Bioetanol 2a Geracao de Biomassa Residual

PRODUO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAO A PARTIR DE BIOMASSA RESIDUAL DA INDSTRIA DE CELULOSE
Neumara Luci Conceio Silva
Dissertao apresentada ao Curso de PsGraduao em Tecnologia de Processos
Qumicos e Bioqumicos para a Obteno do Grau de Mestre em Cincias (M.Sc.)
Orientador: Nei Pereira Jr., Ph.D.
Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro 2010
ii
Neumara Luci Conceio Silva
Dissertao apresentada ao Curso de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos para a obteno do Grau de Mestre em Cincias (M.Sc.)
Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro 2010
FICHA CATALOGRFICA
S586p Silva, Neumara Luci Conceio Produo de bioetanol de segunda gerao a partir de biomassa residual da indstria de celulose/ Neumara Luci Conceio Silva. 2010. xiii, 109 f.: il. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Porcessos Qumicos e Bioqumicos) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Escola de Qumica, Rio de Janeiro, 2010. Orientador: Nei Pereira J.r, Ph.D.
1. Bioetanol. 2. Biomassa residual. 3. Indstria de celulose. Teses. I. Pereira Jr., Nei (Orient.). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, Escola de Qumica. IV. Ttulo. CDD: 665.776
iv
Aos meus pais, fontes de minhas foras, minha irm, exemplo que sempre procurei seguir, e ao meu amor, Petteri, dedico-lhes este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me permitir realizar mais um sonho; Ao professor Nei Pereira Jr. pela compreenso, confiana, oportunidade de trabalhar em seus laboratrios e ser orientada por um admirvel e excepcional pesquisadorprofessor, que compartilhou seu conhecimento e experincia; Aos meus amigos e colegas de trabalho Roberto Nobuyuki Maeda e Gabriel Jaime Vargas Betancur pela colaborao, ateno, conhecimento, pacincia e valiosa amizade; Helosa Barros Bastos, pela dedicao, carinho, principalmente, colaborao nos experimentos realizados. companherismo e,
Aos estudantes e funcionrios dos Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos, em especial a Carolina Barcelos, Mariana Mello, Felipe Oliveira, Luiz Claudio e Jorge, pela ajuda na soluo de problemas e pelo companherismo que tornaram o ambiente de trabalho muito agradvel; Aos funcionrios da secretaria de ps-graduao da Escola de Qumica pela ateno e ajuda na soluo de problemas burocrticos; Ao Petteri, pela compreenso, confiana, companherismo, carinho, apoio e por toda colaborao direta ou indireta durante esta minha importante jornada; Aos funcionrios da empresa Aracruz Celulose, Rudine Antes, Braz Jos Demuner e Pablo Cadaval Santos por fornecerem to prontamente informaes sobre o trabalho; Aos professores Maulori Currie Cabral e Maria Isabel Liberto pelos valiosos ensinamentos recebidos durante minha vida acadmica; minha famlia, por acreditar e apoiar desde os meus pequenos desejos at os grandes e difceis sonhos; PETROBRS e ao CNPq pelo auxlio financeiro.
vi
Resumo da Dissertao de M.Sc. apresentada ao programa de psgraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro Brasil. Neumara Luci Conceio Silva Orientador: Nei Pereira Jr.
