INSTITUTO DE ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PRODUO ANIMAL SUSTENTVEL

DIAGNSTICO EPIDEMIOLGICO DE INFECTIVIDADE PARA Rickettsia rickettsii EM Amblyomma spp. NO MUNICPIO DE AMERICANA, SP.

Jos Brites Neto

Nova Odessa Fevereiro - 2011

GOVERNO DO ESTADO DE SO PAULO SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PRODUO ANIMAL SUSTENTVEL

Diagnstico Epidemiolgico de Infectividade para Rickettsia rickettsii em Amblyomma spp. no Municpio de Americana, SP.

Aluno: Jos Brites Neto Orientadora: Profa. Dra. Keila Maria Roncato Duarte Co-orientadora: Profa. Dra. Ceclia Jos Verssimo

Dissertao apresentada ao Programa de Psgraduao do Instituto de Zootecnia, APTA/SAA, como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Mestre em Produo Animal Sustentvel.

Nova Odessa Fevereiro, 2011. i

Ficha elaborada pelo Ncleo de Informao e Documentao do Instituto de Zootecnia Bibliotecria responsvel Ana Paula dos Santos Galletta - CRB8/7166

B874d

Brites Neto, Jos Diagnstico epidemiolgico de infectividade para Rickettsia rickettsii em Amblyomma spp. no Municpio de Americana,SP. / Jos Brites Neto. Nova Odessa - SP, 2011. 81p. : il. Dissertao (Mestrado) - Instituto de Zootecnia. APTA/SAA. Orientador: Dra. Keila Maria Roncato Duarte.
1. Diagnstico parasitolgico. 2. Febre maculosa. 3. Rickettsia. 4. Amblyomma. I. Duarte, Keila Maria Roncato. II. Ttulo. CDD 636.089696

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GOVERNO DO ESTADO DE SO PAULO SECRETARIA DA AGRICULTURA E ABASTECIMENTO AGNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGCIOS INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM PRODUO ANIMAL SUSTENTVEL

CERTIFICADO DE APROVAO

TTULO: DIAGNSTICO EPIDEMIOLGICO DE INFECTIVIDADE PARA Rickettsia rickettsii EM Amblyomma spp. NO MUNICPIO DE AMERICANA, SP. AUTOR: JOS BRITES NETO Orientadora Orientadora: Profa. Dra. Keila Maria Roncato Duarte Co-orientadora Co-orientadora: Profa. Dra. Ceclia Jos Verssimo
Aprovado como parte das exigncias para obteno de ttulo de MESTRE em Produo Animal Sustentvel, pela Comisso Examinadora: Profa. Dra. Keila Maria Roncato Duarte

Prof. Dr. Marcelo Bahia Labruna

Profa. Dra. Cludia Rodrigues Pozzi

Data da realizao: 03/02/2011.

Presidente da Comisso Examinadora Profa. Dra. Keila Maria Roncato Duarte iii

DEDICATRIA

Desde pequeno ouo uma voz, Inconfundvel em sua beleza, Confortando e no me deixando a ss, Como uma inocente presa. De um menino trazido em seu colo, Onde o tempo no pra a realidade, Como um pssaro de seu ninho eu decolo, Deixando lgrimas em uma saudade. No presente, homem feito, eu recordo, Do carinho e amor de sua sinceridade, Para quem padecer no paraso no fardo, Mas uma satisfao de divina majestade. Na frieza de um mundo cruel e soberano, Sua existncia uma ddiva do eterno, Como seria a vida de cada ser humano, Sem o calor onipresente do aconchego materno. (Jos Brites Neto, 1998).

MINHA QUERIDA ME,

ZENI DA SILVA BRITES (IN MEMORIAN).

DEDICO MEU TRABALHO, MEU AMOR, MINHA SAUDADE.......

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AGRADECIMENTOS

Ao Meu Salvador e Senhor Jesus Cristo, pela minha vida, minha sade e minha paz!

A todos os meus familiares e amigos, que sempre torceram por mim!

Ao meu pai, Jos Brites Filho, grande amigo de longas jornadas, a quem devo qualquer sucesso que tenha em minha carreira.

Adriana, pelo carinho, amor, cuidados, ateno, incentivo e por aturar minha companhia.

s minhas irms, Joszeni e Cristina, pelas boas lembranas que passamos em nossas vidas.

Aos meus filhos, Jos Walther B. Brites e Thiago Henrique B. Brites.

Ao amigo Jardel Brasil, colaborador incansvel nesta rotina de trabalhos e companheiro de desafios e muitas jornadas de dificuldades, nestes ltimos anos.

Ao meu cachorro Fred, companheiro de algumas madrugadas de estudos, com extenso a todos meus queridos ces que passaram em minha vida (Cupim, Diana, Laika, Buba, Dach, Uron e a inesquecvel Ruiva).

Ao meu Fluminense, grande campeo, que me deu uma nica alegria em 2010!

Ao ilustre Prof. Vernon Everett Thatcher, pelos memorveis ensinamentos no incio de minha carreira e que hoje refletem significativamente em todos os nveis de resultados alcanados. Ao Prof. Marcelo Bahia Labruna, pela sua ateno e generosidade dispensada a este trabalho, propiciando auxlios incomensurveis em nossas anlises e resultados. Profa. Keila Maria Roncato Duarte, pela sua dedicao ao curso de ps-graduao, por sua aceitao e orientao e pela grande amizade e carinho. Profa. Ceclia Jos Verssimo, pelas opinies construtivas e observaes sempre muito criteriosas e engrandecidas. Doutoranda Fernanda Aparecida Nieri-Bastos, pelo apoio tcnico, pela amizade e pela construo dos resultados alcanados. Profa. Cludia Rodrigues Pozzi, pelos ensinamentos curriculares e pela honrosa distino em minha banca de tese. Ao Prof. Adriano Pinter dos Santos, pelas sugestes importantes na qualificao e pelas contribuies tcnicas ao trabalho. Ao Prof. Luiz Humberto Gomes, pela sua experiente avaliao na qualificao, pela sua amizade e pelo Fred. Profa. Simone Cristina Mo Niciura, pela idealizao conjunta no projeto inicial deste trabalho que se transformou neste argumento para defesa de tese. Ao Dr. Paulo Bardauil Alcntara, pelo incentivo dado ao projeto de convnio tcnico com o programa da Prefeitura de Americana, que resultou neste argumento para defesa de tese. A todos os professores da ps-graduao do Instituto de Zootecnia, do Instituto de Biologia e da ps-graduao em Parasitologia da UNICAMP que contriburam para esta minha formao, em especial Prof. Arcio Xavier Linhares, Profa. Patrcia Thyssen e Profa. Maria Silvia Gatti. Ao Dr. Emerson Assis, Ex-Secretrio Municipal de Sade, pelo apoio institucional dado ao desenvolvimento deste projeto de trabalho. Enfermeira Leda Maria Ribeiro, pela confiana depositada em nossa atividade profissional junto Vigilncia Epidemiolgica da Secretaria de Sade de Americana. valorosa, guerreira, profissional e exemplar equipe do Programa de Vigilncia e Controle de Carrapatos (PVCC), em nome de Jardel Brasil, Jesus Tendor, Amarildo Azarias e Ubirajara Pedroso Jesuno, meu muito obrigado! Ao ilustre Dr. Antonio Senise (In Memorian), pelo crdito conferido a este trabalho e pela amizade e mtua admirao. s empresas SOL e SYNGENTA pelo prestimoso patrocnio a vrias de nossas atividades, em especial ao Sr. Geraldo Senise, Jnior, Antonio, Dalmo, Daniel, Leslie e Flvia. vi

Aos funcionrios e estagirios da Secretaria de Sade de Americana, que direta ou indiretamente ajudaram na construo destes resultados. Aos amigos, Prof. Francisco de Assis Baroni, Prof. Gino Chaves da Rocha e Prof. Gilberto Salles Gazta, pelo incentivo, pela torcida e pelos bons conselhos acadmicos e pessoais. A todos os colegas, professores e funcionrios do Laboratrio de Parasitologia e do LABMAS (VPS/FMVZ/USP), em especial Thiaguinho, Joo, Iara, Jonas, Matias, Maria, Aliny, Amlia, Hilda, Serginho, Renato, Pedrinho, Aline, Herbert, Sheila e Paulo, pela carinhosa recepo, pela ajuda e pelos bons momentos compartilhados. A todos os funcionrios do Instituto de Zootecnia, em especial aos funcionrios ligados psgraduao, representados por Marta e Vernica. A todos os funcionrios, tcnicos e estagirios do Laboratrio de Biotecnologia Vegetal do CPDNAP, Instituto de Zootecnia, representados por Aides e Thiago, pelo auxlio tcnico e operacional prestado durante os trabalhos realizados. Aos colegas de mestrado, em especial Flvio e Mrcia, pelo convvio e experincias compartilhadas. Aos funcionrios e tcnicos da SUCEN/Campinas, em especial Renata, Savina, Maria Jos, Olga, Miriam e Cida, pelos treinamentos de capacitao e superviso tcnica fornecidos ao Programa de Vigilncia e Controle de Carrapatos (PVCC).

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SUMRIO LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS ...................................................... x LISTA DE TABELA ............................................................................................................. xiii LISTA DE FIGURAS............................................................................................................ xiv LISTA DE ANEXOS ............................................................................................................ xvii RESUMO.............................................................................................................................. xviii ABSTRACT ........................................................................................................................... xix 1.INTRODUO ..................................................................................................................... 1 2. REVISO DE LITERATURA ............................................................................................ 4 2.1 Aspectos Epidemiolgicos ................................................................................................... 8 2.2 Caracterizao do Vetor ..................................................................................................... 12 2.3 Agente Etiolgico ............................................................................................................... 17 2.4 Diagnstico Laboratorial .................................................................................................... 20 2.5 Mtodo de Coleta de Carrapatos ........................................................................................ 23 2.6 Identificao Taxonmica dos Carrapatos ......................................................................... 24 2.7 Teste de Hemolinfa............................................................................................................. 24 2.8 Ensaios Imunolgicos ......................................................................................................... 25 2.9 Ensaios Moleculares ........................................................................................................... 27 3. MATERIAL E MTODOS ............................................................................................... 32 3.1 reas de Estudo .................................................................................................................. 32 3.1.1 Aspectos Fsicos / Territoriais / Geogrficos .................................................................. 32 3.1.2 Caracterizao das reas Epidemiolgicas ..................................................................... 35 3.1.3 rea de Risco Sobrado Velho (Rio Jaguari) ................................................................ 36 3.1.4 rea de Risco Carioba (Rio Piracicaba) ....................................................................... 37 3.1.5 rea de Risco Bosque das Nascentes ........................................................................... 39 3.1.6 rea de Alerta Fazenda Palmeiras/IZ........................................................................... 40 3.1.7 rea de Alerta Museu Histrico (Rio Jaguari) ............................................................. 41 3.1.8 rea de Alerta Ribeiro Quilombo ............................................................................... 42 3.2 Coleta dos Carrapatos - Armadilha Atrativa de CO2 ......................................................... 43 3.3 Identificao Taxonmica dos Carrapatos ......................................................................... 45 3.4 Extrao de Glndulas Salivares das Amostras de Carrapatos Adultos ............................. 45 3.5 Rastreamento da Infeco por Rickettsia............................................................................ 47 3.5.1 Teste de Hemolinfa de Carrapatos .................................................................................. 47 3.5.2 ELISA .............................................................................................................................. 48 3.5.3 Extrao de DNA e PCR ................................................................................................. 49 3.5.3.a Extrao de DNA .......................................................................................................... 49 3.5.3.b Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)...................................................................... 49 4. RESULTADOS E DISCUSSO ....................................................................................... 51 4.1 Identificao Taxonmica dos Carrapatos ......................................................................... 52 4.2 Rastreamento da Infeco por Rickettsia............................................................................ 54 4.2.1 Teste de Hemolinfa de Carrapatos .................................................................................. 54 4.2.2 ELISA .............................................................................................................................. 54 4.2.3 Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)......................................................................... 56 4.3 Distribuio Sazonal de Vetores......................................................................................... 57 viii

4.3 Avaliao Epidemiolgica das reas de Estudo ................................................................ 60 5. CONCLUSES................................................................................................................... 63 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 64 7. ANEXOS ............................................................................................................................. 75

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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS % (-) (+) (F) g L M (M) : C m BSF CC+ CCD CDC cm CO2 CPDNAP CVE DNA dNTP EDTA ELISA EPI EPISUS et al. FMB GFM gltA por cento negativo positivo fmea micrograma microlitro micromolar macho proporo maior ou igual marca registrada graus Celsius micrmetro Brazilian Spotted Fever controle negativo controle positivo Coordenadoria de Controle de Doenas Centers for Disease Control and Prevention centmetro dixido de carbono
Centro de Pesquisa e Desenvolvimento em Nutrio Animal e Pastagens

Centro de Vigilncia Epidemiolgica cido desoxi ribonucleico dexoxinucleotdeo trifosfatado cido etileno diamino tetractico Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Equipamento de Proteo Individual Epidemiologia Aplicada aos Servios do SUS e colaboradores Febre Maculosa Brasileira Grupo da Febre Maculosa gene citrato sintase x

GPS GT H HCl IFD IFI IgG IgM IZ kDa Km LPI LPS L/Lt% m Mg mL mm mM mol/L N N ng nm OG ompA ompB OMS ORFs Patric pb PBS PBS-TG

Global Position System isotiocianato de guanidina hidrognio cido clordrico imunofluorescncia direta imunofluorescncia indireta imunoglobulina G imunoglobulina M Instituto de Zootecnia kilodalton quilmetro quadrado Local provvel de infeco lipopolissacardeo % de ligao por ligao total metro magnsio mililitro milmetro milimolar mol por litro (molar) normal nmero nanograma nanmetro Orthologous Groups outer membrane protein A outer membrane protein B Organizao Mundial da Sade open reading frames PathoSystems Resource Integration Center pares de base Phosphate Buffer Solution (soluo fosfato tamponada) tampo fosfato com tween e gelatina xi

PCR pH PLA2 PLD primers PTA PVCC qPCR RFLP RIA RIFI RMC RNA rpm S SES SFG SINAN SP SUCEN Taq TBE TE TG Tris U USP W X

Polymerase Chain Reaction (Reao em Cadeia da Polimerase) potencial hidrogeninico phospholipase A2 phospholipase D oligonucleotdeos iniciadores Plate Trapped Antigen Programa de Vigilncia e Controle de Carrapatos PCR Quantitativo em Tempo Real Restriction Fragment Length Polymorphism radioimunoensaio Reao de Imunofluorescncia Indireta Regio Metropolitana de Campinas cido ribonucleico rotaes por minuto south Secretaria Estadual de Sade Spotted Fever Group Sistema de Informao de Agravos de Notificao So Paulo Superintendncia de Controle de Endemias Termophilus aquaticus Tris-borato-EDTA tampo Tris-HCl-EDTA Typhus Group tris (hidroximetil) amino metano unidade Universidade de So Paulo west vezes alfa

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LISTA DE TABELAS Tabela 1- Incidncia (por 100.000 habitantes), bitos e Taxa de Letalidade por ano, no Estado de So Paulo - 1985 a 2009 .................................................................. 6

Tabela 2- Distribuio dos Casos Confirmados de FMB, em Municpios prximos de Americana, SP (2000-2010)............................................................................. 8

Tabela 3- Resultado numrico de pesquisas acarolgicas realizadas em reas de vigilncia epidemiolgica de FMB, em Americana/SP ................................... 51

Tabela 4- Resultados comparativos entre teste de hemolinfa, ELISA e gltA-PCR em amostras de carrapatos procedentes de pesquisas acarolgicas ....................... 57

Tabela 5- Total de carrapatos coletados (adultos, ninfas e larvas) de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, no perodo de julho/2009 a junho/2010 ....................................................................................................... 57

Tabela 6- Total de amostras de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, procedentes de reas de alerta e risco para FMB, submetidas a gltA-PCR ...... 61

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LISTA DE FIGURAS Figura 1- Situao Epidemiolgica da Febre Maculosa Brasileira (FMB) em Americana, SP .................................................................................................. 7

Figura 2- Vista dorsal de exemplar macho de Amblyomma cajennense ..........................

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Figura 3- Vista dorsal de exemplar fmea de Amblyomma cajennense ...........................

14

Figura 4 - Microscopia Eletrnica de Rickettsia rickettsii ................................................

18

Figura 5 - Reao de Imunofluorescncia Indireta de soro positivo humano para Rickettsia rickettsii ........................................................................................... 21

Figura 6 - Rickettsia ricketsii em hemolinfa de Amblyomma spp. (colorao pelo mtodo de Gimenez) ........................................................................................ 25

Figura 7 - Carta Planimtrica do municpio de Americana, SP ........................................

33

Figura 8 - reas de Planejamento Urbano do municpio de Americana, SP ....................

34

Figura 9 - Sistema de reas Verdes do municpio de Americana, SP..............................

