MARCOS UYEDA AIVAZOGLOU

INFLUNCIA DE SOLUES DE ARMAZENAMENTO, MTODOS DE ESTERILIZAO E SUAS ASSOCIAES SOBRE A MICRODUREZA DENTINRIA RADICULAR EM DENTES HUMANOS: estudo in vitro

2009

MARCOS UYEDA AIVAZOGLOU

INFLUNCIA DE SOLUES DE ARMAZENAMENTO, MTODOS DE ESTERILIZAO E SUAS ASSOCIAES SOBRE A MICRODUREZA DENTINRIA RADICULAR EM DENTES HUMANOS: estudo in vitro

Dissertao apresentada Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos, Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de MESTRE, pelo Programa de Ps-Graduao em ODONTOLOGIA RESTAURADORA, Especialidade Endodontia.

Orientador: Prof. Dr. Claudio Antonio Talge Carvalho

So Jos dos Campos 2009

Apresentao grfica e normalizao de acordo com: Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prtico para Normalizao de Trabalhos Acadmicos da FOSJC. So Jos dos Campos: FOSJC/UNESP; 2008.

A96i

Aivazoglou, Marcos Uyeda. Influncia de solues de armazenamento, mtodos de esterilizao e suas associaes sobre a microdureza dentinria radicular em dentes humanos: estudo in vitro / Marcos Uyeda Aivazoglou. __ So Jos dos Campos : [s.n.], 2009. 113.f. : il. Dissertao (Mestrado em Odontologia Restauradora) Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos, Universidade Estadual Paulista, 2009. Orientador: Prof. Dr. Claudio Antonio Talge Carvalho. 1.Exposio a agentes biolgicos. 2. Esterilizao. 3. Testes de dureza I. Carvalho, Claudio Antonio Talge. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos. III. Ttulo. tD24

Ficha catalogrfica elaborada pelo Servio Tcnico de Biblioteca e Documentao da Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos UNESP

AUTORIZAO

Autorizo a reproduo e divulgao total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrnico, desde que citada a fonte. So Jos dos Campos, 10 de setembro de 2009. Assinatura : E-mail: marcos.aivaz@gmail.com

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Claudio Antonio Talge Carvalho (Orientador) Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos Universidade Estadual Paulista UNESP

Dra. Samira Esteves Afonso Camargo Doutora pelo Programa de Ps-Graduao em Odontologia Restauradora da Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos Universidade Estadual Paulista UNESP

Prof. Dr. Carlos Rocha Gomes Torres Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos Universidade Estadual Paulista - UNESP

So Jos dos Campos, 20 de julho de 2009.

DEDICATRIA

minha famlia que, eu sei, estar sempre l...

Aos grandes amigos que, eu sei, estaro sempre l...

Aos filhos que um dia, com sorte, viro;

me deles, tambm.

Enfim, a todos aqueles para os quais palavras de dedicao no bastam em dedicatrias.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao meu orientador Prof. Dr. Claudio Antonio Talge Carvalho, pela tranqilidade mpar e confiana sempre depositada. Obrigado por me deixar sempre vontade na relao orientadororientando; Sua maneira de trabalhar possibilitou um importante desenvolvimento em minha autonomia enquanto ser pensante e investigador que aspira carreira acadmica.

AGRADECIMENTOS

A todos os servidores da Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos UNESP; pessoas que trabalham direta e indiretamente para a formao de profissionais acima da mdia nacional. Ao Conselho da Ps-Graduao, representado pelo seu Coordenador, Prof. Adj. Clovis Pagani, por propiciar meu aprimoramento profissional e pessoal. Prof. Adj. Marcia Carneiro Valera Garakis, pelo voto de confiana e o senso humano que sempre a acompanhou, alm da experincia transmitida a cada contato. Prof. Adj. Ana Paula Martins Gomes pelo carinho e presteza em ajudar e contribuir para meu crescimento, e tambm por ter aceito o convite de fazer parte do meu Exame Geral de Qualificao. Suas observaes somaram para a melhoria na qualidade deste trabalho.

Ao Professor e Mestre Jos Benedito Oliveira Amorim, que desde a graduao despertou em mim a vontade de aprender sempre mais; agradeo-o tambm pelas contribuies assaz pertinentes quando fez parte da Banca do meu EGQ. Seguir sendo um grande exemplo para mim. Ao Tenente Torres (tambm conhecido como Prof. Dr. Carlos Rocha Gomes Torres), meu irmo-de-armas e exemplo de integridade e disciplina a ser seguido. Obrigado pelas informaes preciosas e precisas que sempre forneceu, alm de ajudar a utilizar os equipamentos do laboratrio. Ao professor e Diretor Jos Roberto Rodrigues pelo excelente trabalho que vem fazendo ao longo de sua gesto, alm do humor inteligente e das palavras de motivao que sempre transmitiu, especialmente no crdito de redao cientfica. Ao amigo-irmo-mais-velho-compadre Fbio Jos Condino Fujarra, pelo companheirismo, pela convivncia, pelo apoio de sempre, e por me safar da maior ona dos tempos de Marinha! (quando servamos juntos no Colgio Naval) Tenho certeza que nossa amizade perdurar por muito tempo!

A todo o pessoal do CEO (Centro de Especialidades Odontolgicas) de Suzano: ao gerente e coordenador de Sade Bucal Dr. Ricardo Zapata, pela flexibilidade e compreenso que me possibilitaram conciliar o trabalho e a ps-graduao, aos escriturrios Dia e Thiago, a toda a equipe de cirurgies-dentistas, s ACD (Creuza, Sula, Renata, Gislaine e Mariana), e Juliana pelo suporte na limpeza e por seus dotes culinrios... So pessoas de inestimvel valor com as quais tenho o prazer de trabalhar todos os dias! Ao querido Professor Ivan Balducci que, poucos sabem, foi meu treinador de xadrez dos 7 aos 12 anos de idade, e hoje em muito tem colaborado para o meu desenvolvimento, especialmente estatstico. O xadrez sem dvida um esporte que deveria ser mais praticado pelos jovens. Chefe do Departamento de Odontologia

Restauradora, Prof. Dr. Maria Filomena Huhtala, pelas consecutivas autorizaes para uso do laboratrio em horrios alternativos (aps as 23h e em sbados, domingos e feriados!). Muito obrigado!

Aos colegas de ps-graduao Alana, Aletia, Lorraine, Kaizo, Marianna, Humberto (meus companheiros de mestrado), Alessandra Sverberi, Paula, Lilian, Joo, Daniel, Eron, Fernandinha Mollica (do doutorado) pelo conhecimento trocado e pela convivncia, que rendeu muitas e boas risadas. Toro pelo sucesso contnuo de todos vocs! s tcnicas do Departamento de Odontologia

Restauradora, Josi, Fernanda e Clelia por me deixarem usar aquele laboratrio, s vezes alm da conta. Ainda na Restauradora, Rosngela e D. Marinete, que esto sempre a sorrir e nos transmitir simpatia. s secretrias da Ps-Graduao, Erena, Cidinha, Rose e Lilian, sempre atentas aos nossos deslizes. CBE Embrarad pela realizao da esterilizao por radiao gama dos espcimes deste trabalho. A todos que contriburam para meu desenvolvimento ao longo do curso de ps-graduao, meus sinceros agradecimentos!

Life is what happens to you while youre busy making other plans John Winston Lennon

SUMRIO

RESUMO................................................................................... 12 LISTA DE FIGURAS................................................................. LISTA DE QUADROS E TABELAS......................................... 13 15

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS................................... 17 1 INTRODUO....................................................................... 2 REVISO DA LITERATURA................................................. 19 23

2.1 Armazenamento e esterilizao de dentes extrados 23 para estudos in vitro............................................................... 2.1.1 Solues de armazenamento........................................... 23 2.1.2 Mtodos de desinfeco/esterilizao............................. 2.2 Microdureza....................................................................... 29 36

2.2.1 Definies......................................................................... 36 2.2.2 Microdureza em pesquisa odontolgica........................... 37 3 PROPOSIO....................................................................... 49

4 MATERIAL E MTODO......................................................... 50 4.1 Material utilizado............................................................... 4.2 Mtodo experimental........................................................ 50 53

4.2.1 Obteno e seleo dos dentes....................................... 53 4.2.2 Preparo dos espcimes.................................................... 54 4.2.3 Padronizao para as leituras de microdureza................ 4.2.4 Estudo do fator armazenamento...................................... 4.2.5 Estudo do fator esterilizao............................................ 4.2.6 Associao dos fatores armazenamento/esterilizao.... 4.3 Delineamento estatstico.................................................. 4.3.1 Anlise da influncia exercida pelo armazenamento....... 59 63 64 65 67 68

4.3.2 Anlise da influncia exercida pela esterilizao.............

69

4.3.3 Anlise da associao armazenamento/esterilizao...... 70 4.3.4 Validao do mtodo estatstico adotado........................ 73

5 RESULTADOS....................................................................... 75 5.1 Efeitos do armazenamento............................................... 77 5.2 Efeitos da esterilizao..................................................... 80 5.3 Efeitos da associao armazenamento/esterilizao.... 82 5.4 Validao do mtodo estatstico adotado...................... 86

5.4.1 Independncia.................................................................. 87 5.4.2 Homocedasticidade.......................................................... 88

5.4.3 Distribuio normal........................................................... 89 6 DISCUSSO.......................................................................... 6.1 Literatura e metodologia.................................................. 6.2 Discusso dos resultados................................................ 6.2.1 Armazenamento............................................................... 6.2.2 Esterilizao e associaes............................................. 7 CONCLUSES...................................................................... 8 REFERNCIAS............ ANEXOS................................................................................... 91 91 93 93 95 98 99 109

ABSTRACT............................................................................... 113

Aivazoglou MU. Influncia de solues de armazenamento, mtodos de esterilizao e suas associaes sobre a microdureza dentinria radicular em dentes humanos: estudo in vitro [dissertao]. So Jos dos Campos: Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho - UNESP; 2009.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a ao das solues de armazenamento: gua destilada (G1), soluo de timol a 0,05%(G2), formalina a 10%(G3), e hipoclorito de sdio a 1%(G4), bem como os mtodos de esterilizao por autoclave (A) e radiao gama (B), e as associaes dos dois fatores, sobre a microdureza da dentina radicular de terceiros molares extrados. Os dados obtidos foram submetidos aos testes t de Student, ANOVA a 2 e 3 fatores, e teste de Tukey, todos com =0,05. Quanto ao armazenamento, o G1(nos dois perodos avaliados) foi o nico grupo que no alterou significantemente a microdureza, sendo seguido pelos grupos G2 e G3 (7 dias), G2 e G3 (28 dias), e G4 (7 e 28 dias), tendo estes dois ltimos subgrupos apresentado as maiores perdas de microdureza. Na anlise da esterilizao isoladamente, no houve diferena significante para os 2 mtodos quando comparadas as microdurezas iniciais e aps a esterilizao (autoclave: p=0,144; raios gama: p=0,827), apesar da esterilizao por autoclave ter induzido diferenas significantes no grupo armazenado por 28 dias em gua destilada. Entretanto, estudada a interao de todos os fatores, encontraram-se diferenas significantes quanto soluo empregada, mtodo de esterilizao e interaes entre eles (p<0,05). Com base nos dados analisados pde-se concluir que o armazenamento em gua destilada no alterou a microdureza dentinria radicular, e sua associao esterilizao por radiao gama foi o melhor mtodo para o armazenamento e esterilizao de dentes, no que diz respeito s influncias sobre a varivel estudada, sendo indicados para dentes extrados a serem utilizados em pesquisa.

Palavras-chave: Exposio a Agentes Biolgicos. Esterilizao. Testes de Dureza. Dentina. Raiz Dentria.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Desenho esquemtico da geometria do indentador tipo Vickers e a impresso por ele realizada (Modificado de Callister, WD. Materials science and engineering - an introduction. New York, 2007).........................................

37

Figura 2 - Desenho esquemtico ilustrando o plano de seco para obteno das duas metades de cada raiz, com a face mdia em comum..................................................... 54 Figura 3 - Procedimento de corte dos dentes e molde de silicona utilizado para a incluso das razes em resina............... Figura 4 - Razes incluidas em resina acrlica, com a face mdia voltada para cima............................................................

55

56

Figura 5 - Fita adesiva colada ao centro da placa de vidro, com o molde de silicona em posio, detalhe da remoo da face externa da fita com auxlio de uma esptula de insero n 1, razes devidamente posicionadas............. 57 Figura 6 - Segunda placa de vidro em posio, aps a insero da resina acrlica no conjunto......................................... Figura 7 - Esquema da padronizao para observaes de microdureza.................................................................... Figura 8 - Politriz circular DP-10 do Departamento de Odontologia Restauradora da FOSJC-UNESP.............. Figura 9 - Microdurmetro Microhardness Tester FM 700 do Departameto de Odontologia Restauradora da FOSJCUNESP............................................................................ Figura 10 - Desenho esquemtico das indentaes a 500 m da luz do canal..................................................................... Figura 11 - Disposio/destinao dos 16 blocos aps sorteio........

58

59

60

61

61 62

Figura 12 - Histograma obtido aps teste de Kolmogorov-Smirnov, confirmando o carter de normalidade para os valores de microdureza inicial (Md1) de todos os espcimes..... Figura 13 - Grfico tipo P-Plot da distribuio amostral em relao ao valor normal esperado............................................... Figura 14 - Grfico dos grupos experimentais quanto ao armazenamento.............................................................. Figura 15 - Grfico da interao dos fatores soluo e perodo de armazenamento, obtido a partir da diferena [(MD1) (MD2)]............................................................................. Figura 16 - Grfico da interao dos 3 fatores aps a esterilizao.................................................................... Figura 17 - Grfico de disperso dos resduos na ANOVA a 2 fatores realizada aps o armazenamento....................... Figura 18 - Grfico de disperso dos resduos na ANOVA a 3 fatores realizada aps a esterilizao............................. Figura 19 - Grfico mostrando distribuio normal dos resduos para ANOVA a 2 fatores ps-armazenamento............... Figura 20 - Grfico mostrando distribuio normal dos resduos da ANOVA 3 fatores ps-esterilizao................................

72

76

78

79

85

87

88

90

90

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1 - Material utilizado........................................................... Quadro 2 - Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos do armazenamento........................................... Quadro 3 - Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos da esterilizao................................................. Quadro 4 - Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos da associao armazenamento/esterilizao... Tabela 1 - Valores mdios de microdureza e desvio-padro observados nos diferentes grupos e subgrupos de cada anlise................................................................. Tabela 2 - Teste t de Student aps armazenamento.................... Tabela 3 - ANOVA a 2 fatores aps o armazenamento................ Tabela 4 - Anlise do armazenamento. Distribuio dos conjuntos homogneos aps teste de Tukey............... Tabela 5 - Teste t de Student para o fator esterilizao................ Tabela 6 - Teste t de Student para o mtodo de esterilizao por autoclave em diferentes perodos de armazenamento em gua destilada........................................................ Tabela 7 - Teste t de Student para o mtodo de esterilizao por radiao gama em diferentes perodos de armazenamento em gua destilada............................. Tabela 8 - Testes t de Student para o mtodo de esterilizao por autoclave................................................................ Tabela 9 - Testes t de Student para o mtodo de esterilizao por radiao gama........................................................

50

68

70

71

75 77 79

80 81

82

82

83

84

Tabela 10 - Teste ANOVA a 3 fatores realizado aps as esterilizaes................................................................ Tabela 11 - Resultado do teste de Tukey aps ANOVA a 3 fatores........................................................................... Tabela 12 - Resultado do teste de Levene para ANOVA a 2 fatores ps-armazenamento......................................... Tabela 13 - Resultado do teste de Hartley-Cochran-Bartlett para ANOVA a 3 fatores ps-esterilizao...........................

