Além disso, vários fatores que afetam a eficácia da encapsulação como,
material da cápsula, concentração do polímero, concentração de células microbianas
iniciais, condições ambientais, condições dos fatores de processamento, entre outros,
podendo ser superado pela seleção do método de encapsulamento, material de
revestimento e condições de processo adequados10.
Os agentes encapsulantes ideais devem ser biocompatíveis,
biodegradáveis, não tóxicos e de baixo custo74. Os mecanismos por trás da formação
da estrutura do agente encapsulante/matriz podem ser divididos em quatro categorias
com base no tipo de material74, sendo:
• Cadeias de polímero interconectadas por reticulação covalente em uma
membrana semelhante a hidrogel;
• Lipídios estabilizados por interações hidrofóbicas e de Van der Waals;
• Proteínas mantidas juntas por meio de interações hidrofóbicas, as pontes de
dissulfeto e ligações covalentes/reticulação;
• Processo sol-gel, em que alcóxidos de metal são hidrolisados e condensados
para formar matrizes densas.
25
Em uma partícula carregada com um ou mais ingredientes bioativos, as
principais propriedades funcionais incluem eficiência de encapsulação, tamanho e
morfologia das partículas obtidas, estabilidade sob armazenamento e características
de liberação in vitro e in vivo74. O tamanho da partícula difere em uma ampla faixa, de
acordo com fatores como a variação das técnicas de encapsulamento, a quantidade
e concentração dos materiais do núcleo, do invólucro, entre outros 74.
Muitas técnicas de encapsulamento são usadas para produzir partículas
contendo probióticos56. No entanto, no momento da escolha da técnica a ser utilizada,
é extremamente necessário levar em consideração o processo não agressivo,
garantindo suficiente viabilidade das células encapsuladas e ter estabilidade mecânica
compatível com a finalidade da aplicação80.
3.3.1 Técnicas de encapsulamento para probióticos

O encapsulamento de substâncias bioativas pode ser realizado por vários
métodos, os quais podem ser classificados em:
• Métodos físicos – secagem por spray-drying (atomização), leito fluidizado,
extrusão centrífuga com múltiplos orifícios, co-cristalização, liofilização.
• Métodos químicos – inclusão molecular e polimerização interfacial.
• Métodos físico-químicos – coacervação ou separação de fases,
emulsificação seguida de evaporação do solvente, pulverização em agente
formador de reticulação e envolvimento lipossômico81.
Dentre todas as técnicas, extrusão, atomização e emulsificação são
efetivamente utilizadas para encapsulamento de bactérias ácido lácticas (LAB)10.
A técnica de extrusão é um dos métodos mais antigos e usuais para
produzir cápsulas de hidrocolóide10. A vantagem consiste em ser um procedimento
simples e de baixo custo, que causa danos mínimos às células probióticas10. Neste
sistema, uma solução de hidrocolóide é misturada com microrganismos por meio de
uma seringa por gotejamento em solução de endurecimento, como o cloreto de cálcio,
que consiste em cátions multivalentes10.
No fim do processo, os microrganismos são imediatamente aprisionados
pelos polímeros levando a formação de redes tridimensionais que se reticulam com
íons de cálcio11. As desvantagens dessa técnica são: lentidão na produção,
dificultando a aplicação em larga escala. É ineficiente para produzir microesferas
26
menores que 500 μm e requer o uso de soluções de hidrocolóides de baixa a
moderada viscosidade82.
Muito utilizada na indústria alimentícia, a técnica de atomização apresenta
baixo custo, rápido processamento e alta produtividade56. Em geral, essa técnica
consiste na pulverização de uma solução contendo o agente encapsulado em fluxo de
ar quente, formando instantaneamente um pó83.
As principais condições do processo são o fluxo de ar, temperatura de
alimentação, e temperatura do ar de entrada/saída, as quais destacam-se na
otimização dos processos ou na formação das partículas obtidas 56. As temperaturas
utilizadas são extremamente importantes, pois baixas temperaturas reduzem a taxa
de evaporação da água, que forma agregados de partículas. Enquanto que altas
temperaturas podem danificar os constituintes da membrana bacteriana, o que reduz
drasticamente a viabilidade celular dos microrganismos encapsulados 80.
Também comumente usada para encapsulamento de células microbianas,
a emulsificação consiste na dispersão de duas fases imiscíveis entre si por meio do
auxílio ou não de um agente emulsificante (tensoativo), que geralmente apresenta
maior afinidade com a fase contínua do que com a fase dispersa84. Se a fase dispersa
for aquosa, a emulsão é denominada do tipo água em óleo (A/O), enquanto o oposto
é conhecido como emulsão óleo em água (O/A) ou fase reversa56.
Emulsões óleo em água (O/A) são dispersões coloidais
termodinamicamente estáveis que formam partículas pequenas, geralmente
esferóides compostas de óleo, surfactante ou co-surfactante e um meio aquoso de
fase contínua85.
Em encapsulação por emulsificação, os principais parâmetros para
controlar o tamanho das partículas são: energia aplicada ao sistema durante a
emulsificação, adição de emulsificantes, e a razão de viscosidade entre a fase
dispersa e a fase contínua86. Entre as vantagens dessa técnica destaca-se o tamanho
das partículas, que, em função da velocidade da agitação utilizada, pode variar entre
25 μm e 2 mm3 87.
Alguns estudos destacam a proteção das bactérias ácido lácticas (LAB) ao
utilizarem a técnica de emulsificação por diferentes materiais encapsulantes. Wang et
al. (2020)87, relataram que o encapsulamento de Lactobacillus acidophilus AS 1.2686
por meio de dupla emulsão formada por alginato, óleo de soja e solução de celulose
27
proporcionou maior viabilidade da bactéria probiótica durante 14 dias de
armazenamento, comparado às células livres. Ademais, em condições
gastrointestinais simuladas, aproximadamente 84% das células encapsuladas
permaneceram viáveis após a digestão.
Huerta-Vera et al. (2017)88, evidenciaram que a encapsulação por emulsão
dupla para Lactobacillus rhamnosus LC705 usando caldo De Man Rogosa & Sharpe
(MRS), óleo de uva e concentrado de proteína de soro de leite, teve efeito protetor
contra o estresse osmótico, verificado pela sobrevivência celular satisfatória (>8 Log
UFC/mL) do probiótico encapsulado em solução hipertônica de sacarose.
Quintana et al. (2018)89, ao encapsular Lactobacillus plantarum CIDCA
83114 por meio da técnica de emulsificação (O/A), utilizando óleo de okara e
caseinato, mostraram estabilidade da viabilidade probiótica após secagem por
pulverização em armazenamento por 60 dias a 4 °C, com queda de 1,53 ± 0,08 Log
UFC / g para este grupo com razão 1:4 (p/v) (O/A).
É notável que a microencapsulação possibilita a manutenção das
propriedades biológicas e físico-químicas dos materiais encapsulados90,91. Além da
seleção da técnica, a composição do material de revestimento pode afetar as
propriedades funcionais da microcápsula92. Desta forma, é crítico o emprego do
agente encapsulante ideal para promover a proteção do núcleo de interesse. Sendo
assim, grande parte dos materiais usados para a microencapsulação de probióticos
são polímeros naturais93.
3.4 AGENTES ENCAPSULANTES