A grande dependncia de fontes de energia no renovveis e altamente poluentes, como o petrleo e seus derivados, tem levado a sociedade a buscar alternativas para a utilizao de combustveis renovveis. As pesquisas atuais sinalizam como tecnologia emergente a produo de etanol combustvel a partir de biomassas residuais de composio lignocelulsica. Neste contexto, o presente trabalho objetivou produzir bioetanol carburante empregando uma concepo de processo denominado SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) a partir da celulose contida no resduo oriundo do sistema de decantao da indstria de celulose, utilizando linhagens da levedura
Saccharomyces cerevisiae e visando estabelecer condies que aumentassem a produtividade e eficincia do processo. Como resultados desta dissertao, foram obtidas as melhores condies da pr-hidrlise enzimtica (relao slido:lquido 1:4 e 17,5 FPU/g de carga enzimtica) e determinadas as condies que conferiram o maior valor para a produtividade volumtrica (16 h de pr-hidrlise enzimtica, 8 g/L para concentrao celular e 36 h de fermentao). A mxima concentrao de etanol obtida quando o processo SSF foi conduzido em frascos agitados, foi de 77,6 g/L em 64 h, empregando Saccharomyces cerevisiae de panificao. O melhor resultado obtido quando a fermentao foi conduzida em biorreator, foi de 74,6 g/L em 64 h, utilizando celulases comerciais (Multifect) e suplementando o hidrolisado enzimtico com fontes de fosfato e nitrognio e solues de sais minerais e cido ctrico, que foi fermentado por uma cepa industrial de S. cerevisiae codificada como JP1. Os resultados mostraram-se bastante promissores e apontam para maiores desdobramentos.
vii
SECOND GENERATION BIOETHANOL PRODUCTION FROM RESIDUAL BIOMASS OF CELLULOSE INDUSTRY
Abstract of the M.Sc. dissertation presented to the post graduation program on Technology of Chemical and Biochemical Process of the Chemistry School of Federal University of Rio de Janeiro Brazil. Neumara Luci Conceio Silva Supervisor: Nei Pereira Jr.
The large reliance on non-renewable sources and highly polluting fuels such as petroleum and its derivatives, has led the society to seek alternatives to the use of renewables. Current research indicates as emerging technology the production of fuel ethanol from residual biomass of lignocellulosic composition. This study aimed at producing fuel ethanol using a design process called SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) from the cellulose containing residue arisen from the separating system of the cellulose manufactory, using strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The work also aimed at establishing process conditions that increase the productivity and efficiency. As results of this study, the best preenzymatic hydrolysis conditions (solid:liquid ratio 1:4 and 17.5 FPU/g of enzyme loading) was obtained and the conditions that allowed the highest volumetric ethanol productivity was determined (16 h pre-hydrolysis, 8.0 g/L for cell concentration and 36 h of fermentation). The maximum ethanol concentration, obtained when the SSF process was performed in flasks, was 77.6 g/L in 64 hours, using the bakery yeast Saccharomyces cerevisiae. On the other hand, when the fermentation was carried out in bioreactor, the highest ethanol concentration was 74.6 g/L at 64 h of SSF process, using a commercial enzyme preparation (Multifect) and supplementing the enzymatic hydrolysate with sources of phosphate and nitrogen and mineral salts and citric acid solution, which was fermented by an industrial strain of S. cerevisiae coded as JP1. The results were very promising and point to major developments.
