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Desenvolvimento de mtodos analticos espectrofluorimtricos e eletroanalticos para compostos de interesse farmacolgico

Aluno: Juliano Leodonio Xavier Lima Orientador: Ricardo Queiroz Auclio 1. Introduo Com o crescente desenvolvimento e crescimento populacional ocorrido principalmente aps a Primeira Revoluo industrial, ocorrida no sculo XVIII, alguns recursos so sobrecarregados. Especificamente na produo de alimentos, o aumento de eficincia passa pela maior produtividade por rea plantada e pelo controle de pragas. O manejo de culturas geneticamente modificadas, conhecidas como alimentos transgnicos, com resistncia s pragas ainda controverso e necessita de mais pesquisas a cerca dos impactos provenientes na flora e em possveis efeitos colaterais decorrentes do seu consumo. A utilizao de pesticidas ainda a estratgia mais difundida para o controle de pragas, sendo essa prtica extensiva depois da II Guerra Mundial por causa da introduo do DDT, BHC, aldrina, dietilaldrina, endrina e 2,4 D. A constituio da produo de pesticidas possuem propriedades fsicas dos constituintes, como causa diferentes classes de pesticidas podem ser usadas em combinao, como consequncia pretende-se potencializar os efeitos para minimizar ou eliminar a presena de pragas nas culturas. Mesmo assim, ainda que usados corretamente, acidentes decorrentes do uso de pesticidas so comuns. Muitas classes de pesticidas podem prejudicar o meio ambiente alm de ocasionar intoxicaes graves nos seres vivos1. Os pesticidas desenvolvidos nos ltimos anos possuem como caracterstica uma alta persistncia e permanncia mais prolongada no meio ambiente o que acarreta um maior risco de contaminao tanto dos alimentos quanto do manipulador sem os devidos requisitos de segurana, podendo contaminar o solo, o ar e o lenol fretico, tornando importante seu monitoramento quantitativo da presena dos mesmos. As estrobirulinas so uma classe de pesticidas naturais isolados principalmente de cogumelos, sendo facilmente degradados em plantas animais e gua. As estrobirulinas sintticas foram produzidas a partir das estrobirulinas naturais, sendo mais estveis e potentes quando usados para controle de fungos na agricultura. As estrubilurinas inibem a respirao celular ligando-se a um local especfico nas mitocndrias, o local de oxidao do quinol (ou do ubiquinol) do citocromo b, e desse modo a transferncia de eltrons entre o citocromo b e c cessa, o que leva a diminuio da taxa de oxidao do NADH (dinucleotdeo de nicotinamida e adenina) e sntese do ATP (adenosina trifosfato). Como conseqncia, a produo de energia parada e o parasito (fungo) morre2. As estrobilurinas so mais conhecidas como fungicidas inibidores quinonas, cuja caracterstica importante a ao rpida e concentrada no primeiro perodo do ciclo de vida dos fungos, isto , no estgio de esporos. Por causa desse modo de ao diferenciado, as estrobilurinas so degradadas rapidamente nas plantas, gua e solo. A maioria dos fungicidas estrobilurinas tem um perodo residual de aproximadamente 21 dias. As quantidades esperadas para causar toxidade aguda em indivduos de 68 kg seriam as seguintes: de 500 at 5.000 mg/kg (ingesto oral), de 2.000 a 20.000 mg/kg (exposio cutnea) e de 2.0 a 20.0 mg/L (inalao)3. At o ano de 2005 no havia relatos de efeitos teratognicos e carcinognicos decorrentes da exposio s estrobilurinas, no entanto, estas so txicas para peixes e invertebrados aquticos, o que torna necessrio o acompanhamento quando se faz a aplicao em torno de poos

Departamento de Qumica dgua, estes cuidados so indicados nas embalagens dos produtos4. Segundo a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) a dose de Ingesto Diria Aceitvel (IDA) de 0,043 mg Kg-1 para a picoxistrobina, 0,040 mg Kg-1 para a piraclostrobina, 0,02 mg Kg-1 para azoxistrobina e 0,03 mg Kg-1 para trifloxistrobina5. Metodologias analticas tem sido desenvolvidas e pesquisadas visando uma determinao simultnea e prtica de estrobirulinas. As tcnicas cromatogrficas esto sendo utilizadas e variaes desenvolvidas para utilizao em anlises de amostras, tais como frutas, vegetais, sucos, vinhos e compartimentos ambientais como gua e solo. A tcnica de eletroforese capilar at o momento no foi aplicada para determinao de dimoxistrobina. O objetivo deste trabalho desenvolver um novo mtodo para determinao simultnea de sete estrobirulinas apresentados na Figura 1 (azoxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, kresoxim-metil e fluoxastrobina) utilizando a tcnica de eletroforese capilar micelar (MEKC). Esta tcnica se baseia na aplicao de uma diferena de potencial visando separao de analitos com diferentes mobilidades eletroforticas dentro de um capilar preenchido com um eletrlito de separao, a deteco ser por fotometria de absoro. Dentre as vantagens desta tcnica esto a alta velocidade e eficincia, fcil manuseio da amostra, baixa produo de resduos e baixo custo de operao.