34

Figura 10-Imagem area da regio do Sobrado Velho indicando local provvel de infeco de bito por FMB .............................................................................. 36

Figura 11-rea de mata ciliar do Rio Jaguari na regio do Sobrado Velho, Americana/SP................................................................................................... 37

Figura 12-Imagem area de reas de mata ciliar e reas industriais na regio do Rio Piracicaba, indicando local provvel de infeco de caso positivo de FMB ... 38

Figura 13-rea de pesqueiro do Rio Piracicaba com local provvel de infeco para FMB ................................................................................................................. xiv 38

Figura 14-rea do bosque das nascentes com lago artificial ...........................................

39

Figura 15-Fazenda experimental do Instituto de Zootecnia, com reas de pastagem prximas de lago artificial com fragmento de mata ......................................... 40

Figura 16-rea de confluncia dos Rios Jaguari e Atibaia para formao do Rio Piracicaba ......................................................................................................... 41

Figura 17-Trecho do Ribeiro Quilombo em rea urbana de Americana ........................

42

Figura 18-Grupos de capivaras dispersos ao longo do Ribeiro Quilombo .....................

43

Figura 19-Armadilha de CO2............................................................................................ Figura 20-Coleta de Carrapatos ........................................................................................

44

44

Figura 21-Fixao de carrapato adulto para extrao de glndulas salivares...................

45

Figura 22-Extrao de glndulas salivares de carrapato adulto .......................................

46

Figura 23-Teste de Hemolinfa ..........................................................................................

47

Figura 24-Adultos de Amblyomma cajennense (fmea) e Amblyomma dubitatum (fmea) ............................................................................................................. 52

Figura 25-Ninfa de Amblyomma cajennense. A: Captulo dorsal; barra: 20m. B: Captulo ventral; barra: 20m. C: Escudo; barra: 30m. D: Coxas I-IV; barra: 30m. (MARTINS et al., 2010) ............................................................ 52

Figura 26-Ninfa de Amblyomma dubitatum. A: Captulo dorsal; barra: 20m. B: Captulo ventral; barra: 30m. C: Escudo; barra: 100m. D: Coxas I-IV; barra: 30m. (MARTINS et al., 2010) ............................................................ 53

xv

Figura 27-Larvas de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum (aumento de 30x) .................................................................................................................. 53

Figura 28-Titulao em PTA-ELISA de pesquisas acarolgicas, com resultado em densidade tica a 450 nm, onde as amostras de cor vermelha foram negativas no ELISA, na Hemolinfa e no PCR e as amostras de cor verde, foram positivas na Hemolinfa e/ou no PCR..................................................... 55

Figura 29-Grfico mostrando a porcentagem de ligao antgeno/anticorpo sobre o total de ligao do teste (100%), representado por %L/Lt, nas pesquisas acarolgicas realizadas. As pesquisas 65 e 36 mostraram resultados negativos, com % inferior a 50 %. ................................................................... 55

Figura 30-Resultados da reao de gltA-PCR em gel de agarose 1,5 %, realizado com primers CS-62/CS-462, em amostras de carrapatos de reas de risco de Americana, com amplificao de fragmentos de 401 pb do gene citrato sintase (gltA), demonstrando controle positivo (C+), controle negativo (C-) e reaes positivas (4, 5, 6, 10, 11, 17, 20, 21, 22, 26 e 27) ............................... 56

Figura 31-Distribuio sazonal da populao de adultos, ninfas e larvas de Amblyomma cajennense. Mata ciliar. Julho de 2009 a junho de 2010. reas de alerta e risco para FMB. Americana, SP ..................................................... 58

Figura 32-Distribuio sazonal da populao de adultos, ninfas e larvas de Amblyomma dubitatum. Mata ciliar. Julho de 2009 a junho de 2010. reas de alerta e risco para FMB. Americana, SP ..................................................... 59

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LISTA DE ANEXOS

Anexo 1- Caractersticas de termohigrometria das reas de pesquisa acarolgica e respectivas localizaes obtidas atravs do uso de GPS (Garmin eTrex Summit HC) ..................................................................................................... 75

Anexo 2- Quadro comparativo de resultados entre teste de hemolinfa e gltA-PCR ........

76

Anexo 3- Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR - Rio Jaguari, Sobrado Velho, Americana/SP .... 77

Anexo 4- Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR - Rio Piracicaba, Carioba, Americana/SP .......... 78

Anexo 5- Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR Ribeiro Quilombo, Guaicurus e Colina, Americana/SP................................................................................................... 80

Anexo 6- Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR Bosque das Nascentes, Fazenda Palmeiras (IZ) e Rio Jaguari (Museu Histrico) Americana/SP....................................... 81

xvii

Diagnstico Epidemiolgico de Infectividade para Rickettsia rickettsii em Amblyomma spp. no Municpio de Americana, SP. RESUMO A Febre Maculosa Brasileira (FMB) uma antropozoonose de notificao compulsria, com caractersticas epidemiolgicas de elevada endemicidade e alta letalidade. O presente estudo teve por objetivo realizar um diagnstico epidemolgico de infectividade para Rickettsia rickettsi em uma populao de 3.548 carrapatos adultos de vida livre, coletados em 83 pesquisas acarolgicas, identificados como Amblyomma cajennense (2.355) e Amblyomma dubitatum (1.193). Foi verificada a sazonalidade da populao das espcies de carrapatos coletadas no perodo de julho/2009 a junho/2010. Dos carrapatos adultos, 702 foram submetidos ao teste de hemolinfa e 2197 dissecados para remoo de glndulas salivares para extrao de DNA e avaliao por gltA-PCR e ompA-PCR. As reas avaliadas para FMB apresentaram ndices entre 1,2 % e 8,8 % de amostras positivas para gltA-PCR, sendo todas negativas para ompA2-PCR, em espcies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum nas reas de alerta e risco de Americana, So Paulo. No contexto da produo animal sustentvel, os objetivos deste projeto contriburam no mapeamento da distribuio das espcies de carrapatos Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum e na avaliao da prevalncia de infeco nos mesmos para Rickettsia spp., possibilitando melhor entendimento sobre as reais interferncias nos potenciais biticos de reas de preservao contguas s reas de produo agropecuria e mensurando eventuais riscos para pesquisas zootcnicas realizadas no Centro de Pesquisa em Pecuria de Leite do Instituto de Zootecnia, situado em Americana. Palavras-chave: Amblyomma cajennense; Amblyomma dubitatum; Febre Maculosa Brasileira; PCR; Rickettsia spp.

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Infectivity Epidemiological Diagnose of Rickettsia rickettsii from Amblyomma spp. at Americana Municipality, SP. ABSTRACT The Brazilian Spotted Fever (BSF) is an antropozoonosis from compulsory notification, with epidemiological characteristics and high lethality. This work aimed to diagnose the Rickettsia rickettsi infectivity in a population of 3,548 free-live adult ticks, harvested from 83 acarological researches, identified as Amblyomma cajennense (2,355) and Amblyomma dubitatum (1,193). Seasonality pattern from each population was observed, from July/2009 to June/2010. From all adult ticks, 702 were used for the hemolymph test and 2,197 were dissected for their salivary gland remove. The glands were used for DNA extraction and gltAPCR ompA-PCR evaluation. The evaluated areas for BSF showed positive rates between 1.2% and 8.8 % for gltA-PCR and none was positive for the ompA2-PCR, on Amblyomma cajennense and Amblyomma dubitatum species, at risk areas in Americana, So Paulo. For sustainable animal production, the objectives of this work contribute on the mapping and distribuition of Amblyomma cajennense and Amblyomma dubitatum ticks and the prevalence of Rickettsia spp. infectivity, enabling a better understanding about biotic interference data at preserved areas at side of animal production areas and measuring risks for zootechny and livestock research, at the Center of Dairy Research, Institute of Animal Science and Pastures, located in the Americana municipality. Key Words: Amblyomma cajennense; Amblyomma dubitatum; Brazilian Spotted Fever; PCR; Rickettsia spp.

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1. INTRODUO

A Febre Maculosa Brasileira (FMB) uma antropozoonose de notificao compulsria, com incidncia e prevalncia associadas ao nvel de risco para o parasitismo humano, apresentando caractersticas epidemiolgicas de elevada endemicidade e alta letalidade, apesar de sua baixa morbidade para a populao humana do estado de So Paulo. Essa configurao demonstra que uma vigilncia epidemiolgica e laboratorial para confirmao de casos provveis extremamente importante, na medida em que o controle desta enfermidade ser mais eficiente, quanto mais informaes forem obtidas de indivduos expostos a carrapatos (MANCINI et al., 1983; BRASIL, 2009). Entre 2000 a 2009, aumentou significativamente a importncia da FMB enquanto agravo em Sade Pblica, fato justificado pela crescente relao dos nmeros de casos e bitos diagnosticados, respectivamente 314 e 101, em So Paulo; 132 e 50, em Minas Gerais; 30 e 6, no Esprito Santo; 54 e 17, no Rio de Janeiro (BRASIL, 2010a; BRASIL, 2010b), somado s elevadas taxas de letalidade (32 % em So Paulo; 38 % em Minas Gerais; 20 % no Esprito Santo e 31 % no Rio de Janeiro) e agravado pela expanso das reas de transmisso, que no se restringiram mais s reas rurais e de mata (EPISUS/CVE/SES/SP, 2005). A ocorrncia de casos (em reas urbanas e periurbanas) demonstra profunda modificao nas caractersticas ecoepidemiolgicas dessa doena.

O tratamento precoce de casos suspeitos de FMB tem sido primordial para a reduo da letalidade da doena, sendo muito importante o conhecimento da epidemiologia da mesma, por meio de rpidas e coordenadas aes de vigilncia epidemiolgica, sindrmica e laboratorial.

O diagnstico epidemiolgico, em regio com potencial bitico de desenvolvimento da doena, pode ser determinado pelas condies scio-econmicas da populao; pela distribuio e densidade dos vetores transmissores (influenciada por fatores climticos e ambientais); pelas condies ecolgicas locais e pelas espcies domsticas (equdeos e ces) e silvestres (principalmente, capivaras) presentes (PETERKA, 2008).

As alteraes de hbitats naturais, promovidas pela intensificao da agricultura e de novas reas de habitao, geram desequilbrios ecolgicos que determinam alteraes significativas na diversidade de interaes entre reservatrios, hospedeiros e vetores, aumentando a oportunidade de transmisso destas doenas (CUTLER et al., 2010), onde a distribuio potencial da capivara, hospedeiro amplificador de Rickettsia rickettsii em natureza (SOUZA et al., 2009), est associada a hbitats antrpicos, particularmente com intensivo uso agropecurio (FERRAZ et al., 2009).

Vrias mudanas ambientais de carter antrpico em todos os biomas brasileiros determinam considervel aumento na exposio humana aos vrios agentes biolgicos de potencial zoontico emergente que so transmitidos por carrapatos, onde as reas mais susceptveis para transmisso esto fortemente relacionadas s proximidades de cursos de gua, pastagens, matas ciliares e ambincias em limites periurbanos (MAFRA et al., 2010).

Woodford (2009) citou que o surgimento e proliferao de agentes patognicos capazes de afetar os seres humanos, onde os animais domsticos, animais de produo e animais selvagens participam ativamente de sua cadeia de transmisso, constitui-se em ameaa potencial ao equilbrio sustentvel da segurana ambiental e biodiversidade, exacerbado pela transformao antrpica das paisagens naturais, com fins de aumentar a produo agrcola e pecuria.

Os carrapatos geram enormes prejuzos para os animais de produo, em que altos nveis de infestao podem determinar redues na produo de leite e carne, ocasionando na adoo de rigorosas prticas de manejo para controle de ectoparasitas (SZAB, 2010).

Neste contexto da produo animal sustentvel, os objetivos deste projeto foram inseridos na rea de Bem-Estar, Ambincia e Segurana Alimentar, com observaes que ajudaram no conhecimento da epidemiologia da FMB em reas de alerta e risco do municpio de Americana, onde se realizou um mapeamento da distribuio de carrapatos das espcies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum e avaliao da prevalncia de infeco desses carrapatos para Rickettsia spp., possibilitando o estabelecimento de um programa de vigilncia epidemiolgica mais eficiente em medidas preventivas de Sade Pblica. Ao mesmo tempo, as anlises decorrentes promoveram melhor entendimento sobre o que esses processos podem determinar nos potenciais biticos de algumas reas de preservao e lazer do municpio, assim como, sobre suas reais interferncias e riscos para pesquisas zootcnicas realizadas no Centro de Pesquisa em Pecuria de Leite do Instituto de Zootecnia (Fazenda Palmeiras), situado em Americana.

2. REVISO DE LITERATURA

As Rickettsioses so doenas causadas por Rickettsia spp., transmitidas por vetores artrpodes e implicadas na fisiopatogenia da Febre Maculosa e do Tifo Endmico e Epidmico. O Tifo Epidmico (Rickettsia prowazekii) ocorre comumente em situaes de contingncia nas prises, nos campos de refugiados e durante as guerras, onde condies pouco higinicas e de superlotao humana facilitam o parasitismo por piolhos. O Tifo Endmico (R. typhi) surge quando os seres humanos vivem prximos de locais infestados por roedores geralmente associados a depsitos de lixo. As infeces de Febre Maculosa so contradas por seres humanos em hbitats de carrapatos ou caros vetores, e incluem a Febre Maculosa (R. rickettsii), o Tifo Asitico (R. tsutsugamushi), a Febre do Mediterrneo (R. conorii) e o Tifo Africano (R. africae) (JONES, 2005).

A FMB uma doena infecciosa aguda, de gravidade varivel, onde os homens so hospedeiros acidentais, no sendo considerados reservatrios da doena e no colaborando com a propagao do agente (BUZZAR, 2002). caracterizada por um perodo de incubao de 2 a 14 dias, febre contnua, calafrios, prostrao, mal estar, mialgia, artralgia, cefalia, erupes cutneas mculo-papulares e distrbios hemostticos. Com taxas de mortalidade no Brasil girando em torno de 20 a 30 %, em funo das dificuldades diagnsticas e de estabelecimento de uma terapia apropriada e precoce, consignadas ao pouco conhecimento 4

sobre a doena e sintomatologia pouco especfica, sua letalidade pode chegar a 80 %, nos casos no tratados. (DEL FIOL et al., 2010).

Todos os casos suspeitos de FMB (acompanhados por uma ficha de investigao epidemiolgica preenchida e a coleta oportuna de material para diagnstico especfico) so notificados s Vigilncias Epidemiolgicas Municipais para que se proceda investigao e tomada das medidas de controle e preveno. Para que uma determinada rea seja considerada Local Provvel de Infeco (LPI), o local deve ter sido visitado pelo paciente infectado nos ltimos 15 dias que precederam o incio dos sintomas, devendo existir uma populao de vetores estabelecida (carrapatos) e/ou a presena de condies naturais favorveis para estabelecimento da populao do vetor, e o agente etiolgico deve estar estabelecido. Para se determinar as condies supracitadas, devem ser considerados: o estabelecimento da populao dos principais vetores (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), a presena dos principais hospedeiros primrios (capivaras e cavalos), a busca ativa dos vetores (vigilncia acarolgica) e a circulao do agente etiolgico (Rickettsia rickettsii).

Em municpios de So Paulo (Tabela 1), Minas Gerais, Rio de Janeiro, Esprito Santo, Mato Grosso, Paran e Tocantins foram observados bitos causados pela enfermidade (BRASIL, 2010b).

A ocorrncia de casos suspeitos deve ser notificada para investigao da presena de carrapatos e animais nos locais provveis de infeco e desencadeamento das medidas de controle. So necessrios procedimentos de vigilncia ativa e passiva na rea de transmisso (BUZZAR, 2002).

No perodo de 2004 a 2010 foram confirmados sete casos de FMB no municpio de Americana, havendo registro de um bito em 2004, um bito em 2005 e um bito em 2010 (Figura 1), conferindo uma taxa de letalidade de 43 %, superior ao ndice estadual de 36 %. Excetuando-se o ano de 2010, nos demais anos com registro de positividade de casos (2004; 2005; 2006 e 2007), os coeficientes de incidncia por 100.000 habitantes foram respectivamente de 0,51; 0,50; 0,49 e 0,50, sendo tambm muito superiores aos coeficientes estaduais (0,11; 0,14; 0,09 e 0,08 respectivamente) (Tabela 1).

Tabela 1 - Incidncia (por 100.000 habitantes), bitos e Taxa de Letalidade por ano, no Estado de So Paulo - 1985 a 2009.

Ano

N de Casos

N de bitos

Incidncia 0,01 0,02 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,03 0,02 0,01 0,01 0,02 0,01 0,04 0,01 0,04 0,04 0,02 0,08 0,11 0,14 0,09 0,08 0,11 0,07

Letalidade 33,3 80,0 33,3 100,0 0,0 0,0 0,0 0,0 20,0 33,3 100,0 50,0 50,0 46,2 0,0 12,5 73,3 44,4 40,0 26,2 28,1 34,2 23,5 27,3 35,7

1985 03 01 1986 05 04 1987 03 01 1988 03 03 1989 01 00 1990 00 00 1991 00 00 1992 01 00 1993 05 01 1994 03 01 1995 04 04 1996 06 03 1997 02 01 1998 13 06 1999 02 00 2000 16 02 2001 15 11 2002 09 04 2003 30 12 2004 42 11 2005 57 16 2006 38 13 2007 34 08 2008 44 12 2009 28 10 Total 364 124 Fonte: Diviso de Zoonoses - CVE/SES-SP

Neste contexto, a regio de Americana possui uma forte evidncia epidemiolgica de endemicidade para a doena em questo, inserida na Regio Metropolitana de Campinas, que apresenta 56 % dos casos de ocorrncia da doena no estado de So Paulo (MARTINS, 2007).