A seleção de diferentes tipos de materiais encapsulantes geralmente
depende das características físicas e químicas do núcleo, da técnica de encapsulação
utilizada, assim como, da sua proposta de aplicação em matriz alimentar10,49.
O agente encapsulante é a matriz protetora projetada para aumentar a
estabilidade dos probióticos durante os diferentes estágios do processamento de
alimentos72. Uma variedade de materiais têm sido usados para esse propósito no
encapsulamento, tais como: κ-carragenina, alginato, acetato ftalato de celulose, amido
modificado, quitosana, gelana, xantana, goma arábica e proteínas animais (leite,
gelatina)49,72.
28
3.4.1 Alginato
O alginato é um heteropolissacarídeo linear, extraído de algas marrons e
constituído de resíduos de ácido D-manurônico (M) unidos por ligações β- (1 → 4), e
resíduos de ácido L-gulurônico (G) unidos por ligações α- (1 → 4) (Figura 2). Portanto,
a estrutura básica do alginato é composta por unidades de polímero não ramificadas
e por monômeros dispostos em blocos de resíduos M e G intercalados com regiões
contendo sequências M − G alternadas dentro da estrutura94,95.
Este polímero está disponível comercialmente em uma ampla gama de
massa molecular, que varia de dezenas a centenas de kilodaltons 96, sendo
particularmente adequado para encapsulação bacteriana, devido a suas condições
gelificantes, status GRAS (geralmente reconhecido como seguro) e ausência de
toxicidade97. Notavelmente, devido à presença de grupos de ácido carboxílico em
ambos os monômeros, o alginato carrega uma carga negativa acima de sua constante
de dissociação ácida (pKa na faixa de 3,3–3,5)98.
Pesquisas realizadas até o momento demonstram as propriedades úteis do
alginato como um veículo de liberação entérica, devido ao caráter ácido-gel e pH
abaixo de seu pKa (3,3–3,5), resultado da protonação dos grupos ácidos98. Assim,
revestimento, ou incorporação, de outros materiais nas microcápsulas de alginato é
uma direção popular para a pesquisa de encapsulação probiótica 98. Juntamente com
a proteção que esses revestimentos podem oferecer aos microrganismos, outras
propriedades benéficas também podem ser transmitidas, como dar maior controle
sobre a liberação bacteriana98.
Holkem et al. (2017)99 demonstraram que a encapsulação de
Bifidobacterium BB-12 por emulsificação/gelificação interna usando alginato de sódio
conferiram proteção eficaz sob condições gastrointestinais simuladas, e estabilidade
por 120 dias de armazenamento sob congelamento (7,31 Log UFC/g).
29
Figura 2. Complexos estruturais do alginato. GG: blocos do ácido L-gulurônico (G). MM: blocos do
ácido D-manurônico. MGM: blocos dos ácidos D-manurônico e L-gulurônico unidos98.
3.4.2 Gelatina
A gelatina é um ingrediente translúcido, frágil, incolor e sem sabor, derivado
da hidrólise parcial do colágeno, que é coletada dos ossos e pele de certos mamíferos,
como porcos e vacas, por meio de tratamentos ácidos ou alcalinos com alta
temperatura, extração de pressão na água, esterilização e secagem 100. É uma fonte
rica de proteína animal (cerca de 30%), sendo amplamente utilizada como agente de
revestimento, ligação, gelificação em produtos alimentícios, farmacêuticos e produtos
cosméticos, incluindo produtos de confeitaria, cremes, loções, máscaras faciais,
cápsulas e suplementos alimentares, devido à estabilidade estrutural única e às
excelentes propriedades funcionais, nutricionais e outras propriedades físico-
químicas100.
A gelatina é uma proteína de baixo peso molecular, possuindo uma
estrutura e propriedades funcionais versáteis, sendo capaz de formar soluções
aquosas de alta viscosidade, que gelificam sob resfriamento 3. A natureza anfotérica
fornece a capacidade de ter efeitos sinérgicos com polissacarídeos aniônicos, como
a goma de gelana e o alginato3.
Formada por todos os aminoácidos, com exceção do triptofano, a gelatina
apresenta baixo teor dos aminoácidos metionina, cistina e tirosina, devido à
degradação durante a hidrólise101,102. De acordo com a fonte utilizada, a composição
e sequência de aminoácidos da gelatina podem ser diferentes, mas sempre contém
grandes quantidades de glicina, prolina e hidroxiprolina103.
30
As propriedades químicas da gelatina são afetadas pela composição de
aminoácidos, que é semelhante àquela do colágeno original, portanto, influenciada
pelas espécies animais e tipos de tecidos104. Gelatinas de pele bovina e suína são
amplamente utilizadas na fabricação de alimentos porque as fontes estão mais
disponíveis104. A gelatina bovina é produzida a partir de tratamento alcalino de pele e
ossos, sendo conhecida como gelatina Tipo B, enquanto a gelatina suína é produzida
pelo tratamento ácido de pele e ossos, sendo conhecida como Tipo A104.
A força de gel da gelatina depende do ponto isoelétrico e pode ser
controlada pelo ajuste de pH105. A gelatina tipo A possui ponto isoelétrico que varia de
6,0 a 9,5106, e a tipo B possui ponto isoelétrico na faixa de 4,5 a 5,5106. Assim, as
cargas negativas formam uma mistura homogênea em um pH superior ao do ponto
isoelétrico10. No entanto, em pH abaixo do ponto isoelétrico a carga líquida da gelatina
torna-se positiva107.
Características descritas acima indicam a gelatina como um agente para
encapsulação de probióticos. Annan et al., (2008)108, realizaram o encapsulamento de
Bifidobacterium adolescentis 15703T com microesferas de gelatina revestidas com
alginato, observando aumento na sobrevivência probiótica no trato gastrointestinal,
após incubação sequencial em fluidos gástrico e intestinal simulados com viabilidades
de 7,6 e 7,4 Log UFC/mL, respectivamente.
31
4 METODOLOGIA
4.1 MATERIAIS
O caldo De Man Rogosa e Sharpe (MRS) foi adquirido da Difco®. A gelatina
suína (Tipo A), alginato de sódio e tensoativo Tween 20 foram obtidos da Sigma-
Aldrich®. O glicerol foi obtido pela empresa Synth®, a peptona pela Vetec® e o ágar
bacteriológico pela Kasvi®. O óleo de milho (Liza®) foi obtido no comércio da cidade
de Natal (RN).
4.2 MICRORGANISMOS
As linhagens probióticas Lactobacillus acidophilus NRRL B-4495 e
Lactiplantibacillus plantarum NRRL B-4496 foram cedidas pela coleção de culturas do
Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (U.S. Departament of Agriculture,
ARS Culture Collection-NRRL, Peoria, Illinois). As cepas foram armazenadas a -20 °C
em microtubos contendo caldo MRS e glicerol a 15% (m/v) nas dependências do
Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) da Universidade Federal do Rio Grande
do Norte (UFRN).
4.2.1 Ativação dos microrganismos

Para ativação dos microrganismos, 2 mL da cultura estoque em glicerol
(15%), referentes às cepas de L. acidophilus NRRL B-4495 e L. plantarum NRRL B-
4496, foram transferidos separadamente de forma asséptica para 100 mL do caldo
MRS contendo 10 mL de tampão fosfato 200 mM pH 6,5 (pHmetro – Mylabor®). Esse
cultivo inicial foi realizado em estufa bacteriológica (TE-392 – Tecnal®) estática a uma
temperatura de 37 °C por 24 horas.
Alíquotas de 2 mL dos cultivos iniciais foram transferidas, separadamente,
para dois Erlenmeyers contendo 100 mL do caldo MRS e 10 mL de tampão fosfato
200 mM pH 6,5. Em seguida, foram incubados a 37 °C por 17 horas.
Em seguida as células foram centrifugadas (centrífuga refrigerada, SL 701
- Solab®) a 4000 rpm por 15 minutos, lavadas com solução de cloreto de sódio (NaCl)
a 0,9% (m/v), e submetidas a uma segunda centrifugação (4000 rpm por 15 minutos).
O “pellet” foi armazenado por até 48 horas sob refrigeração (4 a 8 °C), até os
procedimentos de encapsulação.
32
4.3 ENCAPSULAÇÃO DOS PROBIÓTICOS
4.3.1 Obtenção das formulações contendo os probióticos

Após ativação, os probióticos L. acidophilus e L. plantarum foram
encapsulados com base em Quintana et al. (2018)89 com modificações, utilizando a
técnica da emulsificação óleo em água (O/A), seguida de homogeneização em fase
aquosa contendo tensoativo, com o auxílio do ultradispersor Turrax (IKA®) modelo
T18, com posterior secagem por liofilização. A gelatina suína (GS) e o alginato de
sódio (AG) foram utilizados como agentes encapsulantes e, o Tween 20 (T20) como
tensoativo.
Com isso, foram obtidas quatro formulações, sendo (LAGE) – L. acidophilus
microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, (LPGE) – L. plantarum
microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, (LAAG) - L. acidophilus
microencapsulado por emulsificação O/A em alginato e (LPAG) – L. plantarum
microencapsulado por emulsificação O/A em alginato, conforme mostra a Tabela 1.
Tabela 1. Descrição das diferentes fases envolvidas na obtenção das formulações

contendo probióticos microencapsulados.
FO FA1 FA2
(100 mL) (50 mL)
Formulações Óleo de GS AG T20 LA LP T20
milho
(% m/v) (% m/v) (% m/v) Log Log (% m/v)
(g) UFC/mL UFC/mL
LAGE 4 4 - 0,5 ≅12 - 0,25

LPGE 4 4 - 0,5 - ≅12 0,25
LAAG 4 - 4 0,5 ≅12 - 0,25
LPAG 4 - 4 0,5 - ≅12 0,25
LAGE – L. acidophilus microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LPGE – L. plantarum
microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LAAG – L. acidophilus microencapsulado por
emulsificação O/A em alginato, LPAG – L. plantarum microencapsulado por emulsificação O/A em alginato,
GS – gelatina suína, AG – alginato, FO – fase oleosa, T20 – Tween 20, LA – L. acidophilus, LP – L.
plantarum, FA1 – fase aquosa 1, FA2 – fase aquosa 2.
33
A fase oleosa das quatro formulações obtidas consistiu em 4 g de óleo de
milho, sendo registrado seu peso em balança semi-analítica (A. Cientifica/Edutec®).
Para o preparo da fase aquosa 1 (FA1) das formulações (LAAG e LPAG),
o alginato foi solubilizado em água destilada autoclavada sob agitação magnética a
50 °C por 24 horas, posteriormente filtrado em papel de filtro qualitativo. Após isto, o
Tween 20 foi solubilizado nesta solução, utilizando agitação magnética em
temperatura ambiente por 40 minutos. Seguidamente, o pellet probiótico foi
ressuspenso nesta solução (alginato e Tween 20), e ao final, utilizou-se ácido
clorídrico (1%) (HCl) ou hidróxido de sódio (1%) (NaOH) para ajuste de pH na faixa
de 5,5 nesta FA1.
Já nas formulações LAGE e LPGE, a fase aquosa 1 (FA1) foi elaborada a
partir da solubilização da gelatina suína por 1 hora a 40 ºC sob agitação magnética.
Posteriormente, o Tween 20 foi solubilizado sob agitação magnética à temperatura
ambiente por 40 minutos e, em seguida, homogeneizado a solução contendo gelatina
suína a temperatura ambiente por 30 minutos.
O procedimento de ressuspensão dos pellets probióticos foi realizado de
acordo com os procedimentos citados anteriormente, com ajuste de pH 5,5 para FA1
final, utilizando HCl ou NaOH. Cabe ressaltar que, coletou-se 1 mL da FA1 de todas
as formulações para a realização de diluição seriada e contagem inicial do probiótico
(N0), que foi utilizada para cálculo da eficiência de encapsulação, conforme descrito
na seção 4.5.
Para o preparo da fase aquosa 2 (FA2) de todas as formulações, o Tween
20 foi solubilizado em água destilada autoclavada, sob agitação magnética à
temperatura ambiente por 40 minutos. Ao final, o pH das soluções foi ajustado para
5,5, utilizando HCl ou NaOH.
As emulsões foram obtidas por meio da homogeneização da fase oleosa
(FO) e FA1, por meio do auxílio do ultradispersor a 5.000 rpm por 7 minutos.
Posteriormente, a FA2 foi homogeneizada na primeira emulsão obtida, utilizando as
mesmas condições descritas. Cabe ressaltar que, todas as formulações foram obtidas
em triplicata, sendo os procedimentos realizados nos Laboratório de Tecnologia de
Alimentos do Departamento de Nutrição e Laboratório de Bromatologia do
Departamento de Farmácia da UFRN. Posteriormente, as emulsões foram submetidas
à secagem por liofilização (LioTop L101) a -57 °C e pressão de 43 μHg no Laboratório
34
de Farmacognosia no Departamento de Farmácia da UFRN, com rendimento final de
aproximadamente 15 g de pó probiótico por encapsulação.
Após liofilização, 1,0 g dos liofilizados foram utilizados para realizar
diluições seriadas e contagem do probiótico (N), que foi utilizada posteriormente para
o cálculo da eficiência de encapsulação. Todos os procedimentos foram realizados
em triplicata.
4.4 CARACTERIZAÇÃO DAS FORMULAÇÕES OBTIDAS
4.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura

Com o objetivo de avaliar a morfologia encapsulados obtidos, as
formulações foram analisadas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) no
Laboratório de Materiais e Ensaios Mecânicos (LABEMAT) do Centro de Tecnologias
do Gás e Energias Renováveis - CTGAS-ER.
As partículas em pó foram colocadas em fita de carbono fixadas em stubs,
e metalizadas em ouro e paládio por 75 segundos. As análises foram realizadas em
microscópio tipo MEV-VEGA3- SEM (Tescan Analytics®), em diferentes ampliações,
utilizando alto vácuo e tensão de 5 – 20 kV.
4.4.2 Difração a laser

Para a determinação do tamanho de partícula, 5 mg dos encapsulados
foram dispersos em 4 mL de acetona (PA) ou 10 mg em 4 mL de dimetilsulfóxido
(DMSO) (PA) dispostos em cubetas de vidro. As amostras foram analisadas no
equipamento NanoBrook ZetaPlus Zeta Potencial Analyzer®, utilizando o software
Brookhaven Instruments – ZetaPALS Particle Sizing Software®, para a mensuração
do diâmetro médio e do índice de polidispersão.
O procedimento foi realizado em triplicata no Laboratório do Núcleo de
Ensino e Pesquisa em Petróleo e Gás II (NUPEG II) do Departamento de Engenharia
Química (DEQ/CT) da UFRN.
4.4.3 Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)

As análises de FTIR foram realizadas na Central Analítica no Instituto de
Química (IQ) da UFRN. As formulações obtidas e os respectivos constituintes brutos
35
(gelatina suína, alginato de sódio e Tween 20) foram homogeneizados com brometo
de potássio (KBr), macerados e prensados para a obtenção de pastilhas.
Posteriormente, foram registrados em transmitância e com região do
infravermelho médio de 400 a 4000 e 600 a 4000 cm -1, utilizando o espectrômetro da
Shimadzu®, modelo FTIR-8400S, série IRAFFINITY-1, utilizando o software
IRSOLUTION®, versão 1.60, com número de varredura de 32 e resolução 4 cm -1.
4.4.4 Difração de raio X

As análises de difração de raio X (DRX) foram realizadas no Laboratório de
Peneiras Moleculares – LABPEMOL do Instituto de Química (IQ)/ UFRN. Os agentes
encapsulantes (alginato de sódio e gelatina) e formulações obtidas (LAGE, LPGE,
LAAG e LPAG) foram analisados em um difratômetro de raios X de alta resolução
(D2Phaser) da Bruker® equipado a um detector Lynxeye com radiação de cobre
(CuKα, λ=1,54Å), filtro de Ni, corrente de 10 mA e voltagem de 30 kV. Os materiais
foram colocados em um porta amostra cilíndrico e analisados na faixa de 2θ de 10-
100, fenda divergente de 0,6 mm, fenda central de 1 mm, fenda convergente 0,02 º
com tempo de aquisição de 0,1 segundo.
4.5 ENUMERAÇÃO DAS CÉLULAS VIÁVEIS E DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA

DE INCORPORAÇÃO
Para avaliação da viabilidade inicial do probiótico (N0), 1 mL de suspensão
celular da Fase aquosa 1 contendo os probióticos L. acidophilus ou L. plantarum em
solução de alginato de sódio ou gelatina suína, foram submetidas à diluições sereadas
em água salina peptonada. Em seguida, 0,1 mL das diluições de 10 -7 a 10-12 foram
semeadas por “spread plate” em placas contendo ágar MRS. As placas foram
incubadas a 37 °C por 72 horas em estufa bacteriológica. Após 72 horas de incubação,
foi realizada a contagem das colônias e a viabilidade expressa em Unidades
Formadoras de Colônias (UFC) por mL (UFC/mL), conforme a metodologia descrita
por Ribeiro et al. (2020)109 com modificações.
A liberação dos probióticos dos encapsulados foi realizada de acordo com
o protocolo descrito por Sheu, Marshall e Heymann (1993)110 com modificações, afim
de quantificar a viabilidade após a encapsulação. Para isso, 1 g de cada formulação
foi adicionada a 9 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,5) estéril, agitada a
36
150 rpm por 1 minuto e colocada em banho Maria à 37 °C por 10 minutos. Em seguida,
a mistura foi agitada a 150 rpm por 1 minuto, e submetida a diluições sucessivas em
água salina peptonada. As diluições foram posteriormente plaqueadas (10 -7 a 10-10) e
incubadas seguindo o mesmo procedimento para enumeração das células viáveis dos
probióticos livres (N0).
A partir das contagens, foi calculada a eficiência de incorporação (EI), que
mensura a taxa de sobrevivência ao processo de imobilização, calculada de acordo
com a Equação 1:
𝑁
𝐸𝐼 (%) = 𝑥 100 (1)
𝑁0
Onde: EI – Eficiência de incorporação, expresso em porcentagem (%); N – Número

de células viáveis (Log UFC/g) nos encapsulados e N0 – Número de células viáveis
(Log UFC/mL) na fase aquosa 1 (probióticos livres, ativados, homogeneizado em
água e materiais encapsulantes).
4.6 ENSAIO DE DISPERSIBILIDADE

A dispersibilidade em água dos encapsulados à base de gelatina foi
determinada de acordo com metodologia previamente descrita por Paula et al.
(2019)111. Para isso, 0,5 g da formulação encapsulada e liofilizada foi adicionada em
um tubo de centrífuga contendo 50 mL de água destilada. A mistura foi agitada a 100
rpm por 30 minutos a 25 °C, utilizado a Incubadora orbital refrigerada TE-421
(Tecnal®), com posterior centrifugação a 3500 rpm durante 5 minutos (Centrífuga
refrigerada, SL 701 - Solab®). Em seguida, retirou-se uma alíquota de 25 mL do
sobrenadante, que foi seca em estufa a 105 °C, até peso constante. A dispersibilidade
foi expressa em percentual, de acordo com a Equação 2:
(𝑚1 𝑥 2)
𝐷𝑖𝑠𝑝𝑒𝑟𝑠𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (%) = 𝑥100 (2)
𝑚0
Onde: m1 – massa da amostra na alíquota de 25 mL, obtida após a secagem em estufa

(g); e m0 – massa inicial da amostra, incorporada em 50 mL (g).
37
4.7 TERMOGRAVIMETRIA (TG) E ANÁLISE TÉRMICA DIFERENCIAL (DTA)
As análises termoanalíticas ocorreram no Laboratório do Núcleo de Ensino
e Pesquisa em Petróleo e Gás II (NUPEG II) do Departamento de Engenharia Química
(DEQ/CT) da UFRN.
A TG e DTA foram realizados para investigar o comportamento da
degradação térmica dos materiais brutos (óleo de milho, Tween 20, gelatina), dos
lactobacillus livres liofilizados (L. acidophilus e L. plantarum) e das formulações à base
de gelatina (LAGE e LPGE).
Foi utilizado (5,0 ± 3,0 mg) de cada amostra, avaliadas em analisador
térmico DTG-60 da Shimadzu®, com taxa de aquecimento de 10 ºC por minuto, no
intervalo de temperatura de 29 °C a 800 ºC em atmosfera de nitrogênio com fluxo de
50 mL por minuto. As variações na massa residual da amostra em relação à mudança
de tempo e temperatura foram fornecidas automaticamente pelo equipamento.

DURANTE O ARMAZENAMENTO
A estabilidade da formulação encapsulada liofilizada à base de gelatina
contendo L. acidophilus (LAGE) foi avaliada quando o armazenamento por 120 dias a
temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) e sob refrigeração (5 ± 2 ºC), de acordo com as
metodologias de Mahmoud et al. (2020)112 e Mu et al. (2018)113 com modificações.
Após liofilização, os probióticos formam pesados (3 g) de forma aleatória
em recipientes de plásticos transparentes estéreis com tampa (Firstlab®, modelo FL1-
0050VE). Posteriormente, submetidos a temperaturas usualmente utilizadas para
armazenamento de produtos alimentícios. O armazenamento sob refrigeração (5 ± 2
ºC) foi realizado em refrigerador Electrolux® (modelo Cycle Defrost Duplex DC50) e a
temperatura ambiente (25 ± 2 ºC) em estufa bacteriológica Tecnal®, modeloTE-
392/170L por 120 dias nas dependências do LEB/UFRN.
Com o intuito de investigar a viabilidade celular e as características
estruturais da partícula, foram realizadas imediatamente após a liofilização a
enumeração de células viáveis e a Difração de raio X (dia 0), e após 7, 15, 30, 45, 60,
90 e 120 dias de armazenamento nas temperaturas mencionadas. A viabilidade foi
avaliada seguindo o procedimento descrito na seção 4.5, e a análise de DRX de
acordo com a seção 4.4.5.
38
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram expressos como média e desvio-padrão. Para
a análise estatística dos dados foi realizada a Análise de Variância (ANOVA) com pós-
teste de Tukey, considerando o valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo.
A análise estatística foi realizada utilizando o software Statistica 8.0 (StatSoft Inc.,
Tulsa, EUA).
39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS FORMULAÇÕES OBTIDAS
5.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura

A Figura 3 apresenta as micrografias das formulações obtidas por
emulsificação O/A seguida de secagem por liofilização.
A B
C D
Figura 3. Microscopia Eletrônica de Varredura das formulações obtidas pela técnica de

emulsificação O/A utilizando gelatina suína, seguida de secagem por liofilização. A: LAGE com
magnitude de 7,01kx; B: LPGE com magnitude de 6,35kx, C: LAAG com magnitude de 542x e
D: LPAG com magnitude de 565x. Círculos vermelhos indicam a presença de probióticos. LAGE
– L. acidophilus microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LPGE – L.
plantarum microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LAAG – L. acidophilus
microencapsulado por emulsificação O/A em alginato, LPAG – L. plantarum microencapsulado 40
por emulsificação O/A em alginato.
As micrografias dos probióticos L. acidophilus e L. plantarum em gelatina
suína são mostradas na Figura 3 (A e B). Para este agente encapsulante, as partículas
apresentaram formatos irregulares e superfícies lisas. Este aspecto irregular pode ser
atribuído em parte ao processo de secagem por liofilização. Além disso, observa-se a
presença de células bacterianas em forma de bastões, organizadas aleatoriamente
aprisionadas nas estruturas, indicando a proteção dos probióticos.
Por meio das micrografias é possível avaliar os aspectos morfológicos e a
homogeneidade do tamanho físico das partículas formadas114. Os resultados obtidos
neste estudo assemelham-se aos descritos por Singh et al. (2018)115, que ao
encapsular Lactobacillus rhamnosus GG LMG 18243 (LGG) pela técnica de
emulsificação água em água (A/A) em carboximetilcelulose e gelatina, após a
liofilização, observaram microestrutura tipo espuma. Além disso, as micrografias
obtidas por esses pesquisadores apresentaram aspecto poroso com morfologia
alveolar e bactérias aprisionadas na superfície dos macroporos.
Paula et al. (2019)111 obtiveram L. plantarum microencapsulado por dupla
emulsificação seguida de coacervação complexa com gelatina e goma arábica, e
secagem por liofilização. Os resultados de MEV não indicaram a presença de células
bacterianas na superfície das partículas, sugerindo que as células de L. plantarum
estavam bastante imobilizadas no núcleo das estruturas do biopolímero
supramolecular, com formação de partículas semelhantes a reservatórios. Uma
explicação para a tal divergência em relação ao presente estudo, é o emprego de
outro método de emulsificação (O/A), e uso somente de gelatina como agente de
incorporação. Assim, no estudo de Paula et al. (2019)111, o aspecto morfológico foi do
tipo cápsulas de reservatório, enquanto no presente estudo a estrutura foi do tipo
matriz, com células bacterianas espalhadas por todo o volume das partículas, o que
sugere a obtenção de microesferas.
Na Figura 3, pode-se observar as micrografias das formulações obtidas à
base de alginato. Os encapsulados (Figura 3 C e D) apresentaram aspectos
morfológicos caracterizados por formatos irregulares e superfície lisa. Observa-se
também o encolhimento das estruturas dos encapsulados. Além disso, cabe ressaltar
que não foi observada a presença dos microrganismos sob a superfície, como nas
formulações a base de gelatina.
41
A descrição de micropartículas à base de alginato com aspecto poroso já é
bem relatado na literatura116–118. Segundo Dianawati et al. (2011)119, o alginato é um
material poroso que não é capaz de isolar microrganismos encapsulados das
migrações de água. Além disso, a secagem por sublimação de cristais de gelo sob
vácuo também resulta na formação de partículas secas porosas80. Cabe ressaltar que,
no presente estudo, com base nas micrografias obtidas, não foi possível observar a
presença de porosidade nas estruturas, possivelmente devido aumento da umidade
nas micropartículas à base de alginato, as quais apresentaram alta higroscopicidade.
Kusuktham et al. (2014)120 relataram que o aumento da concentração de
alginato eleva a viscosidade da solução. Além disso, os autores descreveram que
concentrações menores que 5% (m/v) de alginato geram uma baixa concentração de
grupos carboxila na superfície do grânulo, que durante um processo de secagem por
liofilização, gerando um colapso parcial da estrutura e, consequentemente, ocasiona
o encolhimento da superfície destes grânulos.
5.1.2 Difração a laser

Na encapsulação de compostos para aplicação alimentícia, o tamanho das
partículas é extremamente importante, uma vez que interfere diretamente nos
atributos sensoriais do produto. De uma maneira geral, quanto menor o tamanho da
partícula, mais fácil a dispersão no alimento. Por outro lado, quanto maior o tamanho
da partícula, maior o efeito indesejado na textura56.
O diâmetro médio e índice de polidispersão das formulações encapsuladas
são apresentados na Tabela 2.
42
Tabela 2. Diâmetro médio e índice de polidispersão das formulações à base de
alginato e gelatina contendo probióticos obtidas por emulsificação O/A, seguida de
secagem por liofilização.
Difração a laser
Formulações Diâmetro médio Índice de
de partícula (µm) polidispersão
LAGE 26,08 (1,74)a 0,5 (0,0)a
LPGE 21,56 (4,17)a 0,6 (0,1)a
LAAG 5,24 (1,32)b 0,1 (0,1)b
LPAG 5,52 (4,55)b 0,1 (0,0)b
LAGE – L. acidophilus microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LPGE – L.

microencapsulado por emulsificação O/A em alginato, LPAG – L. plantarum microencapsulado por
emulsificação O/A em alginato; *Valores expressos em média (desvio padrão). *Letras minúsculas
iguais na mesma coluna indicam que não houve diferença estatística significativa (p>0,05), com
base na ANOVA e pós-teste de Tukey.
De acordo com a Tabela 2, os diâmetros médios da partícula para os

grupos encapsulados com gelatina (LAGE e LPGE) foram 26,08 (1,74) e 21,56 (4,17)
µm com índices de polidispersão de 0,5 (0,0) e 0,6 (0,1), respectivamente. Portanto,
o baixo valor de polidispersão (< 1) indica homogeneidade das partículas obtidas121.
É importante destacar que o processo de liofilização não reduz o tamanho das
partículas tanto quanto outros métodos de secagem, devido à retenção de uma
estrutura hidratada98.
Arslan et al. (2015)122, ao microencapsular Saccharomyces cerevisiae var.
boulardii utilizando diferentes materiais de parede seguido de secagem por spray-
dried, obtiveram tamanho de partícula de 21,38 µm para as formulações à base de
gelatina, dados semelhantes ao encontrado em nosso estudo. Todavia, é importante
destacar que além do agente encapsulante, o uso da técnica e tensoativo adequados
é essencial para obtenção de partículas com menor diâmetro.
Contrariamente, o tamanho de partículas dos encapsulados em alginato de
sódio (LAAG e LPAG) foram ainda menores que os à base de gelatina suína, sendo
igual a 5,24 (1,32) e 5,52 (4,55) µm, respectivamente. Além de menores índices de
polidispersão, 0,1 (0,1) e 0,1 (0,0), respectivamente.
43
Neste sentido, os resultados obtidos para das micropartículas de alginato,
ou seja, os menores tamanhos observados comparados às formulações à base de
gelatina, possivelmente indicam não haver a presença dos núcleos probióticos
aprisionados em suas estruturas, como pode ser observado nas micrografias.
Diferentemente de Martin et al. (2013)123, que ao avaliarem a viabilidade de
L. fermentum CECT5716 encapsulado em alginato ou alginato e amido não
modificado, por emulsificação e gelificação interna, o tamanho de partícula para
encapsulados com alginato sem probiótico variou de 30 e 60 μm. Essa diferença
possivelmente pode estar relacionada ao tipo de emulsificação empregada, e ao
tensoativo utilizado no processo de encapsulação.
Destaca-se que o tamanho das células bacterianas varia de 1 a 5 µm, o
que dificulta a obtenção de partículas em escala nanométrica98, mas estudos recentes
têm mostrado avanços124–126. Entretanto, o microencapsulamento apresenta-se como
a opção mais empregada para promover a incorporação de microrganismos, já que a
capacidade de melhorar a sobrevivência dos probióticos, está diretamente relacionada
a seleção do agente encapsulante, à técnica utilizada e o tamanho da partícula 56.
A microencapsulação pode gerar partículas de 1 a 1000 µm86, e aplicando
a técnica de emulsificação o tamanho esperado varia de 25 μm até 2 mm 10. Cook et
al. (2012)98 descreveram que um produto probiótico microencapsulado ideal seria um
pó seco, com facilidade de armazenamento e longa vida útil, ou um gel úmido com
estabilidade de longo prazo em um produto alimentício.
O tamanho e a morfologia dos produtos encapsulados podem ser
influenciados diretamente pelos materiais envolvidos, pela técnica de encapsulação
utilizada127–129, como também pela concentração e pelo tipo de tensoativo utilizado.
Os surfactantes podem reduzir a tensão superficial das emulsões e melhorar a
estabilidade130,131. O Tween 20 é um tensoativo não iônico que contém grupos
hidrofílicos capazes de solubilizar matérias orgânicas e reduzir a tensão superficial132.
A hidrofilicidade de um tensoativo é medida pelo balanço hidrofílico-
lipofílico (BHL). Dinarvand et al. (2005)133, ao avaliar o efeito do BHL de diferentes
surfactantes em micropartículas à base de poli-D, L-lactídeo de naltrexona preparadas
pela técnica de emulsificação O/A, evidenciaram que ao utilizar o Tween 20 com BHL
16,7 e o Tween 80 com BHL 15, obtiveram maior estabilidade das emulsões formadas
e garantiram uma maior eficiência de encapsulação.
44
A aplicação de probióticos encapsulados na indústria de alimentos é um
desafio, principalmente devido ao tamanho das células bacterianas, que
posteriormente levam à produção de partículas grandes, o que pode afetar
negativamente a qualidade sensorial dos alimentos10,134. Por outro lado, Martin et al.
(2013)123 relataram que o tamanho de partícula aceitável para aplicação em alimentos
não deve ultrapassar 80 μm, a fim de evitar um efeito sensorial negativo no produto.
Ribeiro et al. (2014)135 descreveram a encapsulação de L. acidophilus LA-
5 por gelificação iônica e coacervação complexa, utilizando pectina e proteína de soro
de leite como agentes encapsulantes, e obtiveram tamanho médio das partículas igual
a 253,3 μm, isto pode ser conferido pela falta do agente surfactante durante a
encapsulação.
Marefati et al. (2021)136, encapsularam o probiótico Lactobacillus reuteri por
dupla emulsificação do tipo A/O/A, utilizando 5% (m/v) de poliricinoleato de poliglicerol
90 como surfactante, homogeneizado com óleo contendo triglicerídeos de cadeia
média. Os autores descreveram que os diâmetros médios dos encapsulados variaram
de 14,9 a 15,5 μm, e associaram este resultado ao uso do surfactante, ao qual, era
um eficiente emulsificante hidrofílico.
Portanto, a técnica de emulsificação O/A e o tensoativo utilizado (Tween
20) apresentam-se como escolhas vantajosas por propiciar partículas e índice de
polidispersão menores, como demonstrado no presente estudo, proporcionando
aplicação em produtos alimentícios sem afetar os atributos sensoriais dos produtos.
45
5.1.3 Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)
Os espectros de FTIR das formulações obtidas, agentes encapsulantes
brutos e tensoativo são apresentados na Figura 4.
A B
C D
Figura 4. Espectros de FTIR dos encapsulados obtidos por emulsificação O/A em gelatina suína e
alginato de sódio, seguida de secagem por liofilização. A: LAGE: L. acidophilus encapsulado por
emulsificação O/A em gelatina suína (a); Tween 20 (b); Gelatina suína (c). B: (LPGE) - L. plantarum
encapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína (a); Tween 20 (b); Gelatina suína (c). C:
(LAAG) - L. acidophilus encapsulado por emulsificação O/A em alginato (a); Tween 20 (b); Alginato
(c). D: (LPAG) - L. plantarum encapsulado por emulsificação O/A em alginato (a); Tween 20 (b);
Alginato de sódio (c).
O FTIR faz parte das técnicas espectroscópicas vibracionais137 que permite