85

86

89

89

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

m = Micrometro N = Micronewton AEAF = gua Eletroltica cida Forte ANOVA = Anlise de Varincia Ca(OH)2 = Hidrxido de Clcio CDC = Centers for Disease Control and Prevention CDTA = cido Ciclohexano-1,2-Diamino Tetra-Actico DP = Desvio-Padro EDTA = cido Etilenodiamino Tetra-Actico EDTAC = cido Etilenodiamino Tetra-Actico com Cetavlon EGTA = cido Etileno Glicol Tetra-Actco EITF = Espectrometria Infra-Vermelha com Transformada de Fourier g = Grama G1 = Grupo 1 (gua Destilada) G2 = Grupo 2 (Soluo de Timol a 0,05%) G3 = Grupo 3 (Soluo de Formalina a 10%) G4 = Grupo 4 (Soluo de Hipoclorito de Sdio a 1%) Gl = Graus de Liberdade h = Hora H0 = L-se Ag zero (Hiptese de Nulidade) H1 = L-se Ag um H2O = gua H2O2 = Perxido de Hidrognio HV = Vickers Hardness ISO = International Organization for Standardization

JAC = Juno Amelocementria kg = Quilograma kgf/cm2 = Quilograma-fora por Centmetro Quadrado kGy = Quilogray krad = Quilorad M = Molar Md1 = Microdureza Inicial Md2 = Microdureza Ps-Armazenamento Md3 = Microdureza Ps-Esterilizao min = Minuto ml = Mililitro mm = Milmetro mN = Milinewton n = Nmero de Espcimes da Amostra NaF = Fluoreto de Sdio NaOCl = Hipoclorito de Sdio Ni-Ti = Nquel-Titnio Nm = Nanometro Normal P-Plot = Normal Probabilty Plot C = Grau Celsius OSHA = Ocupational Safety and Health Administration p = Fator p de Probabilidade em Estatstica pH = Potencial Hidrogeninico P-Plot = Probality Plot s = Segundo SSBH = Soluo Salina Balanceada de Hank t = Fator t do Teste de Student VHN = Vickers Hardness Number

1 INTRODUO

Dentes extrados so amplamente utilizados em trabalhos de pesquisa odontolgica, seja em estudos microbiolgicos (Fagrell et al.25, 2008; Fimple et al.27, 2008; Norrington et al.54, 2008; Shabahang et al.67, 2008), morfolgicos (Catros et al.16, 2008; Esclassan Noirrit et al.24, 2008; Manjunath et al.44, 2008), biomecnicos (Barjau-Escribano et al.6, 2006; Burcak Cengiz et al.13, 2006; Soares et al.73, 2008), relativos a novos materiais (Alani et al.1, 2008; Coniglio et al.17, 2008) ou a novas tcnicas (Gaggl et al.29, 2007; Sengun et al.66, 2008). Tais dentes devem ser considerados infectantes e os agentes infecciosos a eles associados precisam ser eliminados, sendo desejveis mnimas alteraes estruturais e nas propriedades

biomecnicas dos tecidos, ou, idealmente, que tais no ocorram durante este processo (Brauer et al.12, 2008; Moscovich et al.51, 1999; White et al.83, 1994). De acordo com o Center for Disease Control and Prevention (CDC), dentes extrados livres de amlgama devem ser esterilizados em autoclave por 40 minutos e os que contenham amlgama devem ser armazenados em soluo de formalina a 10% por duas semanas antes de sua utilizao, procedimento efetivo na desinfeco tanto das estruturas externas quanto internas dos dentes (Kohn et al.39, 2003). Normalmente os dentes extrados so armazenados em alguma soluo aps sua obteno e antes da esterilizao. Entretanto, o efeito das solues de armazenamento e a esterilizao sobre esmalte e dentina no est claro (Lee et al.41, 2007). Diferentes meios de armazenamento e mtodos de esterilizao tm sido estudados, bem como suas implicaes sobre

20

algumas propriedades do substrato dental, tendo sido encontrados resultados divergentes. Segundo reviso realizada por DeWald21 (1997) acerca da influncia do armazenamento e esterilizao de dentes em estudos de adeso, resultados muito variveis foram atribudos ao armazenamento em formalina 10%, enquanto a utilizao de esterilizao qumica com calor (chemiclave) e em autoclave produziram resultados mais prximos aos grupos controle. Ainda segundo esse estudo, a esterilizao por xido de etileno, mesmo tendo produzido resultados semelhantes aos grupos controle, foi provada como ineficiente na eliminao total dos

microrganismos, afirmao ltima de acordo com estudo conduzido por WhiteHays84 (1995). Resultados diferentes foram encontrados por Lee et al.41 (2007), que avaliaram os efeitos de meios de armazenamento e mtodos de esterilizao sobre a fora adesiva na dentina de dentes bovinos, tendo concludo que a imerso em soluo de formalina 10% representou a melhor opo tanto para armazenamento quanto para desinfeco dos dentes, e deveria ser indicada previamente a estudos de adeso. Segundo este autor, a esterilizao em autoclave afetou negativamente a fora adesiva na metade dos grupos testados. J segundo Zheng et al.89 (2005), em estudo que utilizou diferentes meios de armazenamento em testes adesivos envolvendo micro-trao, apesar de no ter havido diferenas estatisticamente significantes entre o grupo armazenado em formalina 10% e o controle, o congelamento dos dentes a -20 C e a soluo de cloramina a 1% foram apontados como meios preferenciais de armazenamento quando no forem disponveis dentes recm-extrados em nmero suficiente para testes de fora adesiva. Em adio, Brnnstrm et al.11 (1992), em trabalho no qual os dentes foram congelados ou armazenados em soluo de cloramina a 1%, concluram ser prefervel a primeira

21

alternativa em relao ltima quando da realizao de estudos de infiltrao e fora adesiva. No estudo de Pashley et al.60 (1993), no foram encontradas diferenas estatisticamente significantes na permeabilidade dentinria bem como na fora adesiva em dentes submetidos a esterilizao por xido de etileno ou autoclave quando comparados ao grupo controle, no esterilizado. Outro mtodo de esterilizao passvel de aplicao em dentes extrados a radiao gama, que segundo estudos realizados no causa alteraes morfolgicas na dentina (DeWald21, 1997; Sperandio et al.75, 2001) nem no esmalte (Rodrigues et al.62, 2004) tendo como inconveniente o fato de no ser facilmente disponvel e apresentar custo elevado quando comparado a outros mtodos (Lee et al.41, 2007). A maior parte dos estudos com radiao gama em pesquisa odontolgica utilizou a dose comumente empregada na esterilizao de artigos mdicos, que de 25 kGy (Amaechi et al.2, 1998; Amaechi et al.3, 1999; Moscovich et al.51, 1999; Rodrigues et al.62, 2004). Dentre as propriedades fsicas da estrutura dental, a microdureza tem sido largamente estudada, tendo Panighi e G'Sell57 (1993) encontrado uma forte correlao entre microdureza e fora

adesiva tanto para esmalte quanto para dentina. Os sistemas adesivos continuam em franca evoluo, com aplicao no apenas em dentstica, mas tambm na cimentao de retentores intra-radiculares livres de metal (Esclassan Noirrit et al.24, 2008; Wrbas et al.86, 2007) e inclusive na obturao de canais radiculares (Sly et al.72, 2007). Deste modo, vrios foram os trabalhos que estudaram as propriedades do esmalte e da dentina coronria, entretanto no foram encontrados trabalhos que tenham avaliado a ao de diferentes solues de armazenamento e meios de esterilizao, bem como a associao destes sobre a dentina radicular no que diz respeito sua microdureza.

22

Esta dissertao visa a contribuir para o conhecimento relacionado ao contexto apresentado, uma vez que a maioria dos estudos em endodontia especialmente no tocante adeso dentinria radicular realizada por meio de testes in vitro utilizando dentes extrados, nos quais no apenas fatores relacionados adeso devem ser levados em considerao, como tambm as propriedades biomecnicas do

remanescente radicular, dentre as quais enquadrando-se a microdureza dentinria.

2 REVISO DA LITERATURA

Por se tratar de um estudo voltado para a pesquisa odontolgica em si, a reviso de literatura desta dissertao agrega uma gama de estudos envolvendo variadas metodologias. Visando a facilitar a leitura, encontra-se dividida nas seguintes sees primrias e

secundrias:

a) armazenamento

esterilizao

de

dentes

extrados para estudos in vitro: - solues de armazenamento; - mtodos de desinfeco/esterilizao; b) microdureza: - definies; - microdureza em pesquisa odontolgica.

2.1 Armazenamento e esterilizao de dentes extrados para estudos in vitro

2.1.1 Solues de armazenamento

24

Brnnstrm

et

al.11

(1992)

avaliaram

efeito

do

armazenamento de dentes e a limpeza da cavidade na formao de desadaptaes em restauraes classe II confeccionadas com cimento de ionmero de vidro e resina composta. Foram utilizados o congelamento e o armazenamento em soluo de cloramina a 1%, associados limpeza das cavidades com soluo contendo EDTA a 0,2% e NaF a 1%. Em todas as cavidades utilizaram-se os mesmos materiais de proteo (cimento de ionmero de vidro) e restaurao (resina composta). Houve diferenas estatisticamente significantes entre os grupos: nos dentes armazenados em cloramina houve maior nmero de desadaptaes e estas apresentaram maior tamanho, quando este grupo foi comparado ao dos dentes previamente congelados. Assim, os autores concluram que em dentes a serem utilizados para estudos adesivos e de infiltrao, deve ser prefervel o congelamento ao armazenamento em soluo de cloramina a 1%. Miears et al.48 (1995) avaliaram a influncia da presena ou ausncia de umidade antes da aplicao de um sistema adesivo, e diferentes perodos de ps-armazenamento em gua destilada sobre a resistncia adesiva ao cisalhamento na dentina de molares humanos extrados. No foram encontradas diferenas estatisticamente

significantes em nenhum dos grupos experimentais quanto s variveis estudadas. Tanto a umidificao ou secagem do substrato antes da aplicao do sistema adesivo quanto o armazenamento dos espcimes em gua destilada por perodos diferentes (24 h e 90 dias, a 37 C) pareceram no exercer efeitos sobre a resistncia adesiva ao cisalhamento. Camps et al.15 (1996) conduziram estudo com a finalidade de avaliar a influncia da criopreservao e armazenamento na microinfiltrao de dois sistemas adesivos. Para tanto foram utilizados dentes recm-extrados nas seguintes condies: sem nenhum

tratamento; criopreservados; e armazenados em soluo de cloramina a

25

0,5% a 4 C (refrigerados). A criopreservao definida como a preservao de tecidos anatmicos a temperaturas muito baixas, por perodos variveis, em vapor de nitrognio lquido. Nesse estudo foram confeccionadas restauraes classe V em resina composta aps os diferentes perodos de armazenamento nos diferentes meios. Os resultados revelaram no haver diferenas estatisticamente significantes na microinfiltrao entre os grupos de dentes criopreservados,

refrigerados (cloramina 0,5% a 4 C) por 12 dias e os recm-extrados. Entretanto, o armazenamento em soluo de cloramina por 48 dias ou mais foi responsvel por aumentar em 4 vezes os valores de microinfiltrao em seus respectivos grupos. Ainda assim no foi encontrado nenhum tipo de correlao linear ou exponencial entre perodo de armazenamento e microinfiltrao. Os autores concluram que o armazenamento em soluo de cloramina a 0,5% a 4 C por 48 dias ou mais pode causar aumento na microinfiltrao, enquanto a

criopreservao por 13 semanas ou armazenamento na soluo anterior por perodos inferiores no parece alterar os valores de microinfiltrao. Strawn et al.76 (1996), se propuseram a determinar os efeitos do armazenamento sobre a dentina, por meio de uma anlise espectroscpica. A partir de terceiros molares recm-extrados foram obtidos discos de dentina de 0,75 mm de espessura (de seces paralelas ao plano oclusal dos dentes), os quais foram armazenados nas seguintes solues: gua destilada com timol a 0,02%; gua purificada e filtrada; soluo tampo de fosfato com 0,02% de timol; lcool a 70%; e soluo de formalina a 10%. As anlises foram realizadas utilizando-se a espectrometria infra-vermelha com transformada de Fourier (EITF), nos perodos de 0, 1, 2, 7, 14, 21 e 28 dias. Os resultados das anlises no espectro infra-vermelho no mostraram diferenas significantes quanto s posies de pico referentes ao colgeno ou minerais para qualquer soluo a qualquer perodo de armazenamento. Houve diferenas, entretanto, nas intensidades de pico da dentina armazenada em gua

26

destilada, gua purificada e filtrada, e soluo tampo de fosfato ao longo do tempo. Concluram os autores que mudanas na qumica superficial e nas propriedades pticas da dentina ocorrem em funo da soluo e perodo de armazenamento, o que deve ser considerado quando se estuda a dentina. Tonami et al.79 (1996) submeteram dentes bovinos ao congelamento ou gua fervente antes de realizarem ensaios de resistncia tenso. Os tempos de congelamento foram de 7 dias, 4 semanas e 1 ano. O grupo no qual se utilizou gua fervente foi submetido a este meio por 45 min. Os grupos experimentais foram comparados a controle composto de dentes recm-extrados (menos de 8 h aps extrao). Os resultados encontrados pelos autores os permitiram concluir que o congelamento em todos os perodos no alterou significantemente a resistncia tenso, enquanto a fervura em gua resultou em queda significante nos valores da referida propriedade. Em estudo complexo, Titley et al.77 (1998) se propuseram a verificar a influncia de 10 diferentes condies de armazenamento e da radiao gama sobre a resistncia adesiva ao cisalhamento na dentina de incisivos bovinos, tendo encontrado resultados divergentes aos relatados em estudos congneres. Segundo os autores, 4 dos 11 grupos experimentais (radiao gama, metanol e glutaraldedo) armazenamento em soluo de timol, em resistncias adesivas

resultaram

significantemente menores, sendo os menos recomendveis para aplicao em dentes a serem submetidos a estudos de resistncia adesiva ao cisalhamento. Alm disso, os resultados mostraram no ter havido diferenas entre os grupos armazenados em gua destilada congelada, solues de formalina a 10%, NaOCl a 1%, cloramina-T a 0,5%, homofix (soluo contendo 70 ml de gua, 30 ml de glicerol e 4 g de fenol), e gua destilada a 4 C (por 2 meses). Ghersel et al.30 (2001), avaliaram a influncia do mtodo de armazenamento na microinfiltrao em segundos molares decduos

27

restaurados

com

diferentes

sistemas

adesivos.

Os

mtodos

de

armazenamento estudados foram: o congelamento em soluo fisiolgica; meio hidratado (soluo fisiolgica em refrigerador); e meio desidratado (mantidos secos em recipiente aberto). Todos os dentes foram inicialmente autoclavados antes da diviso entre os grupos experimentais. Foram confeccionadas restauraes classe II nas duas faces proximais, utilizando diferentes sistemas adesivos em cada cavidade, sendo os espcimes submetidos termociclagem e posterior anlise da

microinfiltrao marginal. Foi concludo que no houve diferenas significantes entre os tipos de armazenamento, tendo sido constatada microinfiltrao superior e estatisticamente significante nas paredes cervicais quando comparadas s paredes axiais dos preparos. Habelitz et al.33 (2002) estudaram as propriedades nanomecnicas em esmalte e dentina de terceiros molares extrados, aps a utilizao de diferentes substncias de armazenamento (gua deionizada, soluo salina de cloreto de clcio, e soluo salina balanceada de Hank - SSBH) nos perodos de 1 e 2 semanas. Os dentes foram previamente esterilizados por baixa dose de radiao gama (no especificada pelos autores), e armazenadas em gua destilada a 4 C at sua utilizao. Nanoindentaes com cargas de 1500 e 750 N foram realizadas (em esmalte e dentina, respectivamente), resultando em penetraes de 300 a 400 nm de profundidade. Os resultados encontrados mostraram que o armazenamento tanto em soluo salina de cloreto de clcio quanto em gua deionizada alteraram significantemente o mdulo de elasticidade do esmalte, enquanto o armazenamento em SSBH no o fez. Quanto dureza do esmalte e dentina, foram verificados efeitos semelhantes. Os autores concluram que, visando manuteno das propriedades fsicas dos tecidos dentais recomendvel seu armazenamento em SSBH. A International Organization for Standardization (ISO)35 (2003), em sua especificao tcnica nmero 11405, segunda edio,

28

trata de testes de adeso estrutura dental. Na referida especificao, dada preferncia utilizao de dentes recm-extrados para este tipo de estudo. Contudo, na inviabilidade de se dispor de dentes nessa condio, a recomendao que imediatamente aps a extrao, os dentes sejam lavados abundantemente em gua corrente e que restos de sangue e tecidos aderidos sejam removidos. Em seguida, os dentes devem ser armazenados em gua destilada ou soluo de cloramina-T a 0,5% por, no mximo, uma semana, e depois armazenados definitivamente em gua destilada a 4 C ou congelados a pelo menos -5 C. No recomendada a utilizao de qualquer outro agente qumico devido ao risco de ocorrer absoro deste pelo dente e consequentemente alteraes na estrutura dental. Em estudo de resistncia adesiva micro-trao, Zheng et al.89 (2005) se propuseram a avaliar a influncia exercida por diferentes meios de armazenamento. Utilizaram-se pr-molares humanos que, imediatamente aps a extrao, foram armazenados nos seguintes meios: soluo de timol a 0,02%; soluo de formalina a 10%; soluo de cloramina a 1%; gua destilada a 4 C; e congelamento em gua destilada a -20 C. Os sistemas adesivos e restauraes em resina composta foram aplicados aps os perodos de 10 e 90 dias de armazenamento. Os resultados mostraram diferenas significantes na resistncia adesiva micro-trao entre os grupos. Comparados aos dentes que no foram submetidos ao armazenamento, os grupos armazenados em gua destilada a 4 C e em soluo de timol a 0,02% resultaram em valores significantemente menores da varivel estudada. Os diferentes perodos de armazenamento no exerceram efeitos. Concluram os autores que os meios e mtodos de armazenamento de dentes podem influenciar a resistncia adesiva micro-trao.

Recomendaram ainda a opo pelo congelamento ou armazenamento em cloramina a 1% quando no houver nmero suficiente de dentes recmextrados para se realizar estudo adesivo.

29

Utilizando dentes bovinos, Lee et al.41 (2007) avaliaram a influncia do armazenamento e esterilizao sobre a resistncia adesiva em dentina. Foram testadas as seguintes solues de armazenamento: gua destilada; soluo de cloreto de sdio a 0,9%; soluo de cloraminaT a 0,5%; soluo de NaOCl a 5,25%; soluo de glutaraldedo a 2%; e soluo de formalina a 10%. Em todos os grupos o armazenamento se deu por 60 dias. Como mtodos de esterilizao foram utilizados a autoclave e o armazenamento em soluo de formalina a 10% por 14 dias (sem exposio adicional a este meio para o grupo j armazenado na referida soluo). Os resultados encontrados mostraram reduo

significante na resistncia adesiva dos espcimes armazenados na soluo de NaOCl quando comparados aos demais grupos. A esterilizao em autoclave afetou negativamente os grupos inicialmente armazenados em gua destilada e formalina a 10%, enquanto a esterilizao apenas em formalina no exerceu efeito significante sobre a resistncia adesiva.