Associado a isto, de 2000 a 2010, outros casos foram relatados em cidades vizinhas: 6 em Cosmpolis, 6 em Paulnia, 3 em Santa Barbara d'Oeste, 3 em Sumar, 1 em Limeira, 28 em Piracicaba e 57 em Campinas (Tabela 2).

Alm dos riscos de transmisso desta zoonose aos trabalhadores e pesquisadores desta rea, sabemos que os seus principais hospedeiros naturais, as capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) so bastante seletivas quanto alimentao, competindo com o gado nas reas de pastagem existentes, gerando um convvio frequente e estreito com estes animais de 6

produo e atuando como um importante reservatrio silvestre e rural de enfermidades e excelente amplificador de vetores artrpodes, com desempenho significativo e importante para os mecanismos e fluxos de sustentabilidade relacionados aos ciclos de doenas em Sade Animal, Sade Pblica e suas interrelaes nas perdas econmicas em animais de produo e em criadouros comerciais das espcies domsticas de aproveitamento zootcnico (MOREIRA e PIOVEZAN, 2005).

Situao Epidemiolgica da Febre Maculosa em Americana

CASOS

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

SUSPEITOS

08

26

39

25

16

21

27 01

CONFIRMA DOS

01
(BITO)

01
(BITO)

01
(TRATAMENTO E CURA)

01
(TRATAMENTO E CURA)

(BITO)

02
(TRATAMENTO E CURA)

Figura 1 - Situao Epidemiolgica da Febre Maculosa Brasileira (FMB) em Americana, SP (Fonte: PVCC, Vigilncia Epidemiolgica, 2010).

Assim, estudos sobre a bioecologia dos carrapatos com informaes sobre a dinmica populacional, relacionada aos hospedeiros e ao meio-ambiente, asseguram a aplicao de um programa eficiente de controle de artrpodes e preveno da FMB. Para identificao dos carrapatos contaminados por rickttsias, so frequentemente utilizados os testes de hemolinfa e a reao em cadeia da polimerase (PCR).

Tabela 2 - Distribuio dos Casos Confirmados de FMB, em Municpios prximos de Americana, SP (2000-2010) 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Total casos casos casos casos casos casos casos casos casos casos casos casos Americana 01 01 01 01 03 07 Campinas 02 05 03 03 03 04 10 07 04 14 02 57 01 01 01 01 01 01 06 Cosmpolis Jaguarina 03 04 02 02 03 02 02 01 19 05 01 06 Paulnia Santa Barbara d'Oeste 01 01 01 03 01 01 01 03 Sumar Limeira 01 01 01 01 05 12 01 01 05 02 28 Piracicaba TOTAL 06 11 04 09 12 21 15 11 13 21 07 130 Fonte: SINAN W, SINAN NET, Diviso de Zoonoses/CVE/CCD/SES-SP Municpios / Ano

Um sculo aps a primeira descrio de rickttsias como patgenos humanos, as rickettsioses permanecem pouco entendidas como doenas. Nos ltimos dez anos, a concluso de sequncias de genoma de vrias cepas permitiu melhor conhecimento sobre os mecanismos moleculares envolvidos na patogenicidade das rickttsias. Atualmente, alguns dados relativos ao estudo das fases crticas das interaes entre as rickttsias e as clulas hospedeiras contribuem para uma melhor anlise dos processos deletrios celulares e tissulares, relacionados sobrevivncia intracelular da bactria (BALRAJ et al., 2009).

O uso de modernas tcnicas de deteco e isolamento, incluindo a microscopia eletrnica, a histoqumica e culturas de tecidos dos vetores, bem como a utilizao de ferramentas genmicas e anlise do transcriptoma e do proteoma de rickttsias, devem acelerar o nosso entendimento desses patgenos (SOCOLOVSCHI et al., 2009).

2.1 ASPECTOS EPIDEMIOLGICOS

As florestas tropicais so um grande reservatrio de microrganismos desconhecidos que podem provocar srios problemas de sade. A principal fonte de contgios de seres humanos por esses microrganismos se d por meio do contato com animais silvestres, que atuam como potenciais reservatrios de enfermidades e/ou vetores artrpodes (MILAGRES, 2004).

Mudanas na ecologia das paisagens podem resultar em uma expanso do nmero de carrapatos ou de seus hospedeiros biolgicos, com a consequente expanso das reas de risco para a sade humana ou animal. Nos ltimos anos, a maior ateno aos efeitos das mudanas climticas tem demonstrado que muitas doenas transmitidas por carrapatos esto experimentando um aumento global de elevada significncia (NICHOLSON et al., 2010).

As infeces microbiolgicas adquiridas dos animais, conhecidas como zoonoses, possuem enorme risco para a Sade Pblica, onde 60 % dos patgenos emergentes em humanos so zoonticos, e mais de 71 % destes tm sua origem na vida silvestre. Esses patgenos podem trocar de hospedeiros pela aquisio de novas combinaes genticas que alteram seu potencial patognico ou por modificaes no comportamento ou caractersticas socioeconmicas, ambientais ou ecolgicas dos hospedeiros (CUTLER et al., 2010).

As intervenes na dinmica de populaes hospedeiras, tais como a domesticao e/ou a proximidade de populaes animais, aliadas s condies de precariedade da existncia de alguns grupos humanos e da prpria iatrogenia mdica, atravs do uso indiscriminado de medicamentos, acabam por selecionar espcies cada vez mais resistentes (PIGNATTI, 2004).

A transmisso da FMB ao homem, ocorre exclusivamente por carrapatos. Sendo assim, o ciclo da doena depende do hospedeiro primrio (equdeos, capivaras e antas), do vetor (carrapatos Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum) e do parasita (Rickettsia rickettsii) (RICKETTS, 1906; DIAS e MARTINS, 1939; LEMOS, 1996; SANGIONI, 2003). O hospedeiro primrio o vertebrado sem o qual uma determinada populao de vetores no capaz de se estabelecer numa determinada regio. Os equinos possuem grande importncia no ciclo da FMB, pois mantm alta densidade populacional de A. cajennense e so criados em locais prximos aos frequentados por humanos. Apesar de no apresentarem sintomatologia da doena, os equinos funcionam como animais sentinelas para a infeco humana (MORAES-FILHO et al., 2009b; FREITAS et al., 2010), assim como os ces, nos quais j houve descrio de sintomatologia clnica (LABRUNA et al., 2009), sugerindo que uma estreita associao entre ces e Rhipicephalus sanguineus pode desempenhar importante papel na epidemiologia da FMB (GEHRKE et al., 2009; GAZETA et al., 2009). A capivara (Hydrochoerus hydrochaeris) um reservatrio em potencial da FMB, pois no apresenta os sinais clnicos da doena e, alm disso, atua como hospedeiro 9

multiplicador das Rickettsia spp. (NOGUEIRA e CRUZ, 2007; SOUZA et al., 2009). Alm de capivaras, esse agente j foi isolado de gambs (Didelphis aurita) (MOREIRA e MAGALHES, 1935; HORTA et al., 2009).

Observaes epidemiolgicas indicam a capivara como amplificador de R. rickettsii em natureza, no estado de So Paulo. Tais correlaes sugerem que um desequilbrio populacional de capivaras esteja associado com aumento de casos de FMB, sendo este problema fortemente relacionado com a interveno dos rgos ambientais na proteo e preservao de capivaras, gerando rpida recuperao dessa espcie que, sem predadores naturais e com habitat natural degradado, tornou-se uma populao sinantrpica em reas urbanas, com nfase de riscos para parques pblicos e represas municipais (SOUZA et al., 2008; SOUZA et al., 2009; FERRAZ et al., 2009), sendo importante avaliar se os seus carrapatos, da espcie A. dubitatum, estariam envolvidos como vetores enzoticos da espcie Rickettsia rickettsii (LEMOS et al., 1996; NAVA et al., 2010).

O aumento das populaes de capivaras em pequenas matas ciliares ou em fragmentos florestais de lagos e represas (que caracterizam reas de proteo ambiental em unidades de produo agropecuria), est associado com nveis insuportveis de infestaes ambientais por carrapatos das espcies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum. Os seres humanos e animais domsticos em tais stios so expostos permanentemente ao parasitismo e ao risco de doenas transmitidas por carrapatos, como a Febre Maculosa (SZAB, 2010).

Milagres (2004) relata que tanto o carrapato do cavalo (Amblyomma cajennense) quanto o carrapato Amblyomma dubitatum (indicados como reservatrios naturais do agente causal da FMB), como os carrapatos do co (Rhipicephalus sanguineus), podem parasitar a capivara; como tambm cita a existncia de relatos de ectoparasitismo em capivaras por carrapatos de bovinos das espcies Rhipicephalus (Boophilus) annulatus e Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Segundo Souza (2003), a mata ciliar mostra-se como o habitat de maior abundncia de todos os estgios de ixoddeos, sendo a frequncia de A. cajennense, larvas e ninfas das espcies de Amblyomma estatisticamente iguais. A maior abundncia de carrapatos na mata ciliar pode ser justificada pela presena constante dos hospedeiros primrios de A. cajennense 10

e pelas caractersticas climticas deste habitat, onde os ndices de temperatura so mais baixos e a umidade mais elevada.

O A. cajennense completa uma gerao por ano, na regio Sudeste do Brasil, com os trs estgios marcadamente distribudos ao longo do ano. As larvas, vulgarmente denominadas de micuim, ocorrem basicamente entre os meses de maro a julho. As ninfas, vulgarmente denominadas de vermelhinhos, ocorrem entre os meses de julho a novembro e os adultos, vulgarmente denominados de rodoleiro ou de carrapato estrela, predominam entre os meses de novembro a maro (LABRUNA et al., 2002; SILVA, 2009). A atividade sazonal das fases de vida livre procura pelo hospedeiro e a densidade da populao de carrapatos que realizam parasitismo humano podem afetar a ocorrncia da FMB (PEREIRA e LABRUNA, 1998). Portanto, a incidncia da doena em humanos depende do comportamento do vetor, sua distribuio, ecologia, e mais precisamente da complexa interao da densidade populacional e do ciclo anual dos carrapatos com seus hospedeiros (BURGDORFER, 1975).

No caso da FMB, um outro agravante em sua epidemiologia a caracterstica biolgica do A. cajennense, que permite a estes carrapatos tornarem-se verdadeiros reservatrios de rickttsias em natureza, onde todas as fases evolutivas so capazes de permanecer infectadas, meses ou anos no ambiente, espera do hospedeiro, garantindo um foco de transmisso prolongado da doena (FONSECA e MARTINS, 2007). No entanto, como a infeco dos carrapatos pode interferir tambm na capacidade reprodutiva de suas fmeas adultas, com relativa letalidade para alguns espcimes, os mecanismos de transmisso transovariana e perpetuao transestadial necessitam paralelamente que existam hospedeiros naturais com papel fundamental na amplificao da infeco por Rickettsia rickettsii nesta populao de carrapatos (SANTOS, 2007).

Segundo Lima et al. (2003), a importncia da Febre Maculosa no Brasil, se d especialmente na regio de Campinas onde a doena foi causa de bitos em todos os anos desde 1985 a 2000, com exceo de 1992, com uma letalidade que correspondeu a 49 % do total de casos confirmados. Apesar disso, ainda poucos estudos sobre a ecologia dos ixoddeos foram realizados, onde, alm do A. cajennense, outras espcies tambm podem estar envolvidas na transmisso da doena. 11

O estudo da ixodofauna, em reas rurais do Brasil, tem sido negligenciado em muitas regies, principalmente no mbito da classe mdico-veterinria, subestimando sua repercusso na epidemiologia de doenas transmitidas por carrapatos (MARTINS et al., 2009).

Assim como nos estgios do carrapato, tambm h prevalncia sazonal para a FMB: a maioria dos casos ocorre nos meses de setembro a novembro (primavera e incio do vero). Isso acontece, pois, para haver contaminao, os carrapatos devem manter-se fixos ao hospedeiro por 4 a 20 horas, para que ocorra a reativao da bactria na glndula salivar do vetor (CAMARGO-NEVES et al., 2004). Assim, a doena, em humanos, ocorre com maior frequncia na poca de predomnio das larvas e, principalmente, das ninfas, estgios mais difceis de serem percebidos e removidos, em comparao aos carrapatos adultos. Alm disso, os adultos apresentam menor predileo de parasitismo em seres humanos.

Guglielmone et al. (2006), em anlise baseada em levantamento da literatura cientfica e registros inditos de parasitismo, relataram parasitismo humano por Amblyomma cajennense em 23 municpios e por Amblyomma dubitatum em 3 municpios do estado de So Paulo; e durante os ltimos 10 anos no estado de So Paulo, o nmero de casos confirmados de FMB por localidade foi semelhante entre as reas endmicas, onde Amblyomma aureolatum ou Amblyomma cajennense foram os vetores (LABRUNA et al., 2008).

2.2 CARACTERIZAO DO VETOR

Em relao aos carrapatos, no Brasil, os do gnero Amblyomma spp. (A. cajennense, A. dubitatum e A. aureolatum) so os principais vetores da FMB aos diversos hospedeiros. Entretanto, para o homem, o principal vetor o Amblyomma cajennense (Figuras 2 e 3).

Esse carrapato possui parasitismo inespecfico, principalmente, durante os estdios de larva e ninfa (CAMARGO-NEVES et al., 2004), e, uma vez que apresenta transmisso transovariana e perpetuao transestadial das rickttsias, constitui vetor ideal para a FMB. Alm disso, completa uma gerao por ano e cada estdio sobrevive por vrios meses ou anos no ambiente sem alimentao. Dessa maneira, alm de vetores, os carrapatos podem ser considerados reservatrios das rickttsias em natureza, uma vez que todas as fases podem 12

permanecer infectadas, garantindo foco de transmisso prolongado da doena (SOUZA, 2003).

Figura 2 - Vista dorsal de exemplar macho de Amblyomma cajennense, principal vetor da Rickettsia rickettsii, agente etiolgico da Febre Maculosa Brasileira (FMB) - Courtesy of CDC / Dr. Christopher Paddock (James Gathany, 2008).

O carrapato da espcie Amblyomma cajennense possui distribuio em quase toda a Amrica. encontrado frequentemente no cavalo, mas possui baixa especificidade parasitria, principalmente nas fases de larva e ninfa. So hematfagos obrigatrios e infectam-se ao sugarem animais silvestres. Segundo Walker e Ismail (2008), para os carrapatos se alimentarem por vrios dias ou semanas, inoculam sua saliva contendo componentes antihemostticos que so cruciais para sua alimentao sangunea, alm de componentes salivares imunomoduladores que melhoram a transmisso de patgenos e previnem a rejeio dos carrapatos pelos hospedeiros.

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Figura 3 Vista dorsal de exemplar fmea de Amblyomma cajennense, principal vetor da Rickettsia rickettsii, agente etiolgico da Febre Maculosa Brasileira (FMB) - Courtesy of CDC / Dr. Christopher Paddock (James Gathany, 2008).

Devido ocorrncia de transmisso transovariana e perpetuao transestadial entre os carrapatos, tambm podem atuar como reservatrios da doena (LABRUNA, 2009). Diversos roedores e outros animais tambm ajudam a manter o ciclo da doena. As mudanas constantes no meio ambiente, as alteraes no manejo de espcies domsticas (bovinos e equinos), o aumento da populao animal, o cultivo de pastagens e o aumento na oferta da alimentao so provveis causas do aumento da populao do Amblyomma cajennense, que pode completar uma gerao por ano, mostrando os trs estgios parasitrios marcadamente distribudos ao longo do ano. As larvas ocorrem basicamente entre os meses de maro e julho, as ninfas entre julho e novembro e os adultos entre novembro e maro. Podem ser encontrados, em todas as fases, em aves domsticas (galinhas, perus), aves silvestres (seriemas), mamferos (cavalo, boi, carneiro, cabra, co, porco, veado, capivara, cachorro do mato, coelho, cotia, quati, tatu, tamandu, entre outros) e animais de sangue frio (ofdios), tornando-se um grave problema para a Sade Pblica em nossas cidades.

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Szab et al. (2010) relataram parasitismo por Amblyomma cajennense em dezessete bovinos e trs sunos criados em biomas de cerrado do Brasil, confirmando relatos anteriores sobre a predominncia desta espcie de carrapato.