observar mudanças químicas ocorridas entre componentes estruturantes de
determinado alvo. Nesta análise, a amostra é submetida a um feixe infravermelho
(geralmente no infravermelho médio de 4000 a 400 cm-1), grupos funcionais dentro da
amostra irão absorver essa radiação e vibrar. As vibrações e absorções resultantes
podem então ser correlacionadas diretamente com as espécies químicas 138. Por isso,
as espectroscopias de infravermelho têm sido utilizadas para investigar sistemas
biológicos, incluindo probióticos137.
O espectro do tensoativo Tween 20 (Figura 4) exibiu banda espectral na
região de 3511 cm-1 referente a ligação (O–H). As bandas em 2920 cm-1 e 2866 cm-1
46
correspondem ao estiramento das vibrações das ligações alquil (C-H) assimétricas e
simétricas, respectivamente. Além disso, a banda em 1735 cm-1 corresponde
estiramento do grupo ésteres (C=O), em 1460 cm-1 a vibração relacionada ao metileno
(CH2), e em 1248 cm-1 referente ao estiramento de éter (C-O)139.
No espectro obtido para gelatina suína (Figuras 4A e B) observa-se
presenças de bandas vibracionais na região de 1636 cm-1, referente ao alongamento
assimétricas e simétricas da ligação (C=O) amida I em 1617 cm-1 que caracteriza a
presença de amida II (N-H). Nota-se, ainda, a presença de banda vibracional nas
regiões entre 3549 cm-1 e 3412 cm-1 em relação a trechos de ligações (N-H) e (O-H),
ao qual podem formar ligações de hidrogênio com o grupo carbonil da ligação
peptídica140,141.
O alginato de sódio (Figuras 4C e D) apresentou vibrações na região de
1589 cm-1 – 1466 cm-1, que correspondem à presença do grupo carbonila (C=O).
Rather et al. (2017)142, encontraram valores próximos ao observar os espectros do
alginato de sódio. Bandas características expressaram-se na faixa 3375 cm-1 a 2679
cm-1, indicando que nesta região existe absorção e alongamento intenso de dímeros
do ácido carboxílico (O-H)140.
Todavia, espera-se que variações espectrais presentes nas formulações
obtidas para os probióticos estejam relacionadas às estruturas químicas de ácidos
nucléicos, carboidratos como monossacarídeos e polissacarídeos, proteínas
estruturais e fosfolipídios de membrana135 das linhagens microbianas utilizadas neste
trabalho.
Nesse contexto, o espectro do probiótico L. acidophilus encapsulado em
gelatina suína e liofilizado (LAGE) (Figura 4A), apresentou bandas características em
3008 cm-1, que reflete a formação de dímeros de amidas secundárias (N-H) nas
conformações s-cis ou s-trans140, em 1235 cm-1, a qual reflete os compostos
portadores de fosfato, e em 1162 cm-1 a 916 cm-1 atribuídas aos carboidratos das
paredes das células microbianas137. Ademais, as bandas observadas em 2926 cm-1
e 1744 cm-1, podem estar associadas ao alongamento CH2 de ácidos graxos das
membranas lipídicas do probiótico e também à presença do óleo de milho 143, utilizado
como fase oleosa na encapsulação por emulsificação O/A.
Pode-se constatar que houve interação química entre o agente
encapsulante gelatina e tensoativo Tween 20 nas formulações obtidas. Isso fica
47
evidente após a atenuação das bandas de absorção detectadas na gelatina para o
grupo amida (3552 cm-1 e 3416 cm-1) e estiramento vibracional nas bandas 2926 cm-
1 e 2853 cm-1 referente ao Tween 20. Assim, a presença de picos importantes que
correspondem aos vários componentes celulares de L. acidophilus NRRL B-4495 e
atenuação do encapsulante, indicam o sucesso da incorporação do probiótico.
Para L. plantarum encapsulado em gelatina suína e liofilizado (LPGE)
(Figura 4B), bandas características do microrganismo e do óleo foram observadas,
sendo, 3008 cm-1, 2926 cm-1,1744 cm-1, 1239 cm-1, 1166 – 1030 cm-1 mostrando a
presença dos grupos N-H, CH2, P=O, C-O, C-H, C–C(=O)–C137,140. Além disso, a
presença das bandas relacionadas à gelatina, em 3549 cm -1, 3479 cm-1 e 3412 cm-1
(N-H), e estiramento vibracional das bandas 2926 cm -1 e 2853 cm-1 referentes ao
Tween 20.
Os resultados obtidos reforçam a presença de interações químicas no
sistema, indicando que os probióticos foram encapsulados em gelatina suína. Assim,
os dados reforçam os resultados obtidos na microscopia, sugerindo que o
encapsulamento por emulsificação (O/A) em gelatina seguido de secagem por
liofilização permitiu a proteção e sobrevivência dos probióticos, apresentando grande
potencial para aplicações tecnológicas futuras.
Por outro lado, nos espectros do L. acidophilus encapsulado em alginato
seguido de secagem por liofilização (LAAG) (Figura 4C), não foi possível observar
bandas características para este microrganismo, como os componentes da estrutura
microbiana (amidas, ácidos graxos, compostos portadores de fosfato, carboidratos e
ácidos nucleicos). É possível visualizar a atenuação das bandas do Tween 20 (2923
cm-1 e 2856 cm-1) e alginato (3545 – 3239 cm-1 e 1469 cm-1), sem estiramento ou
formação de novas bandas.
Para L. plantarum encapsulado em alginato (Figura 4D), também não foi
possível observar nos espectros bandas características da cepa. Os deslocamentos
de bandas características do alginato estavam presentes nesta formulação (3384 cm-
1, 3273 cm-1, 3173 cm-1 e 3091 cm-1), contudo não atenuadas.
Assim, acredita-se que a baixa interação química entre os constituintes do
sistema nas formulações LAAG e LPAG não favoreceu a incorporação dos
microrganismos, que, em consequência, ficaram mais expostos durante o processo
de encapsulação, resultando na perda da viabilidade.
48
Ressalta-se que a baixa proteção promovida pelo alginato foi previamente
relatada por outros autores144,145, utilizando diferentes técnicas de encapsulamento de
microrganismos. A partir disso e nos demais resultados de caracterização obtidos
sugere-se, portanto, que as características intrínsecas do alginato, somado à alta
concentração e a secagem por liofilização, condicionaram a formação de partículas
que não propiciaram a sobrevivência dos microrganismos durante o processo. Por
outro lado, os encapsulados com gelatina apresentaram intensas interações químicas
conseguindo promover a proteção de L. acidophilus e L. plantarum.
5.1.4 Difração de raio X

A difração de raio X é comumente usada para identificar o estado cristalino
ou amorfo de produtos em pó146. Em geral, os materiais cristalinos exibem uma série
de picos definidos, enquanto os amorfos produzem um amplo padrão de ruídos147.
Neste estudo, os difratogramas dos agentes encapsulantes isolados e dos diferentes
encapsulados obtidos são apresentados na Figura 5.
É possível observar estruturas de natureza semi-cristalina, com ruídos que
caracterizam regiões amorfas e pico definidos em regiões cristalinas para gelatina
suína (GS) 2θ = 22,07 º (Figura 5A) e alginato de sódio (AG) 2θ = 19,94 º, 20,79 º,
23,30 º, 25,51 º, 28,46 º, 31,40 º, 35,51 º, 36,34 º (Figura 5B). Cabe ressaltar que,
estes picos característicos também foram observados em outros estudos148–151.
A cristalinidade do alginato relaciona-se à sua constituição molecular
contendo minerais como sódio e cálcio150,152. Para a gelatina, a presença de regiões
cristalinas está associada à tríplice hélice do colágeno renaturado153,154.
Os encapsulados produzidos por emulsificação O/A à base de gelatina
suína (LAGE e LPGE) apresentaram um único pico translocado a 2θ = 19,86 º (Figura
5C) e 20,65 º (Figura 5D) respectivamente, podendo estar relacionado a presença de
interação química da gelatina suína com o núcleo probiótico evidenciada no resultado
obtido para a análise de FTIR.
Já as micropartículas de alginato (LAAG e LPAG), obtiveram picos
cristalinos característicos do mesmo, como observado para o polímero bruto. Sendo,
2θ = 19,90 º, 28,22 º, 31,03 º, 31,95 º, 35,69 º para LAAG (Figura 5E) e, 2θ = 19,80 º,
23,08 º, 28,24 º, 32,41 º e 36,13 º para o encapsulado LPAG (Figura 5F).
49
Esses resultados corroboram com os resultados de FTIR dos encapsulados
em gelatina, em que é possível observar interações químicas entre agente-núcleo
reforçando os dados de microscopia no aprisionamento dos microrganismos sob a
estrutura. Todavia, estes dados reafirmam os resultados encontrados anteriormente
para os encapsulados à base de alginato, nos quais por meio dos resultados
anteriores, foi perceptível o encolhimento e irregularidade da estrutura, além da baixa
interação química.
A B
C D
E F
Figura 5. Difratogramas de raios X das partículas em pó dos encapsulados obtidos por