2.1.2 Mtodos de desinfeco/esterilizao

White et al.83 (1994), em estudo envolvendo radiao gama, tiveram como objetivos avaliar os efeitos de vrios mtodos de esterilizao (radiao gama, autoclave, calor seco, e xido de etileno) sobre a estrutura e funo dentinria em termos espectroscpicos e de micro-infiltrao - bem como definir parmetros de radiao gama para esterilizao de dentes extrados. Os dentes utilizados foram

armazenados previamente em soluo salina tampo de fosfato contendo 0,02% de timol (para controlar o crescimento bacteriano). Para determinao da dose efetiva de radiao gama para esterilizar os dentes, foi inoculada em reservatrios criados aps o preparo

30

biomecnico (utilizando NaOCl a 5,25%) e obturao dos canais radiculares, a bactria B. subtilis, comumente utilizada em estudos microbiolgicos por sua conhecida resistncia. Segundo os autores, com uma dose de 173 krad (o equivalente a 1,73 kGy), j foi conseguida a esterilizao dos espcimes; alm disso, as anlises espectroscpicas no detectaram alteraes quando da utilizao deste mtodo, enquanto todos os demais mtodos de esterilizao induziram algum tipo de alterao detectvel. A radiao gama tambm no alterou as propriedades dentinrias com relao permeabilidade. No intuito de investigar a liberao de mercrio quando realizada a esterilizao, em autoclave, de dentes contendo restauraes de amlgama, Parsell et al.58 (1996) submeteram a este mtodo de esterilizao uma quantidade de amlgama simulando a de 175 dentes restaurados com este material. Foi constatado que os vapores de mercrio provenientes deste processo alcanaram nveis

significantemente maiores do que os limites aceitos pela Ocupational Safety and Health Administration (OSHA), contra-indicando este

procedimento, que consiste em risco desnecessrio sade dos profissionais de odontologia, uma vez que podem ser selecionados dentes que no contenham amlgama para posterior utilizao em ensino/pesquisa. Importante estudo de reviso foi realizado por DeWald21 (1997), envolvendo consideraes acerca do controle de infeco em dentes extrados para utilizao em estudos adesivos in vitro. Foram revisados artigos publicados que tratassem dos efeitos de diferentes mtodos de desinfeco e esterilizao sobre os dentes, como alteraes estruturais e da permeabilidade dentinria e seus efeitos em estudos de adeso. Segundo o autor, os meios e mtodos de

desinfeco/esterilizao mais estudados foram o armazenamento em formalina a 10%, esterilizao qumica com calor, autoclave, xido de etileno e radiao gama. Os resultados dos estudos empregando

31

armazenamento em formalina a 10% mostraram resultados controversos; os mtodos por autoclave e esterilizao qumica produziram resultados comparveis aos controles utilizados nos estudos; a radiao gama no produziu alteraes estruturais na dentina, mas teve seus efeitos sobre a adeso - at ento - pouco estudados; e o xido de etileno, embora produzindo resultados de adeso semelhantes aos controles, foi provado como ineficaz no tocante esterilizao de dentes propriamente dita. Concluiu o autor preconizando o uso dos mtodos de esterilizao qumica e por autoclave para preveno de contaminao cruzada durante estudos in vitro envolvendo adeso. Amaechi et al.2 (1998) estudaram a eficcia de diferentes mtodos de esterilizao em dentes destinados a testes intra-orais de cariogenicidade, bem como suas influncias sobre o processo de desmineralizao do esmalte. Foram utilizados incisivos bovinos divididos entre o grupo controle e os seguintes mtodos de esterilizao: radiao gama (dose de 25 kGy); autoclave (121 C por 15 min); soluo de NaOCl a 12% por 24 h; e soluo de iodopovidona a 7,5% por 24 h. Os procedimentos para contagem dos microrganismos viveis aps cada mtodo de esterilizao foram realizados aps incubao dos espcimes por 24 h a 37 C em gar infuso de crebro e corao e em garsangue. Leses artificiais de crie foram produzidas utilizando-se soluo cida tamponada (pH 4,5). As perdas minerais e profundidade das leses foram quantificadas micro-radiograficamente. Houve crescimento

bacteriano apenas no grupo controle (em ambos os meios de cultura utilizados). Os autores relataram as seguintes alteraes induzidas ao esmalte pelos diferentes mtodos: a radiao gama provocou alterao de cor (cream discolouration); o NaOCl provocou clareamento; e a iodopovidona provocou leses em forma de manchas brancas. Com relao s perdas minerais e profundidade das leses no houve diferenas significantes entre os grupos experimentais e o controle, entretanto, depois do grupo controle, o grupo da radiao gama foi o que

32

mostrou menor perda mineral, tendo os autores concludo se tratar do mtodo mais aceitvel para esterilizao de esmalte a ser utilizado em estudos de cariogenicidade intra-oral. Em estudo subsequente, Amaechi et al.3 (1999), avaliaram os efeitos da esterilizao sobre a integridade estrutural das cries artificiais produzidas para estudos de cariogenicidade intra-oral. Aps a confeco de leses de crie artificiais em dentes bovinos, estes foram divididos em duas metades (uma servindo de controle e a outra submetida a um dos mtodos de esterilizao j descritos no trabalho anterior, dos mesmos autores). Aps a esterilizao, os espcimes dos grupos experimentais, bem como os do grupo controle (no esterilizado), foram incubados em meios de cultura por at 7 dias a 37 C, sob condies de aerobiose e anaerobiose. A perda mineral e profundidade das leses foram ento quantificadas por meio de micro-radiografias transversas. Novamente o crescimento bacteriano ocorreu apenas no grupo controle, tendo os autores observado os mesmos fenmenos, sobre a colorao do esmalte, relatados no estudo anterior. A autoclavagem dos espcimes, bem como a exposio s solues de NaOCl e iodopovidona resultaram em desmineralizao adicional das leses. Novamente foi apontada a esterilizao por radiao gama como o mtodo mais aceitvel considerando-se os efeitos adversos dos outros mtodos em estudo. No estudo de Moscovich et al.51 (1999), utilizou-se a radiao gama (dose de 25 kGy) como meio de esterilizao de dentes humanos extrados, tendo sido concludo que este processo - juntamente com o congelamento em gua a -18 C por 12 dias - no causou efeitos na microdureza da dentina coronria. Dominici et al.22 (2001) conduziram estudo com o objetivo de avaliar a eficcia de diferentes mtodos de desinfeco/esterilizao em dentes extrados a serem utilizados para fins educacionais. O microrganismo utilizado neste estudo foi o Bacillus stearothermophilus,

33

uma bactria resistente ao calor e frequentemente utilizada em estudos microbiolgicos. Foram empregados dentes humanos hgidos

armazenados em soluo salina at o momento da utilizao, os quais tiveram os tecidos pulpares removidos via acesso coronrio e inoculados com o referido microrganismo no interior dos canais radiculares. Foram testados os seguintes mtodos de desinfeco/esterilizao: imerso em solues de NaOCl em vrias concentraes (1,3; 2,6 e 5,25%) por 7 dias; imerso em soluo de formalina a 10% por diferentes perodos (2, 4 e 7 dias); imerso em amnio quaternrio a 0,28% por 7 dias; imerso em glutaraldedo a 2% por 7 dias; ciclos de autoclavagem com diferentes duraes (20 e 40 min); e imerso em soluo salina por 7 dias (grupo controle). Os dois nicos grupos capazes de impedir a recuperao do microrganismo utilizado, aps os processos de esterilizao, foram a autoclavagem (ciclo de 40 min) e o armazenamento em formalina a 10% por uma semana. Segundo trabalho de Sperandio et al.75 (2001), no qual estudou-se o efeito da esterilizao por radiao gama (25 kGy) sobre a morfologia dentinria e resistncia adesiva em pr-molares humanos extrados, no foram encontradas diferenas estatisticamente

significantes entre o grupo controle e o submetido radiao, tanto no tangente morfologia dentinria (verificada por microscopia eletrnica de varredura), quanto resistncia adesiva ao cisalhamento. Os autores concluram que a radiao gama no afetou as variveis em estudo. Uma compilao feita por Kohn et al.39 (2003) resultou em documento publicado pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC) com as diretrizes no tocante ao controle de infeco nas atividades relacionadas aos cuidados com a sade bucal. Neste documento so dadas introdutoriamente definies acerca de vrios conceitos envolvidos no tema, e posteriormente so desenvolvidas recomendaes a serem seguidas. Foi includa neste documento uma seo que trata do manuseio de dentes extrados, com uma sub-seo a respeito do uso de dentes

34

extrados para fins educacionais. Com relao a este tpico, o CDC recomenda a esterilizao dos dentes em autoclave previamente utilizao. Dentes contendo amlgama no devem ser autoclavados devido ao risco relacionado aos vapores de mercrio resultantes deste processo (como j mencionado no estudo de Parsell et al.58, 1996), devendo nesse caso ser utilizado o armazenamento em formalina a 10% por 14 dias, o que seria eficaz na desinfeco tanto da superfcie externa quanto interna dos dentes. O documento em questo afirma que, para fins educacionais (especificamente no uso em atividades pr-clnicas em instituies de ensino odontolgico), a esterilizao em autoclave parece no induzir a alteraes que prejudiquem o aprendizado dos alunos; entretanto no se sabe se este processo afeta a estrutura dental sob o ponto de vista de estudos em pesquisa odontolgica. Rodrigues et al.62 (2004) objetivaram avaliar em seu estudo a influncia da radiao gama sobre as propriedades mecnicas do esmalte e a desmineralizao in vitro. Foram utilizados terceiros molares humanos hgidos divididos em 2 grupos: irradiados por 25 kGy de radiao gama; e no irradiados (controle). Sequencialmente obteno dos valores de microdureza (Knoop: 25 g por 5 s) de ambos os grupos, os espcimes foram submetidos ciclagem de pH para obteno dos dados referentes perda mineral. Os autores chamaram a ateno para a mudana na colorao das estruturas dentais aps a irradiao. Os resultados mostraram que no foram induzidas alteraes nas

propriedades mecnicas do esmalte por ao da radiao gama, uma vez que os valores de microdureza obtidos no apresentaram diferenas significantes. Da mesma maneira, a resistncia desmineralizao in vitro no foi alterada. Em outro estudo relacionado utilizao de dentes extrados para fins educacionais, Kumar et al.40 (2005) avaliaram os seguintes mtodos de desinfeco/esterilizao: imerso em formalina a 10% por 7 dias; imerso em perxido de hidrognio a 3% por 7 dias;

35

imerso em NaOCl a 2,6% por 7 dias; fervura em gua a 100 C por 20 min; autoclavagem (ciclo de 30 min); e imerso em soluo salina fisiolgica por 7 dias (grupo controle). Utilizaram-se dentes humanos extrados por motivo periodontal. Aps os tratamentos supracitados, os espcimes foram incubados em meio de cultura por 48 h. Os resultados mostraram que apenas a autoclavagem e o armazenamento em formalina a 10% foram eficazes na desinfeco/esterilizao dos espcimes, tendo os autores concludo que tais mtodos devem ser eficazes para este propsito. No trabalho de Brauer et al.12 (2008) tambm foi estudada a radiao gama como mtodo de esterilizao de dentes. Os autores utilizaram terceiros molares extrados que foram armazenados em SSBH at o momento de sua utilizao. As variveis experimentais foram obtidas por meio de ensaios de dureza utilizando nanoindentadores tipo Berkovich com cargas de 400 e 2000 N, respectivamente em dentina e esmalte, que forneceram valores relativos ao mdulo de elasticidade e dureza dos espcimes. Neste estudo os grupos foram divididos em: controle (no esterilizado); submetido a dose de 7 kGy; e submetido a dose de 35 kGy. Os resultados permitiram concluir no haver associao entre as propriedades nano-mecnicas dos dentes e a dose de radiao gama utilizada na esterilizao, constituindo-se este mtodo como til na esterilizao de dentes extrados, uma vez que as alteraes por ele impostas so mnimas.

36

2.2 Microdureza

2.2.1 Definies

A dureza uma propriedade mecnica que consiste na medida da resistncia de um material a uma deformao plstica localizada. Existem vrios tipos de ensaios mecnicos de dureza, dentre os quais os ensaios Brinell, Rockwell, Knoop e Vickers (os dois ltimos permitindo a realizao de ensaios de microdureza, quando utilizados indentadores de tamanho diminuto e cargas pequenas, segundo Callister14, 2007). O ensaio de dureza Vickers foi proposto em 1925 por Smith e Sandland. O indentador (penetrador) uma pirmide de diamante, de base quadrada, com um ngulo de 136 entre as faces opostas (Figura 1). No ensaio de microdureza utiliza-se carga menor que 1 kg, a qual produz uma impresso microscpica em forma de losango regular com a base quadrada (Callister14, 2007; Ferreira26, 2004). A unidade de dureza Vickers (HV) uma funo da carga aplicada (P) e da diagonal (d1) da impresso deixada na superfcie do material, conforme a equao abaixo:

1,854 1 2

Onde P dada em kg, e d em mm (Callister14, 2007; Moraes50, 2004).

37

Figura 1- Desenho esquemtico da geometria do indentador tipo Vickers e a impresso por ele realizada. (Modificado de Callister, WD. Materials science and engineering - an introduction. New York, 2007.)

2.2.2 Microdureza em pesquisa odontolgica

A microdureza dos tecidos dentais tem sido alvo de muitas investigaes dentro da pesquisa odontolgica. Craig et al.18 (1959) realizaram um dos primeiros estudos sobre o assunto, objetivando encontrar uma correlao entre microdureza e diferenas na estrutura dental. Esses autores obtiveram as medidas de microdureza a partir de seces transversais distantes entre si de 1 a 2 mm, retirando entre elas seces mais finas (0,1 mm) que foram coradas histologicamente pela tcnica do tricrmio de Pollak modificada. A partir desta tcnica, reas contendo maior quantidade de matria orgnica apresentam colorao de roxo escuro a azul, enquanto reas mais calcificadas coram-se de rosa a magenta. Deste modo as medidas de microdureza das seces foram baseadas na colorao das seces finas adjacentes coradas. Foi utilizada a microdureza Knoop, tendo os autores utilizado cargas de 2 a 25 g por 15 s. Quanto dentina radicular, foram encontrados valores menores de microdureza nas reas mais prximas luz do canal, entretanto relataram os autores terem encontrado valores

38

semelhantes aos da dentina coronria (tero mdio da coroa) quando tomadas medidas a 0,5 mm da luz do canal e 0,5 mm da juno amelocementria, respectivamente. Segundo os autores, comparaes de microdureza entre regies dentais diferentes devem ser realizadas no mesmo dente, uma vez que a microdureza dentinria pode variar consideravelmente em regies similares de dentes diferentes. Biven et al.8 (1972) estudaram os efeitos do eugenol e de cimentos endodnticos contendo eugenol sobre a microdureza da dentina radicular. Foram utilizados dentes humanos permanentes recmextrados, seccionados ao nvel do tero mdio das razes, tendo sido os fragmentos includos em resina, de maneira que os 4 mm a partir da face mdia ficassem fora da incluso. As pores radiculares receberam o tratamento com cimentos base de eugenol, enquanto as pores coronrias receberam o tratamento com o eugenol. O controle constituiuse de 2 espcimes que foram preparados da mesma maneira, entretanto ficando apenas em estufa a 37 C e 90% de umidade relativa. Foi utilizada a microdureza Knoop, com carga de 10 g por 15 s. Encontraram-se valores maiores de microdureza aps a aplicao dos fatores

experimentais, tendo os autores concludo que a microdureza da dentina submetida a eugenol e cimentos contendo essa substncia aumenta significantemente, tendendo tal aumento a atingir os valores mximos em um perodo de 3 semanas. Grajower et al.31 (1977), em estudo da microdureza da dentina esclertica (transparente), compararam esta dentina opaca adjacente. A anlise destes autores foi realizada em dentes humanos unirradiculados, tanto em cortes transversais como em cortes

longitudinais, tendo sido empregado o ensaio de microdureza Vickers, com carga de 200 g. Foram encontrados valores de microdureza superiores na dentina esclertica quando comparada dentina opaca adjacente, esta apresentando valores maiores do que a dentina em

39

regies mais distantes da esclertica e mais apicalmente. Os autores tambm afirmaram que a dentina apical menos dura que a dentina prxima coroa antes da ocorrncia da obliterao dos tbulos por material calcificado. Com a proposio de determinar uma possvel correlao entre microdureza dentinria e densidade de tbulos dentinrios em dentes humanos permanentes, Pashley et al.59 (1985) realizaram leituras seriais de microdureza e densidade tubular nos mesmos grupos de tbulos, comeando prximos juno amelodentinria e progredindo em direo polpa. Os resultados confirmaram haver uma significante correlao inversa entre as variveis estudadas; a densidade tubular aumenta em direo cmara pulpar, simultaneamente ao decrscimo nos valores de microdureza. Segundo os autores, este fenmeno presumivelmente ocorre devido reduo na quantidade de dentina intertubular e ao aumento no dimetro individual dos tbulos quando se caminha neste sentido. Panighi e G'Sell56 (1992), conduziram um estudo em duas etapas, no qual inicialmente foram caracterizadas superfcies dentinrias quanto microdureza Vickers e a composio em termos de clcio e fsforo. Na segunda fase do mencionado estudo, os autores compararam a microdureza dos espcimes capacidade de molhamento de um adesivo dentinrio. Estabeleceu-se uma correlao positiva entre os seguintes parmetros: grau de mineralizao, dureza e capacidade de molhamento do adesivo. Os mesmos autores (Panighi, G'Sell57, 1993), em

investigao para testes de fora adesiva de um compsito dental, caracterizaram a microestrutura da dentina e do esmalte segundo a topologia de superfcie, a concentrao de elementos minerais (por sonda microeletrnica), e a microdureza Vickers. Relataram os autores existir

