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3.

MECANISMOS MOLECULARES REPARAO DO DNA

DE

MUTAO

Sumrio

3. Mutao e Reparao do DNA Introduo Tipos de mutaes Agentes mutagnicos qumicos Agentes mutagnicos fsicos - radiaes Mecanismos de reparao do DNA Elementos de transposio

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3.1 Introduo A integridade do DNA vital para a sobrevivncia. Durante a replicao, transcrio, e mesmo num estado inactivo, podem ocorrer erros na sequncia de nucletidos do DNA. No processo evolutivo, foram desenvolvidos mecanismos de correco de erros resultantes da replicao e de agentes ambientais e qumicos. Mutante: organismo ou gene que diferente do tipo normal ou tipo selvagem. Mutao: alterao hereditria na sequncia de bases de uma molcula de DNA. O tipo de mutao mais comum a substituio, adio ou deleco de uma ou mais bases. Agente mutagnico: agente aparecimento de uma mutao;
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fsico

ou

qumico

que

origina

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3.2 Tipos de mutaes Mutao espontnea: ocorre naturalmente e resulta da substituio aleatria de nucletidos, sem a adio de um agente mutagnico. Mutao induzida: mutao que resulta da aco de um agente mutagnico (ex. radiao solar na banda do U.V., aco de agente qumico) A taxa de mutao espontnea baixa e varia em diferentes organismos Vrus e bactrias: 1 em cem milhes (1 x 10-8) Homo sapiens: 1 x 10-5 a 1 x 106 Rato: 1x 10-4 a 1 x 10-5 As mutaes originam o aparecimento de novos alelos e so a origem da variabilidade gentica das populaes

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Mutaes somticas e gamticas: - As mutaes somticas surgem nas clulas somticas e no so transmitidas descendncia. A sua expresso depende se so dominantes ou recessivas, se esto localizadas ou no no cromossoma X. As mutaes gamticas so transmitidas descendncia Mutaes Pontuais I) Substituio de bases no DNA Transio: troca de uma purina (adenina ou guanina) por outra purina, ou de uma pirimidina (timina ou citosina) por outra pirimidina Transverso: troca de uma purina por uma pirimidina, ou vice-versa.

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Transverso Transio

A substituio de bases ocorre porque existem formas tautomricas das bases azotadas. Formas tautomricas: formas qumicas alternativas (ismeros) das bases azotadas, provocadas pela mudana de um proto e que provocam emparelhamento irregular durante a replicao do DNA.

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Tautmeros: timina (enol), guanina (enol), citosina (imino) e adenina (imino)

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Substituio de bases azotadas do DNA

A mudana da base adenina para a forma tautomrica iminio origina, aps replicao do DNA, uma mutao do tipo transio de A = T para GC
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A substituio de bases causa alterao num nico codo do mRNA. O codo mutante pode ou no provocar mudana de um aminocido ao longo da cadeia polipeptdica, sendo possveis trs situaes: i) Mutao silenciosa: a sequncia de bases do DNA no altera a sequncia de aminocidos da cadeia polipeptdica, devido redundncia ou degenerescncia do cdigo gentico. Ex: 3 AGC 5 serina (substituio) 3 AGG 5 serina ii) Mutao de sentido errado (mutao missense): A substituio de uma base azotada acarreta a alterao de um aminocido na cadeia polipeptdica. Ex: 3 AGC 5 serina (substituio) 3 AAC 5 leucina

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iii) Mutao sem sentido (mutao non-sense): Da substituio de uma base azotada no DNA, resulta um dos codes de terminao do mRNA, o que impede a sntese completa da cadeia polipeptdica. Ex. 3 AGC 5 serina (substituio) 3 ATC 5 mRNA 5 UAG 3 (codo de terminao)

II) Insero ou deleco de bases no DNA (frameshift mutation) A eliminao ou incluso de uma nica base azotada provoca alteraes na sequncia de DNA a partir do ponto de adio ou deleco. Consequentemente resulta uma mudana na matriz de leitura do mRNA, resultando uma protena no funcional.