Azoxistrobina

Dimoxistrobina

Piraclostrobina

Trifloxistrobina

Kresoxim-metil

Picoxistrobina

Fluoxastrobina Figura 1: Estrutura das estrobirulinas selecionadas para este trabalho. 1.1 Cromatografia eletrocintica capilar micelar - MEKC O processo de eletroforese definido como o movimento ou migrao diferenciada de espcies carregadas pela atrao ou repulso em um campo eltrico. Na eletroforese capilar vrios modos de separao podem ser efetuados com apenas pequenas mudanas de condies, particularmente no eletrlito de corrida. O modo de separao deve ser escolhido de acordo com as caractersticas qumicas dos analitos, em

Departamento de Qumica especial, se ele possui ou no carga quando em soluo. Nesse trabalho a cromatografia eletrocintica capilar micelar (MEKC) foi escolhida como modo de separao para as estrobilurinas. Os mtodos eletroforticos em soluo livre (CZE) so limitados a separao de compostos que contm carga ou apresentam grande diferena em suas massas moleculares. MEKC o nico modo de CE que capaz de separar tanto os compostos neutros quanto os carregados sendo introduzida por Terabe et al. em 19846. A cromatografia eletrocintica (EKC) pertence a uma famlia de tcnicas de separao com eletromigrao que envolve fenmenos eletrocinticos (eletroforese e eletroosmose) na separao de constituintes da amostra. Em EKC, o equilbrio qumico (distribuio, troca inica, formao de complexo e partio) componente importante do processo de separao. De acordo com Terabe et al.7 EKC definida como uma tcnica de separao com eletromigrao em capilar envolvendo uma fase denominada pseudo-estacionria responsvel pela separao. A fase pseudo-estacionria uma unidade (por exemplo, uma micela ou um polmero dissolvido) que interage com o soluto, no afetando sua velocidade de migrao. Por recomendao da IUPAC, EKC definida como uma tcnica de separao baseada na combinao de eletroforese e interaes do analito com aditivos (por exemplo, surfactantes), os quais formam uma fase dispersa (secundria) que se move com velocidade diferente do analito. Para conseguir a separao dos analitos, essa fase secundria deve ser carregada. MEKC um caso especial de EKC, na qual a fase secundria uma fase micelar dispersa no capilar8. Em MEKC, agentes tensoativos inicos, em condies apropriadas formao de micelas, so adicionados ao eletrlito de corrida, proporcionando assim um sistema cromatogrfico de duas fases. O eletrlito representa a fase primria, a qual transportada eletroosmoticamente sob ao do campo eltrico, enquanto que as micelas representam a fase pseudo-estacionria, a qual transportada por uma combinao de eletroforese e eletroosmose. Solutos neutros com diferentes coeficientes de partio (Pmw) entre a fase aquosa (eletrlito) e a fase micelar podem ser separados6,8 (Figura 2). Em MEKC existe um limite de eluio, chamado janela de eluio, que definido pelo tempo de eluio do EOF (tEO) e o tempo de migrao das micelas (tmc). MEKC pode ser visto como hbrido da cromatogradia lquida de fase reversa e CZE, com um processo de separao tendo interaes hidrofbicas e polares, mecanismo de partio e eletromigrao. MEKC oferece uma combinao de fatores de CZE e cromatografia lquida como a alta eficincia, curtos tempos de anlise, pequeno volume de amostra e o consumo muito reduzido de solvente6.

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Figura 2: Esquema representativo da separao por MEKC usando micelas aninicas (adaptado da ref.9). 1.1.1 Micelas Surfactantes so molculas anfiflicas que contm grupamentos com carter hidrofbico (cauda apolar) e hidroflico (cabea polar ou inica). Eles podem ser reconhecidos pela parte hidroflica, como surfactantes aninico, catinico, neutro ou anfotro; ou pelas caractersticas da parte orgnica (hidrofbica). Os surfactantes tm, em geral, a propriedade de formar micelas quando esto em concentrao superior a um valor crtico, denominada concentrao critica micelar (CMC). As micelas esto sempre em equilbrio com os monmeros (molculas de surfactantes) presentes em soluo. O nmero de monmero e tamanho das micelas varia entre os tipos de surfactantes. O processo de formao de micelas por surfactantes em meio aquoso ocorre do fato da reduo da interao hidrocarboneto-gua ser energeticamente favorvel. A CMC na qual a agregao ocorre reflete o fato de que interaes hidrofbicas entre a parte apolar das molculas do surfactante balanceada pela hidratao e pela repulso eletrosttica do grupo hidroflicoErro! Indicador no definido.. Os surfactantes que apresentam altos valores de CMC so inadequados para MECC, pois as micelas formadas coexistem com grandes quantidades de monmero livre, o que representa uma sobrecarga trmica (aumento de calor a ser dissipado pelo capilar)10. O surfactante utilizado para formao de micelas nesse trabalho foi o dodecil sulfato de sdio (SDS), um surfactante aninico. As micelas aninicas tm mobilidade eletrofortica em sentido contrrio ao do EOF, com isso sua velocidade de migrao diferente da soluo eletroltica o que favorece a interao analito-micela10. Para o sucesso da separao necessrio que essa interao seja diferente para os diversos solutos.