40

uma forte correlao entre fora adesiva e microdureza atravs de uma equao linear simples, vlida tanto para esmalte quanto para dentina. Por sua vez, a microdureza apresenta correlao com a concentrao de clcio atravs de duas relaes lineares distintas (esmalte e dentina). Foi concludo que os mecanismos de adeso tanto para esmalte quanto para dentina so afetados pelo contedo mineral e a topologia da superfcie do substrato dental. Meredith et al.47 (1996) calcularam a microdureza e mdulo de Young em esmalte e dentina coronria. Foi utilizada a dureza Knoop, sendo o mdulo de Young calculado a partir de comparaes das medidas das diagonais maior e menor do losango em diferentes momentos (as diferenas nas medidas ocorrem devido a alteraes elsticas). Na dentina, os valores de microdureza encontrados foram maiores conforme maior distncia da juno amelo-dentinria, o mesmo ocorrendo para o mdulo de Young. No trabalho j mencionado de Moscovich et al.51 (1999), foram investigados os efeitos em curto prazo da irradiao por raios gama e do congelamento em gua sobre a dureza da dentina coronria. Foi utilizada a dureza Vickers, com carga de 30 g por 20 s. Os espcimes foram divididos aleatoriamente em 3 grupos: congelamento em gua a 18 C por 12 dias; exposio a dose nica de radiao gama; e armazenamento em gua a 20 C por 12 dias (controle). As indentaes foram realizadas antes e aps a aplicao dos fatores experimentais. Os resultados encontrados pelos autores mostraram que ambos os processos no exerceram alteraes na microdureza dentinria dos espcimes. O efeito de diferentes solues irrigadoras sobre a dentina radicular nos teros cervical, mdio e apical foi estudado por Saleh e Ettman64 (1999). Utilizaram-se como solues irrigadoras o perxido de

41

hidrognio a 3% alternado com hipoclorito de sdio a 5%, e o EDTA a 17%. O ensaio utilizado foi o de microdureza Knoop, com carga de 100 g por 15 s. Diferenas nos valores de microdureza foram relacionadas ao local das indentaes, com valores menores conforme maior proximidade luz dos canais. Houve reduo significante na microdureza dos espcimes aps o tratamento nos dois grupos, tendo sido a reduo no grupo do EDTA maior e estatisticamente diferente do grupo perxido de hidrognio/hipoclorito de sdio. Mahoney et al.42 (2000) realizaram estudo da dureza e mdulo de elasticidade de esmalte e dentina em molares decduos atravs de um sistema computadorizado de ultra-micro-indentaes, empregando indentador tipo Berkovitch com carga mxima de 50 mN. Os autores, utilizando uma anlise de regresso linear, encontraram forte correlao entre dureza e mdulo de elasticidade, tanto para esmalte quanto para dentina. A ao de trs solues quelantes sobre a microdureza da dentina radicular foi estudada por Cruz-Filho et al.20 (2001). Os autores testaram as solues de EDTAC a 15%, CDTA a 1% e EGTA a 1%, tendo como controle um grupo submetido gua destilada. Foi utilizado o

ensaio de microdureza Vickers, com carga de 50 g por 15 s. Apesar de no ter sido encontrada diferena entre as trs solues testadas, todas elas ocasionaram reduo estatisticamente significante da microdureza dentinria radicular. Com metodologia semelhante, Cruz-Filho et al.19 (2002) avaliaram a influncia de concentraes diferentes de EGTA sobre a microdureza da dentina radicular, tambm utilizando o ensaio Vickers com carga de 50 g por 15 s. Os autores concluram que todas as concentraes estudadas reduziram significantemente a microdureza dentinria quando comparadas ao grupo controle (gua destilada),

42

havendo diferenas tambm entre elas. Os grupos em ordem decrescente de microdureza foram: grupo controle, EGTA a 1%, EGTA a 3% e EGTA a 5%. Slutzky-Goldberg et al.70 (2002) compararam o efeito de dois tipos de instrumentao (manual com limas de ao inoxidvel convencionais, e rotatria com limas de Ni-Ti), ambas associadas soluo de NaOCl a 2,5%, sobre a microdureza da dentina radicular, realizando leituras a 500 e 1000 m de distncia luz dos canais. Os autores utilizaram o ensaio tipo Vickers, com carga de 300 g por 10 s. Concluram que houve reduo da microdureza dentinria em todos os grupos experimentais, sendo a reduo a 500 m maior que a 1000 m, isto somado ao fato de ter a instrumentao manual com limas de ao inoxidvel ocasionado uma maior reduo na microdureza quando comparada instrumentao rotatria com limas de Ni-Ti. Ainda, este ltimo grupo no diferiu do grupo submetido apenas mesma soluo irrigadora, porm sem instrumentao. Utilizando o mesmo sistema de ultra-micro-indentaes empregado no j mencionado estudo de Mahoney et al.42 (2000), Angker et al.4 (2003) tambm estudaram molares decduos quanto dureza e mdulo de elasticidade, utilizando entretanto uma carga mxima de 25 mN, tanto para esmalte quanto para dentina. Estes autores reiteraram como evidente o fato de haver uma reduo gradual nos valores de dureza e mdulo de elasticidade com a proximidade polpa, tendo os espcimes mostrado uma tendncia similar, a despeito das variaes nos valores de ambas as variveis. Tambm foi relatada uma correlao linear significante entre ambas. Ari et al.5 (2004) realizaram estudo da influncia de diferentes solues irrigadoras sobre a microdureza e rugosidade da dentina radicular, com o propsito de avaliar a viabilidade de utilizao de

43

uma soluo de gluconato de clorexidina. Foram utilizadas as solues de NaOCl a 5%, NaOCl a 2,5%, H2O2 a 3%, EDTA a 17%, gluconato de clorexidina a 0,2% e gua destilada (grupo controle). Novamente o ensaio de microdureza empregado foi o Vickers, tendo sido utilizada carga de 300 g por 20 s para a obteno dos dados. Os resultados mostraram que todas as solues teste com exceo da clorexidina alteraram negativamente a microdureza da dentina radicular, o mesmo ocorrendo com relao rugosidade de superfcie, a qual no foi alterada pela clorexidina nem pela soluo de H2O2 a 3%. Concluram os autores consistir a mencionada soluo de clorexidina em uma substncia vivel para irrigao de canais radiculares. Visando a avaliar a resistncia tenso e a microdureza dentinria aps diferentes pr-tratamentos, Fuentes et al.28 (2004) submeteram espcimes a: EDTA 0,5 M, NaOCl 5%, EDTA 0,5 M seguido de infiltrao por sistema adesivo, e NaOCl 5% seguido de infiltrao por sistema adesivo, comparando-os dentina normalmente mineralizada. Foi realizado teste de resistncia tenso, tendo sido o ensaio de microdureza (Knoop) efetuado nas linhas de fratura. Ambas as substncias afetaram negativamente a resistncia tenso e a microdureza. Os grupos que foram submetidos infiltrao de sistema adesivo mostraram valores maiores das duas variveis, entretanto no atingindo os valores da dentina originalmente mineralizada. Os autores concluram alertando para o fato de que a utilizao das mencionadas substncias previamente a procedimentos restauradores adesivos pode produzir um substrato dental mais frgil na interface dente/restaurao, por sua vez podendo levar a falhas prematuras. Em estudo que avaliou o efeito de diferentes como

concentraes e perodos de aplicao de solues de NaOCl

irrigantes (2,5 e 6% por 5, 10, e 20 min) sobre a microdureza Vickers da dentina radicular de dentes bovinos, Slutzky-Goldberg et al.71 (2004),

44

chegaram s seguintes concluses: aps 10 min de aplicao das solues de NaOCl houve reduo significante da microdureza dentinria, de tal maneira sendo aconselhvel, segundo esses autores, limitar-se o perodo de irrigao a um mximo de 10 min, a fim de no prejudicar as propriedades fsicas da dentina; a 500 m da luz dos canais a reduo da microdureza foi maior quando utilizada a soluo de NaOCl 6%, sugerindo os autores que se evite o uso de solues fortemente concentradas no interior dos canais radiculares. Yoldas et al.87 (2004) investigaram a ao de duas preparaes base de Ca(OH)2 (associado glicerina e associado gua destilada) sobre a microdureza Knoop da dentina radicular, aps 24 h, 3 e 7 dias. As indentaes foram realizadas com carga de 100 g por 15 s. Houve reduo estatisticamente significante nos valores de

microdureza, para ambas as preparaes, apenas aps 3 dias, sendo a reduo ocasionada pela preparao de glicerina maior e estatisticamente diferente da ocasionada pela preparao com gua destilada. Concluram os autores que o uso de medicaes intra-canais base de Ca(OH)2 pode amolecer o tecido dental e causar alteraes na superfcie dentinria radicular. Eldeniz et al.23 (2005) estudaram o efeito do cido ctrico a 19% e EDTA a 17% sobre a microdureza e rugosidade da dentina radicular. Utilizaram o ensaio Vickers, com carga de 300 g por 20 s para cada indentao. Em ambos os grupos experimentais foi realizada uma ltima irrigao com NaOCl a 2,5%. Os resultados revelaram aumento significante na rugosidade superficial quando comparados os grupos experimentais ao controle (irrigados apenas com gua destilada), sendo o grupo do cido ctrico o que causou maior aumento de rugosidade (diferena estatisticamente significante em comparao ao grupo do EDTA). Com relao microdureza, os grupos se comportaram de maneira similar ao ocorrido com a rugosidade.

45

Toledano et al.78 (2005) realizaram estudo para verificar se a microdureza da dentina superficial ou profunda seria afetada por diferentes pr-tratamentos qumicos realizados em procedimentos

adesivos. Utilizaram terceiros molares humanos dos quais foram obtidos discos a partir das dentinas superficial e profunda. Os discos foram ento apenas polidos (grupo controle); submetidos a condicionamento com cido fosfrico a 37% por 15 s; submetidos ao mesmo condicionamento e infiltrados por sistema adesivo; polidos, condicionados e tratados com soluo de NaOCl a 5% por 2 min, e; infiltrados por sistema adesivo aps condicionamento cido e tratamento com NaOCl. O ensaio de microdureza utilizado foi o Knoop, com carga de 20 g por 5 s. Os resultados encontrados foram a reduo da microdureza das dentinas tanto superficial quanto profunda aps condicionamento cido. A aplicao da soluo de NaOCl aps o condicionamento cido no afetou a microdureza da dentina superficial, entretanto o fez na dentina profunda. Os sistemas adesivos aplicados aumentaram a microdureza dentinria, entretanto sem que fossem atingidos os valores do grupo controle. Em 2005, Vieira et al.80 (2005) estudaram a influncia da concentrao de flor nos dentes e da severidade de fluorose na microdureza e no processo de mineralizao. Os autores utilizaram terceiros molares inclusos com indicao de exodontia e razes com formao completa ou quase completa, provenientes de pacientes de 3 regies diferentes: Montreal e Toronto, no Canad; e Fortaleza, no Brasil (localidades com nveis timos ou sub-timos de flor na gua de abastecimento). Os dentes foram avaliados quanto severidade de fluorose, concentrao de flor na dentina e no esmalte, microdureza e mineralizao dentinrias. Quanto microdureza, foi utilizado o ensaio Vickers, com carga de 100 g por 10 s. Os autores, considerando a severidade de fluorose como um exemplo de fator gentico, concluram que estes associados a fatores locais (como a concentrao de flor nos

46

dentes)

influenciaram

as

propriedades

mecnicas

(microdureza),

enquanto apenas os fatores locais influenciaram a mineralizao. Os dentes provenientes de Fortaleza foram considerados mais duros e, controversamente, menos mineralizados, apresentando maior

concentrao de flor na dentina. Os dentes provenientes de Montreal apresentaram menores nveis de severidade de fluorose quando comparados aos provenientes das demais localidades. Bechtold7 (2006) realizou estudo com o objetivo de avaliar o comportamento da dentina radicular bovina frente aplicao de diferentes concentraes de NaOCl (a 0,5 e 2,5%) e a aplicao das mesmas solues seguidas pelo cimento fosfato de zinco. Utilizou-se o ensaio Knoop (carga de 100 g por 15 s), sendo as indentaes realizadas em duas distncias luz do canal (100 e 300 m) em dois momentos (antes e aps a aplicao dos fatores experimentais). A autora concluiu que os valores de microdureza a 300 m foram significantemente maiores que a 100 m da luz dos canais, tendo o grupo controle (submetido a soluo fisiolgica apenas) apresentado reduo nos valores de microdureza em relao aos demais grupos experimentais (de maneira significante quando comparado aos grupos tratados com NaOCl a 2,5% e NaOCl a 2,5% seguido de cimento de fosfato de zinco, nas duas distncias, e ao grupo tratado com soluo fisiolgica seguida de cimento de fosfato de zinco, a 300 m da luz dos canais). Em estudo realizado por Qing et al.61 (2006), foi avaliada a influncia da irrigao dos canais com uma soluo de gua eletroltica cida forte (AEAF, tambm conhecida por gua ativada

eletroquimicamente, ou gua com potencial oxidativo) - uma substncia originalmente utilizada para fins de desinfeco em agricultura sobre a limpeza das paredes dentinrias e sua microdureza. A referida soluo foi comparada ao NaOCl a 5,25%, ao H2O2 a 3% e ao EDTA a 14,3%. Para o ensaio de microdureza foi utilizada carga de 50 g por 15 s (Vickers). Os

47

autores concluram que sob vibrao ultra-snica, o efeito de limpeza do uso combinado de AEAF e NaOCl foi equivalente ao grupo da associao NaOCl e EDTA, e que quando a AEAF foi utilizada como soluo irrigadora por 1 min sob vibrao ultra-snica, no foi observado decrscimo nos valores de microdureza dentinria. Oliveira et al.55 (2007) avaliaram a ao de agentes clareadores internos - associados ou no clorexidina - sobre a microdureza dentinria. Os grupos estudados foram o do perborato de sdio + gua; perborato de sdio + gel de clorexidina a 2%; perborato de sdio + soluo de perxido de hidrognio a 30%; e gel de perxido de carbamida + gel de clorexidina a 2%. O ensaio de microdureza utilizado foi do tipo Knoop, com indentaes de 25 g por 15 s. Concluiu-se que a maior perda de microdureza ocorreu no grupo tratado pela associao perborato de sdio + perxido de hidrognio a 30%; no foram encontradas diferenas entre os grupos de perborato de sdio + gua e perborato de sdio + clorexidina, tendo os autores relatado que o gel de clorexidina a 2% no afetou negativamente a microdureza dentinria quando associado aos agentes clareadores. Visando a avaliar a ao da clorexidina e do NaOCl, enquanto solues irrigadoras, sobre a microdureza dentinria radicular, Oliveira et al.55 (2007) utilizaram o ensaio de microdureza Vickers, com carga de 50 g por 10 s aps a aplicao das diferentes solues (tendo como controle um grupo irrigado com soluo salina). Os canais foram irrigados com 1 ml de cada soluo, que permaneceu em contato com a dentina radicular por 15 min. Os autores concluram que ambas as solues experimentais (clorexidina a 2% e NaOCl a 1%) reduziram a microdureza da dentina radicular a 500 e a 1000 m de distncia luz dos canais.

48

A microdureza e a liberao de fluoretos por materiais restauradores em diferentes solues de armazenamento foi estudada por Silva et al.68 (2007). Os materiais testados foram: um cimento de ionmero de vidro convencional; dois cimentos ionomricos modificados por resina; e duas resinas compostas modificadas por policidos. Os meios de armazenamento foram a gua destilada (controle) e solues utilizadas para a ciclagem de pH (uma soluo desmineralizadora e outra remineralizadora). As substncias, inclusive do grupo controle, eram trocadas a cada 6 e 18 h (respectivamente as duraes dos ciclos de desmineralizao e remineralizao), sendo as solues retiradas avaliadas quanto concentrao de fluoretos. Os espcimes

permaneceram nas solues por um perodo total de 15 dias. Para a avaliao das microdurezas inicial e final foi empregado o ensaio Knoop com aplicao de carga perpendicular de 100 g por 5 s. Concluiu-se que ambas as variveis foram influenciadas pelos meios nos quais os espcimes foram armazenados. O maior valor de microdureza foi constatado no grupo composto pelo cimento ionomrico convencional submetido ciclagem de pH.

3 PROPOSIO

A proposta deste trabalho foi avaliar a influncia de diferentes solues de armazenamento (gua destilada, soluo de timol a 0,05%, soluo de formalina a 10%, e soluo de hipoclorito de sdio a 1%, nos perodos de 7 e 28 dias), mtodos de esterilizao (por autoclave e radiao gama) e suas respectivas associaes sobre a microdureza dentinria radicular humana.

4 MATERIAL E MTODO

Este estudo foi aprovado pelo comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos UNESP, sob o protocolo n 075/2008-PH/CEP (ANEXO A). Para facilitar a compreenso das etapas englobadas na execuo da presente dissertao, este captulo desenvolve-se em diferentes sees.

4.1 Material utilizado

Todo o material e os equipamentos utilizados neste estudo esto elencados no Quadro 1 abaixo.

Quadro 1- Material utilizado (continua).