emulsificação O/A em gelatina suína e alginato de sódio, seguida de secagem por liofilização.
A: gelatina suína; B: alginato de sódio; C: LAGE: L. acidophilus encapsulado em gelatina
suína; D: LPGE - L. plantarum encapsulado em gelatina suína E: LAAG - L. acidophilus
50
encapsulado em alginato e F: LPAG - L. plantarum encapsulado em alginato.
5.2 ENUMERAÇÃO DAS CÉLULAS VIÁVEIS E EFICIÊNCIA DE INCORPORAÇÃO
Os resultados de viabilidade celular antes e após encapsulação e eficiência
de incorporação dos probióticos são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Contagem de células viáveis antes e após encapsulação dos probióticos

por emulsificação O/A e eficiência de incorporação (EI%).
Viabilidade
Antes da Após a
Formulações EI%*
encapsulação encapsulação
(Log UFC/mL) (Log UFC/g)
LAGE 12,1 (1,0) 10,9 (0,9) 89,6 (4,2)a
LPGE 12,3 (1,4) 9,9 (0,8) 81,1 (9,7)a
LAAG 12,8 (0,0) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)b
LPAG 12,7 (0,2) 0,0 (0,0) 0,0 (0,0)b
LAGE – L. acidophilus microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LPGE – L.

microencapsulado por emulsificação O/A em alginato, LPAG – L. plantarum microencapsulado
por emulsificação O/A em alginato; EI% - Eficiência de Incorporação em percentual; *Valores
expressos em média (desvio padrão); *Letras minúsculas diferentes na mesma coluna diferem
significativamente segundo a ANOVA com pós-teste Tukey (p < 0,05).
A eficiência da incorporação (EI) tem por objetivo avaliar a sobrevivência

das bactérias probióticas no processo de encapsulação. Conforme apresentado na
Tabela 3, para a formulação LAGE observou-se uma redução de 1,2 Log UFC/g na
viabilidade em relação à concentração celular inicial, correspondendo a uma EI de
89,6% (4,2). Semelhante valor de EI foi encontrado para a formulação (LPGE)
(81,1%), com uma redução de 2,4 Log UFC/g em relação à viabilidade celular inicial.
O procedimento de microencapsulação utilizando a gelatina como agente
encapsulante resultou em eficiência elevada, quando comparado ao encontrado por
outros autores. Annan et al. (2008)108 ao avaliar a sobrevivência do probiótico
Bifidobacterium adolescentis 15703T encapsulado em gelatina suína tipo A 13%
revestidas com alginato a 1% pela técnica de gelificação com cálcio de fonte de (Ca2+),
externa e interna obtiveram uma EI de 41 a 43% para método da fase interna, e de
30% para fase externa. Khalil et al. (2019)155, relatam que a encapsulação de
51
Bifidobacterium pseudocatenulatum G4 em gelatina Tipo B pelo método da extrusão
resultou em uma eficiência de apenas 45,9%.
Por outro lado, os achados do presente estudo corroboraram com os
resultados de eficiência de outros que utilizaram gelatina, por meio de técnicas e
materiais variados. Jiang et al. (2020)156, obtiveram eficiência de incorporação de
81,02% para biofilmes de Lactobacillus rhamnosus GG microencapsulados com
gelatina de peixe (50%) e maltodextrina (50%) por liofilização. Vaziri et al. (2018) 151
obtiveram eficiência de incorporação de 97,5 a 99,9% na co-microencapsulação de L.
plantarum e ácido graxo DHA em alginato-pectina-gelatina por técnica de extrusão. Já
Paula et al. (2018)111 relataram uma eficiência de incorporação de 97,78% para L.
plantarum microencapsulado por dupla emulsificação água-óleo-água (A/O/A)
seguida por coacervação complexa, utilizando gelatina Tipo B e goma arábica como
agentes encapsulantes.
Assim, os altos valores de EI obtidos no presente estudo indicam
compatibilidade entre o método de emulsificação O/A, agente encapsulante escolhido
(gelatina) com os probióticos selecionados. Segundo Sagiri et al. 157, estudos com
ótima eficiência de incorporação apresentam percentuais superiores a 80%. Nesse
contexto, garantir a viabilidade é um fator fundamental para que os probióticos
exerçam seus efeitos benéficos ao hospedeiro. Para isto, uma concentração de
microrganismos vivos no produto deve estar acima de 6–7 Log UFC por g ou mL no
momento do consumo22. Com base nisso, cabe destacar que para os dois probióticos
encapsulados em gelatina, a viabilidade celular foi superior a 7,0 Log UFC/g.
Estes resultados corroboram com dados obtidos no MEV, nos quais foi
possível observar as células dos probióticos dispostas sob a estrutura das
formulações à base de gelatina (LAGE e LPGE). Além disso, os resultados de FTIR
mostraram as interações químicas entre os agentes brutos (gelatina e Tween 20) e os
microrganismos, indicando a proteção dos probióticos.
Entretanto, ao utilizar alginato como agente encapsulante, observou-se
uma drástica diminuição da viabilidade de L. acidophilus e L. plantarum, com eficiência
de encapsulação nula (Tabela 2). O alginato é comumente utilizado como material
encapsulante de células microbianas, resultando na formação de matrizes mais
porosas e suscetíveis à desintegração na presença de excesso de íons monovalentes
e agentes quelantes de cálcio56.
52
Estudos anteriormente publicados utilizam o alginato isolado ou em
combinação com outros polímeros, e diferentes métodos de encapsulamento,
relatando um efeito protetor aos microrganismos probióticos 7,158–160. Diferentemente
dos resultados obtidos no presente estudo, Rather et al. (2017)142, observaram uma
eficiência de 72,48% e 62,54%, para L. plantarum NCDC201 e L. casei NCDC297
após microencapsulação com alginato de sódio (3%) por extrusão. Trabelsi et al.
(2014)161, também observaram um rendimento de encapsulação entre 13% e 68%
para L. plantarum TN9 microencapsulado por técnica de extrusão, utilizando alginato
de sódio (1%, 2% ou 3%) revestido com quitosana e gelatina.
No entanto, alguns autores relatam que encapsulação em alginato pode
não conferir efeito protetor. Ester et al. (2019)162 avaliaram a sobrevivência de
Lactobacillus salivarius spp. salivarius encapsulado por emulsificação, em alginato,
utilizando Tween 80 como tensoativo, incorporado à discos de maçã. Os autores
concluíram que a encapsulação com alginato não conseguiu garantir a sobrevivência
de L. salivarius spp. salivarius, com 60% de perda da viabilidade devido à superfície
porosa.
Com base nos resultados obtidos no presente estudo, observa-se que a
seleção de agentes encapsulantes e da técnica a ser utilizada são fatores cruciais
para garantir uma encapsulação bem sucedida 56. Os agentes encapsulantes devem
proteger as células microbianas e não apresentar toxicidade 56. Neste sentido, a
gelatina é uma proteína derivada do colágeno, sendo a principal proteína estrutural do
tecido conjuntivo da pele e osso animal106. Apresenta baixo custo, sendo utilizada na
indústria alimentícia como agente gelificante, espessante, formador de filme,
estabilizador e emulsificante106.
O principal destaque da gelatina é a capacidade de formar géis
termorreversíveis, em temperatura de 35 a 37 °C106. Neste estudo foi utilizado a
gelatina suína tipo A, que é obtida por meio de processo ácido 106. Assim, destacamos
que as características físicas e químicas do agente encapsulante foram determinantes
para a manutenção da viabilidade probiótica pós-encapsulamento por emulsificação e
liofilização.
Em relação ao alginato, um fator importante a ser considerado é a razão
entre as unidades M e G, em que a quantidade dos três blocos presentes no polímero
pode variar de acordo com a fonte e influência nas propriedades dos géis formados a
53
partir deste polímero56. Alginatos com maior porcentagem de blocos G tendem a dar
origem a géis mais rígidos e quebradiços, enquanto maiores quantidades de blocos
M formam géis menos rígidos e mais flexíveis56.
A oscilação das propriedades do gel de alginato também depende da
concentração do polímero, do pH e da presença de cátions divalentes que promovem
ligações iônicas intermoleculares com os blocos aniônicos presentes no alginato 163.
Kavitake et al. (2018)10 destacaram que concentrações ideais de alginato para
encapsular probióticos são de 0,5–4%. No presente estudo, foi utilizada a
concentração de 4% de alginato.
Cook et al. (2012)98 reforçam que o método usado para obtenção das
partículas também pode influenciar significativamente o resultado final. Nesse sentido,
uma vantagem associada à técnica de emulsificação consiste na capacidade de
promover a produção em larga escala de microesferas com grânulos de tamanho
relativamente pequeno, que são mais adequados para sensação na boca, sendo
assim, aceitáveis em produtos alimentícios11.
Por conseguinte, sugere-se que a não proteção das bactérias probióticas
neste estudo ocorreu pelas características do alginato de sódio, visto que, a técnica
de emulsificação promove a proteção dos lactobacillus sem causar danos às suas
estruturas, diferentemente de outras técnicas como o spray-drying.
Como descrito na literatura, o alginato é um material poroso, que em altas
concentrações proporciona a géis mais rígidos. Assim, a concentração de 4% de
alginato utilizada neste trabalho pode ter influenciado a degradação dos
microrganismos pela não proteção contra fatores extrínsecos, como exposição ao
oxigênio, temperatura entre outros fatores, que inviabilizaram a sobrevivência ao
processo de encapsulação.
Cabe ressaltar que, com base nos resultados obtidos para a caracterização
das partículas, avaliação da viabilidade celular e eficiência de incorporação, as demais
investigações realizadas avaliaram apenas as formulações a base de gelatina suína.
5.3 DISPERSIBILIDADE
O ensaio de dispersibilidade mostrou que L. acidophilus (LAGE) e L.
plantarum (LPGE) encapsulados em gelatina obtiveram uma solubilização em água
de 69,9% (9,7) e 69,0% (8,4), não havendo diferenças significativas entre as
54
formulações (p> 0,05). É importante mencionar que a solubilidade influencia
diretamente a aplicação alimentícia, favorecendo ou não a aceitação por parte dos
consumidores, assim, esta avaliação torna-se um parâmetro importante.
Os resultados de difração a laser mostraram que LAGE e LPGE
apresentaram diâmetros médios de partículas de 26,08 e 21,56 μm, respectivamente.
Desta forma, o pequeno diâmetro de partícula obtido, associado às características
físicas e químicas do agente encapsulante, possivelmente influenciaram na boa
solubilidade das partículas. Destaca-se, ainda, a maior interação química entre a
gelatina e demais materiais, indicado nos resultados de FTIR.
É importante destacar que a gelatina é um material proteico biodegradável
derivado da hidrólise parcial do colágeno. Constitui-se uma excelente escolha como
material de parede devido à sua alta solubilidade em água, capacidade de
emulsificação e espessamento164. Além disso, a boa atividade de superfície pode ser
usada para estabilizar a emulsão na interface óleo-água165.
Ensaio de dispersibilidade utilizando gelatina e probióticos ainda é pouco
descrito na literatura. Paula et al. (2019)111 ao avaliar micropartículas contendo L.
plantarum obtidas por dupla emulsificação seguida de coacervação complexa,
utilizando gelatina e goma arábica como agentes encapsulantes, obtiveram uma
dispersibilidade de 18,3%. Segundo estes autores, a baixa dispersibilidade em água
é característica de micropartículas obtidas por coacervação complexa, uma vez que
em um dado pH, as moléculas com cargas interagem eletrostaticamente, resultando
em divisão de fase e separação das partículas.
5.4 ANÁLISE TÉRMICA DAS PARTÍCULAS