viii
NDICE CAPTULO 1 1. APRESENTAO DO TEMA DE DISSERTAO DE MESTRADO CAPTULO 2 2. REVISO BIBLIOGRFICA 2.1. BIOMASSA: FONTE DE BIOENERGIA 2.1.1. Celulose 2.1.2. Hemicelulose 2.1.3. Lignina 2.1.4. Pr-tratamentos 2.1.5. A celulose no contexto de biorrefinaria 2.1.6. Hidrlise enzimtica da celulose 2.2. A INDSTRIA DE CELULOSE 2.2.1. Produo de celulose 2.2.2. Resduos gerados na produo de celulose 2.2.3. Aspectos econmicos da indstria de celulose 2.3. O BIOETANOL NO CONTEXTO DE 2 GERAO DE BIOCOMBUSTVEIS 2.3.1. Dimenses tcnicas e ambientais do uso de bioetanol como combustvel veicular 2.3.2. Evoluo do bioetanol combustvel no mercado 2.3.3. Progresso das aes ambientalistas 2.3.4. Produo de bioetanol de segunda gerao 2.3.5. Estratgias para a produo de bioetanol de segunda gerao 2.3.6. Principais resultados reportados na literatura 5 5 8 10 11 12 13 14 16 19 22 24 26 26 28 33 34 37 42 1
ix
CAPTULO 3 3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS 3.1. JUSTIFICATIVA 3.2. OBJETIVOS CAPTULO 4 4. MATERIAIS E MTODOS 4.1. MATRIA-PRIMA 4.2. CARACTERIZAO DAS BIOMASSAS PM1, PM2 E PM3 4.3. MICROORGANISMO 4.3.1. Manuteno, ativao e propagao celular de S. cerevisiae JP1 4.4. AVALIAO DA FERMENTABILIDADE DE PM1, PM2 E PM3 PARA PRODUO DE BIOETANOL 4.5. ESTUDO COMPARATIVO DA HIDRLISE ENZIMTICA DE PM1, PM2 E PM3 4.6. OTIMIZAO DO PROCESSO SSF DE PM3 4.6.1. Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR) 4.6.2. Planejamento univarivel 4.6.3. Validao das melhores condies do processo SSF 4.7. DESEMPENHO DAS PROCESSO SSF DE PM3 CELULASES LADEBIO NO 48 48 50 50 50 52 53 54 54 55 55 55 56 57 57 58 45 45 46
4.8. SUPLEMENTAO DO HIDROLISADO 4.9. MTODOS ANALTICOS 4.9.1. Determinao de acares e etanol 4.9.2. Quantificao celular CAPTULO 5 5. RESULTADOS E DISCUSSO 5.1. CARACTERIZAO DAS BIOMASSAS PM1, PM2 E PM3
60 60
5.2. AVALIAO DA FERMENTABILIDADE DE PM1, PM2 E PM3 PARA PRODUO DE BIOETANOL 5.3. ESTUDO COMPARATIVO DA HIDRLISE ENZIMTICA DE PM1, PM2 E PM3 5.4. PLANEJAMENTO SEQUENCIAL PARA OTIMIZAO DO PROCESSO SSF 5.4.1. DCCR 5.4.2. Planejamento univarivel 5.4.3. Validao das melhores condies do processo SSF em frascos agitados 5.5. PROCESSOS SSF CONDUZIDOS EM BIORRETAOR 5.5.1. Processo SSF empregando a linhagem industrial S. cerevisiae JP1 e celulases comerciais Multifect 5.5.2. Processo SSF empregando S. cerevisiae JP1 como inculo e consrcio celulsico LADEBIO 5.5.3. Processo SSF empregando S. cerevisiae JP1, celulases comerciais Multifect e hidrolisado suplementado com fontes de nitrognio, fosfato e sais minerais 5.6. CONSIDERAES FINAIS CAPTULO 6 6. CONCLUSES E SUGESTES 6.1. CONCLUSES 6.2. SUGESTES CAPTULO 7 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
61 64 73 73 79 84 85 85 89 92
94
98 98 100
101
xi
NDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Esquema estrutural simplificado das fibras do material lignocelulsico Figura 2.2. Estrutura qumica da celulose Figura 2.3. Componentes da frao hemicelulose Figura 2.4. Precursores primrios da lignina Figura 2.5. Biorrefinaria de matrias-primas lignocelulsicas: produtos da celulose Figura 2.6. Fluxograma de blocos da produo da pasta de celulose Figura 2.7. Evoluo da produo brasileira de celulose Figura 2.8. Destinos das exportaes brasileiras de celulose Figura 2.9. Evoluo das emisses de gases dos veculos brasileiros Figura 2.10. Evoluo da produo de cana-de-acar, etanol e acar no Brasil Figura 2.11. Teor mdio de etanol anidro na gasolina brasileira Figura 2.12. Evoluo