MATERIAL INFORMAES

192 metades radiculares obtidas a Pacientes e cirurgies-dentistas partir de 76 terceiros molares doadores/colaboradores assinaram termo de doao de material biolgico (conforme Anexos B e C)

humanos extrados

51

Quadro 1- Material utilizado (continuao).

MATERIAL gua destilada INFORMAES 5 litros (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) Soluo de timol a 0,05% 5 litros (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) Soluo de formalina a 10% 5 litros (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) Soluo de hipoclorito de sdio a 1% 5 litros (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) Recipiente de vidro com tampa rosquevel 9 unidades, 590ml de volume (CIV Companhia Industrial de Vidros, Recife, PE, Brasil) Caixa de isopor Rgua endodntica milimetrada Disco de ao diamantado dupla-face Broca carbide esfrica n 4 Micro-motor com pea de mo acoplada Fita adesiva dupla-face Molde de silicona para incluso dos espcimes em resina acrlica 600 X 400 X 300 mm JON, So Paulo, SP, Brasil KG Sorensen, Barueri, SP, Brasil KG Sorensen, Barueri, SP, Brasil INTRAmatic 181, Kavo, Joinville, SC, Brasil Adelbras, So Paulo, SP, Brasil Confeccionado especificamente para o estudo (Clssico, So Paulo, SP, Brasil)

52

Quadro 1- Material utilizado (continuao).

MATERIAL Resina acrlica autopolimerizvel INFORMAES Clssico, Campo Limpo Paulista, SP, Brasil Esptula n 36 Duflex SS White, So Paulo, SP, Brasil Esptula de insero n 1 Duflex SS White, So Paulo, SP, Brasil Pina clnica Duflex SS White, So Paulo, SP, Brasil Placas de vidro Pote de vidro para manipulao de resina acrlica Politriz circular DP-10, Struers-Panambra, So Paulo, SP, Brasil Lixas de carbeto de silcio de granulaes sequenciais para politriz circular Papel absorvente Microdurmetro Nmeros 400, 600, 800, 1200 e 4000 (Norton Abrasivos Brasil, So Paulo, SP, Brasil) Melitta, So Paulo, SP, Brasil Microhardness Tester FM 700, Future Tech Corp., Tokyo, Japan 250 X 200 mm JON, So Paulo, SP, Brasil

53

Quadro 1- Material utilizado (concluso).

MATERIAL Autoclave INFORMAES 1,8 kgf / cm2; 128-130 C por 40 min (Vitale 12, Cristfoli, Campo Mouro, PR, Brasil). Embalagens auto-adesivas para esterilizao 150 mm X 250 mm (Medstril, So Paulo, SP, Brasil).

4.2 Mtodo experimental

4.2.1 Obteno e seleo dos dentes

Para este estudo foram utilizados terceiros molares que apresentavam indicao de exodontia, cujos doadores assinaram termo de doao de material biolgico (ANEXO B). Os profissionais cirurgiesdentistas colaboradores na obteno dos referidos dentes tambm preencheram e assinaram termo especfico (ANEXO C). Os dentes colhidos foram mantidos em gua destilada (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) a 4 C at sua utilizao. Foram excludos terceiros molares cuja formao radicular no estivesse completa ou que no fossem hgidos.

54

4.2.2 Preparo dos espcimes

Inicialmente, as razes tiveram seus comprimentos - da juno amelocementria (JAC) ao pice - medidos com auxlio de rgua milimetrada para endodontia (JON, So Paulo, SP, Brasil), sendo demarcados os limites para que se realizassem seces ao nvel mdio e ao nvel da JAC (separando-as das coroas), com uso de disco de ao diamantado dupla-face (KG Sorensen, Barueri, SP, Brasil) montado em micromotor de baixa rotao (INTRAmatic 181, Kavo, Joinville, SC, Brasil) e sob refrigerao a gua, conforme as Figuras 2 e 3. Foi aproveitado o maior nmero possvel de razes de cada dente, desde que viveis ao corte. Desta forma foram obtidas 192 metades radiculares - a partir de 76 terceiros molares - com a face mdia em comum, duas a duas.

Figura 2- Desenho esquemtico ilustrando o plano de seco para obteno das duas metades de cada raiz, com a face mdia em comum.

55

Figura 3- Procedimento de corte dos dentes (a, b, c, d, e) e molde de silicona utilizado para a incluso das razes em resina (f).

As 192 metades assim obtidas foram aleatoriamente divididas em grupos de 12, e includas em blocos de resina acrlica autopolimerizvel (JET, Clssico, Campo Limpo Paulista, SP, Brasil), utilizando-se molde previamente confeccionado em silicona (Clssico, So Paulo, SP, Brasil) - Figura 3 - de modo que a face mdia das metades ficasse livre e voltada para cima aps a desincluso, como ilustrado na Figura 4.

56

Figura 4- Razes includas em resina acrlica, com a face mdia voltada para cima.

Para que a incluso ocorresse sem o deslocamento das metades radiculares durante a insero da resina acrlica no molde, foi utilizada fita adesiva dupla-face (Adelbras, So Paulo, SP, Brasil) que, colada ao centro de uma placa de vidro, permitia o correto

posicionamento e a fixao dos espcimes de maneira adequada (Figura 5). A resina era ento vertida no interior do molde contendo as metades radiculares em posio, e outra placa de vidro era posicionada sobre o conjunto (Figura 6).

57

Figura 5- Fita adesiva colada ao centro da placa de vidro, com o molde de silicona em posio (a), detalhe da remoo da face externa da fita com auxlio de uma esptula de insero n 1 (b), razes devidamente posicionadas (c).

58

Figura 6- Segunda placa de vidro em posio, aps a insero da resina acrlica no conjunto.

Ao incio da reao exotrmica de polimerizao da resina, os blocos eram imersos em gua destilada temperatura ambiente, visando a evitar possveis danos aos espcimes por ao do calor liberado. Concluda a polimerizao final, os blocos de resina foram identificados por nmeros sequenciais, de 01 a 16, gravados em suas faces laterais com broca carbide esfrica em baixa rotao. Finalizada a etapa de incluso em resina, os blocos tiveram a superfcie de interesse polida em politriz circular (DP-10, StruersPanambra, So Paulo, SP, Brasil) Figura 8 - por lixas de carbeto de silcio em uma seqncia da granulao mais grossa para a mais fina (Norton Abrasivos Brasil, So Paulo, SP, Brasil). O polimento foi realizado utilizando-se a lixa de granulao 400 por 40 s, seguida pelas lixas 600 e 800 por 60 s cada, finalizando-se com as lixas 1200 e 4000 por 90 s cada. Os blocos foram lavados com gua destilada e secos com papel absorvente (Mellita, So Paulo, SP, Brasil).

59

4.2.3 Padronizao para as leituras de microdureza

A fim de permitir comparaes entre as medidas de microdureza dos mesmos espcimes em diferentes momentos, houve a necessidade de se criar uma padronizao de localizao e

posicionamento dentro dos respectivos blocos de resina. Assim, cada bloco teve um de seus ngulos demarcados para referncia de posio, e aos espcimes foi atribuda uma ordem topogrfica a ser seguida nas leituras, como ilustrado na Figura 7.

Figura 7- Esquema da padronizao para observaes de microdureza.

Foram ento realizadas as medidas da microdureza inicial (Md1). Para tanto os blocos foram levados ao microdurmetro (Microhardness Tester FM 700, Future Tech Corp., Tokyo, Japan) Figura 9 sendo obtidos valores de microdureza na unidade Vickers Hardness Number (VHN). Duas indentaes foram efetuadas para cada espcime a 500 m da luz do canal radicular (Figura 10), utilizando-se carga

60

perpendicular de 50 g por 10 s. Cada indentao teve as diagonais medidas por trs vezes, obtendo-se um valor mdio das trs. Considerouse a mdia dos valores de microdureza das duas indentaes para cada espcime.

Figura 8- Politriz circular DP-10 do Departamento de Odontologia Restauradora da FOSJCUNESP.

61

Figura 9- Microdurmetro Microhardness Tester FM 700 do Departamento de Odontologia Restauradora da FOSJC-UNESP.

Dentina

Luz

Figura 10- Desenho esquemtico das indentaes a 500 m da luz do canal.

Em seguida os 16 blocos foram aleatoriamente divididos entre as diferentes solues e perodos de armazenamento aos quais seriam submetidos, bem como os mtodos de esterilizao que seriam utilizados, de acordo com o esquema da Figura 11.

62

Figura 11- Disposio/destinao dos 16 blocos aps sorteio.

Uma vez que a proposta desta dissertao envolveu a anlise da atuao de dois fatores experimentais (armazenamento e esterilizao) tanto isolada quanto associadamente, os grupos e subgrupos foram atribudos de acordo com cada anlise, a partir dos 16 blocos de resina contendo 12 metades radiculares cada. Todas as anlises envolveram a comparao de mdias de microdureza dentre os mesmos espcimes, em momentos distintos.

63

4.2.4 Estudo do fator armazenamento

Para esta anlise, foram considerados os seguintes grupos experimentais:

a) grupo 1 (G1): gua destilada (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) (n=48); b) grupo 2 (G2): Soluo de timol a 0,05% (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) (n=48); c) grupo 3 (G3): Soluo de formalina a 10% (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) (n=48); d) grupo 4 (G4): Soluo de hipoclorito de sdio a 1% (Byofrmula, So Jos dos Campos, SP, Brasil) (n=48).

Cada grupo foi subdividido em:

a) subgrupo

1:

perodo

de

dias

de

armazenamento (n=24; 2 blocos); b) subgrupo 2: perodo de 28 dias de

armazenamento (n=24; 2 blocos).

Assim, os blocos foram introduzidos em frascos de vidro com tampa rosquevel contendo as solues em estudo, de maneira que cada frasco contivesse 1 subgrupo (portanto 2 blocos de resina). Os 8 frascos de vidro utilizados (CIV Companhia Industrial de Vidros, Recife, PE, Brasil) apresentavam 590ml de volume e tampas coloridas de 4 cores diferentes, para facilitar a visualizao de cada grupo. Foram

64

acondicionados ao abrigo da luz e do calor (em caixa de isopor), permanecendo desta forma at que se atingissem os perodos prdeterminados de armazenamento. Nos subgrupos armazenados por 28 dias, as solues foram renovadas semanalmente. Findos os perodos de armazenamento, novo polimento foi realizado (apenas com a lixa de granulao 4000, por 60 s, visando remoo de possveis resduos das solues) bem como nova lavagem em gua destilada e secagem em papel absorvente. As leituras de microdureza posteriores s iniciais foram realizadas em regies prximas s primeiras, respeitando-se uma distncia mnima de 100 m entre elas e a distncia de 500 m em relao luz dos canais. A coleta dos valores de microdureza deu-se da mesma maneira que inicialmente, seguindo a ordem topogrfica j mencionada, sendo obtidos valores a partir de duas indentaes para cada espcime, considerada a mdia entre os dois (microdureza ps-armazenamento = Md2).

4.2.5 Estudo do fator esterilizao

Esta parte do trabalho props-se a analisar e comparar os efeitos dos dois mtodos de esterilizao sobre a microdureza dentinria radicular. Como o objetivo aqui foi estudar a influncia exercida apenas pela esterilizao, foram levados em considerao somente os blocos armazenados em gua destilada, considerada incua para a varivel microdureza. Portanto, a amostra foi reduzida nesta etapa a 48 metades radiculares (blocos 05, 08, 09 e 11, conforme j ilustrado na Figura 11).

65

Desta forma, foram considerados os seguintes grupos experimentais:

a) grupo A: esterilizao em autoclave (blocos 05 e 09; n= 24); b) grupo B: esterilizao por radiao gama (blocos 08 e 11; n= 24).

Cada grupo foi subdividido em:

a) subgrupo a: armazenados em gua destilada por 7 dias (n= 12); b) subgrupo b: armazenados em gua destilada por 28 dias (n= 12).

4.2.6 Associao dos fatores armazenamento/esterilizao

Nesta etapa foi estendida a anlise explicitada na seo anterior para os grupos das outras solues de armazenamento (no mesmo formato descrito acima), e, em seguida, outra anlise foi conduzida considerando-se os mesmos grupos da avaliao do fator armazenamento (seo 4.2.4), entretanto subdividindo-se cada um em 4 subgrupos:

a) subgrupo

1:

perodo

de

7 em

dias

de

armazenamento, (n=12);

esterilizao

autoclave

66

b) subgrupo

2:

perodo

de

dias

de

armazenamento, esterilizao por radiao gama (n=12); c) subgrupo 3: perodo de 28 em dias de

armazenamento, (n=12); d) subgrupo 4:

esterilizao

autoclave

perodo

de

28

dias

de

armazenamento, esterilizao por radiao gama (n=12).

Para os processos de esterilizao, os blocos foram acondicionados em embalagens prprias, auto-adesivas, de dimenses 150 mm X 250 mm (Medstril, So Paulo, SP, Brasil). A autoclavagem foi realizada num ciclo sob presso de 1,8 kgf/cm2 e temperatura entre 128 e 130 C por 40 min sendo os blocos retirados antes do processo de secagem, ainda midos (Autoclave Vitale 12, Cristfoli, Campo Mouro, PR, Brasil). J a esterilizao por radiao gama foi realizada pela empresa CBE Embrarad (Cotia, SP, Brasil), tendo sido os blocos de resina acondicionados da mesma maneira. Foi utilizada dose de 25 kGy (conforme certifica o ANEXO D). Aps os processos de esterilizao, tomaram-se os mesmos procedimentos de polimento, lavagem e secagem realizados aps o armazenamento, bem como os parmetros para a realizao das indentaes. Assim foram obtidos os valores de microdureza psesterilizao (Md3).

67

4.3 Delineamento estatstico

Os 576 dados obtidos (192 metades radiculares X 3 momentos) foram analisados de acordo com a metodologia descrita nesta seo. Inicialmente estudou-se o comportamento da distribuio amostral, e para isso os dados preliminares da microdureza inicial de todos os espcimes foram submetidos a teste de normalidade (Kolmogorov-Smirnov), para se assegurar de que se tratava de uma amostra normalmente distribuda (Figura 12). Aps a obteno de todos os dados experimentais, a anlise estatstica foi dividida nas seguintes fases:

a) anlise

da

influncia

exercida

pelo

armazenamento: - interao entre solues e perodos de armazenamento; b) anlise da influncia exercida pela esterilizao; c) anlise da influncia exercida pela associao armazenamento/esterilizao: interao entre solues, perodos de

armazenamento e mtodos de esterilizao.

68

4.3.1 Anlise da influncia exercida pelo armazenamento

Esta anlise objetivou verificar a ao de cada soluo de armazenamento sobre a microdureza dos espcimes. Inicialmente, a varivel em estudo foi a microdureza, uma varivel quantitativa contnua. Foi utilizado o teste t de Student para amostras dependentes, utilizando-se os valores absolutos de Md1 e Md2. Analisaram-se separadamente as solues nos dois tempos de armazenamento (sub-anlise 1). Determinada a ao isolada de cada soluo sobre a microdureza, passou-se a uma nova etapa, visando ao estabelecimento da possvel interao existente entre soluo e perodo de

armazenamento, bem como comparao entre os diferentes grupos. Nesta fase a varivel estudada foi a diferena entre os dois valores de microdureza [(Md1) (Md2)]. Foram conduzidos os testes de Anlise de Varincia (ANOVA) a 2 fatores (soluo X perodo de armazenamento) e teste de Tukey, ambos com = 0,05 (sub-anlise 2). Abaixo encontram-se resumidos os dados do delineamento estatstico desta etapa (Quadro 2).

Quadro 2- Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos do armazenamento (continua).
metades radiculares includas em resina acrlica. microdureza (VHN) sub-anlise 1; diferenas de microdureza sub-anlise 2.

Unidade experimental

Varivel em anlise

69

Quadro 2- Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos do armazenamento (concluso).
4 nveis: diferentes solues de armazenamento (H2O destilada, Timol a Tratamentos Testes estatsticos utilizados nvel de significncia () 0,05%, Formalina a 10%, e NaOCl a 1%); 2 sub-nveis: diferentes perodos de

armazenamento (7 e 28 dias). Repeties/rplicas H0 H1 12 em cada sub-nvel. No h diferenas entre os tratamentos. H diferenas entre os tratamentos. Teste t de Student para amostras

dependentes (sub-anlise 1); Anlise de Varincia (ANOVA) a 2 fatores seguida de teste de Tukey (sub-anlise 2). 0,05.

4.3.2 Anlise da influncia exercida pela esterilizao

Para a avaliao dos efeitos dos mtodos de esterilizao foi conduzido o teste t de Student comparando-se os valores de microdureza aps o armazenamento em gua destilada com os valores colhidos dos mesmos espcimes- aps os procedimentos de esterilizao (Md2 e Md3, respectivamente). Foram feitas anlises separadas para cada perodo de armazenamento. O resumo deste delineamento encontra-se no Quadro 3.

70

Quadro 3- Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos da esterilizao.

metades radiculares includas em resina acrlica microdureza (VHN) 2 nveis: diferentes mtodos de

Unidade experimental Varivel em anlise

esterilizao (autoclave e radiao gama); Tratamentos 2 sub-nveis: diferentes perodos de

armazenamento prvio em gua destilada (7 e 28 dias). Repeties/rplicas H0 H1 Testes estatsticos utilizados nvel de significncia () 0,05. 12 para cada sub-nvel. No h diferenas entre os tratamentos. H diferenas entre os tratamentos. Teste t de Student.