1.1.2 Migrao em MEKC Como citado, micelas aninicas migram em direo oposta ao EOF em um capilar de slica. Tipicamente em capilares de slica fundida e em pH maior que 6, a

Departamento de Qumica vEOF maior que a velocidade eletrofortica das micelas aninicas. Como resultado as micelas so carreadas para o catodo. Quando micelas catinicas so usadas, a parede do capilar recoberta com surfactante positivamente carregado para inverter o EOF, e conseqentemente a polaridade dos eletrodos tambm deve ser invertida para permitir a eluio das micelas dentro da janela de eluio. Existem dois extremos que define uma janela de eluio em MEKC. O extremo teo marcado por analitos que no interagem com as micelas (Pmw ~ 0) e que passam todo o tempo de migrao na fase aquosa, migrando com mobilidade eletroosmtica. O outro extremo tmc definido pela eluio de analitos que interagem fortemente com as micelas e (Pmw ~ ), esses compostos so muito hidrofbicos e seus tempos de migrao coincidem com o tempo de migrao das micelas (tmc). A existncia da janela de eluio limita a capacidade de pico em MEKC j que todos os analitos neutros devem ser separados entre os tempos teo e tmc. O tamanho da janela de eluio pode ser alterado pela adio de modificadores orgnicos, misturas de micelas ou pela modificao da parede do capilar 6(Figura 3).
Solutos EOF

Micela

teo

t1

t2

t3

tmc

Figura 3: Esquema da janela de eluio em MEKC (adaptado da ref. 11). 2. Proposta de Trabalho A proposta de trabalho foi desenvolver um mtodo analtico para determinao simultnea de pesticidas em alimentos atravs da tcnica de cromatografia eletrocintica capilar micelar. Os pesticidas analisados foram azoxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, kresoxim-metil e fluoxastrobina, que pertencem a uma classe conhecida como estrobirulina. As condies instrumentais e experimentais para a separao dos pesticidas foram otimizadas. 3. Procedimento experimental 3.1 Materiais e reagentes Azoxistrobina, dimoxistrobina, piraclostrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, kresoxim-metil e fluoxastrobina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Steinheim, Alemanha). Solues estoque 1x10-3 mol L-1, preparadas em acetonitrila grau HPLC (Merck - Darmstadt, Alemanha), foram utilizadas no preparo das solues de trabalho atravs de diluies posteriores. Todas as solues foram filtradas com filtros Miilipore de 0,45 m (membranas de PTFE) antes da injeo nos sistemas eletroforese capilar. O eletrlito de corrida contendo tampo borato, SDS e acetonitrila foi preparado diariamente e o pH ajustado com NaOH 1 mol L-1. O cido brico e o SDS (docecil sulfato de sdio) foram obtidos da Merck.

Departamento de Qumica 4. Instrumentao As anlises por eletroforese capilar foram realizadas em um equipamento comercial Hewlett-Packard (HP) CE Agilent. O instrumento era equipado com um detector espectrofotomtrico do tipo arranjo de diodos de operao na faixa de 190 a 600 nm, um controlador de temperatura do tipo Peltier, um sistema automtico de injeo de amostra e um programa de aquisio e tratamento de dados desenvolvido pela Agilent. As separaes foram conduzidas em capilar de slica fundida de 56 cm de comprimento total (47,5 cm at o detector) e 75 m de dimetro interno. A diferena de potencial aplicada durante as anlises foi de +25 kV e a temperatura mantida constante em 25 C. As injees das amostras foram realizadas em modo hidrodinmico com presso de 50 mbar por 15 segundos. 5. Resultados e discusso 5.1 Estudo visando determinao de pesticidas por CE O primeiro estudo foi realizado com intuito de separar duas estrobilurinas (azoxistrobina e dimoxistrobina) utilizando o mtodo MEKC, uma vez que os analitos so neutros em soluo. Estudos realizados anteriormente com duas estrobilurinas, picoxistrobina e piraclostrobina, indicaram que apenas a interao analito-micela no era suficiente para que ocorresse a separao desses analitos. A separao das estrobilurinas s ocorreu aps a adio de modificador orgnico ao eletrlito de trabalho (BGE), e o estudo mostrou que a adio de acetonitrila (ACN) apresentava melhores resultados em termos de resoluo do que a presena de metanol12. Devido a estudos anteriores, os estudos iniciais de separao da azoxistrobina e dimoxistrobina foram realizados utilizando como eletrlito de trabalho uma soluo contendo 40 mmol L-1 Borato, 30 mmol L-1 SDS, pH = 8,61 e os parmetros instrumentais estabelecidos nos seguintes valores: temperatura = 25 C; voltagem = 25kV e tempo de injeo = 15 segundos. Solues estoques dos pesticidas foram preparados a partir de seus padres analticos em ACN na concentrao de 1 x 10 -3 mol L-1 e estocados a 4 C no escuro. Solues de trabalho foram diludas em gua nas concentraes desejadas. O eletrlito de trabalho foi preparado diariamente com ajuste de pH com auxlio de um pHmetro. Um estudo univariado dos parmetros experimentais que tem maior influncia na separao dos analitos foi realizado para otimizar a separao entre azoxistrobina e dimoxistrobina. O tempo de anlise, representado pelo tempo de migrao do ltimo pico, e a resoluo entre os picos foram as respostas avaliadas na escolha das condies experimentais. A melhoria da resoluo foi verificada pela adio de ACN no eletrlito de trabalho variando sua proporo entre 15 e 25%, em volume (Figura 4). Uma porcentagem maior de solvente foi evitada por causa do possvel efeito deletrio na formao das micelas. A melhor resoluo entre os picos foi obtida com 21% de ACN apesar de uma pequena degradao do pico da dimoxistrobina (pico em 4,6 minutos), essa porcentagem foi estabelecida para os prximos testes.