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Ex. DNA 5 ATG CCG ACG TAT CAG TAA 3 3 TAC GGC TGC ATA GTC ATT 5 (cadeia molde) mRNA: 5 AUG CCG ACG UAU CAG UAA 3 metionina prolina treonina tirosina glutamina Mutao por Insero de: A-T entre o 5 e o 6 par de bases DNA 5 ATG CCA GAC GTA TCA GTA A 3 3 TAC GGT CTG CAT AGT CAT T 5 (cadeia molde) mRNA: 5 AUG CCA GAC GUA UCA GUA A 3 metionina prolina cido asprtico valina serina - valina Alterao da sequncia de aminocidos e desaparecimento do codo de terminao (ponto final) cadeia polipeptdica no funcional.
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3. 3 Agentes mutagnicos qumicos i) Compostos qumicos Anlogos de bases azotadas So agentes qumicos mutagnicos que podem substituir purinas ou pirimidinas durante a biossntese dos cidos nucleicos. 5-bromouracilo comporta-se como um anlogo da timina. Na sua forma tautomrica, enol, o 5-BU emparelha com a guanina. Aps uma gerao de replicao, resulta uma transio de AT para GC. Para alm do 5-BU, existem outras substncias qumicas anlogas de bases azotadas, que so agentes mutagnicos. Por exemplo a 2-amino purina (2-AP), um anlogo da adenina. A 2-AP emparelha normalmente com a timina, contudo pode emparelhar tambm com a citosina originando transies de A = T para G T, aps replicao do DNA.
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O 5-bromouracilo tem uma estrutura semelhante timina. Na forma ceto (normal) o 5-BU emparelha com a adenina. Contudo, na forma tautomrica rara enol, emparelha com a guanina

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ii) Agentes Alquilantes Os gases mostarda, utilizados durante a I guerra mundial, foram dos primeiros agentes mutagnicos a serem descobertos. Os gases mostarda reagem com os cidos nucleicos e tm capacidade para ceder um grupo alquilo como CH3 ou CH3CH2 aos grupos amino e ceto de nucletidos. Por exemplo, o sulfonato de etilmetano (EMS) introduz um grupo alquilo na guanina. A guanina perde a afinidade de ligao com a citosina, resultando aps replicao do DNA a transio GC para A = T.

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iii) Desaminao A desaminao (substituio de grupos amina NH2 por grupos ceto =O) produzida por determinados agentes mutagnicos, como por exemplo o xido nitroso (NO2H), pode resultar numa mutao do tipo substituio. C A G Uracilo (U) o qual emparelha com A Hipoxantina (H) a qual emparelha com C Xantina (X) a qual emparelha com C.

iv) Agentes intercalantes As substancias, acridinas e brometo de etdio, so molculas planas que se inserem entre dois pares de bases do DNA separando-as entre si. Durante a replicao, esta conformao anormal conduz a inseres ou deleces, originando mutaes na sequncia de leitura (mutaes frameshift).
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3.4 Agentes mutagnicos fsicos - Radiaes i) Radiao ultravioleta (UV) O principal efeito da radiao UV consiste na induo de dmeros entre pirimidinas T, C), particularmente entre bases do tipo timina.

Os dmeros entre pirimidinas distorcem a conformao da molcula de DNA e inibem uma replicao normal. Consequentemente so introduzidos erros na sequncia de bases do DNA durante a replicao.
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Ao nvel celular, existem mecanismos de reparao que permitem reparar as leses provocadas pelas radiaes UV.

ii) Radiaes ionizantes Raios X, raios gama, raios csmicos, causam a ionizao das molculas. Os raios X penetram atravs das clulas e provocam a ejeco de electres dos tomos das molculas. As molculas e tomos inicialmente estveis so transformados em radicais livres e ies reactivos. Um dos radicais mais importantes o radical hidroxilo (OH-). Os radicais livres reagem com o DNA podendo originar: - Alteraes das purinas e pirimidinas mutaes pontuais; - Quebra das ligaes fosfodister; - Ruptura da integridade dos cromossomas.

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As clulas em mitose so mais sensveis aos efeitos mutagnicos dos raios X do que clulas em interfase. Durante a mitose, a cromatina est mais condensada e existe maior susceptibilidade, os raios X podem quebrar os cromossomas, resultando deleces, translocaes e fragmentao de cromossomas, com morte celular. Esta propriedade explorada no tratamento de tumores malignos por radiao. 3.5 A sequenciao do genoma humano tem permitido compreender a origem de algumas mutaes em humanos Ex. - Grupos sanguneos ABO Os alelos IA ou IB apresentam diferenas em 4 nucletidos (4 substituies : Glicosiltransferase H antignio A ou B. No caso do grupo O (gene IO) no existe actividade da referida enzima devido deleco de um nucletido.
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3.6 Mecanismos de reparao do DNA A. Reparao antes da replicao: i) Fotorreactivao Albert Kelner (1949) Em E. coli os danos causados por UV so revertidos parcialmente se as clulas, aps a radiao UV, so expostas a luz na banda do azul, do espectro visvel. O processo dependente da activao de uma protena enzima de fotorreactivao (PRE). A reparao por fotorreactivao parece no ser essencial em E. coli. A enzima eucariotas. PRE no foi detectada em