4.3.3 Anlise da associao armazenamento/esterilizao

Nesta fase foram realizados os testes t de Student para verificar a ao dos mtodos de esterilizao sobre os grupos das demais solues de armazenamento, em ambos os perodos. Para tanto foram levados em considerao os valores absolutos de Md2 e Md3 (sub-anlise 1). Em seguida, visando a avaliar a influncia da associao dos fatores armazenamento e esterilizao, procedeu-se a uma ANOVA a 3 fatores (soluo de armazenamento X perodo de armazenamento X mtodo de esterilizao). A varivel utilizada, semelhana da anlise de

71

interao das solues e perodos de armazenamento, foi uma diferena entre valores de microdureza [(Md1) (Md3)]. Na sequncia foi aplicado o teste de Tukey, para localizar as possveis diferenas entre os grupos (sub-anlise 2). Todos os testes foram realizados em um intervalo de confiana de 95% (ou seja, com significncia para p<0,05), utilizando-se o software Statistica 8.0 (Stat Soft Inc., Tulsa, OK, EUA). Os dados do delineamento estatstico desta etapa do trabalho encontram-se resumidos no Quadro 4.

Quadro 4- Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos da associao armazenamento/esterilizao (continua).
Unidade experimental Varivel em anlise microdureza (VHN) (sub-anlise 1); diferenas de microdureza (sub-anlise 2). 6 nveis: diferentes solues de armazenamento (H2O destilada, Timol a 0,05%, Formalina a 10%, Tratamentos e NaOCl a 1%) e diferentes mtodos de esterilizao (autoclave e radiao gama); 2 sub-nveis: diferentes perodos de metades radiculares includas em resina acrlica

armazenamento (7 e 28 dias). Repeties/rplicas H0 H1 12 para cada sub-nvel. No h diferenas entre os tratamentos. H diferenas entre os tratamentos.

72

Quadro 4- Resumo do delineamento estatstico para anlise dos efeitos da associao armazenamento/esterilizao (concluso).
Testes estatsticos utilizados nvel de significncia () Teste t de Student (sub-anlise 1); ANOVA a 3 fatores seguida por teste de Tukey (sub-anlise 2). 0,05.

Varivel: Md1, Distribuio: Normal Kolmogorov-Smirnov d = 0,03783, p = n.s., Lilliefors p = n.s. Qui-Quadrado = 2,78905, df = 8 (ajustado) , p = 0,94689 35

30

25

Nmero de observaes

20

15

10

0 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68

Figura 12 - Histograma obtido aps teste de Kolmogorov-Smirnov, confirmando o carter de normalidade para os valores de microdureza inicial (Md 1) de todos os espcimes.

73

4.3.4 Validao do mtodo estatstico adotado

O embasamento terico desta seo terciria foi retirado de Vieira

81

(2006). Quando se utilizam mtodos estatsticos comparando

diversos grupos experimentais por meio de Anlise de Varincia, faz-se necessrio o atendimento a algumas pressuposies. Segundo a referida autora, uma ANOVA s deveria ser aplicada se fossem satisfeitas as pressuposies de:

a) independncia; b) homocedasticidade; c) normalidade.

Por independncia entende-se que os dados - e tambm os erros - encontrados devem ser variveis aleatrias independentes. Em estudos nos quais as unidades experimentais so observadas em sequncia, ou seja, na presena de correlao serial (como o caso deste estudo), no seria razovel pressupor independncia. Da a necessidade de se analisar os resduos (que so estimativas de erro). Tal anlise feita graficamente. Para que a pressuposio de independncia seja satisfeita, os resduos devem ficar dispersos em torno de zero, sem padro definido. A homocedasticidade refere-se constncia nas

varincias. Afinal devem ser esperadas diferenas nas mdias entre os grupos (tratamentos), mas no em suas varincias. Existem algumas regras empricas para se constatar a homocedasticidade. Para alguns

74

autores, ela considerada presente quando a maior varincia no exceder a menor em mais do que trs vezes. Porm existem testes especficos para se fazer esta anlise, como os testes de Cochran, Hartley, Bartlett e Levene, que so conhecidos como testes de homogeneidade de varincias. Quanto normalidade, entende-se que os dados (e consequentemente os erros) devam apresentar uma distribuio normal, o que pode ser verificado tambm por meio de grficos. Foram conduzidas todas essas anlises, tendo sido empregado novamente o software Statistica 8.0 (Stat Soft Inc., Tulsa, OK, EUA).

5 RESULTADOS

Os valores mdios de microdureza e respectivos valores de desvio-padro encontrados nos diferentes grupos e momentos so mostrados na Tabela 1.

Tabela 1- Valores mdios de microdureza e desvio-padro observados nos diferentes grupos e subgrupos de cada anlise.
Microdureza (VHN) desvio-padro Perodo (dias) Md3 Md1 Md2 Autoclave 46,75,8 46,34,5 40,65,9 42,56,9 45,04,2 46,04,3 15,72,2 20,81,7 Radiao gama 49,55,1 53,95,1 47,87,6 45,36,1 47,05,7 47,45,1 20,81,7 16,04,0

Grupo

7 G1 28 7 G2 28 7 G3 28 7 G4 28

49,25,2 51,04,9 50,75,0 51,64,8 51,16,0 51,93,9 50,85,1 50,04,4

48,24,0 51,15,6 46,64,8 45,53,3 45,85,7 45,44,6 21,71,8 13,12,7

G1: H2O / G2: timol / G3: formalina / G4: NaOCl ; VHN: Vickers Hardness Number.

76

Como mencionado anteriormente, os valores de Md 1 de todos os espcimes foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov para se averiguar a normalidade de sua distribuio. No referido teste, o valor d encontrado foi menor que o valor d crtico calculado para a amostra, tornando aceita a H0 hiptese de nulidade (neste caso, a no existncia de diferenas entre a distribuio amostral com relao distribuio normal). Isto pode ser visualizado no grfico tipo Normal PPlot da Figura 13.

Normal P-Plot: Microdureza inicial dos espcimes

3

Valor Esperado Normal

-1

-2

-3 38

40

42

44

46

48

50

52 Valor

54

56

58

60

62

64

66

Figura 13- Grfico tipo P-Plot da distribuio amostral em relao ao valor normal esperado.

77

5.1 Efeitos do armazenamento

Os testes t de Student para amostras dependentes foram realizados para todas as solues e tempos de armazenamento, utilizando-se os pares das medidas obtidas de cada espcime (Md 1 e Md2). O resultado deste teste encontra-se na Tabela 2.

Tabela 2- Teste t de Student aps armazenamento; diferenas significantes para p<0,05.

Grupo;subgrupo / Momento I G1;a II I G1;b II I G2;a II I G2;b II I G3;a II I G3;b II I G4;a II G4;b I II 48,2 51,0 51,1 50,6 46,6 51,6 45,5 51,1 45,8 51,9 45,4 50,8 21,7 50,0 13,1 4,0 4,9 24 5,6 4,0 24 4,8 4,8 24 3,3 6,08 24 5,7 3,95 24 4,66 5,1 24 1,8 4,4 24 2,7 36,886 33,461 23 0,000* 29,145 29,219 23 0,000* 6,470 5,339 23 0,000* 5,235 3,757 23 0,001* 6,137 6,654 23 0,000* 4,066 2,971 23 0,006* -0,070 -0,101 23 0,920 Md mdia (VHN) 49,2 DP n (Md1-Md2) t Gl p

5,2 24 0,995 1,241 23 0,226

G1: H2O / G2: timol / G3: formalina / G4: NaOCl; a: 7 dias; b: 28 dias; I: inicial; II: aps armazenamento; Md: microdureza; DP: desvio-padro; *: significncia estatstica.

78

Apenas os subgrupos da gua destilada (G1) no ocasionaram diferenas significantes de microdureza. As demais solues em ambos os perodos de armazenamento influenciaram negativamente a varivel estudada (Figura 14).

Soluo de armazenamento F(3, 184)=389,82, p=0,0000

40 35 30

Diferena Microdureza (Md1 - Md2)

25 20 15 10 5 0 -5

H2O (G1)

Timol (G2)

Formalina (G3)

NaOCl (G4)

Figura 14- Grfico dos grupos experimentais quanto ao armazenamento.

O teste ANOVA a 2 fatores (Tabela 3), para se estabelecer os efeitos das diferentes solues, perodos de armazenamento e sua interao, revelou diferenas estatisticamente significantes para todos os fatores (soluo: p=0,00000; perodo: p=0,00000; interao soluo X perodo: p=0,00047), originando o grfico da Figura 15.

79

Tabela 3- ANOVA a 2 fatores aps o armazenamento (=0,05).

SS Solues Perodos Solues*Perodos
* Significncia estatstica

Gl 3 1 3

MS 10501,86 293,41 168,16

F 389,8153 10,8911 6,2420

p 0,000000* 0,001160* 0,000465*

31505,58 293,41 504,49

ANOVA a 2 fatores:Armazenamento (Soluo*Perodo) F(3, 184)=6,2420, p=,000465

45 40 35

Diferena Microdureza (Md1 - Md2)

30 25 20 15 10 5 0 -5 -10 07 dias 28 dias

H2O Timol 0,05% Formalina 10% NaOCl 1%

Figura 15- Grfico da interao dos fatores soluo e perodo de armazenamento, obtido a partir da diferena [(MD1) (MD2)].

O teste de Tukey, aplicado neste momento, permitiu a identificao das diferenas atravs dos subgrupos, bem como a distribuio dos conjuntos homogneos verificados na Tabela 4. O subgrupo que menos causou alteraes na microdureza dos espcimes (menor diferena Md1-Md2) foi o da gua destilada por 28 dias, tendo o subgrupo do NaOCl a 1% por 28 dias causado as maiores alteraes.

80

Tabela 4- Anlise do armazenamento. Distribuio dos conjuntos homogneos aps teste de Tukey (=0,05).
Grupo (n=24) G1 G1 G2 G3 G2 G3 G4 G4 Perodo (dias) 28 07 07 07 28 28 07 28 Mdia (Md1-Md2)
-0,07083 1,00000 4,15000 5,23542 6,13750 6,47083 29,14583 36,88333

Conjuntos homogneos* B B A A A A D E B C C C

* Letras iguais denotam grupos homogneos entre si; Md1: microdureza inicial; Md2: microdureza ps-armazenamento; G1: H2O / G2: timol / G3: formalina / G4: NaOCl.

5.2 Efeitos da esterilizao

Como explicitado no captulo anterior, para se analisar os efeitos da esterilizao, como fator isolado, foi realizado teste t de Student com base nos valores Md3 e Md2 dos blocos submetidos ao armazenamento em gua destilada.

81

No foi encontrada diferena estatisticamente significante nos valores de microdureza antes e aps a aplicao dos dois mtodos de esterilizao, (autoclave: p=0,144; radiao gama: p=0,827) Tabela 5 tornando aceita a hiptese de nulidade (segundo a qual no h

diferena entre as mdias antes e aps a introduo deste fator experimental). Entretanto, ao se separar a mesma anlise entre os perodos de armazenamento distintos, observa-se que a esterilizao por autoclave levou a alterao estatisticamente significante nos valores de microdureza do bloco armazenado em gua destilada por 28 dias. J a radiao gama mostrou melhor resultado, no ocasionando diferenas significantes em nenhum dos perodos (Tabelas 6 e 7).

Tabela 5- Teste t de Student para o fator esterilizao; diferenas significantes para p<0,05.
Grupo/ Momento II A III II B III 46,5 51,6 51,7 5,1 5,2 24 5,4 -0,095 -0,220 23 0,827 Md mdia (VHN) 47,7 DP 4,1 24 1,172 1,509 23 0,144 n
(Md2 - Md3)

Gl

A: autoclave; B: radiao gama; II: aps armazenamento; III: aps esterilizao; Md: microdureza; VHN: Vickers Hardness Number; DP: desvio-padro; *: significncia estatstica.

82

Tabela 6- Teste t de Student para o mtodo de esterilizao por autoclave em diferentes perodos de armazenamento em gua destilada; diferenas significantes para p<0,05.
Grupo/ subgrupo A / a (bloco 05) A / b (bloco 09) n 12 12 (Md2 Md3)
0,479167 1,866667

t
0,350120 2,481685

Gl
11 11

p
0,732861 0,030482*

a: 7 dias; b: 28 dias; *: significncia estatstica.

Tabela 7- Teste t de Student para o mtodo de esterilizao por radiao gama em diferentes perodos de armazenamento em gua destilada; diferenas significantes para p<0,05.
Grupo/ subgrupo B / a (bloco08) B / b (bloco 11)
a: 7 dias; b: 28 dias.

n 12 12

(Md2 Md3)
-0,325000 0,133333

t
-0,493097 0,227535

Gl
11 11

p
0,631640 0,824181

5.3 Efeitos da associao armazenamento/esterilizao

Os resultados dos testes t para estudo da influncia dos mtodos de esterilizao sobre a microdureza, nas demais solues e em ambos os perodos de armazenamento, podem ser visualizados nas Tabelas 8 e 9 (autoclave e radiao gama, respectivamente). Em seguida, para estudar o efeito de todos os fatores sobre a microdureza dos espcimes aps as esterilizaes, procedeu-se ao teste ANOVA a 3 fatores (soluo de armazenamento, perodo de armazenamento e mtodo de esterilizao) - Figura 16 - sendo

83

encontradas diferenas estatisticamente significantes, como mostra a Tabela 11. Tabela 8- Testes t de Student para o mtodo de esterilizao por autoclave; diferenas significantes para p<0,05.
(Md2 Md3)
0,479167 1,866667 6,962500 3,404167 0,295833 -0,033333 5,812500 -7,94167

Grupo/ subgrupo G1/1 G1/3 G2/1 G2/3 G3/1 G3/3 G4/1 G4/3

n 12 12 12 12 12 12 12 12

t
0,350120 2,481685 2,701334 1,681420 0,243421 -0,021424 9,394012 -8,67881

Gl
11 11 11 11 11 11 11 11

p
0,732861 0,030482* 0,020608* 0,120821 0,812159 0,983291 0,000001* 0,000003*

G1: H2O / G2: timol / G3: formalina / G4: NaOCl Subgrupo 1: 7 dias; subgrupo 3: 28 dias; * significncia estatstica.

84

Tabela 9- Testes t de Student para o mtodo de esterilizao por radiao gama; diferenas significantes para p<0,05.
Grupo/ Perodo (dias)

(Md2 Md3)

Gl

G1/2

12

-0,325000

-0,493097

11

0,631640

G1/4

12

0,133333

0,227535

11

0,824181

G2/2

12

-2,19167

-1,46331

11

0,171364

G2/4

12

-0,241667

-0,180377

11

0,860137

G3/2

12

-0,558333

-0,620561

11

0,547530

G3/4

12

-2,61250

-2,44540

11

0,032510*

G4/2

12

-2,61250

-2,44540

11

0,032510*

G4/4

12

1,158333

1,499819

11

0,161804
*

G1: H2O / G2: timol / G3: formalina / G4: NaOCl Subgrupo 2: 7 dias; subgrupo 4: 28 dias; significncia estatstica.

85

Tabela 10- Teste ANOVA a 3 fatores realizado aps as esterilizaes (=0,05).

FATORES Soluo Perodo Esterilizao Soluo*Perodo Soluo*Esterilizao Perodo*Esterilizao Soluo*Perodo*Esterilizao
* Significncia estatstica
ANOVA a 3 fatores (soluo*perodo*esterilizao) F(3, 176)=2,7415, p=,04477 45 40 35 30

SS
28545,04 0,00 130,68 29,97 414,64 39,24 262,65

Gl 3 1 1 3 3 1 3

MS
9515,01 0,00 130,68 9,99 138,21 39,24 87,55

F
297,9442 0,0001 4,0920 0,3128 4,3279 1,2288 2,7415

p
0,000000* 0,990843 0,044600* 0,816084 0,005685* 0,269163 0,044772*

Md1 - Md3

25 20 15 10 5 0 -5 -10 G1 G2 G3 G4 G1 G2 G3 G4 07 dias Autoclave Radiao Gama

G1:H2O / G2: Timol 0,05% / G3: Formalina 10% / G4: NaOCl 1%

28 dias

Figura 16- Grfico da interao dos 3 fatores aps a esterilizao.

86

O teste de Tukey foi realizado em seguida para que fossem localizadas as diferenas entre os grupos experimentais. Aps o teste verificou-se a formao dos conjuntos homogneos, que podem ser visualizados na Tabela 11. Tabela 11- Resultado do teste de Tukey aps ANOVA a 3 fatores (=0,05).
Soluo H2O H2O H2O H2O Timol 0,05% Formalina 10% Formalina 10% Timol 0,05% Formalina 10% Formalina 10% Timol 0,05% Timol 0,05% NaOCl 1% NaOCl 1% NaOCl 1% NaOCl 1% Perodo 28 dias 07 dias 28 dias 07 dias 07 dias 28 dias 07 dias 28 dias 07 dias 28 dias 28 dias 07 dias 28 dias 07 dias 07 dias 28 dias Esterilizao Radiao Radiao Autoclave Autoclave Radiao Radiao Autoclave Radiao Radiao Autoclave Autoclave Autoclave Autoclave Radiao Autoclave Radiao Mdia (Md1-Md3) -0,12500 0,15417 1,98333 2,01250 2,03333 3,88750 3,93333 6,00417 6,27500 6,40833 9,43333 11,03750 29,05833 31,78333 33,47917 34,13333 A A A A A A A A A A B B B B B B B B B C C C C C C C C C C D D D D Conjuntos homogneos*

* A presena de letras iguais denota grupos homogneos entre si; Md 1: microdureza inicial; Md3: microdureza ps-esterilizao.