A porcentagem de carrapatos infectados muito baixa, mesmo em reas de alta endemicidade; sendo tambm varivel anualmente. Entretanto existe a possibilidade que a infeco possa ser mantida em natureza pela transmisso transovariana. Neste caso, os carrapatos seriam os principais reservatrios e os animais serviriam apenas para a manuteno do seu ciclo biolgico (GUIMARES et al., 2001).

Conhecido como o carrapato da capivara, o Amblyomma dubitatum tambm j foi encontrado parasitando outros hospedeiros, como antas, morcegos e gambs (GUIMARES et al., 2001). Segundo Nava et al. (2010), o principal hospedeiro para todos os estgios parasitrios de A. dubitatum a capivara (H. hydrochaeris), podendo sustentar todo o ciclo desta espcie, enquanto outros mamferos tais como bovinos, equinos, antas (Tapirus terrestris), veados-catingueiros (Mazama gouazoubira), javalis (Sus scrofa) e queixadas (Tayassu pecari) possuem um menor papel, apenas como fonte alimentar, para esta espcie de carrapato. No Brasil, essa espcie j foi registrada nos estados da regio sul, sudeste e centro oeste (CAMARGO-NEVES et al., 2004).

Apesar de haver controvrsias sobre o parasitismo humano por A. dubitatum, sua importncia mdica se caracteriza pela possvel manuteno do ciclo enzotico da doena, atravs da transmisso transovariana da bactria a sua prognie e infeco de capivaras que so consideradas potenciais amplificadores de rickttsias (LABRUNA, 2006).

Labruna et al. (2007) observaram uma infestao parasitria por todos os estgios de Amblyomma dubitatum em humanos, sugerindo que este comportamento tambm possa ser mais frequente do que o esperado, especialmente no caso de formas imaturas (larvas e ninfas).

Os conceitos de distribuio e intensidade de patgenos transmitidos por carrapatos so fortemente influenciados por diversos fatores, tais como os parmetros ambientais,

alteraes no uso da terra, mudanas nas atividades humanas e animais, a vigilncia estabelecida e competncia diagnstica (NICHOLSON et al., 2010). 15

A distribuio dos carrapatos pode ser associada a certos tipos de vegetao, havendo maior abundncia em hbitats de floresta decdua e regies com vegetao herbcea, arbustiva ou em campos abandonados (SOUZA, 2003). No Brasil, geralmente, a vegetao rasteira que abriga carrapatos tambm serve de pastagem para animais, e acessvel aos reservatrios e hospedeiros secundrios. Assim, a manuteno da doena no ambiente e a sua ocorrncia em humanos dependem de condies favorveis para a sobrevivncia e a multiplicao dos vetores. O aumento da populao de carrapatos depende tanto da presena do hospedeiro primrio quanto de condies ambientais (clima e vegetao) favorveis s fases de vida livre. Dessa maneira, reas de campos limpos ou pastos limpos, cobertura vegetal pobre ou presena de apenas um tipo de gramnea so menos favorveis ao carrapato que reas de matas secundrias, capoeiras e pastos sujos (LABRUNA et al., 2001).

Larvas e ninfas de Amblyomma spp. so parasitas frequentes de humanos e animais domsticos no Brasil, podendo adquirir e transmitir patgenos. Dessa forma, importante a identificao taxonmica desses estgios imaturos. No entanto, como os estgios imaturos da maioria das espcies de carrapatos do gnero Amblyomma do Brasil permaneciam desconhecidos, a identificao precisa da espcie era possvel apenas de duas formas: criando a larva e ninfa at o estgio adulto em laboratrio, fazendo a identificao da espcie de Amblyomma a partir do carrapato adulto obtido; ou atravs de sequenciamento gnico de marcadores moleculares (principalmente fragmentos de genes mitocondriais e ribossomais), e comparao com sequncias previamente obtidas de carrapatos adultos de espcies conhecidas (LABRUNA et al., 2007). Vale salientar que esses dois mtodos citados acima so trabalhosos, demorados, e nem sempre possveis de serem executados. Sendo assim, notria a grande necessidade da existncia de uma chave taxonmica, associada descrio morfolgica, para os estgios imaturos de Amblyomma spp. do Brasil.

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2.3 AGENTE ETIOLGICO

As rickttsias so parasitas intracelulares obrigatrios muito pequenos (medindo em torno de 0,3 a 0,6 m de largura e 0,8 a 2 m de comprimento) que pertencem subdiviso da -Proteobacteria, como membros do gnero Rickettsia, dentro da famlia Rickettsiaceae, na ordem Rickettsiales (BECHAH et al., 2008). Apresentam caractersticas de bactrias gramnegativas, que retm a fucsina bsica quando coradas pelo mtodo de Gimnez (1964) e residem em glndulas salivares e ovrios de artrpodes hospedeiros (SANGIONI, 2003).

As rickttsias so divididas em dois grupos: o grupo tfico (Typhus group - TG) e o grupo da Febre Maculosa (Spotted Fever Group - SFG), baseados em diferenas nas doenas que causam, na presena das protenas de membrana externa, rOmpA e rOmpB (CHAN et al., 2009) e na composio intracelular de plasmdeos que possuem extrema importncia na evoluo e epidemiologia das rickttsias, em razo de sua plasticidade gentica e caractersticas adaptativas ao hospedeiro, responsveis pela transferncia horizontal de genes que aumentam sua virulncia ou resistncia antibitica (FOURNIER et al., 2009; BALDRIDGE et al., 2010).

O TG contm as rickttsias: R. prowazekii e R. typhi, que so transmitidas, primariamente, por piolhos e pulgas. O SFG possui outras 60 espcies, das quais pelo menos 13 so, conhecidamente, patognicas ao homem: R. rickettsii (reconhecida no Brasil, como causadora da FMB), R. parkeri, R. conorii, R. africae, R. australis, R. honei, R. sibirica, R. japonica, R. felis, R. mongolotimonae, R. slovaca, R. helvetica e R. akari (LABRUNA, 2004).

A Rickettsia rickettsii (Figura 4) a espcie de rickttsia mais patognica, com uma grande variabilidade gentica, fazendo com que seus gentipos circulantes possam ser mais virulentos que outros, estabelecendo ampla variao nas taxas de letalidade da doena (PAROLA et al., 2009). Ferreira (2006) descreve que, embora determine baixa morbimortalidade na populao, talvez seja o agente etiolgico mais letal para os humanos depois do vrus rbico.

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Figura 4 - Microscopia eletrnica de Rickettsia rickettsii, mostrando a ligao de rickttsias na superfcie de uma clula endotelial, seguida por sua entrada no interior da clula por fagocitose induzida. Quando a membrana do fagossomo (seta) perdida, as rickttsias escapam para o citoplasma da clula hospedeira. Barra=0,5 m. Vsevolod Popov e David H. Walker, University of Texas Medical Branch, Texas, USA.

Alm disso, segundo Bechah et al. (2008), Rickettsia prowazekii, o agente da epidemia de tifo, e R. rickettsii, o agente da Febre Maculosa das Montanhas Rochosas, so microrganismos que podem potencialmente ser usados como armas biolgicas para induzir o pnico na populao. As Rickttsias so bactrias intracelulares obrigatrias em ambos os hospedeiros vertebrados e invertebrados, mas as espcies envolvidas nas Riquetsioses diferem em termos de sua associao com os artrpodes, no comportamento do vetor infeco, fisiopatologia e evoluo da doena. Compreender as etapas de patogenicidade das Rickettsioses essencial para desenvolver estratgias de proteo contra estas ameaas bacteriolgicas. Infelizmente, os mecanismos envolvidos na patognese de muitas Rickettsioses so mal caracterizados, e os mecanismos imunitrios incompletamente entendidos; em parte, pela necessidade de modelos animais que simulem doenas humanas, hoje to escassos. Sua parede celular constituda de peptidioglicano contendo os cidos murmico e diaminopimlico, como caracterstica de uma bactria Gram-negativa. Multiplica-se por diviso binria e, em cultura de clulas, seu tempo de gerao varia de oito a dez horas a uma temperatura de 34 C. So microrganismos pleomrficos e podem apresentar-se em formato 18

de cocos ou de hastes curtas, em pares, isolados ou como filamentos. Entre os antgenos proteicos de R. rickettsii, duas protenas superficiais (190 e 135 kDa) contm eptopos termolbeis que so espcies-especficos, e outras protenas que so comuns a vrios membros do grupo. Associam-se a diferentes organelas celulares e, ocasionalmente, formam massas de microrganismos no citoplasma ou ncleo da clula infectada, dependendo da espcie de rickttsia envolvida (GRECA et al., 2008).

Nas bactrias Gram-negativas, a parede celular est composta por uma camada de peptidioglicano e trs outros componentes que a envolvem externamente; lipoprotena, membrana externa e lipopolissacardeo. O peptidioglicano, responsvel pela forma das clulas e proteo do citoplasma frente s diferenas de presso osmtica entre os meios externo e interno, confere rigidez ao corpo bacteriano. Formado por dois acares aminados, o cido Nacetil glicosamina e o cido N-acetil murmico, e por um tetrapeptdio, sempre ligado ao resduo de cido N-acetil murmico; as subunidades peptdicas de cadeias glicdicas adjacentes, so unidas entre si por ligaes diretas ou indiretas (pontes de ligao) (MADIGAN e MARTINKO, 2006). O peptidioglicano situa-se no espao periplsmico, localizado entre a membrana citoplasmtica (interna) e a membrana externa, onde tambm so encontradas enzimas hidrolticas (fosfatases, nucleases, proteases e outras que facilitam a nutrio bacteriana), protenas de ligao que participam da captao de acares e aminocidos a partir do meio e enzimas que inativam certos antibiticos (MADIGAN e MARTINKO, 2006).

A concluso do sequenciamento do genoma de Rickettsia conorii e R. prowazekii proporcionou a oportunidade de identificar possveis fatores de virulncia nesses patgenos intracelulares. O papel para uma fosfolipase A2 (PLA2) na patogenicidade das rickettsioses foi investigado, no sendo identificado o gene correspondente. Foi identificado um gene que codifica a fosfolipase D (PLD) e foi detectada por Southern blotting em 11 amostras de rickttsias analisadas. Uma protena recombinante dimrica possui atividade PLD, tal como demonstrado pela sua capacidade de libertar [3H]-choline de fosfatidil [3H]-choline. Este PLD est presente em todo lisado de rickttsias e provavelmente seja um fator de virulncia, porque a incubao de rickttsias com um anticorpo anti-PLD reduziu sua atividade citotxica contra clulas Vero. Esta enzima pode contar para a atividade anteriormente atribuda a PLA2 e pode ser crtica para a vida intracelular dessas bactrias (RENESTO et al., 2003). 19

2.4 DIAGNSTICO LABORATORIAL

O diagnstico laboratorial das Rickettsioses, atravs das principais tcnicas sorolgicas; imunofluorescncia indireta, fixao de complemento, microaglutinao, ELISA e Imunoblotting um poderoso instrumento para a reduo da letalidade destas zoonoses, auxiliando nas aes de vigilncia epidemiolgica desta enfermidade nas diversas espcies animais envolvidas (hospedeiros e vetores, sejam reservatrios ou sentinelas) juntamente com o homem (BRITES-NETO e DUARTE, 2010).

O diagnstico laboratorial da Febre Maculosa em humanos pode ser feito por pesquisa de anticorpos especficos, pelo isolamento do agente em amostras de sangue ou bipsia de pele, seguido pelo cultivo em clulas, e em amostras de carrapatos coletados de pacientes, animais reservatrios ou de vida livre. Vrios mtodos diagnsticos esto sendo desenvolvidos, mas ainda limitados pesquisa bsica, tal como o teste de imunoblotting (utilizado para anlise antignica) e a reao em cadeia da polimerase (PCR) que permite a deteco rpida e especfica da rickttsia (MILAGRES, 2004).

O uso de modernas tcnicas de deteco e isolamento, incluindo a microscopia eletrnica, a histoqumica, e culturas de tecidos dos vetores, bem como a utilizao de ferramentas genmicas para identificao de grupos e espcies em anlise filogentica de rickttsias, certamente agilizar o melhor entendimento sobre a etiofisiopatogenia e a ecoepidemiologia dessas zoonoses transmitidas por artrpodes vetores (BRITES-NETO e DUARTE, 2010).

A imunofluorescncia direta, assim como a colorao de Gimnez (1964), podem ser usadas para identificao de rickttsias atravs do teste de hemolinfa dos carrapatos, eventualmente encontrados nos pacientes (BURGDORFER, 1970).

A imunofluorescncia indireta (IFI) a prova padro recomendada pela Organizao Mundial da Sade (OMS) para o diagnstico das rickettsioses, utilizando como antgeno a espcie que se deseja identificar (CALIC, 2004).

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O teste de IFI considerado atualmente o mais simples e mais econmico teste para o diagnstico precoce de rickettsiose, tanto para estudos soro-epidemiolgicos, quanto para identificao dos isolados das rickttsias. As reaes de imunofluorescncias positivas (Figura 5) identificam o grupo antignico ao qual o agente patgeno pertence e no a espcie de rickttsia. Com o desenvolvimento da microimunofluorescncia indireta, possvel fazer reagir uma nica gota de soro diludo com seis a nove antgenos diferentes, simultaneamente, aumentando a capacidade de diferenciao das cepas de rickttsias dentro do grupo da Febre Maculosa (MILAGRES, 2004).

Figura 5 - Reao de Imunofluorescncia Indireta de soro positivo humano para Rickettsia rickettsii, aumento de 400X - Courtesy of the Center for Disease Control and Prevention (http://www.cdc.gov/).

A Reao de Imunofluorescncia Indireta - RIFI (casos positivos com ttulo de 1:64 ou mais) usada para diagnstico sorolgico, em humanos e animais, e detecta infeco por Rickettsia SFG (Spotted Fever Group), patognica ou no, mas no suficiente para identificar a espcie. Ttulos de IgM maiores ou iguais a 1:64 indicam infeces recentes ou correntes; contudo, uma reao para IgM em ausncia de reao para IgG pode representar um resultado falso positivo. As infeces recentes devem ser confirmadas pela demonstrao de soroconverso para IgG com aumentos de quatro vezes ou mais no ttulo de IgG quando soros de casos agudos e convalescentes so testados em amostras pareadas. Ttulos positivos para IgG maiores ou iguais a 1:256 geralmente indicam infeces recentes ou correntes; 21

enquanto ttulos positivos de 1:64 ou 1:128 podem indicar infeces recentes ou anteriores. As infeces recentes podem ser confirmadas pela demonstrao de quatro vezes ou mais de aumento no ttulo de IgG quando soros de casos agudos e convalescentes so testados em amostras pareadas (PINTER et al., 2004; BROUQUI et al., 2007).

Pinter et al. (2008) testaram soros caninos e humanos por IFI contra quatro antgenos de rickttsias (R. rickettsii, R. parkeri, R. felis e R. bellii), mostrando que 16 (64 %) dos soros caninos e 1 (2,8 %) dos soros humanos reagiram a pelo menos um desses antgenos com ttulos 64. Sete soros caninos e um nico soro reativo humano mostraram ttulos para R. rickettsii, no mnimo quatro vezes maior do que qualquer um dos outros trs antgenos. O ttulo de anticorpos nestes sete animais e um humano foram atribudos estimulao pela infeco por R. rickettsii. Nenhum soro positivo canino ou soro humano foi atribudo estimulao pela R. parkeri, R. felis, ou R. bellii. Os resultados sorolgicos mostraram que ces so importantes sentinelas para a presena de R. rickettsii, em reas onde o carrapato Amblyomma aureolatum o principal vetor da FMB.

Segundo Pacheco et al. (2007), as capivaras seriam potenciais sentinelas para rickttsias, e neste sentido testaram soros sanguneos de 73 capivaras de seis localidades do estado de So Paulo pela RIFI, usando antgenos de Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri e Rickettsia bellii, encontrando resultados que evidenciaram o primeiro registro de infeco por Rickettsia parkeri em capivaras e o primeiro registro de infeco natural de Rickettsia bellii em hospedeiros vertebrados.

Moraes-Filho et al. (2009b) pesquisaram a presena de anticorpos contra Rickettsia rickettsii, em equinos no municpio de So Paulo, no perodo de 2003 a 2005, onde avaliaram soros de 363 equinos pela RIFI, sendo que 64 (17,6 %) se mostraram reagentes a R. rickettsii. Os resultados obtidos demonstraram baixa porcentagem de animais reagentes quando comparados com dados de literatura de reas endmicas para FMB, onde foram encontrados at 77,8 % de equinos sororeagentes. Resultados similares foram obtidos por Freitas et al. (2010), em que amostras de soro foram obtidas aleatoriamente de 75 cavalos de carroceiros no municpio de So Jos dos Pinhais e testados pela RIFI com anticorpos contra ricktsias do grupo da Febre Maculosa, num total de 9,33 % de animais positivos, com ttulos entre 64 e 1.024, indicando a presena do agente em nvel reduzido. 22

Labruna et al. (2009) reportaram dois casos clnicos naturais de Febre Maculosa das Montanhas Rochosas em ces no Brasil, confirmados por soroconverso e anlise molecular, que foram resolvidos aps tratamento com doxiciclina.