da produo de veculos a etanol hidratado e de sua participao nas vendas de veculos novos Figura 2.13. Evoluo dos preos mdios para o consumidor do bioetanol hidratado e da gasolina comum no Brasil Figura 2.14. Vendas de lcool etlico e de gasolina automotiva no Brasil Figura 2.15. Evoluo da produo de bioetanol do Brasil e dos EUA Figura 2.16. Produo mundial de bioetanol combustvel em 2008 Figura 2.17. Perspectivas da produo de biocombustveis Figura 2.18. Fermentao alcolica Figura 2.19. Diagrama da Sacarificao e Fermentao em Separado (SHF) Figura 2.20. Diagrama da Sacarificao e Fermentao Simultnea (SSF) Figura 2.21. Diagrama do processo de Sacarificao e Co-Fermentao Simultnea Figura 2.22. Diagrama do Bioprocesso Consolidado (CBP) Figura 4.1. Fluxograma da produo de celulose Figura 4.2. Polpas PM1 e PM2 e resduo PM3 da indstria de celulose Figura 4.3. Biorreator instrumentado Figura 4.4. Fermentmetro Figura 4.5. Regresso linear e coeficiente de correlao para a quantificao de biomassa de S. cerevisiae JP1 Figura 5.1. Concentrao de acares aps 12 h de pr-hidrlise enzimtica, utilizando relao S:L 1:4 e 32 FPU/g de carga enzimtica Figura 5.2. Perfis cinticos do processo SSF das biomassas PM1, PM2 e PM3, empregando 2 g/L de S.verevisiae de panificao
7 9 10 12 14 20 24 25 28 29 29 30 31 31 32 32 33 36 38 39 40 41 49 49 52 58 59 62 63
xii
Figura 5.3. Concentrao de acares e etanol aps 96 h de SSF Figura 5.4. Hidrlise enzimtica da biomassa PM1 Figura 5.5. Hidrlise enzimtica da biomassa PM2 Figura 5.6. Hidrlise enzimtica da biomassa PM3 Figura 5.7. Grfico de Pareto para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta da hidrlise enzimtica de PM1 Figura 5.8. Grfico de Pareto para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta da hidrlise enzimtica de PM2 Figura 5.9. Grfico de Pareto para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta da hidrlise enzimtica de PM3 Figura 5.10. Superfcie de resposta para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta da hidrlise enzimtica de PM1 Figura 5.11. Superfcie de resposta para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta da hidrlise enzimtica de PM2 Figura 5.12. Superfcie de resposta para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta da hidrlise enzimtica de PM3 Figura 5.13. Concentrao de glicose aps hidrlise enzimtica de PM1, PM2 e PM3 Figura 5.14. Perfis cinticos dos processos SSF do DCCR para PM3 Figura 5.15. Grfico de Pareto para a concentrao de etanol (g/L) como varivel de resposta do SSF de PM3 Figura 5.16. Superfcie de resposta para concentrao de etanol (g/L) como varivel de resposta do SSF de PM3 Figura 5.17. Experimento 8 do DCCR para SSF de PM3 Figura 5.18. Perfis cinticos de SSF do planejamento univarivel Figura 5.19. Concentraes de etanol equivalente e etanol (CLAE) do planejamento univarivel Figura 5.20. Perfil cintico do SSF na validao das melhores condies do processo SSF com PM3 em frascos agitados Figura 5.21. Cintica do pr-inculo de S. cerevisiae JP1 Figura 5.22. Cintica do crescimento de S. cerevisiae JP1 em biorreator Figura 5.23. Perfil cintico do processo SSF de PM3 em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases Multifect Figura 5.24. Perfil cintico do processo SSF de PM3 em biorreator empregando celulases LADEBIO e S. cerevisiae JP1 Figura 5.25. Perfil cintico do processo SSF de PM3 em biorreator com hidrolisado suplementado com fontes de nitrognio, fosfato de potssio, soluo de sais minerais e cido ctrico
63 66 66 66 69 69 70 70 71 71 72 74 78 78 79 81 81 84 86 87 88 90
93
xiii
NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1. Composio qumica parcial de alguns materiais lignocelulsicos Tabela 2.2. Diferenas entre hemicelulose e celulose Tabela 2.3. Comparao de rotao e rendimento de rvores Tabela 2.4. Caracterizao de espcies de eucalipto Tabela 2.5. Maiores produtos mundiais de celulose em 2008 Tabela 2.6. Propriedades da gasolina e do bioetanol Tabela 2.7. Condies empregadas para produo de bioetanol de segunda gerao por SSF na literatura Tabela 4.1. Meio de cultura para manuteno da S. cerevisiae JP1 Tabela 4.2. Meio de cultura para crescimento do pr-inculo Tabela 4.3. Composio da soluo de sais minerais e cido ctrico Tabela 4.4. Intervalo utilizado para construir o DCCR para a hidrlise enzimtica de PM1, PM2 e PM3 Tabela 4.5. Intervalo utilizado para construir o DCCR para o processo SSF de PM3 Tabela 5.1. Caracterizao das biomassas PM1, PM2 e PM3 Tabela 5.2. Concentraes de acares e etanol no incio e final do SSF Tabela 5.3. Concentrao de acares liberados na hidrlise enzimtica (HE) de PM1 Tabela 5.4. Concentrao de acares liberados na hidrlise enzimtica (HE) de PM2 Tabela 5.5. Concentrao de acares liberados na hidrlise enzimtica (HE) de PM3 Tabela 5.6. Concentrao de acares no incio do SSF e de etanol equivalente, acares e etanol no final do processo (48h) Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA) para concentrao final de etanol do DCCR Tabela 5.8. Concentrao de acares no incio do SSF e de etanol equivalente (equival.), acares e etanol no final dos processos SSF (36h) do planejamento univarivel Tabela 5.9. Concentrao de acares no incio do SSF e de etanol equivalente (equiv.), acares e etanol no final do SSF (36h) na validao das melhores condies Tabela 5.10. Concentrao de acares e etanol no incio e final do processo (64h) em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases Multifect Tabela 5.11. Concentrao de acares e etanol no incio e final do processo (64h) em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases LADEBIO Tabela 5.12. Concentrao de acares e etanol no incio e final do SSF (64h) em biorreator empregando S. cerevisiae JP1, celulases Multifect e hidrolisado suplementado Tabela 5.13. Condies utilizadas e resultados obtidos em cada etapa da pesquisa 8 11 17 19 25 26 43 50 51 51 53 54 61 63 67 67 67 75 77 82
84
89
92 94
96
CAPTULO 1. Apresentao do tema
CAPTULO 1
1. APRESENTAO DO TEMA DE DISSERTAO DE MESTRADO
O suprimento de energia est na base da estruturao e da dinmica operacional da sociedade humana nos seus mais diversos aspectos, desde o bemestar individual at o desempenho industrial e de prestao de servios. Neste contexto, o petrleo tem tido uma importncia mpar, sendo responsvel pelo fornecimento de um tero da energia primria consumida no planeta. Assim, alteraes no suprimento ou no uso do petrleo teriam desdobramentos econmicos, polticos e sociais importantes para a maior parte das naes do mundo. A sociedade humana depara-se, agora, com a escassez e com o aumento do preo desta fonte no renovvel de energia. Avaliaes mais pessimistas afirmam que em torno de 41 anos chegar-se-ia sua total depleo (ODAC, 2007). Paralelamente, a combusto crescente de combustveis fsseis, iniciada h 60 anos, tem gerado, juntamente com o desmatamento, o acmulo na atmosfera de gases poluentes, particularmente de CO2, responsveis pelo efeito estufa e conseqentes alteraes climticas. Esse atual quadro exige mudanas nos padres de industrializao e de consumo da sociedade humana, de forma a reduzir a emisso de gases de efeito estufa (PEREIRA Jr. et al., 2008).