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ii) Reparao por exciso de bases azotadas e de nucletidos Mecanismo de reparao do DNA em procariotas e eucariotas, no dependente da luz 1. O erro existente numa das cadeias da dupla hlice do DNA reconhecido e removido por aco de uma nuclease 2. Uma DNA polimerase (DNA polimerase I em E. coli) preenche o local de exciso, colocando nucletidos por complementaridade com os da cadeia intacta. 3. A enzima DNA ligase estabelece a ligao entre a extremidade 3-OH da sequncia de nucletidos inserida e a restante cadeia
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Reparao por exciso: reparao por exciso de bases azotadas (BER) vs. reparao por exciso de nucletidos (NER)

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A reparao por exciso de bases azotadas (BER) reconhece e substitui pequenas alteraes nas bases azotadas do DNA, resultantes de mutaes espontneas ou da aco de agentes qumicos. Estes erros no impedem a replicao e transcrio do DNA. A reparao por exciso de nucletidos (NER) est relacionada com a reparao de mutaes que distorcem a configurao normal da molcula de DNA, como as ocasionadas por radiao UV. Estes erros impedem a replicao e transcrio do DNA.
BER em E. coli: 1. Reconhecimento e exciso da base alterada por aco das DNA glicosilases; 2. Remoo da pentose por ao de uma endonuclease (AP endonuclease); 3. A DNA Polimerase I preenche o local de exciso; 4. A DNA ligase realiza a ligao fosfodister.

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NER (em danos causados pela radiao UV): 1. Reconhecimento e exciso de nucletidos na regio afectada por aco de enzimas codificadas pelos genes uvr (uvrA, uvrB, uvrC). Em E. coli so removidos 13 nucletidos; 2. A DNA polimerase preenche a lacuna resultante; 3. A DNA ligase realiza a ligao fosfodister.

Xeroderma pigmentosum e a reparao por exciso de nucletidos em humanos A Xeroderma pigmentosum uma doena de natureza gentica que se caracteriza pela incapacidade de realizar a reparao, por exciso de nucletidos, de mutaes causadas por aco dos raios UV. Consequentemente indivduos com esta doena podem desenvolver facilmente cancro da pele, caso a mutao afecte genes importantes como o gene supressor de tumores p53.
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B: Reparao aps a replicao: reparao mismatch, reparao por recombinao e sistema de reparao SOS Um dos erros mais comuns consiste na insero, pela DNA polimerase III, de um nucletido errado (no complementar). Em bactrias este tipo de erro ocorre 1 vez em cada 100 000 inseres (1x10-5). A prpria enzima tem capacidade para rever e corrigir os erros (proofreading), comportando-se como uma exonuclease. Assim cerca de 99% dos erros so corrigidos. A taxa de erro final de ~ 1x 10-7. i) Reparao mismatch Mecanismo proposto por Robin Holliday no final dos anos 70 para explicar a correco de erros resultantes da insero errada de nucletidos na replicao. O par de nucletidos no complementar reconhecido, sistema de reparao sabe qual deles o incorrecto?
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mas como o

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Em E. coli o processo de reconhecimento baseia-se na metilao do DNA. Uma enzima, a adenina metilase, reconhece a seguinte sequncia do DNA : 5 ... GATC ... 3 3 ... CTAG ... 5 A enzima adenina metilase adiciona um grupo metilo (CH3) a cada nucletido de adenina, modificao que estvel durante todo o ciclo celular. Aps um ciclo de replicao, as cadeias sintetizadas de novo permanecem temporariamente no metiladas, o que permite que a enzima de reparao bacteriana (DNA polimerase I) reconhea o erro. A DNA polimerase I liga-se cadeia no metilada, e uma endonuclease corta o fragmento de DNA que contm o erro.