A deteco ou o isolamento de rickttsias tambm permite estabelecer as delimitaes de reas endmicas. Em carrapatos, a pesquisa da presena de rickttsias pode ser feita por teste de hemolinfa, imunofluorescncia direta (IFD), ELISA, imuno-histoqumica e reao em cadeia da polimerase (PCR) (GALVO et al., 2005).

A presena do agente etiolgico estabelecido numa rea de transmisso para FMB ser baseada na confirmao de um caso atravs do critrio laboratorial no local de investigao e na realizao de inqurito sorolgico nos hospedeiros primrios, atravs de colheita de sangue e utilizao da tcnica de IFI com antgenos de Rickettsia bellii e Rickettsia rickettsii, realizada pelos laboratrios de referncia ou pesquisa (PINTER et al., 2004).

2.5 MTODO DE COLETA DE CARRAPATOS

Garcia (1962) descreveu o mtodo para coleta de carrapatos, como base na presena de dois quimiorreceptores sensveis ao estmulo por CO2, encontrados no rgo de Haller (localizado na face dorsal do tarso no primeiro par de pernas dos carrapatos) (STEULLET e GUERIN, 1992). Labruna et al. (2007) durante a realizao de pesquisas acarolgicas, observaram a ocorrncia de infestaes humanas por Amblyomma dubitatum, executando trabalhos com armadilhas de gelo seco no campo; sugerindo a possibilidade de que a sublimao do gelo seco, em gs CO2, tenha um efeito excitatrio sobre estes carrapatos, resultando em maior agressividade para os seres humanos.

Apesar de alguns fatores (atividade sazonal, densidade de infestao, umidade e temperatura limiar de ativao, disperso do CO2 por fatores ambientais e aspectos fisiolgicos dos ixoddeos) interferirem na variabilidade do mtodo, a utilizao das armadilhas de CO2 mostrou-se sensvel para a coleta de todos os estgios de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum nos habitats de mata ciliar, validando o procedimento para reas endmicas com casos humanos de FMB (SOUZA, 2003). 23

2.6 IDENTIFICAO TAXONMICA DOS CARRAPATOS

Segundo Barros-Battesti et al. (2006), no que se refere ao Neotrpico, as chaves dicotmicas disponveis para adultos do gnero Amblyomma so: Boero (1957), com espcies da Argentina; Arago e Fonseca (1961), uma das primeiras chaves para espcies do Brasil; Fairchild et al. (1966), com espcies do Panam; Jones et al. (1972), com todas as espcies do hemisfrio ocidental e Guimares et al. (2001), com espcies brasileiras.

Martins et al. (2010) descreveram a morfologia do estgio ninfal, atravs da microscopia eletrnica de varredura, de 15 espcies do gnero Amblyomma que ocorrem no Brasil.

Famadas et al. (1997); Amorim e Serra-Freire (1999a,b) e Serra-Freire e Mello (2006) descreveram a morfologia e elaboraram chaves dicotmicas para identificao de larvas do gnero Amblyomma e para as espcies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, com base na quetotaxia do idiossoma, palpos, rgo de Haller e demais estruturas.

2.7 TESTE DE HEMOLINFA

O teste de hemolinfa de carrapatos (Figura 6) indicado para deteco de rickttsias em carrapatos adultos infectados, natural e experimentalmente, e oferece condies para uma rpida identificao colorimtrica dos grupos antignicos aos quais estas bactrias pertencem. Sendo um mtodo econmico e rpido para deteco do grupo de rickttsias em carrapatos adultos (BURGDORFER, 1970).

Vrios pesquisadores (LEMOS et al., 1997b; HORTA, 2002; SANGIONI, 2003; LABRUNA et al., 2004; GUEDES et al., 2005; SANGIONI et al., 2005; ESTRADA et al., 2006; PACHECO et al., 2007; SILVEIRA et al., 2007; PETERKA, 2008; VIANNA et al., 2008; PACHECO et al., 2009; GUEDES, 2009; VERONEZ et al., 2010) utilizaram este teste, que permite a visualizao de bactrias gram-negativas na hemolinfa, como triagem de carrapatos infectados por microrganismos sugestivos para Rickettsia, visando posterior confirmao de amostras positivas por mtodos moleculares.

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Figura 6 - Rickettsia ricketsii em hemolinfa de Amblyomma spp. (colorao pelo mtodo de Gimenez). Courtesy of the Center for Disease Control and Prevention (http://www.cdc.gov/).

2.8 ENSAIOS IMUNOLGICOS

Teste Imunoenzimtico Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay - ELISA

O teste de ELISA consiste em uma tcnica precisa, baseada na reao antgenoanticorpo com alta afinidade e sensibilidade na deteco de compostos proteicos, nos quais a presena de bactrias ou protenas bacterianas se encaixa perfeitamente. Os imunoensaios possuem uma srie de variveis quanto ao tipo de ensaio que mais se adqua a cada situao (CROWTHER, 2009).

Os testes de ELISA so comumente utilizados para diagnstico de espcies de Rickettsia, usando anticorpos IgM ou IgG produzidos pelo hospedeiro, com base nas propriedades de ligao antgeno-anticorpo. Neste caso, antgenos lipopolissacardeos (LPS) que so sorologicamente imuno-dominantes (HARLOW e LANE, 1988).

Testes imunoenzimticos (ELISA) foram tambm aplicados para a deteco de rickettsioses (MANSUETO e MICELLI, 1980). 25

A clonagem molecular, o sequenciamento de nucleotdeos, a expresso da protena de 56 kDa de Rickettsia tsutsugamushi e a avaliao do potencial diagnstico da protena recombinante foram reportados em comparao de resultados obtidos atravs de imunoensaioenzimtico recombinante (ELISA) com os resultantes do teste de

imunofluorescncia padro. Este estudo indicou que o ELISA recombinante foi significativamente sensvel e especfico tanto para deteco de IgM como para IgG, em soros de pacientes humanos analisados (KIM et al., 1993).

Diagnstico precoce em amostras de soro de pacientes humanos, para Rickettsia tsutsugamushi, foi estabelecido utilizando-se a deteco colorimtrica (baseada em ELISA) de DNA rickettsiceo, atravs do Nested PCR (SHIEH et al., 1996).

Eletroforese em gel e Western-blot foram empregados para identificao e caracterizao em rickttsias, onde a protena recombinante ou as rickttsias purificadas em gradiente de renographin foram separadas em gel 12 % de poliacrilamida e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A anlise Western-blot realizou-se utilizando o anticorpo Penta-His (1:1000) ou o anticorpo PLD de camundongo (1:500), produzido e purificado. Aps a lavagem, as manchas foram incubadas com anticorpos anti-camundongo marcados com peroxidase (1:1000) e detectados por quimioluminescncia (RENESTO et al., 2003).

Os imunoensaios mais utilizados hoje so: ELISA, baseado na marcao com enzimas; o RIA, com radioistopos como marcao; Western Blot, que se baseia na localizao da protena (antgeno) por anticorpos aps corrida em gel de eletroforese e transferncia para membrana; Imunofluorescncia, com uso de marcadores fluorescentes para os anticorpos, os strips e a imunolocalizao in situ, que permite estudos de desenvolvimento celular e tecidual, capazes de sinalizar o aparecimento das protenas na morfognese vegetal ou animal (DUARTE et al., 2006b).

Tvora et al. (2007) em um estudo de validao comparativo entre as tcnicas ELISA e RIFI para diagnosticar Leishmania sp., relataram que a RIFI um bom teste confirmatrio, podendo ser utilizado como contraprova do ELISA que por sua vez um bom teste para triagem, recomendando a associao dos dois testes em casos positivos no ELISA.

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Spolidorio et al. (2010) caracterizaram municpios endmicos para seis espcies de Rickettsia que so presentes no Brasil (R. rickettsii, R. parkeri, R. felis, R. amblyommii, R. rhipicephali e R. bellii) no estado do Esprito Santo, utilizando PCR, RIFI e ELISA, em amostras de sangue coletadas de humanos, caninos e equinos.

Para o diagnstico de Rickettsia conorii, regies OmpA1350-1784, OmpB801-1269 e OmpB1227-1634 foram selecionadas de protenas truncadas, como antgenos candidatos para diagnstico por ELISA, usando soros controle. Os resultados de trs antgenos por ELISA foram comparados com os resultados obtidos por um kit comercial de ELISA que continha todos os antgenos OmpA e OmpB de R. conorii. Para esta anlise, 40 amostras de soro colhidas de pacientes febris e de controles no infectados foram testadas. Dos 20 soros de pacientes, os resultados dos testes foram positivos para R. conorii com o kit comercial e 18 amostras mostraram-se positivas pelo ELISA usando OmpA1350-1784 (uma sensibilidade de 90 %). A especificidade do ELISA foi de 100 %, onde todas as 20 amostras de soro controlenegativo tambm foram negativas usando o kit comercial. A sensibilidade do teste ELISA usando OmpB801-1269 e OmpB1227-1634 foi de 90 % e 95 %, respectivamente. A especificidade do OmpB801-1269 e OmpB1227-1634 foi de 100 % e 95 %, respectivamente. Esses resultados sugerem que as regies especficas do OmpA e OmpB efetivamente detectam anticorpos contra R. conorii, e os antgenos truncados recombinantes podem ser usados para o desenvolvimento de ferramentas de diagnstico para rickettsioses (DO et al., 2009).

2.9 ENSAIOS MOLECULARES

Reao em cadeia pela polimerase (PCR)

A PCR tem sido utilizada para deteco de rickttsias em triturados brutos de carrapatos e, quando seguida pelo sequenciamento gnico, permite identificao e anlise filogentica de diferentes espcies de rickttsias. Atravs da PCR, podem ser avaliados vrios genes especficos das rickttsias, como o 16S rRNA, o gltA (citrato sintase), encontrado em todas as espcies de rickttsias (LABRUNA et al., 2004) e os genes que codificam as protenas OmpA e OmpB, importantes na patogenicidade das rickttsias SFG.

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A PCR foi aplicada na amplificao do DNA de R. rickettsii, R. conorii, R. japonica, R. typhi, R. prowazekii, R. africae, R. felis, R. helvetica, R. slovaca e O. tsutsugamushi, geralmente do sangue perifrico, crosta de coagulao, ou plasma, mas ocasionalmente de tecido fresco, congelado ou embebido em parafina ou ainda em vetores artrpodes de pacientes. Para todas as Rickettsia sp. patognicas, o gene lipoproteico que codifica a protena de 17 kDa o alvo principal, empregando os primers CATTACTTGGTTCTCAATTCGGT e GTTTTATTAGTGGTTACGTAACC, que ampliam um fragmento de 231 pares de base. A sntese do citrato, 16S rRNA, e o gene OmpA tambm foram ampliados diagnosticamente com a Rickettsia sp., identificados tanto pela anlise polimrfica da extenso do fragmento de restrio (RFLP), utilizando Alu I e Xba I, ou sequenciamento de produto PCR. Apesar do PCR ser uma boa ferramenta para diagnstico, a contaminao de DNA ou do PCR, a produo insuficiente de DNA nas preparaes das amostras e a presena de inibidores de PCR como a quitina ou heme na preparao do DNA podem acarretar problemas com falsos positivos (BOYER, 2004).

Tendo em vista a informao de que existe competio entre diferentes rickttsias dentro de um mesmo vetor (NASCIMENTO e SCHUMAKER, 2004) e assim, a presena de rickttsias no patognicas em uma populao de carrapatos pode minimizar a transmisso das rickttsias patognicas (LABRUNA et al., 2004), a PCR visa identificao de Rickettsia spp. pela amplificao de fragmento do gene gltA, especfico das rickttsias, e as amostras positivas para esse gene so submetidas amplificao de gene rOmpA, de maneira a identificar rickttsias SFG (SANTOS, 2007).

Horta (2002) delineou estudo para comprovao indireta de deteco de rickttsias em humanos e animais e, diretamente em carrapatos Amblyomma cajennense, obtendo reao positiva de IFI em 31,2 % e 77,3 % dos soros de ces e equinos, respectivamente. Para confirmao de infeco natural dos carrapatos adultos utilizou o teste de hemolinfa, que se revelou insatisfatrio, e submeteu larvas, ninfas e adultos de A. cajennense tcnica de PCR. As reaes resultaram na amplificao de um fragmento (230 pb) do gene codificador da protena 17 kDa, somente em adultos (4,7 %) e em larvas (1,1 %). No foi possvel a amplificao de nenhum fragmento de outros genes testados (citrato sintase, OmpA e OmpB). Os produtos amplificados pela PCR de dois carrapatos adultos e de quatro larvas foram sequenciados, apresentando nos adultos 100 % de similaridade com Rickettsia felis e nas 28

larvas 99,4 % a 100 % de similaridade com Rickettsia rickettsii, Rickettsia conorii, Rickettsia parkeri e Rickettsia peacockii.

luz da filogenia, o estabelecimento de grupos orthologous (OGs), de regies de leitura aberta (ORFs), distinguir os genes de ncleo das rickttsias e outros grupos de genes especficos (classe 1 OGs ou C1OGs) daqueles distribudos indiscriminadamente em toda a rvore das rickettsioses (classe 2 OG ou C2OGs). Foi determinada uma relativa conservao e distribuio de 14.354 ORFs previstos a partir de 10 genomas de rickettsioses atravs de uma robusta estimao filogentica. Os dados, disponveis em PATRIC (PathoSystems Resource Integration Center), fornecem novas informaes para desanuviar os dilemas associados com a patognese das rickttsias, ampliando o leque de possibilidades de diagnstico, vacinas e alvos teraputicos (GILLESPIE et al., 2008).

As Rickttsias SFG associadas aos carrapatos vetores desenvolveram um mecanismo molecular eficiente, sincronizando a sua replicao com a fisiologia do seu carrapato hospedeiro. Os mecanismos moleculares implicados na adaptao das Rickttsias SFG para diferentes condies de hospedeiros e na reativao de virulncia so desconhecidos, mas sabe-se que os SpoT genes so reguladores do metabolismo celular global, respondendo aos mecanismos de estresse e reforando a sobrevivncia da clula bacteriana (SOCOLOVSCHI et al., 2009).

Com o objetivo de relatar a primeira deteco molecular de R. rickettsii em Rhipicephalus sanguineus naturalmente infectado no Rio de Janeiro, Brasil, carrapatos foram coletados de ces, procedentes de uma regio rural do municpio de Resende, onde ocorreram cinco casos humanos de FMB em 2006. Todos os carrapatos foram identificados e separados de acordo com estgio, espcie e sexo para a extrao de DNA utilizando-se o kit comercial QIAamp DNA (QIAGEN ). O DNA foi submetido tcnica de PCR utilizando quatro conjuntos de iniciadores para a amplificao dos genes: Rr190.70p/Rr190.602n (OmpA, 532bp), BG1-21/BG2-20 (OmpB, 650bp), Tz15/Tz16 (gene que codifica a protena de 17 kDa de 246bp) e RpCS.877p/RpCS.1258n (gltA, 381bp). Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em gel agarose 1 %, corados com brometo de etdio e visualizados sob luz ultravioleta, e aqueles que apresentaram bandas amplificadas foram purificados, utilizando-se o kit comercial QIAquick , e sequenciados pelo ABI PRISM. As sequncias nucleotdicas 29

foram geradas usando Bioedit, editado em software e comparados os correspondentes homlogos com as sequncias disponveis atravs do GenBank, utilizando Discontiguous Mega Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Confirmou-se R. rickettsii (GenBank FJ356230) no sequenciamento de apenas um espcime adulto de carrapato R. sanguineus. A caracterizao molecular de R. rickettsii em exemplar de carrapato R. sanguineus confirma que esta espcie pode ter importante papel na transmisso de R. rickettsii para humanos no territrio brasileiro (CUNHA et al., 2009).

A infeco de gambs (Didelphis aurita) por Rickettsia rickettsii foi avaliada quanto ao seu papel como hospedeiros amplificadores para transmisso horizontal de R. rickettsii aos carrapatos Amblyomma cajennense. Mediante extrao de DNA, seguida pela Reao em cadeia da polimerase em tempo real (Real-Time PCR) com alvo para o gene gltA e deteco de anticorpos reativos para R. rickettsii por ensaio de IFI, demonstraram que R. rickettsii foi capaz de infectar gambs sem causar a doena nos mesmos, e estes desenvolveram uma bacteriemia capaz de causar infeco em cobaias e carrapatos, embora a taxa de infeco nos animais tenha sido baixa. Ficou evidenciado que gambs desenvolvem longa bacteriemia por R. rickettsii, podendo funcionar como hospedeiros amplificadores para a infeco de carrapatos A. cajennense por R. rickettsii, com alguma importncia epidemiolgica na histria natural de R. rickettsii no Brasil (HORTA et al., 2009).