5.4 Validao do mtodo estatstico adotado

Para validao do mtodo estatstico adotado, foram checadas todas as anlises realizadas para se verificar a independncia, homocedasticidade e normalidade.

87

5.4.1 Independncia

Para

esta

anlise

foram

estudados

os

resduos

encontrados. A anlise dos resduos para as duas ANOVA conduzidas no estudo (para determinao dos efeitos do armazenamento segundo os perodos, e para determinao dos efeitos associados das solues, perodos de armazenamento e mtodos de esterilizao) revelou uma disperso ao redor de zero, sem padro definido, sugerindo

independncia, conforme pode ser visto nas Figuras 17 e 18, respectivamente.

Observaes X Resduos (ANOVA 2 fatores ps-armazenamento) Varivel: (MD1 - MD2) 4 3 2

Resduos padronizados

1 0 -1 -2 -3 -4 -20

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

Observaes

Figura 17- Grfico de disperso dos resduos na ANOVA a 2 fatores realizada aps o armazenamento.

88

Observaes X Resduos (ANOVA 3 fatores ps-esterilizao)

Varivel: (Md1 - Md3)

3,5 3,0 2,5 2,0

Resduos padronizados

1,5 1,0 0,5 0,0 -0,5 -1,0 -1,5 -2,0 -2,5 -3,0 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

Observaes

Figura 18- Grfico de disperso dos resduos na ANOVA a 3 fatores realizada aps a esterilizao.

5.4.2 Homocedasticidade

Para esta anlise foram utilizados os testes de Levene e Hartley-Cochran-Bartlett, respectivamente para as ANOVA a 2 e 3 fatores conduzidas neste trabalho, tendo os resultados revelado a

homogeneidade das varincias, como mostram as Tabelas 12 e 13.

89

Tabela 12- Resultado do teste de Levene para ANOVA a 2 fatores psarmazenamento ( = 0,05).

MS

MS 9,979832

F 1,738931

p 0,102367

(Md1 Md2)

17,35424

Tabela 13- Resultado do teste de Hartley-Cochran-Bartlett para ANOVA a 3 fatores ps-esterilizao ( = 0,05).

Hartley

Cochran 0,138589

Bartlett 20,85228

Gl 15

p 0,141616

(Md1 Md3)

7,313701

5.4.3 Distribuio normal

Novamente os resduos foram analisados, desta vez para verificar se apresentavam uma distribuio normal. Foram construdos grficos tipo normal p-plot, revelando que os resduos apresentaram distribuio normal em ambos os casos (ANOVA a 2 e 3 fatores). Os referidos grficos podem ser vistos nas Figuras 19 e 20.

90

Normal P-Plot; Resduos padronizados

(ANOVA 2 fatores ps-armazenamento)

Varivel: (Md1 - Md2)

4 3 ,99 2

Valor Esperado Normal

,95 1 0 ,35 -1 -2 ,01 -3 -4 -4 -3 -2 -1 0 Resduos 1 2 3 4 ,15 ,05 ,85 ,65

Figura 19- Grfico mostrando distribuio normal dos resduos para ANOVA a 2 fatores psarmazenamento.
Normal P-Plot; Resduos padronizados (ANOVA 3 fatores ps-esterilizao) Varivel: (Md1 - Md3)
4 3 ,99 2
Valor Esperado Normal

,95 1 0 ,35 -1 -2 ,01 -3 -4 -3,0 ,15 ,05 ,85 ,65

-2,5

-2,0

-1,5

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Resduos

Figura 20- Grfico mostrando distribuio normal dos resduos da ANOVA 3 fatores psesterilizao.

6 DISCUSSO

6.1 Literatura e metodologia

Dentes extrados ainda so utilizados na maioria dos estudos in vitro em pesquisa odontolgica, seja em endodontia (Bodrumlu et al.9, 2007; Matherne et al.46, 2008; Solano et al.74, 2005), prtese (Boschian Pest et al.10, 2002; Kalkan et al.36, 2006; Karapanou et al.37, 1996; Wrbas et al.86, 2007), dentstica (Ghersel et al.30, 2001; Miranda et al.49, 2005; Muench et al.52, 2000), e at ortodontia (Manfrin et al.43, 2009). Ainda que existam recomendaes de rgos de sade como o CDC norte-americano (Kohn et al.39, 2003), e especificaes tcnicas como a da ISO, grande parte dos trabalhos cientficos publicados no cita o meio de desinfeco ou esterilizao utilizado (exceo feita aos estudos de Ghersel et al.30, 2001, e Habelitz et al.33, 2002), que utilizaram a autoclave e a radiao gama, respectivamente). No mais das vezes, no so citados sequer os meios de armazenamento empregados previamente aos experimentos. Talvez muitos pesquisadores, em dvida sobre estarem criando ou no mais uma varivel para seus estudos, optem por no realizar os procedimentos recomendados, o que, do ponto de vista tico, pode ser considerada atitude reprovvel.

92

A microdureza das estruturas dentais tem sido estudada j h muito dentro da pesquisa odontolgica. Consiste em uma propriedade inerente constituio fsica do dente, que, dentre as vantagens, possibilita estudos em modelos experimentais utilizando ensaios nodestrutivos, nos quais podem ser feitas observaes antes e depois da aplicao de tratamentos experimentais. Alm disso, j foram estabelecidas correlaes importantes entre a microdureza e outras propriedades dentais, como a densidade tubular (Pashley et al.59, 1985), grau de mineralizao (Panighi, G'Sell56, 1992) e a resistncia adesiva (Panighi, G'Sell57, 1993). Sob esta tica, a escolha da microdureza como varivel a ser observada neste estudo visou ao afastamento ou minimizao dos possveis efeitos de condies individuais dos espcimes, j que os valores obtidos foram sempre associados a um mesmo espcime, apenas em momentos diferentes. Soma-se a isso o fato da existncia das correlaes supracitadas entre microdureza e outras propriedades dos dentes, bem como o de testes de dureza se constiturem mtodos relativamente simples, baratos e reproduzveis (Willems et al.85, 1993). Optou-se pelo o ensaio Vickers, ao invs do Knoop, levando-se em considerao trabalhos de outros autores, nos quais foi apontada uma adequao maior daquele em relao a este, alm do ensaio tipo Vickers se mostrar mais apropriado para estudos das variaes de propriedades mecnicas de um material anisotrpico como a dentina (Ari et al.5, 2004; Vieira et al.80, 2005). Quanto utilizao de terceiros molares, trata-se de um procedimento comumente observado em pesquisas odontolgicas in vitro (Kinney et al.38, 1996; Marending et al.45, 2007; Nakajima et al.53, 2000; Sauro et al.65, 2009; Strawn et al.76, 1996; Toledano et al.78, 2005), sendo recomendado na especificao tcnica da ISO referente aos estudos envolvendo adeso, que sugere a utilizao de terceiros molares de pacientes entre 14 e 40 anos de idade (ISO35, 2003). Na presente

93

dissertao pde-se constatar a adequao destes dentes para estudos de microdureza, quando da verificao da distribuio normal dos valores de microdureza inicial dos 192 espcimes. A aplicao da radiao gama na esterilizao de dentes tem mostrado resultados promissores, uma vez que este mtodo de esterilizao parece no alterar a estrutura dental, tendo sido mais frequentemente utilizada a dose de 25 kGy (Amaechi et al.2, 1998; Amaechi et al.3, 1999; Brauer et al.12, 2008; DeWald21,1997; Moscovich et al.51, 1999; Sperandio et al.75, 2001), embora White et al.83 (1994) tenha conseguido a esterilizao de dentes com uma dose inferior (1,73 kGy). Encontrou-se apenas o estudo de Titley et al.77 (1998) mostrando resultados negativos relacionados a este mtodo. Segundo estes autores, a radiao gama e outros meios de armazenamento/esterilizao (timol, metanol e glutaraldedo) foram responsveis pelos menores valores de resistncia adesiva ao cisalhamento.

6.2 Discusso dos resultados

6.2.1 Armazenamento

Quando analisada a ao isolada de cada soluo de armazenamento, utilizando-se o teste t de Student (Tabela 2), verificou-se que apenas a gua destilada no causou alteraes significantes na microdureza dos espcimes (p=0,226 a 7 dias; p=0,920 a 28 dias). Todas as demais solues produziram efeitos estatisticamente significantes. Aps a ANOVA a 2 fatores para avaliar a interao das solues e

94

perodos de armazenamento, chamou ateno o comportamento do grupo NaOCl (G4), que foi responsvel por redues de microdureza nos espcimes da ordem de at 70% em mdia (subgrupo de 28 dias de armazenamento, Tabela 2). Tambm possvel visualizar, no grfico da Figura 14, a magnitude da diferena existente entre o G4 e os demais grupos, tendo os grupos G2 (timol) e G3 (formalina) apresentado valores de diferenas (Md1 Md2) semelhantes, porm discretamente superiores aos do G1 (gua destilada). Isso confirmado pela anlise da Tabela 4, na qual so observados os conjuntos homogneos formados. Note-se a discrepncia dos subgrupos do G4 em relao proximidade dos outros subgrupos entre si. Esses resultados coadunam com os de outros estudos nos quais utilizaram-se solues de NaOCl sobre a dentina (Oliveira et al.55, 2007; Sim et al.69, 2001; Slutzky-Goldberg et al.70, 2002; Slutzky-Goldberg et al.71, 2004; Toledano et al.78, 2005). Quanto ao do NaOCl sobre o tecido dentinrio, vrios outros autores tambm relataram alteraes estruturais. White et al.82 (2002) observaram enfraquecimento da dentina quando exposta por longos perodos ao hipoclorito. Grigoratos et al.32 (2001), Sim et al.69 (2001) e Marending et al.45 (2007) relataram reduo no mdulo de elasticidade e resistncia flexural quando empregadas solues de NaOCl de diferentes concentraes (3, 5, e 9%). Slutzky-Goldberg et al.71 (2004) relataram reduo na microdureza de dentes irrigados endodonticamente com NaOCl em diferentes concentraes, descrevendo uma ao concentrao-dependente. Embora a maior parte dos estudos defenda uma ao focal do hipoclorito apenas no contedo orgnico da dentina (Inaba et al.34, 1996; Marending et al.45, 2007; Zehnder et al.88, 2003), estudo de Sakae et al.63 (1988) utilizando dentes bovinos, detectou perda de ons magnsio

95

e carbono da estrutura cristalina da dentina aps exposio ao NaOCl a 10%. Cabe ressaltar que dentro desta anlise, quando

observado o perodo de 7 dias de armazenamento, houve a formao de apenas 2 conjuntos homogneos: um formado pelos grupos 1 a 3 (gua destilada, timol a 0,05% e formalina a 10%) e outro formado pelo grupo 4 (NaOCl a 1%). Passando-se para o perodo de 28 dias de

armazenamento, foram notados 3 conjuntos homogneos: os grupos da gua destilada e do NaOCl ficaram cada um em uma extremidade, situando-se entre eles o conjunto formado pelos grupos do timol e da formalina, o que denota a influncia do perodo de armazenamento na ao das diferentes solues sobre os resultados obtidos.

6.2.2 Esterilizao e associaes

Quanto esterilizao, os resultados mostraram que, quando analisados isoladamente - tendo sido tal anlise realizada no grupo armazenado em gua destilada - os mtodos de esterilizao no causaram alteraes significantes na microdureza dentinria, embora tenham sido observados resultados mais consistentes no grupo esterilizado pela radiao gama. Em relao aos diferentes perodos, a esterilizao por autoclave causou diferenas significantes na

microdureza do subgrupo armazenado por 28 dias, enquanto a esterilizao por radiao gama no causou diferenas em nenhum dos perodos.

96

Quando analisada a esterilizao nos demais grupos anlise conduzida pelo teste t de Student estendido a todos os grupos experimentais- foi notado um comportamento diferente entre os mtodos de esterilizao. Enquanto a autoclave causou diferenas

estatisticamente significantes em 4 subgrupos ( gua destilada a 28 dias, timol a 7 dias, e NaOCl a 7 e 28 dias), a radiao gama o fez apenas em 2 (formalina a 28 dias e NaOCl a 7 dias), sendo que as diferenas de microdureza observadas para esta ltima foram de amplitude menor do que para a primeira. Alm disso, os grupos da formalina a 28 dias e do NaOCl a 7 dias apresentaram diferena negativa dos valores de microdureza, ou seja, mostraram valores de Md3 maiores do que os de Md2, quando submetidos radiao gama. Outro aspecto importante foi notado quanto ao

comportamento da esterilizao por autoclave sobre os subgrupos armazenados em formalina a 10%. Nestes grupos foi alcanado o melhor resultado deste mtodo de esterilizao, sem ocorrncia de diferenas estatisticamente significantes aps sua aplicao, e com as menores diferenas. Este resultado discorda do relatado por Lee et al.41 (2007). Entretanto, h concordncia entre os dois estudos quanto associao do armazenamento em gua destilada seguido da esterilizao em autoclave, o que, em ambos, foi mostrado como prejudicial (o referido estudo avaliou a resistncia adesiva). Os resultados da ANOVA a 3 fatores mostraram significncia para os fatores: soluo de armazenamento (p= 0,000000), mtodo de esterilizao (p= 0,044600), interao soluo de

armazenamento X mtodo de esterilizao (p= 0,005685) e interao soluo de armazenamento X perodo de armazenamento X mtodo de esterilizao (p= 0,044772).

97

Verificando-se os grficos da Figura 16, destaca-se o comportamento da soluo de timol. Quanto ao subgrupo armazenado por 7 dias, possvel observar uma maior distncia entre as curvas azul (autoclave) e vermelha (radiao gama), o que sugere que a diferena estatstica encontrada nesse caso tenha se dado mais s expensas desta soluo, no referido perodo. Reforando esta idia, pode-se notar a formao de conjuntos homogneos contendo muitos subgrupos, ou seja, a diferena estatstica verificada parece ter sido influenciada pelo comportamento diferencial deste subgrupo (armazenamento por 7 dias seguido de esterilizao por autoclave), enquanto os demais mantiveram se prximos entre si. No estudo de Titley et al.77 (1998) tambm foi encontrado resultado negativo associado ao armazenamento em soluo de timol quando avaliada a fora adesiva. Quando analisados os conjuntos homogneos formados aps o teste de Tukey ps-esterilizao, foi notada heterogeneidade dos subgrupos H2O/radiao gama apenas em relao aos subgrupos do timol expostos autoclave e aos subgrupos do NaOCl (todos os perodos e mtodos de esterilizao). A associao do armazenamento em timol a 0,05% seguido da esterilizao em autoclave (tanto a 7 quanto a 28 dias) mostrou-se prejudicial quanto aos valores de microdureza dentinria neste estudo. Em todas as anlises conduzidas neste trabalho, os melhores resultados foram atribudos ao armazenamento em gua destilada seguido da radiao gama como mtodo de esterilizao.

7 CONCLUSES

Com base nos resultados obtidos, e nos limites da proposio deste estudo, foi possvel concluir que:

a) o armazenamento de dentes em gua destilada por at 28 dias no alterou as propriedades fsicas do substrato dental em termos de microdureza dentinria radicular; b) o NaOCl a 1% reduziu a microdureza dentinria da ordem de at 70% em mdia (em 28 dias de armazenamento), no sendo recomendado seu uso para dentes a serem utilizados em pesquisa; c) a esterilizao tanto em autoclave quanto por radiao gama no alterou a microdureza

dentinria de forma significante quando aplicada isoladamente, embora interaes com solues previamente utilizadas para o armazenamento tenham sido encontradas; d) a esterilizao por radiao gama aps o armazenamento em gua destilada mostrou-se o melhor mtodo a ser utilizado em terceiros molares extrados, no que diz respeito

microdureza dentinria.

99

8 REFERNCIAS*

1 Alani A, Knowles J, Ng YL, et al. Ion release characteristics, precipitate formation and sealing ability of a potential new root canal filling material. Int Endod J. 2008;41(9):817-8.

2 Amaechi BT, Higham SM, Edgar WM. Efficacy of sterilisation methods and their effect on enamel demineralisation. Caries Res. 1998;32(6):441-6.

3 Amaechi BT, Higham SM, Edgar WM. Effect of sterilisation methods on the structural integrity of artificial enamel caries for intra-oral cariogenicity tests. J Dent. 1999;27(4):313-6.

4 Angker L, Swain MV, Kilpatrick N. Micro-mechanical characterisation of the properties of primary tooth dentine. J Dent. 2003;31(4):261-7.

5 Ari H, Erdemir A, Belli S. Evaluation of the effect of endodontic irrigation solutions on the microhardness and the roughness of root canal dentin. J Endod. 2004;30(11):792-5.

6 Barjau-Escribano A, Sancho-Bru JL, Forner-Navarro L, et al. Influence of prefabricated post material on restored teeth: fracture strength and stress distribution. Oper Dent. 2006;31(1):47-54.

7 Bechtold P. Avaliao in vitro da microdureza dentinria radicular em dentes bovinos aps aplicao de diferentes tratamentos com hipoclorito de sdio, associado ou no ao cimento de fosfato de zinco [dissertao]. So Paulo: Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo - USP; 2006.

_______________________ * Baseado em: International Committee of Medical Journal Editors Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical journals: US National Library of Medicine, 2009.

100

8 Biven GM, Bapna MS, Heuer MA. Effect of eugenol and eugenolcontaining root canal sealers on the microhardness of human dentin. J Dent Res. 1972;51(6):1602-9.

9 Bodrumlu E, Tunga U, Alacam T. Influence of immediate and delayed post space preparation on sealing ability of resilon. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2007;103(6):e61-4.