Os resultados da termogravimetria (TG) e análise térmica diferencial (DTA)
dos encapsulados são apresentados na Figura 6. Estas análises fornecem
informações sobre a perda de massa da amostra pelo aumento da temperatura até a
decomposição e os fenômenos físicos que ocorrem durante estes eventos.
A perda de massa foi consideravelmente menor (2%) para os dois
encapsulados com gelatina nas temperaturas de 54-52 ºC (Figura 6 F e G). Como os
eventos se iniciam em temperaturas ambientes, presume-se que esta perda é devido
à eliminação de água das amostras166.
55
Após estes eventos endotérmicos iniciais, a perda de massa dos
encapsulados ocorreu de forma gradativa. Eventos de fusão destacam-se por
condicionar as maiores perdas de massa das amostras, a qual variou de 58 a 69%,
para LAGE (Figura 6F) e LPGE (Figura 6G). Isso pode estar relacionado à degradação
de componentes presentes no material de parede167, já que a gelatina suína perdeu
consideravelmente massa (58%) a 420 ºC (Figura 6A), sendo isto associado à
degradação e modificação das cadeias de gelatina168.
Khodaei et al. (2020)169, ao avaliarem a capacidade de sobrevivência de L.
plantarum, L. casei e S. boulardii em filmes comestíveis à base de gelatina e baixa
metoxil pectina (LMP), observaram picos endotérmicos em 66-104 ºC e a 232-268 °C.
Contudo, a gelatina utilizada neste estudo era a tipo B (gelatina bovina).
Outros materiais constituintes também perderam massas parcialmente no
evento de fusão, como, o tensoativo Tween 20 (56%) (Figura 6B) e óleo de milho
(68%) (Figura 6E). Além disso, os próprios microrganismos foram afetados por este
evento com temperaturas que variaram até 478 ºC. L. acidophilus com perda de 55%
e L. plantarum 56% (TG). Isso, pode ser representado pela degradação dos
constituintes celulares dos probióticos como proteínas, lipídios e polissacarídeos170.
Ainda na Figura 6, é possível observar eventos de decomposição dos
agentes encapsulantes brutos sobre temperaturas superiores a 400 ºC. A gelatina,
teve a perda de massa (68%) a 505 ºC de DTA. Sendo isto, relacionado à quebra das
estruturas mais termicamente estáveis da gelatina168.
Já os agentes T20 (Figura 6B) e OM (Figura 6E), apresentaram
decomposições finais com TG 94%-86% em temperaturas que variaram de 420 ºC a
445 ºC (DTA), respectivamente. Todavia, as amostras de probiótico (LA) (Figura 6F)
e (LP) (Figura 6G) obtiveram temperaturas correspondentes a perda de massa (TG)
(68%-61%) a 555 ºC e 522 ºC, respectivamente.
O pico de decomposição exotérmica para ambos os encapsulados com
gelatina foi entre 559 ºC (LPGE) e 616 ºC (LAGE). Este dado indica que a presença
da gelatina melhorou a estabilidade química e térmica dos encapsulados quando
comparado aos agentes e núcleos probióticos. Diferentemente dos resultados
encontrados por Lopes et al. (2017)171, em que as cápsulas de alginato com gelatina
contendo L. rhamnosus apresentaram termogramas com pico de decomposição
exotérmica a 450 ºC.
56
A B
C D
E F
Figura 6. Termogramas e DTA dos materiais encapsulantes e encapsulados por emulsão O/A,
liofilizados. A: GE – Gelatina suína; B: T20 – Tween 20; C: (LA) – L. acidophilus; D: LP – L.
plantarum; E: OM – Óleo de milho; F: LAGE – L. acidophilus encapsulado por emulsificação O/A
em gelatina suína (4%); G: LPGE – L. plantarum encapsulado por emulsificação O/A em gelatina
suína (4%). 57
Stojanovic et al. (2012)172, relatam que a decomposição térmica de
polímeros inclui as etapas de desidratação e despolimerização acompanhadas pela
ruptura das ligações C-O e C-C e formação de CO, CO2 e H2O.
Como evidenciado nos resultados acima, formulações probióticas
microencapsuladas em gelatina suína obtiveram melhores estabilidades térmicas até
temperatura de 54 ºC, antes da ocorrência dos primeiros eventos térmicos. Avaliar a
estabilidade térmica é crítico quando se fala em probióticos, pois a maioria deles têm
sido usados predominantemente em laticínios, uma vez que os laticínios fornecem um
meio de cultura favorável para a viabilidade probiótica173.
Em termos de temperatura, quando os probióticos são expostos a altas
temperaturas, sua atividade e crescimento microbiano são alterados, enquanto a
exposição a baixas temperaturas diminui seu metabolismo, inibindo o crescimento
celular173. Assim, um processamento térmico tradicionalmente utilizado pela indústria
de alimentos na fabricação de diversos tipos de alimentos e bebidas é a
pasteurização, com aquecimento de 68 °C por um tempo médio de 25 minutos 174. Em
nosso estudo, os encapsulados com gelatina suína possivelmente seriam capazes de
resistir a este processamento, tendo em vista, a perda de massa mínima sob referida
temperatura.
Portanto, é importante ressaltar que as condições de processamento e
armazenamento são fundamentais, pois direcionam as futuras aplicações
tecnológicas na produção de alimentos, como também, orienta os tratamentos
industriais adequados a este produto probiótico.

DURANTE O ARMAZENAMENTO
A viabilidade bacteriana expressa a capacidade de uma célula de crescer
e, subsequentemente, gerar uma colônia de células sob condições ambientais
definidas173. Além disso, a viabilidade é um pré-requisito para a funcionalidade dos
probióticos no que se refere às propriedades de promoção da saúde nos
consumidores175.
Para isto, é necessário que o probiótico apresente-se viável, mantendo-se
acima de 6-7 Log UFC/g ou mL durante toda a vida útil do produto176. De acordo com
as análises realizadas, a encapsulação por emulsificação O/A utilizando gelatina foi
58
eficiente para as duas linhagens estudadas. Em virtude da maior aplicação na
indústria de alimentos, a avaliação da estabilidade durante o armazenamento a 5 ºC
e 25 ºC foi realizada com as micropartículas contendo L. acidophilus (Figura 7).
Figura 7. Viabilidade de micropartículas contendo L. acidophilus em gelatina suína por

emulsificação O/A (LAGE) durante 120 dias de armazenamento na temperatura
ambiente (25 ± 2 ºC) e sob refrigeração (5 ± 2 ºC).
Com base na Figura 7, é possível observar uma boa estabilidade durante