Souza et al. (2009) avaliaram a infeco de capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) por Rickettsia rickettsii e seu papel como hospedeiro amplificador para a transmisso horizontal de R. rickettsii ao carrapato Amblyomma cajennense, mediante extrao de DNA das amostras de carrapatos, seguida por real-time PCR com alvo para o gene gltA de Rickettsia e deteco de anticorpos para R. rickettsii por IFI em amostras de soro sanguneo de capivaras e cobaias. Como resultado, 20 a 35 % dos carrapatos alimentados nos grupos de capivaras testados tornaram-se infectados, demonstrando que R. rickettsii foi capaz de infectar capivaras sem causar danos clnicos ao seu hospedeiro, mas induzindo a uma bacteriemia capaz de causar infeco em cobaias e carrapatos, indicando que Hydrochoerus hydrochaeris atua verdadeiramente como hospedeiro amplificador de R. rickettsii para Amblyomma cajennense no Brasil.

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Moraes-Filho et al. (2009a) avaliaram a infeco por rickttsias em ces e seus carrapatos em uma rea endmica para FMB, na Regio Metropolitana de So Paulo, onde se presume que o carrapato Amblyomma aureolatum seja o vetor desta doena. Foram coletados de ces, carrapatos das espcies Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma aureolatum, Amblyomma longirostre e Amblyomma sp., sendo estes submetidos a PCR com alvo para genes de rickttsias, com resultados de 3,1 % de carrapatos A. aureolatum infectados por Rickettsia bellii e 1,3 % de carrapatos R. sanguineus infectados por Ricketttsii rickettsii. Atravs da RIFI detectaram a presena de anticorpos para R. rickettsii no soro de ces, com ttulos maiores ou iguais a 256, estabelecendo que Amblyomma aureolatum um vetor de R. rickettsii na Regio Metropolitana de So Paulo. Pela primeira vez no Brasil, relataram o papel de R. sanguineus na epidemiologia de R. rickettsii, corroborando com pesquisas anteriores feitas no Mxico e Estados Unidos, onde R. sanguineus tem sido implicado na transmisso de R. rickettsii aos humanos.

Zanetti (2009) utilizou com sucesso um PCR Quantitativo em Tempo Real (qPCR), para quantificar a replicao de rickttsias do Grupo da Febre Maculosa, em carrapatos Amblyomma americanum infectados naturalmente, demonstrando a eficincia destes ensaios qPCR para avaliao da carga de rickttsias no interior de clulas teciduais de glndulas salivares, intestinais e ovarianas de A. americanum, durante o repasto sanguineo e sua transmisso vertical. Em resumo, o qPCR foi validado para compreender a cintica de rickttsias em diferentes hospedeiros. A expanso do uso de qPCR para caracterizar o crescimento de patogenicidade reconhecida para rickttsias, em carrapatos A. americanum, e para determinar as taxas de replicao destas em diferentes linhagens celulares de carrapatos, sob as mesmas circunstncias, servir como valiosa abordagem para auxlio na elucidao da natureza patognica de rickttsias do Grupo da Febre Maculosa, e compreender melhor a ntima relao que algumas rickttsias guardam com espcies de carrapatos de diferentes gneros.

31

3. MATERIAL E MTODOS

3.1 reas de Estudo

3.1.1 Aspectos Fsicos / Territoriais / Geogrficos

O Municpio de Americana (Coordenadas Geogrficas de Latitude: 2244'21"S e Longitude: 4719'53"W) est localizado na regio Leste do Estado de So Paulo, integrando a regio Sudeste do Brasil (Figura 7). Est limitado ao Norte pelo municpio de Limeira, a Nordeste por Cosmpolis, a Oeste por Santa Brbara D'Oeste, ao Sul por Nova Odessa e a Leste por Paulnia. Sua extenso territorial possui uma rea total de 144 Km, com uma rea ocupada de 86 Km. Possui uma rea de expanso urbana de 45 Km (no ps-represa 32 Km e nos vazios urbanos 13 Km) (FELICIANO, 2008).

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Sobrado Velho Museu Histrico

Bosque das Nascentes

Carioba

Fazenda Palmeiras

Ribeiro Quilombo

Figura 7 - Carta Planimtrica do municpio de Americana, SP, com demarcao das reas de estudo.

Est inserido em uma exuberante bacia hidrogrfica composta por uma represa com rea de 13 Km (Represa do Salto Grande) e pelos Rios Piracicaba, Jaguari, Atibaia e Ribeiro Quilombo. Possui um clima tropical, com temperatura mdia anual mnima de 17,5 C e mxima de 26,1 C; precipitao pluvial mdia anual de 1.308,48 mm e mdia mensal de 109,09 mm; vento predominante Sudeste; relevo em depresso perifrica e altitude de 545 metros. Com uma populao de 203.283 habitantes, o municpio est dividido em dez reas de planejamento urbano e uma rea de preservao ambiental (APAMA), apresenta densidade demogrfica de 1.412 habitantes/Km e uma demografia duas vezes e meia maior que a Regio Metropolitana de Campinas (RMC), e oito vezes e meia superior a do estado de So Paulo (FELICIANO, 2009) (Figuras 8 e 9).

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Figura 8 - reas de Planejamento Urbano do municpio de Americana, SP.

Figura 9 - Sistema de reas Verdes do municpio de Americana, SP.

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O estudo foi realizado, segundo critrios epidemiolgicos da SUCEN, em reas de alerta e risco para FMB na cidade de Americana, SP. Durante as coletas de carrapatos, foram realizadas anotaes de dados ambientais da regio (temperatura - C; umidade relativa - % e coordenadas geogrficas por Global Position System ou GPS - altitude, latitude e longitude), alm de informaes sobre presena de equinos, ces e capivaras, ectoparasitismo animal e relatos de picadas de carrapatos pelos humanos.

3.1.2 Caracterizao das reas Epidemiolgicas

Foram utilizados os critrios preconizados pela SUCEN, para classificao de reas epidemiolgicas em trabalhos de vigilncia da FMB;

rea de Infestao:

De Risco:

Casos confirmados ou compatveis de FMB ou de outras doenas transmitidas por carrapatos.

Populao de vetores estabelecida: presena de hospedeiro primrio e condies naturais favorveis.

De Alerta:

Agente etiolgico estabelecido.

Sem notificao de casos confirmados ou compatveis de FMB.

Pesquisa de campo positiva para o gnero Amblyomma ou associada a condies ambientais favorveis.

Presena de hospedeiros primrios. 35

Frequncia humana significativa.

3.1.3 rea de Risco Sobrado Velho (Rio Jaguari)

Regio situada em zona rural do municpio de Americana, caracterizada por reas de mata ciliar na extenso do Rio Jaguari (Figura 11) e por reas agrcolas de plantio de cana-deacar. Existe uma populao de 350 moradores em colnias agrcolas e chcaras da regio. Houve registro de incidncia de quatro casos com dois bitos de FMB nesta rea, nos ltimos sete anos (Figura 10).

Nesta rea foram distribudas 130 armadilhas de CO2, atravs de 13 pesquisas acarolgicas, com periodicidade mensal e registro de dados de termohigrometria e de coordenadas geogrficas (Anexo 1). Durante as atividades, observou-se a presena de capivaras, gambs, equinos, bovinos, ces, gatos, aves domsticas e pssaros silvestres nas reas de pesquisa. O parasitismo humano por carrapatos frequente em moradores das colnias agrcolas e frequentadores de chcaras aos fins de semana.

Figura 10 Imagem area da regio do Sobrado Velho indicando local provvel de infeco de bito por FMB.

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Figura 11 rea de mata ciliar do Rio Jaguari na regio do Sobrado Velho, Americana/SP.

3.1.4 rea de Risco Carioba (Rio Piracicaba) Regio situada em zona periurbana do municpio de Americana, caracterizada por reas de mata ciliar na extenso do Rio Piracicaba e por reas industriais no limite geogrfico com o municpio de Limeira, onde houve registro de um caso positivo de FMB nos ltimos cinco anos (Figura 12). Existe uma frequncia mdia permanente de 150 trabalhadores na rea e uma populao de 2.500 moradores em bairro perifrico (Jardim Guanabara). Nas reas de mata ciliar existem vrios pontos de frequncia por pescadores (Figura 13).

Foram distribudas 150 armadilhas de CO2, atravs de 15 pesquisas acarolgicas, com periodicidade mensal e registro de dados de termohigrometria e de coordenadas geogrficas (Anexo 1). Durante as atividades, observou-se a presena de capivaras, equinos, ces e pssaros silvestres nas reas de pesquisa e permetro perifrico. O parasitismo humano por carrapatos frequente nas reas de pesqueiros.

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Figura 12 Imagem area de reas de mata ciliar e reas industriais na regio do Rio Piracicaba, indicando local provvel de infeco de caso positivo de FMB.

Figura 13 rea de pesqueiro do Rio Piracicaba com local provvel de infeco para FMB.

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3.1.5 rea de Risco Bosque das Nascentes

Regio situada em zona urbana do municpio de Americana, caracterizada por uma rea de bosque com um lago artificial abastecido por gua de nascente (Figura 14). frequentada como rea de lazer por 350 visitantes dirios e existe uma populao de 28.400 moradores nas reas de imediao do bairro Antonio Zanaga. Nunca houve registro de caso de FMB nesta rea nos ltimos sete anos, no entanto, situa-se muito prxima de outras reas com forte evidncia de risco (Carioba-Rio Piracicaba e Sobrado Velho-Rio Jaguari).

Foram distribudas 130 armadilhas de CO2, atravs de 13 pesquisas acarolgicas, com periodicidade mensal e registro de dados de termohigrometria e de coordenadas geogrficas (Anexo 1). Durante as atividades, observou-se a presena de capivaras, gambs, coelhos, aves domsticas e aves silvestres nas reas de pesquisa. O parasitismo humano por carrapatos frequente em crianas.

Figura 14 rea do bosque das nascentes com lago artificial.

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3.1.6 rea de Alerta Fazenda Palmeiras/IZ

Regio situada em zona periurbana do municpio de Americana, caracterizada por uma fazenda experimental do Instituto de Zootecnia (Centro de Pesquisa em Pecuria de Leite), com reas de pastagem prximas de um lago artificial com fragmento de mata (Figura 15). A fazenda possui trs famlias residentes e quinze funcionrios em atividades dirias. Existe uma populao de 4.500 moradores em conjuntos residenciais vizinhos (Jardim Mirandola e Jardim Boer). Nunca houve registro de casos de FMB nesta rea nos ltimos sete anos.

Foram distribudas 130 armadilhas de CO2, atravs de 13 pesquisas acarolgicas, com periodicidade mensal e registro de dados de termohigrometria e de coordenadas geogrficas (Anexo 1). Durante as atividades, observou-se a presena de capivaras, equinos, bovinos de leite, ces e pssaros silvestres nas reas de pesquisa. O parasitismo humano por carrapatos frequente em trabalhadores da fazenda e moradores dos bairros vizinhos.

Figura 15 - Fazenda experimental do Instituto de Zootecnia, com reas de pastagem prximas de lago artificial com fragmento de mata.

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3.1.7 rea de Alerta Museu Histrico (Rio Jaguari) Regio situada em zona periurbana do municpio de Americana, caracterizada por reas de mata ciliar na extenso do Rio Jaguari e pela presena de reas industriais no limite geogrfico do Museu Histrico. Existe uma frequencia constante de pescadores nesta rea de confluncia dos Rios Jaguari e Atibaia (Figura 16) e uma populao de 1.800 moradores em bairro perifrico desta regio (Conjunto Vista Bela). Nunca houve registro de casos de FMB nesta rea, nos ltimos sete anos; no entanto, este stio localiza-se muito prximo a um local provvel de infeco da rea de risco do Sobrado Velho.

Foram distribudas 130 armadilhas de CO2, atravs de 13 pesquisas acarolgicas, com periodicidade mensal e registro de dados de termohigrometria e de coordenadas geogrficas (Anexo 1). Durante as atividades, observou-se a presena de capivaras e pssaros silvestres nas reas de pesquisa. O parasitismo humano por carrapatos frequente em pescadores.

Figura 16 rea de confluncia dos Rios Jaguari e Atibaia para formao do Rio Piracicaba.

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3.1.8 rea de Alerta Ribeiro Quilombo Regio situada em zona urbana do municpio de Americana, caracterizada por reas de mata ciliar (Figura 17) em toda a extenso de 7.650 metros do Ribeiro Quilombo. Existe uma populao residente em reas limtrofes ao Ribeiro Quilombo, em torno de 2.500 moradores, nos bairros de Nova Americana, Residencial Guaicurus, Conserva, Chcara Machadinho, Jardim Colina e Vila Cordenonsi. Nunca houve registro de caso de FMB nestas reas nos ltimos sete anos.

Foram distribudas 160 armadilhas de CO2, atravs de 16 pesquisas acarolgicas, com periodicidade mensal e registro de dados de termohigrometria e de coordenadas geogrficas (Anexo 1). Durante as atividades, observou-se a presena de capivaras, ces e pssaros silvestres nas reas de pesquisa. Foram observados e identificados, ao longo da mata ciliar do Ribeiro Quilombo, sete grupos sociais familiares de capivaras (Figura 18), em uma populao total de 71 indivduos (03 machos adultos, 20 fmeas adultas, 20 fmeas jovens e 28 filhotes). O parasitismo humano por carrapatos frequente em moradores desta rea.

Figura 17 Trecho do Ribeiro Quilombo em rea urbana de Americana.

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Figura 18 Grupos de capivaras dispersos ao longo do Ribeiro Quilombo.

3.2 Coleta dos Carrapatos - Armadilha Atrativa de CO2 A tcnica utilizada foi modificada da empregada por Wilson et al.(1972) onde, em pontos distintos da mata ciliar, foram colocados 800 gramas de cubos de gelo seco em uma depresso rasa no solo e, acima desta, uma flanela branca medindo 1,0 m X 1,0 m com fita adesiva dupla face de 1 cm de largura, fixada nas bordas e nos quatro lados da flanela (Figura 19). O tempo de permanncia de cada armadilha foi de 1 hora. Os carrapatos de vida livre foram coletados por 830 armadilhas de CO2, mediante equipe de 4 capturadores devidamente paramentados por Equipamentos de Proteo Individual (EPIs - macaces de mangas longas e botas, ambos brancos, com a barra do macaco presa bota com fita adesiva larga). As coletas foram realizadas semanalmente das 9 as 12h (SOUZA, 2003).

Os carrapatos foram retirados das flanelas com pina e acondicionados em embalagens plsticas (Figura 20), vedadas com tampa com pequenos furos e encaminhadas no mesmo dia, com o boletim de campo preenchido, ao Laboratrio de Biotecnologia Vegetal do Instituto de Zootecnia de Nova Odessa, SP.

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Dos carrapatos coletados, todos foram destinados identificao taxonmica e os exemplares das espcies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum submetidos ao teste de hemolinfa, sendo posteriormente acondicionados em microtubos de 1,5 mL, devidamente identificados, e armazenados em freezer a 80 C para anlise comparativa pelo teste de Elisa e extrao de DNA para anlise pela PCR.

Figura 19 - Armadilha de CO2.

Figura 20 - Coleta de Carrapatos.

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3.3 Identificao Taxonmica dos Carrapatos

Os carrapatos coletados foram examinados em microscpio estereoscpico, com iluminao incidente, sendo os adultos identificados, sexados e classificados

taxonomicamente segundo as chaves dicotmicas traduzidas e modificadas por BarrosBattesti et al. (2006), baseadas em Arago e Fonseca (1961), Jones et al. (1972) e Guimares et al (2001).

As formas imaturas foram identificadas atravs de critrios morfolgicos, baseados na chave dicotmica para identificao de larvas de espcies do gnero Amblyomma (SERRAFREIRE e MELLO, 2006) e pela chave de identificao taxonmica para ninfas de espcies de Amblyomma, segundo Martins (2009) e Martins et al. (2010).

3.4 Extrao de Glndulas Salivares das Amostras de Carrapatos Adultos

C
Figura 21 - Fixao de carrapato adulto para extrao de glndulas salivares (a); (b); (c); (d).

D 45

As glndulas salivares de carrapatos desempenham importante papel na disseminao de patgenos aos hospedeiros (LEE e CHAE, 2010), onde so normalmente armazenados e transmitidos para a corrente sangunea dos vertebrados durante a alimentao dos mesmos (PAROLA et al., 2005; ITNAN et al., 2010).

Visando avaliar o potencial de infectividade para Rickettsia, cada carrapato adulto foi descongelado, fixado individualmente em placa de Petri com uma gota de adesivo cianoacrilato (Figura 21) e, em seguida, imerso em PBS (soluo fosfato tamponada).

C
Figura 22 - Extrao de glndulas salivares de carrapato adulto. (a); (b); (c); (d).

Com duas agulhas 25x8 estreis (Figura 22a), realizaram-se incises ao longo das margens de seu escudo dorsal (Figura 22b), visando abertura com exposio de seu aparelho digestivo (Figura 22c). Procedeu-se identificao, separao e remoo das glndulas salivares (Figura 22d), colocando-as em tubos de 2 mL tipo eppendorf com 30 a 50 L de TE (Tris HCl 10mM, EDTA 1mM, pH 7,4). 46

Este procedimento, bem como o teste de hemolinfa e ELISA foram conduzidos no Laboratrio de Biotecnologia Vegetal, do CPDNAP, Instituto de Zootecnia.