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A bs orb n cia ( m A U )

1 2 .5

21 % ACN 19 % ACN 17 % ACN 15 % ACN

10

25 % ACN 23 % ACN

7 .5 5

2 .5

0 -2 .5

-5 0 1 2 3 4 5 T e m po d e m ig ra o (m in ) 6

Figura 4: Anlise de uma soluo padro das estrobilurinas (1 x 10-5 mol L-1) pelo mtodo MEKC. Variao da porcentagem de ACN no eletrlito. Eletrlito de trabalho: 30 mmol L-1 de SDS, 40 mmol L-1 Borato, pH 8,5, capilar de slica fundida de 50 cm x 75 m d.i. (42,5 cm at o detector), os analitos foram injetados hidrodinmicamente,
com presso de 50 mbar por 15 segundos. O potencial aplicado (V) foi de 25 kV, temperatura (T) de 25C e deteco em 200 nm.

O efeito da concentrao do surfactante (SDS) foi otimizada numa faixa de concentrao entre 27 42 mmol L-1 (faixa de concentrao acima da CMC 8,2 mmol L-1 - do surfactante em gua). Os resultados foram apresentados na Figura 5 abaixo. O aumento da concentrao de surfactante provocou um aumentou no tempo de migrao, melhorou a resoluo e aumentou na rea dos picos, aumentando a sensibilidade do mtodo. Com uma concentrao de 27 mmol L-1, o tempo total da anlise foi de aproximadamente 3,78 minutos, j com a concentrao de 42 mmol L-1 a anlise teve um tempo alterado para 5,42 minutos. A concentrao de 42 mmol L-1 de SDS foi escolhida para otimizao do prximo parmetro.

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Absorbncia ( mAU )

1
35

30

25

20

42 mM SDS 39 mM SDS

15
36 mM SDS

10

33 mM SDS 30 mM SDS 27 mM SDS

0 1 2 3 4 5 6 7 9 8 Tempo de migrao (min)

Figura 5: Anlise de uma soluo padro das estrobilurinas (1 x 10-5 mol L-1) pelo mtodo MEKC. Variao da concentrao de SDS no eletrlito. Eletrlito de trabalho: 40 mmol L-1 Borato, pH 8,5 e 21% ACN; capilar de slica fundida de 50 cm x 75 m d.i. (42,5 cm at o detector), os analitos foram injetados hidrodinmicamente, com presso de 50 mbar por 15 segundos. O potencial aplicado (V) foi de 25 kV, temperatura (T) de 25C e deteco em 200 nm. 1 = azoxistrobina, 2 = dimoxsitrobina. Um ajuste fino de pH foi feito com o tampo borato, com pequenas variaes, dentro da faixa entre 8,51 e 9,01 (Figura 6). A separao dos picos foi observada em todos os valores de pH testados dentro da faixa do tampo borato e no houve diferena significativa na resoluo dos picos, assim como no tempo de anlise. Assim, o pH entre de 8,81 e 9,01 pode ser usado nos prximos testes. importante salientar que durante o estudo com diferentes valores de pH, um condicionamento do capilar com soluo eletroltica em questo foi realizada antes da injeo no sentido de estabilizar o sistema.