todo o período avaliado, com valores superiores a 10 Log UFC/g após 120 dias de
armazenamento. Ao final dos 120 dias, os encapsulados LAGE obtiveram viabilidade
de 12,2 (0,1) Log UFC/g em refrigeração 5 ºC, e 10,7 (0,6) Log UFC/g para a
temperatura ambiente 25 ºC.
De maneira geral, os encapsulados submetidos às diferentes condições de
armazenamento apresentaram-se viáveis durante o período de 120 dias. Os dados
encontrados mostram que mesmo em temperatura ambiente (25 ºC) os encapsulados
mantiveram viabilidade superior quando comparados a outros estudos 111,169,177 que
utilizaram gelatina como agente de incorporação.
Boa estabilidade pode ser atribuída à formação de micropartículas por
emulsificação O/A utilizando gelatina suína e Tween 20, que efetivamente protegeram
as células do estresse ambiental, como presença de oxigênio e umidade, e também
59
limitaram a difusão interna do calor111, sendo assim, vantajosas para aplicações
futuras na indústria alimentícia.
Paula et al. (2019)111 ao microencapsular L. plantarum por dupla
emulsificação, seguida de coacervação complexa utilizando gelatina e goma arábica
observaram que o probiótico apresentou viabilidade celular igual a 7,6 Log UFC/ g
após 45 dias de armazenamento a 8 °C e −18 °C.
Trabelsi et al. (2014)161 avaliaram a sobrevivência de L. plantarum TN9
encapsulados com alginato/gelatina por extrusão com cloreto de cálcio frente ao
armazenamento em temperatura de refrigeração (4 ºC) por 35 dias. Ao final do tempo
de armazenamento, os pesquisadores observaram a perda total da viabilidade para
micropartículas de alginato revestidas com gelatina. Neste sentido, a escolha da
técnica, agentes encapsulantes, tensoativos e a própria cepa probiótica são
essenciais na garantia de formação de micropartículas probióticas mais estáveis.
Para avaliar os efeitos da temperatura de armazenamento sob as
estruturas dos encapsulados à base de gelatina suína, utilizou-se a técnica da
Difração de raio X para os mesmos tempos de análise da viabilidade. Os difratogramas
obtidos são apresentados na Figura 8.
Nos difratogramas (Figura 8) pode-se observar que para as duas
temperaturas avaliadas, as formulações mantiveram a natureza semi-cristalina
durante todo período de armazenamento. É notável a presença de ruídos que
caracterizam áreas amorfas, e a presença de picos definidos, indicando áreas
cristalinas em 19 º e 20 º. Como mencionado anteriormente, esses picos estão
relacionados à tríplice hélice do colágeno renaturado153,154.
60
A B C D
TR/TA – Dia 0 TA – Dia 7 TR – Dia 7 TA – Dia 15
TA – Dia 0 TA – Dia 0 TA – Dia 0
E F G H
TR – Dia 15 TA – Dia 30 TR – Dia 30 TA – Dia 45
TA – Dia 0 TA – Dia 0 TA – Dia 0 TA – Dia 0
I J k L
TR – Dia 45 TA – Dia 60 TR – Dia 60 TA – Dia 90
TA – Dia 0 TA – Dia 0 TA – Dia 0 TA – Dia 0
M N O
TR – Dia 90 TA – Dia 120 TR – Dia 120
TA – Dia 0 TA – Dia 0 TA – Dia 0
Figura 8. Difratogramas das micropartículas de gelatina (LAGE) durante o armazenamento em diferentes temperaturas (T). Onde,
A: Pós-liofilizado – dia 0; B: T. ambiente – dia 7; C: T. refrigerada – dia 7; D: T. ambiente – dia 15; E: T. refrigerada – dia 15; F: T.
ambiente – dia 30; G: T. refrigerada – dia 30; H: T. ambiente – dia 45; I: T. refrigerada – dia 45; J: T. ambiente – dia 60; K: T. 61
refrigerada – dia 60; L: T. ambiente – dia 90; M: T. refrigerada – dia 90; N: T. ambiente – dia 120; O: T. refrigerada – dia 120.
Em 45 (Figura 8 H-I) e 60 dias (Figura 8 J-K) de armazenamento, é possível
notar modificações na estrutura das micropartículas nas duas temperaturas avaliadas.
Nestas condições, áreas amorfas são atenuadas, assim como, as cristalinas. Todavia,
nota-se apenas no dia 60 da temperatura ambiente (Figura 8 J) ocorre a translocação
do pico cristalino para 2θ = 28,5 °. É provável que, esse abrandamento estrutural
possa sugerir o início de perturbações das associações intramoleculares,
possivelmente em decorrência da temperatura e do longo período de
armazenamento178.
A partir do dia 90 (Figura 8 L-N), mudanças mais acentuadas na estrutura
são observadas para ambas as condições de armazenamento, com a presença de
picos cristalinos à 2θ = 19 °, 20 °, 26 °, 27 °, 28 °, 29 °, 37 ° e 39 °. Em 120 dias (Figura
8 M-O) são observados picos cristalinos à 2θ = 18 °, 19 °, 20 °, 29 °, 30 °, 31 °, 34 ° e
40 °, possivelmente indicando a aglomeração e recristalização da estrutura. Além
disso, é possível observar aumento na intensidade das regiões amorfas da estrutura.
Segundo Botrel et al. (2014)179, regiões amorfas das matrizes são em geral mais
solúveis e mais higroscópicas, facilitando assim, a aglomeração da estrutura.
Já a cristalização é um processo que inclui duas etapas: uma fase inicial
de nucleação seguida pelo crescimento do cristal179. Além do impacto negativo nas
propriedades de manuseio, tanto a aglomeração quanto a cristalização podem levar à
liberação dos componentes encapsulados na matriz 179, que neste caso, poderia
culminar na liberação dos probióticos aprisionados nas estruturas da gelatina suína.
Contudo, é importante destacar que, apesar das alterações estruturais
mencionadas, estas não foram suficientes para gerar o comprometimento da
viabilidade probiótica, que foi mantida ao longo dos 120 dias de armazenamento.
Os dados de viabilidade probiótica e DRX apresentados corroboram com
os resultados da estabilidade térmica, nos quais é notável o mínimo de degradação
das micropartículas à base de gelatina em temperatura inferior a 54 ºC. Assim, as
micropartículas obtidas neste estudo são altamente estáveis e apresentam potenciais
aplicações na indústria de alimentos.
6 CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as micropartículas
produzidas por meio da técnica de emulsificação O/A utilizando gelatina Tipo A como
62
agente encapsulante foram adequadas para microencapsulação de L. acidophilus e
L. plantarum. Enquanto que as micropartículas obtidas com alginato de sódio não
favoreceram a viabilidade dos probióticos.
A caracterização dos encapsulados em gelatina indicou micropartículas
com morfologia lisa, irregulares, e com baixa porosidade. Os resultados mostraram
interações químicas entre os agentes de incorporação e o aparecimento de bandas
espectrais características dos componentes da célula bacteriana e natureza semi-
cristalina.
Estes encapsulados apresentaram também boa eficiência de
encapsulação, dispersibilidade em água e mantiveram termicamente estáveis sob
temperaturas de processamento. Além disso, foram capazes de manter a viabilidade
probiótica durante 120 dias de armazenamento a 5 ºC e 25 ºC.
Portanto, sugere-se que a microencapsulação em gelatina por
emulsificação O/A é uma estratégia adequada e favorável à proteção de bactérias
probióticas, viabilizando futuras aplicações na área de alimentos
63
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Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro de Ciências Da Saúde Programa de Pós-Graduação em Nutrição

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

SEBASTIÃO ÂNDERSON DANTAS DA SILVA

MICROENCAPSULAÇÃO DE Lactobacillus acidophilus E Lactiplantibacillus

MICROENCAPSULAÇÃO DE Lactobacillus acidophilus E Lactiplantibacillus

Dissertação de mestrado apresentada ao

Orientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de

Coorientadora: Profa. Dra. Thaís Souza

Silva, Sebastião Ânderson Dantas da.

Dissertação (Mestrado em Nutrição) - Universidade Federal do

1. Alimentos funcionais - Dissertação. 2. Probiótico -

RN/UF/BSCCS CDU 612.39

Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474

MICROENCAPSULAÇÃO DE Lactobacillus acidophilus E Lactiplantibacillus

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição

Aprovado em 30 de novembro de 2021.

Profa. Dra. Clelia de Oliveira Lyra

Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior

Profa. Dra. Thaís Souza Passos

Profa. Dra. Karla Suzanne Florentino da Silva Chaves Damasceno

Dr. Sérgio Dantas de Oliveira Júnior

À Deus por sempre me ajudar em todos os momentos dessa breve jornada.

Antoine de Saint-Exupéry (1943)

Os probióticos são definidos como microrganismos viáveis, os quais

Probiotics are defined as viable microorganisms when ingested regularly,

Figura 1 Representação de micropartículas funcionais (microcápsula e

Tabela 1 Descrição das diferentes fases envolvidas no preparo e obtenção

4.8 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DOS PROBIÓTICOS ENCAPSULADOS

2.1 OBJETIVO GERAL

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

3.1 ALIMENTOS FUNCIONAIS

3.2.1 Família Lactobacillaceae

3.2.1.1 Lactobacillus acidophilus

3.2.1.2 Lactiplantibacillus plantarum

Neste sentido, para que o material do núcleo tenha a funcionalidade

3.3.1 Técnicas de encapsulamento para probióticos

3.4 AGENTES ENCAPSULANTES

4.2.1 Ativação dos microrganismos

4.3.1 Obtenção das formulações contendo os probióticos

Tabela 1. Descrição das diferentes fases envolvidas na obtenção das formulações

LAGE 4 4 - 0,5 ≅12 - 0,25

4.4 CARACTERIZAÇÃO DAS FORMULAÇÕES OBTIDAS

4.4.1 Microscopia Eletrônica de Varredura

4.4.2 Difração a laser

4.4.3 Espectroscopia no Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR)

4.4.4 Difração de raio X

4.5 ENUMERAÇÃO DAS CÉLULAS VIÁVEIS E DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA

Onde: EI – Eficiência de incorporação, expresso em porcentagem (%); N – Número

4.6 ENSAIO DE DISPERSIBILIDADE

Onde: m1 – massa da amostra na alíquota de 25 mL, obtida após a secagem em estufa

4.8 AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DOS PROBIÓTICOS ENCAPSULADOS

5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS FORMULAÇÕES OBTIDAS

5.1.1 Microscopia Eletrônica de Varredura

Figura 3. Microscopia Eletrônica de Varredura das formulações obtidas pela técnica de

5.1.2 Difração a laser

LAGE – L. acidophilus microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LPGE – L.

De acordo com a Tabela 2, os diâmetros médios da partícula para os

O FTIR faz parte das técnicas espectroscópicas vibracionais137 que permite

5.1.4 Difração de raio X

Figura 5. Difratogramas de raios X das partículas em pó dos encapsulados obtidos por

Tabela 3. Contagem de células viáveis antes e após encapsulação dos probióticos

LAGE – L. acidophilus microencapsulado por emulsificação O/A em gelatina suína, LPGE – L.

A eficiência da incorporação (EI) tem por objetivo avaliar a sobrevivência