3.5 Rastreamento da Infeco por Rickettsia

3.5.1 Teste de Hemolinfa de Carrapatos

O fato desta tcnica pouco danificar os exemplares de carrapatos permite que os infectados sejam utilizados para identificao das espcies de rickttsias encontradas, atravs de outros ensaios laboratoriais, servindo como excelente ferramenta para triagem diagnstica de carrapatos adultos infectados.

C
Figura 23 - Teste de Hemolinfa (a); (b); (c); (d).

No laboratrio, de cada exemplar de carrapatos adultos provenientes das pesquisas acarolgicas, seccionou-se a poro distal de uma das patas (Figura 23a) com recuperao de 1-2 gotas de hemolinfa (Figura 23b) para aplicao em lmina (Figura 23c). 47

As lminas passaram pelo processo de secagem em temperatura ambiente por 12 horas, foram coradas pelo mtodo de Gimnez (1964) e examinadas ao microscpio ptico utilizando-se objetiva de imerso (100x), para observao de microrganismos semelhantes a Rickettsia sp. (Figura 23d).

3.5.2 ELISA

De cada amostra de carrapatos, 0,5 g (10 a 12 adultos) foi macerada em nitrognio lquido, ressuspendida em 5 mL de PBS (Phosphate Buffer Solution), centrifugada 10 minutos a 13.000 rpm e o sobrenadante diludo 10 vezes antes de ser colocado na microplaca de ELISA. O soro de coelho anti-rickttsia foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Marcelo Bahia Labruna, do Departamento de Medicina Veterinria Preventiva e Sade Animal, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo.

A titulao dos soros e a quantificao dos antisoros foram realizadas segundo o mtodo de PTA-ELISA (plate trapped antigen enzyme linked immunosorbent assay) (CROWTHER, 2009). A sensibilizao com as amostras foi feita atravs de incubao por 2 horas a 37 C, com a suspenso dos carrapatos. A placa foi bloqueada com BSA 1 % (soro albumina bovina, frao V) por 1 hora. Foi seca e incubada com o soro de coelho antiRickettsia sp., diludo 1:10.000 em PBS. Aps este perodo, a placa foi lavada duas vezes com soluo de PBS-TG (PBS contendo 0,1 % de tween 20 e 0,25 % de gelatina) e incubados com conjugado anti-coelho, diludo 1:1.000, marcado com peroxidase, por 1 hora a 37 C. As placas foram novamente lavadas com PBS-TG e o ELISA foi revelado com Sure Blue (KPL), e bloqueado com soluo HCl 0,1 N. As leituras foram realizadas em leitor de microplacas a 450 nm. (Bio-Tek Instruments, X-Chek software). O controle positivo (100 % de reao) foi obtido com soro anti-rickttsia e anti-soro de coelho, revelados com Sure Blue (DUARTE et al., 2006a).

Os resultados positivos foram confrontados com as demais tcnicas, para anlise de concordncia em relao de co-positividade.

48

3.5.3- Extrao de DNA e PCR

As etapas de extrao de DNA e

PCR foram conduzidas no Laboratrio de

Parasitologia do Prof. Dr. Marcelo Bahia Labruna, do Departamento de Medicina Veterinria Preventiva e Sade Animal, Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, USP.

3.5.3.a Extrao de DNA

A extrao de DNA foi realizada atravs da tcnica de isotiocianato de guanidina (GT) atravs do seguinte protocolo: amostras de glndulas salivares, de cada exemplar de carrapato, foram acondicionadas individualmente em microtubos com 150 L de TE (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), homogeneizadas por 30 segundos em agitador do tipo vrtex, acrescidas de 450 L de isotiocianato de guanidina (5mol/L) e incubadas por dez minutos temperatura ambiente. Em seguida, foram adicionados 100 L de clorofrmio, submetidos a vrtex e descanso de 2 minutos. Posteriormente, por centrifugao a 12.000 rpm por 5 minutos, a fase aquosa (sobrenadante) foi separada e transferida para outro microtubo ao qual se acrescentaram 600 L de isopropanol, para insolubilizao do DNA. As amostras foram levadas ao freezer por 2-18 horas. Aps esse perodo foram centrifugadas sob refrigerao (4 C) a 12.000 rpm por 15 minutos. Em seguida, foi desprezado o sobrenadante e acrescentado 800 L de etanol 70 %, seguido pela centrifugao a 12.000 rpm por cinco minutos a 4 C. O sobrenadante foi novamente desprezado e o sedimento submetido em banho-maria (termobloco) por 15 minutos a 56 C. Posteriormente, o sedimento foi ressuspendido com 30 L de TE, homogeneizado manualmente e levado ao banho-maria (termobloco) a 56 C por 15minutos e armazenado sob congelamento a -20 C.

3.5.3.b Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

A presena de Rickettsia spp. das amostras coletadas foi avaliada atravs da amplificao de um fragmento de 401 pb do gene citrato sintase (gltA), presente em todas as espcies de Rickettsia, utilizando-se um par de oligonucleotdeos iniciadores (primers), denominados de CS-62 (GCA AGT ATC GGT GAG GAT GTA AT) e CS-462 (CTT CCT TAA AAT TCA ATA AAT CAG GAT G) (LABRUNA et al., 2004). 49

O gene da membrana externa da protena A de Rickettsia (ompA) foi utilizado para a confirmao da infeco por Rickettsia do Grupo da Febre Maculosa (GFM), atravs da amplificao de um fragmento de 532pb do gene, empregando-se oligonucleotdeos iniciadores Rr190.70 (ATGGCGAATATTTCTCCAAAA) e Rr190.701

(GTTCCGTTAATGGCAGCATCT) (REGNERY et al., 1991).

Para os dois genes, a reao de 20 L foi otimizada a partir da reao padro com 1X tampo, 0,25 M de cada primer, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, 0,5 U de Taq DNA polimerase e 50 ng de DNA. Para cada reao, foi includo um tubo controle negativo (gua). A termociclagem foi ajustada a partir das seguintes condies: desnaturao inicial a 97 C por 2 minutos; 40 ciclos de desnaturao a 95 C por 30 segundos; anelamento a 64 C (gtlA) ou 62 C (rOmpA) por 30 segundos e extenso a 72 C por 30 segundos; e extenso final a 72 C por 5 minutos.

A visualizao dos produtos amplificados foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 1,5 %, em cuba horizontal com tampo de corrida TBE 0,5X (0,045 M Tris-borato e 0,001 EDTA pH 8,0). O gel submetido voltagem constante de 6 a 7 Volts/cm durante 40 minutos. Posteriormente, o gel foi corado por imerso em soluo de brometo de etdeo a 0,5g/mL por 20 minutos, observado em transiluminador ultravioleta e digitalizado em programa de anlise de imagens. As bandas foram comparadas ao padro de peso molecular de 100 pb.

50

4. RESULTADOS E DISCUSSO

Considerando o delineamento inteiramente ao acaso em esquema fatorial, a avaliao de infestaes prevalentes de carrapatos por mtodo de captura (armadilha de CO2), durante 12 meses de atividade (uma coleta mensal em cada rea estudada, sendo trs reas de alerta e trs reas de risco para FMB) foi satisfatria, com resultados que permitiram observar a sazonalidade das espcies prevalentes na regio (A. cajennense e A. dubitatum) e diagnosticar nveis de infeco por Rickettsia spp. em amostras de carrapatos.

De Julho (2009) a Junho (2010) foram realizadas 83 pesquisas acarolgicas, que resultaram em 3.548 carrapatos adultos de vida livre (1.649 machos e 1.899 fmeas) e 21.565 estgios imaturos (7.629 ninfas e 13.936 larvas) coletados nas seis reas estudadas (Tabela 3).

Tabela 3 - Resultado numrico de pesquisas acarolgicas realizadas em reas de vigilncia epidemiolgica de FMB, em Americana/SP. Amblyomma cajennense Adultos Macho 1094 Fmea 1261 Amblyomma dubitatum Adultos Macho 555 Fmea 638

Ninfas

Larvas

Ninfas

Larvas

4265

6122

3364

7814

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4.1 Identificao Taxonmica dos Carrapatos

Os carrapatos adultos coletados atravs de 830 armadilhas de CO2 (Figura 24) foram identificados por espcie (BARROS-BATTESTI et al., 2006), resultando no total de 2.355 espcimes de Amblyomma cajennense (1.094 machos e 1.261 fmeas) e 1.193 espcimes de Amblyomma dubitatum (555 machos e 638 fmeas).

A
Figura 24 Fmea de Amblyomma cajennense (A) e Amblyomma dubitatum (B).

Figura 25 - Ninfa de Amblyomma cajennense. A: Captulo dorsal; barra: 20m. B: Captulo ventral; barra: 20m. C: Escudo; barra: 30m. D: Coxas I-IV; barra: 30m. (MARTINS et al., 2010).

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Foram identificados 4.265 estgios ninfais de Amblyomma cajennense (Figuras 25) e 3.364 estgios ninfais de Amblyomma dubitatum (Figuras 26) (Tabela 3).

Figura 26 - Ninfa de Amblyomma dubitatum. A: Captulo dorsal; barra: 20m. B: Captulo ventral; barra: 30m. C: Escudo; barra: 100m. D: Coxas I-IV; barra: 30m. (MARTINS et al., 2010).

Figura 27 Larvas de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum (aumento de 30X).

53

Os estgios imaturos (larvas) coletados foram observados quanto diferenciao morfolgica do maior tamanho corporal, de contorno mais ovalado em Amblyomma

dubitatum, em comparao com Amblyomma cajennense (Figura 27), sendo identificadas 6.122 larvas de Amblyomma cajennense e 7.814 larvas de Amblyomma dubitatum (Tabela 3).

4.2 Rastreamento da Infeco por Rickettsia

4.2.1 Teste de Hemolinfa de Carrapatos

Analisaram-se 702 amostras de carrapatos adultos pelo teste da hemolinfa (353 amostras de Amblyomma cajennense e 349 amostras de Amblyomma dubitatum). Os testes de hemolinfa resultaram em 17,5 % (123/702) de carrapatos contendo estruturas indicativas de Rickettsia spp. em seus hemcitos, com resultados por espcie de 16,4 % (58/353) para Amblyomma cajennense e de 18,6 % (65/349) para Amblyomma dubitatum. Estes resultados foram superiores aos obtidos por Pacheco et al. (2009) de 15,1 % para A. dubitatum e inferiores aos de Estrada et al. (2006) de 36 % para esta espcie.

Confrontando-se os resultados das amostras do teste de hemolinfa com gltA-PCR obtivemos 81,9 % (575/702) de resultados concordantes, 17 % (119/702) de falsos positivos e 1,1 % (8/702) de falsos negativos (Anexo 2).

4.2.2 ELISA

Nas figuras 28 e 29, verificamos que as amostras, oriundas de pesquisas acarolgicas (Tabela 4), apresentaram resultados semelhantes queles do teste de hemolinfa, onde os negativos para hemolinfa e PCR foram tambm negativos no PTA-ELISA.

Na figura 29, vemos a porcentagem de ligao da reao antgeno/anticorpo, comparado com o controle 100 %, onde a reao acontece com o soro de coelho antirickttsia e o conjugado anti-coelho. As amostras consideradas negativas apresentaram no mximo 22,9 % de ligao e, segundo Sutula et al. (1986), amostras com resultados duas vezes o valor negativo podem ser consideradas positivas, neste caso, amostras acima de 45,8 % de ligao. 54

Figura 28 - Titulao em PTA-ELISA de pesquisas acarolgicas, com resultado em densidade tica a 450 nm, onde as amostras de cor vermelha foram negativas no ELISA, na Hemolinfa e no PCR e as amostras de cor verde, foram positivas na Hemolinfa e/ou no PCR.

Figura 29 - Grfico mostrando a porcentagem de ligao antgeno/anticorpo sobre o total de ligao do teste (100%), representado por %L/Lt, nas pesquisas acarolgicas realizadas. As pesquisas 65 e 36 mostraram resultados negativos, com % inferior a 50 %.

Os testes preliminares de ELISA, embora no tenham sido feitos com todas as amostras, apresentaram resultados promissores como indicadores em triagem inicial, com a vantagem de serem mais rpidos e menos trabalhosos que o teste da hemolinfa. No entanto, haver necessidade de submet-los a protocolos de validao para efetividade de seus resultados laboratoriais.

55

4.2.3 - Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

As amostras de DNA, extradas de carrapatos coletados em pesquisas acarolgicas, foram confirmadas por PCR e diferenciadas quanto ao gnero Rickettsia (Figura 30) e quanto s espcies de rickttsias do Grupo da Febre Maculosa (GFM).

Baseados nos estudos de Sangioni (2005), onde a prevalncia mdia de infeco dos carrapatos por rickttsias SFG foi de 1,43 % em Amblyomma cajennense, analisaram-se 2197 amostras de carrapatos adultos por PCR, com resultado de 4,7 % (104/2197) de amostras positivas para gltA-PCR (Figura 30). Analisando os resultados por espcie, encontramos 1,6 % (18/1157) de positividade para Amblyomma cajennense e 8,3 % (86/1040) para Amblyomma dubitatum. Estes resultados para A. dubitatum foram superiores aos 5,3 % de Estrada et al. (2006) e inferiores aos 44,9 % de Pacheco (2007) e 23,8 % de Pacheco et al. (2009).

Figura 30 Resultados da reao de gltA-PCR em gel de agarose 1,5 %, realizado com primers CS-62/CS-462, em amostras de carrapatos de reas de risco de Americana, com amplificao de fragmentos de 401 pb do gene citrato sintase (gltA), demonstrando controle positivo (C+), controle negativo (C-) e reaes positivas (4, 5, 6, 10, 11, 17, 20, 21, 22, 26 e 27).

56

As 104 amostras positivas para gltA-PCR foram analisadas pela ompA2-PCR, na qual todas as amostras foram negativas (Anexos 3, 4, 5 e 6) e submetidas ao sequenciamento de DNA, para identificao das espcies de Rickettsia.

Tabela 4 - Resultados comparativos entre teste de hemolinfa, ELISA e gltA-PCR em amostras de carrapatos procedentes de pesquisas acarolgicas. Pesquisa Acarolgica 31 40 49 50 62 71 74 Teste de Hemolinfa Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Positivo Positivo ELISA Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo gltA-PCR Negativo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo

4.3 Distribuio Sazonal de Vetores

Tabela 5 - Total de carrapatos coletados (adultos, ninfas e larvas) de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, no perodo de julho/2009 a junho/2010. Ms Julho/2009 Agosto/2009 Setembro/2009 Outubro/2009 Novembro/2009 Dezembro/2009 Janeiro/2010 Fevereiro/2010 Maro/2010 Abril/2010 Maio/2010 Junho/2010 Total Amblyomma cajennense Adultos 229 34 174 553 154 534 103 132 105 150 136 51 2355 Ninfas 432 409 869 473 167 390 8 3 43 254 183 1034 4265 Larvas 861 357 75 396 4 0 2 2 4 1605 1649 1167 6122 Amblyomma dubitatum Adultos 104 159 102 99 76 43 41 19 72 133 229 116 1193 Ninfas 295 284 487 880 70 46 34 27 123 166 226 726 3364 Larvas 1043 400 94 644 43 242 111 217 75 2375 779 1791 7814

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Foi verificada a sazonalidade da amostragem de 2.355 espcimes adultos (1.094 machos e 1.261 fmeas), 4.265 ninfas e 6.122 larvas de Amblyomma cajennense (Figura 31) e 1.193 espcimes adultos (555 machos e 638 fmeas), 3.364 ninfas e 7.814 larvas de Amblyomma dubitatum (Figura 32), coletada mediante pesquisas acarolgicas em matas ciliares, no perodo de julho/2009 a jun/2010 (Tabela 5).

A distribuio dos padres sazonais de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum foi caracterizada pela presena de adultos e estgios imaturos durante todos os meses do perodo de estudo, em seis reas de mata ciliar estudadas no municpio de Americana.

Adultos de Amblyomma cajennense predominaram no perodo de setembro a janeiro, com picos de frequncia nos meses de outubro e dezembro; as ninfas apresentaram maior atividade entre os meses de abril e dezembro, com picos nos meses de junho e setembro; e as larvas maior abundncia nos meses de abril a outubro, com picos em abril e maio (Figura 31).

Figura 31 Distribuio sazonal da populao de adultos, ninfas e larvas de Amblyomma cajennense. Mata ciliar. Julho de 2009 a junho de 2010. reas de alerta e risco para FMB. Americana, SP.

Embora seja recomendado um perodo de anlise mais amplo (dois a trs anos) para estudos de sazonalidade, estes resultados apresentaram concordncia parcial com os estudos 58

anteriores de Lemos et al. (1997a), Oliveira et al. (2000) e Szab et al. (2007) e total concordncia com as anlises de Labruna et al. (2002), Souza et al. (2006), Guedes e Leite (2008), Toledo et al. (2008), Guedes (2009) e Veronez et al. (2010).