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A b s orb n c ia (m A U )

50

40
9 ,0 1 8 ,9 1

30
8 ,8 1

20

8 ,7 1 8 ,6 1

10

8 ,5 1

T e m p o d e m ig ra o (m in)

Figura 6: Anlise de uma soluo padro das estrobilurinas (1 x 10-5 mol L-1) pelo mtodo MEKC. Variao do pH do eletrlito. Eletrlito de trabalho: 42 mmol L-1 de SDS; 40 mmol L-1 Borato, 21% ACN, capilar de slica fundida de 50 cm x 75 m d.i. (42,5 cm at o detector), os analitos foram injetados hidrodinmicamente, com presso de 50 mbar por 15 segundos. O potencial aplicado (V) foi de 25 kV, temperatura (T) de 25C e deteco em 200 nm.

As condies estabelecidas at aqui foram: eletrlito de trabalho contendo: 42 mmol L-1 de SDS, 40 mmol L-1 Borato, 21% ACN e ajuste de pH com hidrxido de sdio entre 8,81 e 9,01. Os analitos foram injetados hidrodinmicamente, com presso de 50 mbar por 15 segundos com aplicao de potencial aplicado de 25 kV e temperatura de 25C. O estudo com as estrobilurinas foi ampliado pela incluso no mtodo de outros pesticidas da classe como, piraclostrobina, picoxistrobina, trifloxistrobina, kresoximmetil, metominostrobina e fluoxastrobina. A condio de contorno j estabelecida foram utilizadas para a realizao de um estudo para otimizar as condies de condicionamento e pr-condicionamento do capilar no incio de cada dia e entre corridas para que um nmero mximo de anlises sucessivas possa ser realizado. Esses condicionamentos so fundamentais para garantir a reproduo dos resultados e a capacidade do sistema em obter a separao de componentes. De fato, um dos problemas mais crticos da CE vem da falta de manuteno das condies de separao por perodos de tempo mais longos. A principal causa disso so as mudanas na dupla camada do capilar, alteraes na soluo causada pela aplicao de potencial elevado, entupimentos, criao de bolhas dentro do capilar. As condies estabelecidas anteriormente foram utilizadas para iniciar os estudos de separao das sete estrobilurinas selecionadas. O primeiro teste de separao foi realizado variando a concentrao de ACN (15, 17 e 20%) no eletrlito de trabalho

Departamento de Qumica (Figura 7). Os sete picos referentes aos analitos foram identificados, mas alguns analitos migraram juntos. A melhor resoluo entre os picos foi obtida com 15% de ACN.
*DAD1 D, Sig=200,4 Ref=450,50 (CABRINI\22072010000007.D) *DAD1 D, Sig=200,4 Ref=450,50 (CABRINI\22072010000008.D) *DAD1 D, Sig=200,4 Ref=450,50 (CABRINI\22072010000009.D) mAU

80

Absobncia (mAU)

70

60

50

15% ACN

40

30

17% ACN
20

20% ACN
10

10

12

14

16

min

Tempo

de migrao (min)

Figura 7: Anlise de uma soluo padro das estrobilurinas (1 x 10-5 mol L-1) pelo mtodo MEKC. Variao da porcentagem de ACN no eletrlito de trabalho: 42 mmol L-1 de SDS; 40 mmol L-1 Borato, pH 9,0, capilar de slica fundida de 50 cm x 75 m d.i. (42,5 cm at o detector), os analitos foram injetados hidrodinmicamente, com presso de 50 mbar por 15 segundos. O potencial aplicado (V) foi de 25 kV, temperatura (T) de 25C e deteco em 200 nm. O efeito da concentrao do tampo no eletrlito foi realizado para verificar a possvel separao dos analitos. O resultado apresentado na Figura 8 mostra que a variao da concentrao do tampo no teve efeito significativo na resoluo entre os picos. A concentrao de 80 mmol L-1 foi selecionada para os prximos testes por apresentar um menor alargamento dos ltimos picos.

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*DAD1 *DAD1 *DAD1 *DAD1 mAU 80 D, Sig=200,4 D, Sig=200,4 D, Sig=200,4 D, Sig=200,4 Ref=450,50 Ref=450,50 Ref=450,50 Ref=450,50 (CABRINI\27072010000002.D) (CABRINI\27072010000003.D) (CABRINI\27072010000004.D) (CABRINI\27072010000005.D)

Absorbncia (mAU)

70

60

50

120 mM

40

100 mM
30

20

80 mM

10

40 mM
10 11 12 13 14 15 16 17 min

Tempo de migrao (min)

Figura 8: Anlise de uma soluo padro das estrobilurinas (1 x 10-5 mol L-1) pelo mtodo MEKC. Variao da concentrao do tampo no eletrlito de trabalho: 42 mmol L-1 de SDS; 15 % ACN, pH 9,0 capilar de slica fundida de 50 cm x 75 m d.i. (42,5 cm at o detector), os analitos foram injetados hidrodinmicamente, com presso de 50 mbar por 15 segundos. O potencial aplicado (V) foi de 25 kV, temperatura (T) de 25C e deteco em 200 nm. Um planejamento experimental foi realizado para fazer um ajuste das condies experimentais. A amplitude de cada parmetro foi ajustada de acordo com os resultados obtidos nos estudos univariados apresentados anteriormente. Um planejamento experimental composto central (CCD) 23 foi utilizado e as variveis consideradas foram: porcentagem de ACN, concentrao de SDS e o pH do eletrlito de trabalho. O procedimento foi realizado com replicatas autnticas (3) no ponto central. Os nveis escolhidos e estabelecidos para os parmetros esto apresentados na Tabela 1. A resoluo foi calculada pela Equao 1, onde utilizou o critrio da largura do pico a meia altura13.
R = 1,176 (t1 t2) w1(1/2) + w2(1/2)