Embora as crises de petrleo anteriores, como a dos anos 1970, responsveis pelo aumento do preo do petrleo, tenham sido episdicas, a conjuno e sinergia dos fatores acima mencionados, indicam uma tendncia crescente e irreversvel no aumento do preo do petrleo e, em um prazo mais longo, a diminuio do seu uso. Neste contexto, a busca por fontes renovveis de energia e de alternativas ao uso do petrleo est mobilizando internacionalmente e de forma mpar setores acadmicos, industriais, sociais e governamentais com nfase no desenvolvimento de processos biotecnolgicos de menor impacto ambiental (PEREIRA Jr. et al., 2008). O Brasil j vem, por muitas dcadas, utilizando apenas lcool como combustvel ou sob a forma de uma mistura contendo de 22% a 25% de lcool na gasolina, colocando o pas em uma posio extremamente favorvel
internacionalmente, em termos de emisso de CO2. Atualmente, o Brasil produz 25 bilhes de etanol por ano a partir da cana-de-acar. O plantio dessa matria-prima, realizado em terras arveis de boa qualidade, dever ser expandido devido crescente demanda nacional e internacional de lcool (MAPA, 2010). No entanto, para evitar a expanso desmedida das reas de cultivo, tm se desenvolvido processos biotecnolgicos que permitam a utilizao de biomassas residuais de composio lignocelulsica, abundantemente geradas nos setores agrcolas e florestais. Dentre estas biomassas, os resduos celulsicos provenientes da produo de pasta de celulose e separados na etapa de decantao constituem uma das fontes mais promissoras de carboidratos para a produo de bioetanol de segunda gerao. Os resduos lignocelulsicos agroindustriais so matrias-primas de grande interesse industrial uma vez que podem ser utilizadas para a produo de uma gama de produtos, no somente o etanol. Os materiais lignocelulsicos so constitudos majoritariamente por celulose, hemicelulose e lignina. Dentro do conceito de biorrefinaria, as fraes devem ser separadas seletivamente de acordo com suas caractersticas e as do produto desejado, sendo necessrio desenvolver processos eficientes para disponibilizar os monmeros (acares) e para a transformao destes atravs de processos de fermentao com altas taxas de produo (PEREIRA Jr. et al., 2008).
No caso da utilizao da celulose contida no resduo fibroso do sistema de decantao da indstria de celulose, faz-se necessrio a sua hidrlise, utilizando enzimas especficas, que pode ser conduzida em sinergia com o processo de fermentao da glicose, o qual se denomina Sacarificao e Fermentao Simultnea (Simultaneous Saccharification and Fermentation SSF). No presente estudo tencionou-se desenvolver um processo SSF para o aproveitamento da celulose, contida no resduo slido proveniente do sistema de decantao da indstria de celulose, para a produo de bioetanol combustvel. Composta de sete captulos, a presente dissertao procurou cobrir de forma abrangente esta complexa temtica. No primeiro captulo, apresentado de forma sumarizada, o paradigma defectivo que a populao mundial vive com os combustveis de origem fssil, apontando suas principais problemticas e destacando o bioetanol como excelente alternativa de combustvel veicular. O segundo captulo apresenta uma reviso bibliogrfica sobre os temas que tangem a temtica do presente trabalho: a biomassa lignocelulsica como fonte de bioenergia; a produo de celulose e seus resduos; e o bioetanol, relatando a importncia do seu uso, a sua produo e as estratgias para a obteno desta substncia qumica. As justificativas e os objetivos que nortearam a construo deste presente trabalho so relatados no terceiro captulo. Os materiais utilizados e as metodologias empregadas so descritas no quarto captulo, enquanto os resultados obtidos, assim como a anlise estatstica e fenomenolgica dos mesmos so apresentados no quinto captulo. No sexto captulo, encontram-se as concluses obtidas a partir dos experimentos realizados e as sugestes para a continuidade deste trabalho. As referncias utilizadas para dar embasamento textual ao trabalho so listadas no stimo captulo. A seguir, esto listados os artigos publicados, em revistas indexadas e anais de congressos nacionais, decorrentes do desenvolvimento do trabalho de pesquisa desta dissertao de mestrado.