Adultos de Amblyomma dubitatum predominaram no perodo de abril a setembro, com picos de frequncia nos meses de maio e agosto; as ninfas apresentaram maior atividade entre os meses de maro e outubro, com picos nos meses de junho e outubro; e as larvas maior abundncia nos meses de abril a outubro, com picos em abril e junho (Figura 32).

Figura 32 - Distribuio sazonal da populao de adultos, ninfas e larvas de Amblyomma dubitatum. Mata ciliar. Julho de 2009 a junho de 2010. reas de alerta e risco para FMB. Americana, SP.

Embora seja recomendado um perodo de anlise mais amplo (dois a trs anos) para estudos de sazonalidade, estes resultados apresentaram concordncia parcial com os estudos anteriores de Souza et al. (2006), Szab et al. (2007), Guedes e Leite (2008), Toledo et al. (2008) e Guedes (2009).

Deve ser evidenciado, em qualquer anlise de perfil sazonal de uma populao de carrapatos, o fato de que as espcies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum apresentam padro de uma gerao anual (OLIVEIRA et al., 2000; LABRUNA et al., 2002) controlado por diapausa comportamental durante uma fase do ciclo de vida (OLIVEIRA et al., 59

2000; GUEDES e LEITE, 2008; GUEDES, 2009); havendo tambm grande interferncia do fotoperodo e de variveis climticas sobre o nvel de infestaes ambientais estudadas.

4.4 Avaliao Epidemiolgica das reas de Estudo

Na rea de risco do Rio Jaguari, localizada na regio do Sobrado Velho, obtivemos um ndice de 8,8 % (17/193) de amostras positivas para gltA-PCR (Tabela 6). Nesta rea houve registro de incidncia de quatro casos de FMB, com dois bitos nos ltimos sete anos.

Na rea de risco do Rio Piracicaba, localizada na regio do Carioba, obtivemos um ndice de 5,5 % (53/970) de amostras positivas para gltA-PCR (Tabela 6). Nesta rea houve registro de um caso positivo de FMB, nos ltimos cinco anos.

Na rea de risco do Bosque das Nascentes, obtivemos um ndice de 4,9 % (5/102) de amostras positivas para gltA-PCR (Tabela 6).

Na rea de alerta da Fazenda Palmeiras, pertencente ao Instituto de Zootecnia, obtivemos um ndice de 1,5 % (3/194) de amostras positivas para gltA-PCR (Tabela 6).

Na rea de alerta do Rio Jaguari, localizada na regio do Museu Histrico, obtivemos um ndice de 1,2 % (2/170) de amostras positivas para gltA-PCR (Tabela 6).

Na rea de alerta do Ribeiro Quilombo, obtivemos um ndice de 4,2 % (24/568) de amostras positivas para gltA-PCR (Tabela 6).

Em segunda anlise, as amostras procedentes de todas as reas estudadas foram negativas para ompA2-PCR (Anexo 3, 4, 5 e 6), no sendo possvel indicar infectividade para rickttsias do grupo da Febre Maculosa.

O parasitismo humano foi observado ativamente por adultos, ninfas e larvas de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, na equipe de capturadores, em todas as pesquisas acarolgicas realizadas, em todas as reas de alerta e risco estudadas.

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Tabela 6 - Total de amostras de Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, procedentes de reas de alerta e risco para FMB, submetidas a gltA-PCR. rea de Risco (Sobrado Velho) Amblyomma cajennense gltA-PCR (+) 1 gltA-PCR (-) 86 Amblyomma dubitatum gltA-PCR (+) 16 gltA-PCR (-) 90

rea de Risco (Carioba/Piracicaba) Amblyomma cajennense gltA-PCR (+) 10 gltA-PCR (-) 498 Amblyomma dubitatum gltA-PCR (+) 43 gltA-PCR (-) 419

rea de Risco (Bosque das Nascentes) Amblyomma cajennense gltA-PCR (+) 1 gltA-PCR (-) 45 Amblyomma dubitatum gltA-PCR (+) 4 gltA-PCR (-) 52

rea de Alerta (Fazenda Palmeiras/IZ) Amblyomma cajennense gltA-PCR (+) 1 gltA-PCR (-) 156 Amblyomma dubitatum gltA-PCR (+) 2 gltA-PCR (-) 35

rea de Alerta (Ribeiro Quilombo) Amblyomma cajennense gltA-PCR (+) 5 gltA-PCR (-) 260 Amblyomma dubitatum gltA-PCR (+) 19 gltA-PCR (-) 284

rea de Alerta (Museu Histrico) Amblyomma cajennense gltA-PCR (+) 0 gltA-PCR (-) 94 Total Amblyomma cajennense gltA-PCR (+) 18 gltA-PCR (-) 1139 Amblyomma dubitatum gltA-PCR (+) 86 gltA-PCR (-) 954 Amblyomma dubitatum gltA-PCR (+) 2 gltA-PCR (-) 74

Total de Amostras: 1157

Total de Amostras: 1040

Apesar de uma caracterizao epidemiolgica de acentuado risco para as reas estudadas do Rio Jaguari (regio do Sobrado Velho), Rio Piracicaba (regio do Carioba), Bosque das Nascentes, Fazenda Palmeiras (Instituto de Zootecnia), Rio Jaguari (regio do Museu Histrico) e Ribeiro Quilombo, os resultados de anlises moleculares no presente estudo, em amostras de carrapatos vetores da FMB, no elucidaram a presena de rickttsias SFG, configurando assim um diagnstico epidemiolgico negativo de infectividade para Rickettsia rickettsii em Amblyomma spp., no municpio de Americana, estado de So Paulo.

61

Na rea de estudo da Fazenda Palmeiras (sem histrico de casos de FMB, mas com rotineiro parasitismo humano por carrapatos), a possibilidade de risco para transmisso, suscitou o entendimento de que nas reas de produo animal, sempre contguas aos cultivos agrcolas por cana-de acar, ficam intensificadas relaes de potencial risco zoontico entre capivaras (hospedeiros amplificadores de rickttsias), animais domsticos de criao (hospedeiros primrios e secundrios) e seres humanos (trabalhadores rurais e populaes urbanas perifricas), sendo de extrema importncia o monitoramento dos nveis de bem-estar animal e humano dentro de um contexto sustentvel de relaes biticas estabelecidas.

Tais estudos devem ser continuados, visando sempre contribuir para a confirmao de protocolos de ateno mdica bsica, mais adequados nos aspectos da vigilncia sindrmica e indicar aes em vigilncia em sade mais efetivas nas reas de maior risco epidemiolgico.

A possibilidade de riscos de transmisso da FMB, em razo de elevada mobilidade da populao humana em muitas destas reas, recomenda a adoo rigorosa de aes preventivas em vigilncia em sade, com nfase na sinalizao de reas de risco com placas de advertncia e adoo de medidas educativas junto populao residente nestas reas.

62

5. CONCLUSES

A utilizao de chaves dicotmicas para estgios imaturos (principalmente, ninfas) mostrou ser uma ferramenta vlida para a identificao taxonmica em estudos de dinmica sazonal de espcies de Amblyomma.

A distribuio sazonal de populaes de Amblyomma cajennense nas reas estudadas correspondeu ao padro estabelecido previamente por outros pesquisadores; no entanto, para Amblyomma dubitatum houve concordncia parcial de resultados com os poucos estudos anteriormente realizados.

Na anlise comparativa de resultados, entre os testes de triagem (ELISA e hemolinfa) confrontados com gltA-PCR, verificou-se que os resultados foram semelhantes no ELISA e teste de hemolinfa.

Mesmo com uma prevalncia para Rickettsia spp. entre 1,2 % e 8,8 % nas reas estudadas, os resultados derivados das anlises moleculares no evidenciaram rickttsias do grupo da Febre Maculosa, em espcies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, estabelecendo um diagnstico epidemiolgico negativo de infectividade para Rickettsia rickettsii em Amblyomma spp. no municpio de Americana, SP, neste presente estudo. 63

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Anexo 1 Caractersticas de termohigrometria das reas de pesquisa acarolgica e respectivas localizaes obtidas atravs do uso de GPS (Garmin eTrex Summit HC). rea de pesquisa Sobrado Velho (Rio Jaguari) Carioba (Rio Piracicaba) Bosque das Nascentes Fazenda Palmeiras/IZ Museu Histrico (Rio Jaguari) Ribeiro Quilombo classificao rea de risco rea de risco rea de risco rea de alerta rea de alerta rea de alerta perodo 03/07/2009 a 29/06/2010 06/07/2009 a 22/06/2010 22/07/2009 a 10/06/2010 15/07/2009 a 24/06/2010 27/07/2009 a 02/06/2010 07/07/2009 a 23/06/2010 latitude e longitude (altitude) 224116S e 471509 WO (516 m) 224135S e 471516 WO (565 m) 224175S e 471930 WO (496 m) 224284S e 471983 WO (502 m) 224194S e 471793 WO (534 m) 224205S e 471802 WO (548 m) 224501S e 471682 WO (558 m) 224509S e 471680 WO (596 m) 224160S e 471742 WO (508 m) 224162S e 471732 WO (531 m) 224339S e 471966 WO (528 m) 224525S e 471902 WO (513 m) temperatura mdia (perodo) 20,7 C (jul./2009) 39,7 C (fev./2010) 22,8 C (jul./2009) 39,2 C (mar./2010) 23,2 C (jun./2010) 36,5 C (fev./2010) 21,3 C (mai./2010) 45,0 C (fev./2010) 23,8 C (mai./2010) 36,3 C (nov./2009) 22,9 C (ago./2009) 37,6 C (mai./2010) unidade relativa mdia (perodo) 32 % (abr./2010) 90 % (jul./2009) 35 % (mar./2010) 85 % (jul./2009) 33 % (abr./2010) 85 % (dez./2009) 28 % (fev./2010) 80 % (ago./2009) 30 % (mai./2010) 98 % (jul./2009) 28 % (mai./2010) 92 % (jul./2009)

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Anexo 2 Quadro comparativo de resultados entre teste de hemolinfa e gltA-PCR. REA DE RISCO (SOBRADO VELHO) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (+) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (+) Resultados concordantes Falso positivo Falso negativo 1 37 6 1 REA DE RISCO (CARIOBA/PIRACICABA) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (+) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (+) Resultados concordantes 0 Falso positivo 136 30 REA DE RISCO (BOSQUE DAS NASCENTES) Falso negativo 2

HEMOLINFA (+) gltA-PCR (+) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (+) Resultados concordantes 0 Falso positivo 41 4 REA DE ALERTA (FAZENDA PALMEIRAS/IZ) Falso positivo 111 26 REA DE ALERTA (RIBEIRO QUILOMBO) Falso positivo 170 38 REA DE ALERTA (MUSEU HISTRICO) Falso positivo 15 TOTAL HEMOLINFA (+) gltA-PCR (+) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (+) Resultados concordantes 4 571 Falso positivo 119 Falso negativo 8 Falso negativo 1

HEMOLINFA (+) gltA-PCR (+) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (+) Resultados concordantes 2 Falso negativo 0

HEMOLINFA (+) gltA-PCR (+) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (+) Resultados concordantes 1 Falso negativo 4

HEMOLINFA (+) gltA-PCR (+) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (+) gltA-PCR (-) HEMOLINFA (-) gltA-PCR (+) Resultados concordantes 0 76 Falso negativo 0

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Anexo 3 Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR - Rio Jaguari, Sobrado Velho, Americana/SP. AMOSTRA PESQUISA REA DATA SITUAO EPIDEMIOLGICA ESPCIME HEMOLINFA gltA-PCR ompA2-PCR 6 212 698 758 759 760 764 765 776 777 780 786 787 788 2004 2006 2118 7 14 27 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 69 69 75 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 3/6/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 13/7/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 15/9/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 12/8/2009 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 8/6/2010 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 8/6/2010 RIO JAGUARI (SOBRADO VELHO) 14/6/2010 REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. cajennense (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO POSITIVO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO SEM RESULTADO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

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Anexo 4 - Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR - Rio Piracicaba, Carioba, Americana/SP. AMOSTRA PESQUISA REA DATA SITUAO EPIDEMIOLGICA ESPCIME HEMOLINFA gltA-PCR ompA2-PCR 169 4 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 6/5/2009 REA DE RISCO A. dubitatum (F) NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO 202 9 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 9/6/2009 REA DE RISCO A. cajennense (M) SEM RESULTADO POSITIVO NEGATIVO 205 228 229 233 234 235 237 240 242 253 256 259 260 261 267 269 271 275 277 290 291 294 304 319 9 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) 9/6/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO A. cajennense (M) SEM RESULTADO A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

78

AMOSTRA PESQUISA 320 335 338 339 340 342 485 589 613 614 826 838 839 852 859 864 865 872 874 914 1043 1050 1059 1085 1087 1788 2088 4 4 4 4 4 4 12 12 13 13 19 19 19 19 19 19 19 19 19 19 32 32 32 32 32 62 73

REA RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA) RIO PIRACICABA (CARIOBA)

DATA 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 6/5/2009 3/7/2009 3/7/2009 8/7/2009 8/7/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009 5/8/2009

SITUAO EPIDEMIOLGICA REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO

ESPCIME A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. cajennense (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. cajennense (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M)

HEMOLINFA SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO

gltA-PCR POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

ompA2-PCR NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO

A. cajennense (M) SEM RESULTADO

RIO PIRACICABA (CARIOBA) 13/10/2009 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 13/10/2009 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 13/10/2009 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 13/10/2009 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 13/10/2009 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 8/3/2010 RIO PIRACICABA (CARIOBA) 6/5/2010

A. cajennense (M) SEM RESULTADO A. cajennense (M) SEM RESULTADO A. cajennense (F) A. cajennense (F) A. cajennense (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO NEGATIVO SEM RESULTADO

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Anexo 5 - Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR Ribeiro Quilombo, Guaicurus e Colina, Americana/SP. AMOSTRA PESQUISA REA DATA SITUAO EPIDEMIOLGICA ESPCIME HEMOLINFA gltA-PCR ompA2-PCR 28 10 RIBEIRO QUILOMBO 22/6/2009 REA DE ALERTA A. cajennense (F) SEM RESULTADO POSITIVO NEGATIVO 64 76 79 95 106 108 125 161 591 592 596 597 598 1498 1861 1862 1865 1888 1920 1973 1980 1981 2001 3 2 2 2 2 2 2 2 8 8 8 8 8 50 66 66 66 66 72 72 72 72 72 RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO RIBEIRO QUILOMBO 23/4/2009 7/4/2009 7/4/2009 7/4/2009 7/4/2009 7/4/2009 7/4/2009 7/4/2009 4/6/2009 4/6/2009 4/6/2009 4/6/2009 4/6/2009 15/1/2010 8/4/2010 8/4/2010 8/4/2010 8/4/2010 3/5/2010 3/5/2010 3/5/2010 3/5/2010 3/5/2010 REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA REA DE ALERTA A. dubitatum (M) A. cajennense (F) A. cajennense (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. cajennense (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) A. dubitatum (M) SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO A. cajennense (M) SEM RESULTADO

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Anexo 6 - Quadro demonstrativo de amostras gltA-PCR positivas (Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum), com resultados comparativos do teste de hemolinfa e ompA2-PCR Bosque das Nascentes, Fazenda Palmeiras (IZ) e Rio Jaguari (Museu Histrico) Americana/SP. AMOSTRA PESQUISA REA DATA SITUAO EPIDEMIOLGICA ESPCIME HEMOLINFA gltA-PCR ompA2-PCR 206 608 611 612 810 5 11 11 11 30 BOSQUE DAS NASCENTES BOSQUE DAS NASCENTES BOSQUE DAS NASCENTES BOSQUE DAS NASCENTES BOSQUE DAS NASCENTES REA FAZENDA PALMEIRAS (IZ) FAZENDA PALMEIRAS (IZ) FAZENDA PALMEIRAS (IZ) 22/5/2009 1/7/2009 1/7/2009 1/7/2009 5/10/2009 REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO REA DE RISCO A. dubitatum (M) A. cajennense (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) A. dubitatum (M) ESPCIME A. dubitatum (F) A. cajennense (F) A. dubitatum (M) ESPCIME A. dubitatum (F) A. dubitatum (F) SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO SEM RESULTADO NEGATIVO HEMOLINFA SEM RESULTADO POSITIVO POSITIVO HEMOLINFA SEM RESULTADO SEM RESULTADO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO gltA-PCR POSITIVO POSITIVO POSITIVO gltA-PCR POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO ompA2-PCR NEGATIVO NEGATIVO NEGATIVO ompA2-PCR NEGATIVO NEGATIVO

AMOSTRA PESQUISA 222 15 705 29 2121 76

DATA SITUAO EPIDEMIOLGICA 15/7/2009 REA DE ALERTA 29/9/2009 REA DE ALERTA 20/5/2010 REA DE ALERTA DATA SITUAO EPIDEMIOLGICA 17/8/2009 REA DE ALERTA 17/8/2009 REA DE ALERTA

AMOSTRA PESQUISA REA 792 21 RIO JAGUARI/M.HISTRICO 793 21 RIO JAGUARI/M.HISTRICO

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