(1)

onde: t1 e t2 so os tempos de migrao dos analitos 1 e 2, w1(1/2) e w 2(1/2) so as larguras dos picos 1 e 2 calculadas a meia altura e 1,176 o fator de multiplicao. Tabela 1: Nveis estabelecidos dos parmetros escolhidos para CCD 23. Parmetro % ACN pH Concentrao SDS (mol L-1) + 1,682 + 1 23,0 9,8 48,4 0 - 1 - 1,682 12,9 8,2 31,5

21 18 15 9,5 9,0 8,5 45 40 35

A Figura 8 e 9 apresenta o grfico de pareto dos resultados obtidos para a resoluo entre os analitos denominados 2, 3, 4 e 5 seguindo a ordem de eluio. A porcentagem de ACN no eletrlito de trabalho o termo mais relevante e tem

Departamento de Qumica contribuio linear para a resoluo entre os anlitos 2 e 3 e contribuio linear e quadrtica para a resoluo entre os analitos 4 e 5. No foi detectada a interao entre os parmetros selecionados neste planejamento.

Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Res. 2 e 3 3 factors, 1 Blocks, 17 Runs; MS Pure Error=,0453844 DV: Res. 2 e 3 (3)ACN(L) 2Lby3L ACN(Q) (2)SDS(L) 1Lby2L 1Lby3L SDS(Q) pH(Q) (1)pH(L) -,872765 ,8247232 ,6998095 -,565006 -,418632 ,2165057 ,154254 p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) 1,52725 4,996919

Figura 8: Grfico de pareto considerando como resposta a resoluo entre os analitos 2 e 3.

Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: Res. 4 e 5 3 factors, 1 Blocks, 17 Runs; MS Pure Error=,1157686 DV: Res. 4 e 5 (3)ACN(L) ACN(Q) (1)pH(L) 1Lby3L 1Lby2L pH(Q) (2)SDS(L) 2Lby3L SDS(Q) 5,010199 3,936108 2,351631 2,346361 1,795539 -1,67526 1,411761 -,721149 p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value) 12,64566

Figura 9: Grfico de pareto considerando como resposta a resoluo entre os analitos 4 e 5.

A Figura 10 apresenta um eletroferograma que mostra a melhor resoluo obtida experimentalmente quando realizado o planejamento. Um novo planejamento experimental composto central 22 considerando apenas as variveis, concentrao de SDS e % ACN no eletrlito de trabalho foi realizado para melhorar a resoluo entre os

Departamento de Qumica picos 2 e 3. O pH do eletrlito foi fixado em 9,0 para o novo planejamento. No eletroferograma abaixo podemos ver que para um valor de pH igual a 9,0 foi obtido uma boa resoluo entre os demais analitos com exceo dos analitos 2 e 3 que ainda tiveram tempos de migrao muito prximos.

DAD1 D, Sig=200,4 Ref=450,50 (CABRINI\29072010000005.D)

9.634

10.918

< 8.625

< 11.729

11.998

mAU

Absoro (mAU) Absoro (mAU)

15

12.817

17.5

11.160

12.5

15.468

10

7.5

6 7
17.251

2.5

0 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 min

Figura 10: Anlise de uma soluo padro das estrobilurinas (1 x 10-5 mol L-1) pelo mtodo MEKC. Eletrlito de trabalho: 40 mmol L-1 de SDS; 23% ACN, pH 9,0 capilar de slica fundida de 50 cm x 75 m d.i. (42,5 cm at o detector), os analitos foram injetados hidrodinmicamente, com presso de 50 mbar por 15 segundos. O potencial aplicado (V) foi de 25 kV, temperatura (T) de 25C e deteco em 200 nm. Os nveis dos parmetros selecionados para a realizao do novo planejamento experimental composto central 22 esto apresentados na Tabela 2 abaixo. Tabela 2: Nveis estabelecidos dos parmetros escolhidos para CCD 22. Parmetro % ACN Concentrao SDS (mol L-1) + 1,414 + 1 28,2 64 27 60 0 - 1 - 1,414 19,8 36

13.696

Tempo de migrao (min)