10 Boschian Pest L, Cavalli G, Bertani P, et al. Adhesive postendodontic restorations with fiber posts: push-out tests and SEM observations. Dent Mater. 2002;18(8):596-602.

11 Brnnstrm M, Coli P, Blixt M. Effect of tooth storage and cavity cleansing on cervical gap formation in Class II glass-ionomer/composite restorations. Dent Mater. 1992;8(5):327-31.

12 Brauer DS, Saeki K, Hilton JF, et al. Effect of sterilization by gamma radiation on nano-mechanical properties of teeth. Dent Mater. 2008;24(8):1137-40.

13 Burcak Cengiz S, Stephan Atac A, Cehreli ZC. Biomechanical effects of splint types on traumatized tooth: a photoelastic stress analysis. Dent Traumatol. 2006;22(3):133-8.

14 Callister WD. Mechanical properties of metals. In: Materials science and engineering - an introduction. New York: John Wiley & Sons; 2007. p.131-173.

15 Camps J, Baudry X, Bordes V, et al. Influence of tooth cryopreservation and storage time on microleakage. Dent Mater. 1996;12(2):121-6.

16 Catros S, Pothuaud L, Dard M, et al. Collagen fibrils of human acellular extrinsic fiber cementum. J Periodontol. 2008;79(6):1095-100.

101

17 Coniglio I, Magni E, Goracci C, et al. Post space cleaning using a new nickel titanium endodontic drill combined with different cleaning regimens. J Endod. 2008;34(1):83-6.

18 Craig RG, Gehring PE, Peyton FA. Relation of structure to the microhardness of human dentin. J Dent Res. 1959;38(3):624-30.

19 Cruz-Filho AM, Paula EA, Pecora JD, et al. Effect of different EGTA concentrations on dentin microhardness. Braz Dent J. 2002;13(3):188-90.

20 Cruz-Filho AM, Sousa-Neto MD, Saquy PC, et al. Evaluation of the effect of EDTAC, CDTA, and EGTA on radicular dentin microhardness. J Endod. 2001;27(3):183-4.

21 DeWald JP. The use of extracted teeth for in vitro bonding studies: a review of infection control considerations. Dent Mater. 1997;13(2):74-81.

22 Dominici JT, Eleazer PD, Clark SJ, et al. Disinfection/sterilization of extracted teeth for dental student use. J Dent Educ. 2001;65(11):1278-80.

23 Eldeniz AU, Erdemir A, Belli S. Effect of EDTA and citric acid solutions on the microhardness and the roughness of human root canal dentin. J Endod. 2005;31(2):107-10.

24 Esclassan Noirrit E, Gregoire G, Cournot M. Morphological study of fiber-reinforced post-bonding system-root dentin interface by evaluation of two bonding systems. J Dent. 2008;36(3):204-13.

25 Fagrell TG, Lingstrom P, Olsson S, et al. Bacterial invasion of dentinal tubules beneath apparently intact but hypomineralized enamel in molar teeth with molar incisor hypomineralization. Int J Paediatr Dent. 2008;18(5):333-40.

26 Ferreira MC. Preparo de amostras para realizao do teste de microdureza [apostila]. Florianpolis: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina; 2004.

102

27 Fimple JL, Fontana CR, Foschi F, et al. Photodynamic treatment of endodontic polymicrobial infection in vitro. J Endod. 2008;34(6):728-34.

28 Fuentes V, Ceballos L, Osorio R, et al. Tensile strength and microhardness of treated human dentin. Dent Mater. 2004;20(6):522-9.

29 Gaggl A, Weiglein A, Kahr H, et al. Apical capping as a new technique for retrograde treatment of an infected root apex: introduction and first results. J Craniomaxillofac Surg. 2007;35(4-5):212-7.

30 Ghersel EL, Guedes-Pinto AC, Ciamponi AL. [Effect of the storage method on microleakage of primary teeth restored with different bonding systems: in vitro study]. Pesqui Odontol Bras. 2001;15(1):29-34.

31 Grajower R, Azaz B, Bron-Levi M. Microhardness of sclerotic dentin. J Dent Res. 1977;56(4):446.

32 Grigoratos D, Knowles J, Ng YL, et al. Effect of exposing dentine to sodium hypochlorite and calcium hydroxide on its flexural strength and elastic modulus. Int Endod J. 2001;34(2):113-9.

33 Habelitz S, Marshall GW, Jr., Balooch M, et al. Nanoindentation and storage of teeth. J Biomech. 2002;35(7):995-8.

34 Inaba D, Ruben J, Takagi O, et al. Effect of sodium hypochlorite treatment on remineralization of human root dentine in vitro. Caries Res. 1996;30(3):218-24.

35 International Organization for Standardization. Technical Specification. ISO/TS 11405. Dental Materials - Testing of adhesion to tooth structure. Genebra, Sua; 2003.

36 Kalkan M, Usumez A, Ozturk AN, et al. Bond strength between root dentin and three glass-fiber post systems. J Prosthet Dent. 2006;96(1):416.

103

37 Karapanou V, Vera J, Cabrera P, et al. Effect of immediate and delayed post preparation on apical dye leakage using two different sealers. J Endod. 1996;22(11):583-5.

38 Kinney JH, Balooch M, Marshall SJ, et al. Hardness and Young's modulus of human peritubular and intertubular dentine. Arch Oral Biol. 1996;41(1):9-13.

39 Kohn WG, Collins AS, Cleveland JL, et al. Guidelines for infection control in dental health-care settings--2003. MMWR Recomm Rep. 2003;52(RR-17):1-61.

40 Kumar M, Sequeira PS, Peter S, et al. Sterilisation of extracted human teeth for educational use. Indian J Med Microbiol. 2005;23(4):2568.

41 Lee JJ, Nettey-Marbell A, Cook A, Jr., et al. Using extracted teeth for research: the effect of storage medium and sterilization on dentin bond strengths. J Am Dent Assoc. 2007;138(12):1599-603.

42 Mahoney E, Holt A, Swain M, et al. The hardness and modulus of elasticity of primary molar teeth: an ultra-micro-indentation study. J Dent. 2000;28(8):589-94.

43 Manfrin TM, Poi WR, de Mendonca MR, et al. Analysis in vitro of direct bonding system with cyanoacrylate ester and orthodontic wires. Dent Traumatol. 2009;25(2):229-32.

44 Manjunath K, Kavitha B, Saraswathi TR, et al. Cementum analysis in cleidocranial dysostosis. Indian J Dent Res. 2008;19(3):253-6.

45 Marending M, Luder HU, Brunner TJ, et al. Effect of sodium hypochlorite on human root dentine--mechanical, chemical and structural evaluation. Int Endod J. 2007;40(10):786-93.

104

46 Matherne RP, Angelopoulos C, Kulild JC, et al. Use of cone-beam computed tomography to identify root canal systems in vitro. J Endod. 2008;34(1):87-9.

47 Meredith N, Sherriff M, Setchell DJ, et al. Measurement of the microhardness and Young's modulus of human enamel and dentine using an indentation technique. Arch Oral Biol. 1996;41(6):539-45.

48 Miears JR, Jr., Charlton DG, Hermesch CB. Effect of dentin moisture and storage time on resin bonding. Am J Dent. 1995;8(2):80-2.

49 Miranda WG, Placido E, Moura SK, et al. Influence of postextraction substrate aging on the microtensile bond strength of a dental adhesive system. J Adhes Dent. 2005;7(3):193-6.

50 Moraes LGP. Anlise quantitativa de espectros de absoro no infravermelho de compsitos odontolgicos fotoativados [dissertao]. Ilha Solteira: Faculdade de Engenharia - UNESP; 2004.

51 Moscovich H, Creugers NH, Jansen JA, et al. In vitro dentine hardness following gamma-irradiation and freezing. J Dent. 1999;27(7):503-7.

52 Muench A, da Silva EM, Ballester RY. Influence of different dentinal substrates on the tensile bond strength of three adhesive systems. J Adhes Dent. 2000;2(3):209-12.

53 Nakajima M, Kanemura N, Pereira PN, et al. Comparative microtensile bond strength and SEM analysis of bonding to wet and dry dentin. Am J Dent. 2000;13(6):324-8.

54 Norrington DW, Ruby J, Beck P, et al. Observations of biofilm growth on human dentin and potential destruction after exposure to antibiotics. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2008;105(4):526-9.

105

55 Oliveira LD, Carvalho CA, Nunes W, et al. Effects of chlorhexidine and sodium hypochlorite on the microhardness of root canal dentin. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2007;104(4):e125-8.

56 Panighi M, G'Sell C. Influence of calcium concentration on the dentin wettability by an adhesive. J Biomed Mater Res. 1992;26(8):10819.

57 Panighi M, G'Sell C. Effect of the tooth microstructure on the shear bond strength of a dental composite. J Biomed Mater Res. 1993;27(8):975-81.

58 Parsell DE, Karns L, Buchanan WT, et al. Mercury release during autoclave sterilization of amalgam. J Dent Educ. 1996;60(5):453-8.

59 Pashley D, Okabe A, Parham P. The relationship between dentin microhardness and tubule density. Endod Dent Traumatol. 1985;1(5):1769.

60 Pashley EL, Tao L, Pashley DH. Sterilization of human teeth: its effect on permeability and bond strength. Am J Dent. 1993;6(4):189-91.

61 Qing Y, Akita Y, Kawano S, et al. Cleaning efficacy and dentin micro-hardness after root canal irrigation with a strong acid electrolytic water. J Endod. 2006;32(11):1102-6.

62 Rodrigues LK, Cury JA, Nobre dos Santos M. The effect of gamma radiation on enamel hardness and its resistance to demineralization in vitro. J Oral Sci. 2004;46(4):215-20.

63 Sakae T, Mishima H, Kozawa Y. Changes in bovine dentin mineral with sodium hypochlorite treatment. J Dent Res. 1988;67(9):1229-34.

64 Saleh AA, Ettman WM. Effect of endodontic irrigation solutions on microhardness of root canal dentine. J Dent. 1999;27(1):43-6.

106

65 Sauro S, Mannocci F, Toledano M, et al. EDTA or H3PO4/NaOCl dentine treatments may increase hybrid layers' resistance to degradation: a microtensile bond strength and confocal-micropermeability study. J Dent. 2009;37(4):279-88.

66 Sengun A, Cobankara FK, Orucoglu H. Effect of a new restoration technique on fracture resistance of endodontically treated teeth. Dent Traumatol. 2008;24(2):214-9.

67 Shabahang S, Aslanyan J, Torabinejad M. The substitution of chlorhexidine for doxycycline in MTAD: the antibacterial efficacy against a strain of Enterococcus faecalis. J Endod. 2008;34(3):288-90.

68 Silva KG, Pedrini D, Delbem AC, et al. Microhardness and fluoride release of restorative materials in different storage media. Braz Dent J. 2007;18(4):309-13.

69 Sim TP, Knowles JC, Ng YL, et al. Effect of sodium hypochlorite on mechanical properties of dentine and tooth surface strain. Int Endod J. 2001;34(2):120-32.

70 Slutzky-Goldberg I, Liberman R, Heling I. The effect of instrumentation with two different file types, each with 2.5% NaOCl irrigation on the microhardness of root dentin. J Endod. 2002;28(4):311-2.

71 Slutzky-Goldberg I, Maree M, Liberman R, et al. Effect of sodium hypochlorite on dentin microhardness. J Endod. 2004;30(12):880-2.

72 Sly MM, Moore BK, Platt JA, et al. Push-out bond strength of a new endodontic obturation system (Resilon/Epiphany). J Endod. 2007;33(2):160-2.

73 Soares CJ, Soares PV, de Freitas Santos-Filho PC, et al. The influence of cavity design and glass fiber posts on biomechanical behavior of endodontically treated premolars. J Endod. 2008;34(8):1015-9.

107

74 Solano F, Hartwell G, Appelstein C. Comparison of apical leakage between immediate versus delayed post space preparation using AH Plus sealer. J Endod. 2005;31(10):752-4.

75 Sperandio M, Souza JB, Oliveira DT. Effect of gamma radiation on dentin bond strength and morphology. Braz Dent J. 2001;12(3):205-8.

76 Strawn SE, White JM, Marshall GW, et al. Spectroscopic changes in human dentine exposed to various storage solutions--short term. J Dent. 1996;24(6):417-23.

77 Titley KC, Chernecky R, Rossouw PE, et al. The effect of various storage methods and media on shear-bond strengths of dental composite resin to bovine dentine. Arch Oral Biol. 1998;43(4):305-11.

78 Toledano M, Osorio R, Osorio E, et al. Microhardness of acidtreated and resin infiltrated human dentine. J Dent. 2005;33(4):349-54.

79 Tonami K, Takahashi H, Nishimura F. Effect of frozen storage and boiling on tensile strength of bovine dentin. Dent Mater J. 1996;15(2):20511.

80 Vieira A, Hancock R, Dumitriu M, et al. How does fluoride affect dentin microhardness and mineralization? J Dent Res. 2005;84(10):951-7.

81

Vieira S. Anlise de varincia: (Anova). So Paulo: Atlas; 2006.

82 White JD, Lacefield WR, Chavers LS, et al. The effect of three commonly used endodontic materials on the strength and hardness of root dentin. J Endod. 2002;28(12):828-30.

83 White JM, Goodis HE, Marshall SJ, et al. Sterilization of teeth by gamma radiation. J Dent Res. 1994;73(9):1560-7.

84 White RR, Hays GL. Failure of ethylene oxide to sterilize extracted human teeth. Dent Mater. 1995;11(4):231-3.

108

85 Willems G, Celis JP, Lambrechts P, et al. Hardness and Young's modulus determined by nanoindentation technique of filler particles of dental restorative materials compared with human enamel. J Biomed Mater Res. 1993;27(6):747-55.

86 Wrbas KT, Altenburger MJ, Schirrmeister JF, et al. Effect of adhesive resin cements and post surface silanization on the bond strengths of adhesively inserted fiber posts. J Endod. 2007;33(7):840-3.

87 Yoldas O, Dogan C, Seydaoglu G. The effect of two different calcium hydroxide combinations on root dentine microhardness. Int Endod J. 2004;37(12):828-31.

88 Zehnder M, Lehnert B, Schonenberger K, et al. [Irrigants and intracanal medicaments in endodontics]. Schweiz Monatsschr Zahnmed. 2003;113(7):756-63.

89 Zheng TL, Huang C, Zhang ZX, et al. [Influence of storage methods on microtensile bond strength of dentin adhesive system]. Shanghai Kou Qiang Yi Xue. 2005;14(2):147-50.

109

ANEXO A Certificado do comit de tica em pesquisa

110

ANEXO B - Modelo do termo de doao de material biolgico preenchido e assinado pelos pacientes doadores ou seus responsveis legais

TERMO DE DOAO DE MATERIAL BIOLGICO

Autorizao de doao de material biolgico (dente/tecido) para pesquisa cientfica

Eu, ____________________________________________, abaixo assinado, RG ____________, CPF ______________, residente na cidade

de______________________________, Estado de _______________, declaro que estou doando os dentes/tecidos, que seriam descartados, para serem utilizados em pesquisas cientficas.

So Jos dos Campos, _____de _______________ de ____________.

______________________________________________ Paciente ou responsvel legal

__________________________________________________ Cirurgio-Dentista (profissional responsvel pela coleta e destinao do material)

111

ANEXO C - Modelo do termo de doao de material biolgico preenchido e assinado pelos profissionais que

colaboraram com a pesquisa

TERMO DE DOAO DE MATERIAL BIOLGICO

Eu, Dr. ________________________________________, RG__________, CPF ______________, CROSP, ______________, com consultrio na Rua/Av. __________________________________n ______na cidade

de______________________, Estado de ______________________, declaro que estou doando dentes/tecidos para serem utilizados em pesquisas cientficas, obtidos mediante Termo de Doao constante dos pronturios dos pacientes.

Declaro estar ciente que o Comit de tica em Pesquisa com Seres Humanos CEPh, da Faculdade de Odontologia de So Jos dos Campos UNESP, poder, a qualquer momento, solicitar cpia de todos os Termos de Doao de Material Biolgico corretamente preenchidos por cada doador ou seu representante legal.

So Jos dos Campos, _____de _______________ de ____________.

_________________________________________________ Cirurgio-Dentista (profissional responsvel pela coleta e destinao do material)

112

ANEXO D Certificado de esterilizao CBE Embrarad

Aivazoglou MU. Effect of storage solutions, sterilization methods and their associations upon human dentin microhardness: an in vitro study [dissertation]. So Jos dos Campos: So Jos dos Campos School of Dentistry, UNESP - So Paulo State University; 2009.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effect of storage solutions: distilled water (G1), 0.05% thymol solution (G2), 10% formalin (G3), and 1% sodium hypochlorite (G4); sterilization methods- steam autoclaving (A) and gamma irradiation (B)- and the associations between the two factors on the root dentin microhardness of extracted human third molars. Data were subjected to Students t test for dependent samples, Two and Three-way ANOVA, and Tukeys test ( = 0.05 for all tests). Regarding storage, only the G1 (in both periods) did not alter the dentin microhardnes significantly. In the analysis of sterilization methods, there were significant differences on the solution employed, storage time and sterilization method (p <0.05). Based on the results, it was concluded that the storage in distilled water did not change the root dentin microhardness, and association of this storage solution with sterilization by Gamma radiation did not produce alterations by means of the studied variable, thus consisting in the best methods regarding storage and sterilization of teeth to be used in research.

Keywords: Exposure to Biological Agents. Sterilization. Hardness tests. Dentin. Tooth root.