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ii) Reparao por recombinao Sistema de reparao proposto por Miroslav Radman em E. coli Ocorre quando o dano na cadeia de DNA no foi corrigido por outros sistemas e a replicao ocorre com falhas. A enzima RecA determina um processo de troca por recombinao, em que a falha na cadeia de DNA sintetizada de novo preenchida pela insero de um segmento da cadeia complementar intacta. A falha criada na cadeia complementar posteriormente preenchida pelo mecanismo de reparao que envolve a DNA polimerase I e a DNA ligase
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iii) Sistema de reparao SOS Sistema que em E. coli envolve um conjunto de DNA polimerases (Translesional polimerases) que permitem que a replicao prossiga apesar de existir um erro numa das cadeias do DNA. iv) Reparao de leses em ambas as cadeias (double strand break repair) Em clulas eucariotas, quando ambas as cadeias de DNA sofrem leses (ex. radiao ionizante), um mecanismo de reparao utiliza o DNA do cromossoma homlogo no danificado para reparar a mutao O processo de reparao ocorre normalmente durante o final da fase S/ incio de G2, aps a replicao. Em leveduras, sabe-se que esto envolvidas pelo menos 5 protenas designadas complexo RAD52.
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C. Elementos de transposio: sequncias de insero transposes So unidades genticas que se podem mover dentro do genoma.

Os elementos de transposio (transposes) foram estudados pela primeira vez por Barbara McClintock nos anos 50. No entanto, nessa poca, a ideia de que a informao gentica poderia no estar fixa no genoma, no foi bem aceite A bactria E. Coli, bem como muitos outros organismos, contm segmentos mveis de DNA que tm centenas a milhares pares de bases transposes ou elementos de transposio. Quando um transposo se replica, uma rplica permanece no stio original de insero e a outra replica inserida noutra regio do cromossoma transposio.
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Em bactrias, quando ocorre a transposio a sequncia frequentemente insere-se num gene, verificando-se a ruptura da funo gnica. Elementos IS ou Sequncias de insero Peter Starlinger & James Shapiro, anos 70, conseguiram evidncias ao nvel molecular da existncia de elementos genticos mveis em E. coli. Constataram uma mutao resultante da insero de um segmento de DNA no cromossoma bacteriano, no incio do gene policistrnico para o metabolismo da galactose, o qual reprimia a expresso deste gene. O referido segmento foi designado de sequncia de insero ou elemento IS. Quando o segmento saa espontaneamente da referida regio, a funo selvagem era restaurada.

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As sequncias de insero so sequncias curtas de DNA que funcionam como um elemento de transposio simples. Possuem duas caractersticas distintivas relativamente aos transposes bacterianos: - so sequncias curtas (usualmente 700 2500 pb) - Apenas codificam transposio. para protenas envolvidas no processo de

As sequncias IS possuem promotores e sinais de trmino de transcrio e traduo. Os elementos IS codificam para uma protena especial de ligao ao DNA designada transposase, e uma protena reguladora que estimula ou inibe a transposio. A zona codificante do elemento IS est flanqueada por sequncias terminais invertidas

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As transposases so protenas de ligao ao DNA que tm habilidade de reconhecer especificamente as sequncias terminais invertidas da sequncia de insero, permitindo que o elemento IS se mova como uma unidade discreta. As transposases determinam provavelmente o local do cromossoma onde a sequncia IS ser inserida, embora tambm se admita que para muitos elementos IS a insero seja aleatria.

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Transposes bacterianos Os transposes em bactrias consistem de elementos IS que contm genes cujas funes no esto relacionadas exclusivamente com o processo de insero. semelhana das sequncias de insero, os transposes so mveis nos cromossomas de bactrias, vrus e em plasmdeos Os transposes proporcionam um mecanismo para o movimento da informao gentica dentro de um organismo e tambm entre organismos A descoberta do movimento de transposes entre molculas de DNA, est associada a estudos de resistncia a antibiticos em bactrias, efectuados por Sumusu Mitsuhashi, nos anos 60. Os genes responsveis pela resistncia a vrios antibiticos movimentavam-se entre o DNA de plasmdeos e o cromossoma bacteriano.
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Estudos de microscopia electrnica permitem confirmar a presena de sequncias repetitivas invertidas e terminais em plasmdeos transportadores de transposes.

Quando o DNA em cadeia dupla de plasmdeos levado separao em duas cadeias simples, verifica-se a formao de hetroduplex pelo emparelhamento complementar entre sequncias terminais dos transposes.

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Em humanos o transposo mais comum a sequncia Alu, a qual possui um comprimento de cerca 300 pb. Esta sequncia encontra-se repetida no genoma humano entre 3x105 e 1x106.

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