24 21 50 40

A Figura 11 apresenta os grficos da curva de nvel e pareto tendo como resposta a resoluo entre os picos 2 e 3. O grfico da curva de nvel mostra que para obter um maior valor de resoluo entre os analitos 2 e 3 necessrio aumentar a concentrao de SDS (aproximadamente 70 mmol L-1) e tambm a porcentagem de acetonitrila (aproximadamente 29%). O grfico de pareto mostra que os fatores mais relevantes so a concentrao de SDS no eletrlito e h interao entre os fatores, ambos apresentam uma contribuio linear para a resoluo. A Figura 12 mostra os grficos obtidos da curva de nvel e pareto para a resoluo entre os picos 4 e 5. Esses analitos haviam sido resolvidos no primeiro planejamento, mas importante verificar a resoluo entre todos dos picos que

< 16.303

Departamento de Qumica apresentam tempos de migrao prximos. A resposta da curva de nvel teve um comportamento muito prximo ao obtido para a resoluo entre os analitos 2 e 3. Ambos os fatores tiveram contribuio relevante, a concentrao de SDS tem uma contribuio linear assim como a interao entre os fatores, a porcentagem de ACN teve uma contribuio linear e quadrtica. A resoluo entre os analitos 3 e 4 tambm foi investigada, pois estes estavam bem resolvidos no primeiro planejamento (Figura 10), mas alterao na resoluo foi observa durante o planejamento 22. A Figura 13 apresenta o resultado encontrado para a resoluo entre os analitos 3 e 4. Pelo grfico da curva de nvel verificamos que para obter uma melhor resoluo entre os analitos 3 e 4 no podemos aumentar a concentrao de SDS no eletrlito de trabalho como indicado nos resultados anteriores. A porcentagem de acetonitrila foi o nico fator relevante para esta resoluo. A Figura 14 apresenta um eletroferograma obtido utilizando os resultados obtidos com o planejamento CCD 22. Foi verificado que com o aumento da concentrao de SDS para 70 mmol L-1 e a porcentagem de ACN para 27% possvel separar todos os analitos em um tempo de analise de aproximadamente 36 minutos. Com 80 mmol L-1 de SDS o tempo de analise foi de aproximadamente 48 minutos e os analitos 3 e 4 no tiveram boa resoluo. O eletrlito de trabalho para determinao dos 7 analitos deve conter 70 mmol L-1 de SDS e 27% de ACN com pH igual a 9,00. (a)
29 28
(1)SDS(L) 15,39419

Fitted Surface; Variable: RES 2E3 2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,0055441 DV: RES 2E3

(b)

Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: RES 2E3 2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,0055441 DV: RES 2E3

27 26 25 24
ANC ANC

1Lby2L

7,311676

SDS(Q)

2,8624

23 22 21 20 19 30 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5

ANC(Q) -2,01104

(2)ANC(L)

,8667599

35

40

45

50 SDS

55

60

65

70

p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 11: Grfico da curva de nvel (a) e pareto (b) para a resoluo entre os analitos 2 e 3.

Departamento de Qumica
Fitted Surface; Variable: RES 4E5 Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: RES 4E5

(a)
29 28 27 26 25 24
ANC

2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,0216012 DV: RES 4E5

(b)
(1)SDS(L)

2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,0216012 DV: RES 4E5

22,51918

1Lby2L

13,57316

ANC(Q)

-13,4536

23 22 21 20 19 30 8 6 4 2 0 SDS(Q) -,236096 (2)ANC(L) 9,46275

35

40

45

50 SDS

55

60

65

70

p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 12: Grfico da curva de nvel (a) e pareto (b) para a resoluo entre os analitos 4 e 5.
Fitted Surface; Variable: RES 3E4
Pareto Chart of Standardized Effects; Variable: RES 3E4

(a)
29 28 27 26 25 24
ANC

2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,2157442 DV: RES 3E4

(b)

2 factors, 1 Blocks, 11 Runs; MS Pure Error=,2157442 DV: RES 3E4

(2)ANC(L)

-11,5896

1Lby2L

2,003996

ANC(Q)

1,235807

23 22 21 20 19 30 8 6 4 2 0
SDS(Q) -,30088 (1)SDS(L) -,469398

35

40

45

50 SDS

55

60

65

70

p=,05 Standardized Effect Estimate (Absolute Value)

Figura 13: Grfico da curva de nvel (a) e pareto (b) para a resoluo entre os analitos 3 e 4.

Departamento de Qumica
*DAD1 D, Sig=200,4 Ref=450,50 (CABRINI\13082010000003.D) *DAD1 D, Sig=200,4 Ref=450,50 (CABRINI\13082010000004.D) mAU 30

1a

1b

Absobncia (mAU)

25

2a

4a 3a

2b 4b 3b

20

5b 5a
15

6b
80 mM SDS
10

7b

(B)

6a
5

7a
70 mM SDS

(A)

0 10 20 30 40 50 min

Tempo de migrao (min)

Figura 14: Anlise de uma soluo padro das estrobilurinas (1 x 10-5 mol L-1) pelo mtodo MEKC. Eletrlito de trabalho: 70 e 80 mmol L-1 de SDS; 27% ACN, pH 9,0 capilar de slica fundida de 50 cm x 75 m d.i. (42,5 cm at o detector), os analitos foram injetados hidrodinmicamente, com presso de 50 mbar por 15 segundos. O potencial aplicado (V) foi de 25 kV, temperatura (T) de 25C e deteco em 200 nm. Com a resoluo dos sete picos, a identificao dos analitos no eletroferograma foi realizada atravs da medio dos espectros de absoro com o prprio detector utilizado para as anlises eletroforticas (detector espectrofotomtrico do tipo arranjo de diodos). Um espectro foi obtido para cada pico no eletroferograma da mistura contendo todos os sete analitos (Figura 12), e estes espectros foram comparados com os espectros obtidos para as solues das substncias puras, nas mesmas condies. A ordem de sada dos analitos foi determinada como: Azoxistrobina, Dimoxistrobina, Kresoximmetil, Fluoxastrobina, Picoxistrobina, Piraclostrobinae Triflosxistrobina. Os espectros de absoro esto apresentados nas Figuras 15 e 16.

Departamento de Qumica
* D A D 1 , 8 .8 7 6 ( 1 6 .9 m A U , - ) R e f = 8 .7 1 3 & 9 .0 6 6 o f 0 5 0 8 2 0 1 0 0 0 0 0 0 5 .D mAU 16 14 12 10

* D A D 1 , 1 0 .4 2 6 ( 1 1 .7 m A U , - ) R e f = 1 0 .2 3 3 & 1 0 .6 2 6 o f 0 5 0 8 2 0 1 0 0 0 0 0 0 6 .D mAU

1
10

6
8 6 4

2
2 0

0
250 300 350 400 450 500 550 nm

250

300

350

400

450

500

550

nm

* D A D 1 , 1 1 .2 4 3 ( 7 .1 m A U , - ) R e f = 1 1 .0 2 0 & 1 1 .4 4 0 o f 0 5 0 8 2 0 1 0 0 0 0 0 0 9 .D mAU

* D A D 1 , 1 1 .8 6 6 ( 1 4 .8 m A U , - ) R e f = 1 1 .5 4 0 & 1 2 .0 2 0 o f 0 5 0 8 2 0 1 0 0 0 0 0 0 7 .D mAU

3
12 10

8
3

6
2

250

300

350

400

450

500

550

nm

250

300

350

400

450

500

550

nm

Figura 15: Espectros de absoro das estrobilurinas: (1) Azoxistrobina, (2) Dimoxistrobina, (3) Kresoxim-metil, (4) Fluoxistrobina.
* D A D 1 , 1 2 .1 0 3 (6 .3 m A U , - ) R e f= 1 1 .9 1 3 & 1 2 .3 2 0 o f 0 5 0 8 2 0 1 0 0 0 0 0 0 2 .D mAU
mAU 5 * D A D 1 , 1 4 .4 6 6 (5 .4 m A U , - ) R e f= 1 4 .3 1 0 & 1 4 .7 1 6 o f 0 5 0 8 2 0 1 0 0 0 0 0 0 2 .D

5
5

4
3

3
2

250

300

350

400

450

500

550

nm

250

300

350

400

450

500

550

nm

* D A D 1 , 1 2 .5 7 0 ( 1 1 .9 m A U , - ) R e f = 1 2 .3 1 0 & 1 3 .1 7 0 o f 0 5 0 8 2 0 1 0 0 0 0 0 1 0 .D mAU

10

250

300

350

400

450

500

550

nm

Figura 16: Espectros de absoro das estrobilurinas: (5) Picoxistrobina, (6) Piraclostrobina, (7) Trifloxistrobina .

Departamento de Qumica 6. Concluso:

Os parmetros experimentais e instrumentais do mtodo analtico baseado em MEKC foram otimizados para determinao de sete estrobilurinas. O mtodo foi inicialmente otimizado para apenas duas estrobilurinas (azoxistrobina e dimoxistrobina) para avaliar a capacidade de separao das condies j existente no mtodo desenvolvido anteriormente no laboratrio12. Uma tima separao para esse dois picos foi obtida com boa simetria e resoluo. O planejamento composto central (23 e 22) foi realizado tendo como variveis a concentrao de SDS, a porcentagem de ACN e o pH do eletrlito de trabalho. Com a realizao dos planejamentos foi possvel encontrar as melhores condies para promover a separao dos sete analitos utilizando o mtodo MEKC. Os valores obtidos para os parmetros otimizados no eletrlito de trabalho foram 70 mmol L-1 para a concentrao de SDS, 27% de ACN e pH igual a 9,00. O desenvolvimento do mtodo se encontra em andamento. Ser realizada a validao do mtodo, que muito importante para avaliar o desempenho das anlises na eletroforese capilar. Em busca de aumentar a sensibilidade ser estudada a possibilidade da aplicao pr-concentrao em linha. O mtodo ser aplicado em amostra de alimentos com diferentes procedimentos de preparo de amostra.

7.
1

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