SILVA, N.L.C; BETANCUR, G.J.V.; VASQUEZ , M.P.; BARROS, E.; PEREIRA Jr., N. (2010). Ethanol production from residual wood chips of cellulose industry: Acid pretreatment investigation, hemicellulosic hydrolysate fermentation and remaining solid fraction fermentation by SSF process. Applied Biochemistry and Biotechnology (no prelo).
SILVA, N.L.C; BASTOS, H.B.; PEREIRA Jr., N. (2009). Second generation ethanol production from residual biomass of cellulose industry. Artigo submetido ao Brazilian Journal of Chemical Engineering.
SILVA, N.L.C; BETANCUR, G.J.V.; PEREIRA Jr., N. (2009). Produo de bioetanol a partir de cavaco residual da indstria de celulose: Otimizao do pr-tratamento cido e fermentao do hidrolisado hemicelulsico. Trabalho completo publicado nos anais do XVII Simpsio Nacional de Bioprocessos (SINAFERM), CD-ROM, 6 pginas.
SILVA, N.L.C; BASTOS, H.B.; BETANCUR, G.J.V.; MAEDA, R.N.; PEREIRA Jr., N. (2009). Produo de etanol de segunda gerao a partir de biomassas residuais da indstria de celulose. Trabalho completo publicado nos anais do XVII Simpsio Nacional de Bioprocessos (SINAFERM), CD-ROM, 6 pginas.
SILVA, N.L.C; BETANCUR, G.J.V.; PEREIRA Jr., N. (2009). Avaliao do potencial da biomassa residual da indstria de celulose para a produo de bioetanol. Trabalho completo publicado nos anais do IX Simpsio de Hidrlise Enzimtica de Biomassas (SHEB), CD-ROM, 7 pginas.
SILVA, N.L.C; MAEDA, R.N.; PEREIRA Jr., N. (2009). Otimizao da hidrlise enzimtica da biomassa residual da indstria de celulose. Trabalho completo publicado nos anais do IX Simpsio de Hidrlise Enzimtica de Biomassas (SHEB), CD-ROM, 12 pginas.
CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica
CAPTULO 2
2.
REVISO BIBLIOGRFICA
Neste captulo so apresentados os diferentes aspectos tericos que tangem a temtica abordada: a biomassa, como material lignocelulsico, e os meios de sua converso em bioetanol; a indstria de celulose e sua produo, relatando as matrias-primas utilizadas e os resduos gerados neste processo; e o bioetanol, abordando suas dimenses tcnicas e ambientais, evoluo do seu uso como combustvel veicular, sua produo e as estratgias concebidas para este fim.
2.1. BIOMASSA: FONTE DE BIOENERGIA Em geral, denomina-se biomassa qualquer matria de origem vegetal que dispe de bioenergia e que pode ser processada para fornecer formas bioenergticas mais elaboradas e adequadas para o uso final. Portanto, seriam exemplos de matrias a lenha, os resduos de serrarias, o carvo vegetal, o biogs resultante da decomposio de lixo orgnico e de outros resduos agropecurios, bem como os biocombustveis lquidos, como o bioetanol e o biodiesel. No amplo contexto da bioenergia, a produo de biocombustveis lquidos a partir de biomassa
tem sido considerada para atender particularmente s necessidades de transporte veicular. Para esses fins, ainda no existem outras alternativas renovveis, alm dos biocombustveis, com maturidade tecnolgica e viabilidade econmica suficientes (ZHANG & SMITH, 2007). Com exceo da cana-de-acar, as tecnologias comercialmente disponveis na atualidade para a produo de bioetanol de primeira gerao a partir de biomassas sacarneas e amilceas envolvem ganhos energticos e ambientais bastante estreitos. Alm disso, essas matrias-primas apresentam uma limitada vantagem econmica e encontram, em geral, mercados alternativos mais remuneradores, como alimentos ou insumos para outros fins. Entretanto, apesar de suas destacadas vantagens, a cana-de-acar no uma opo vivel para todas as regies do planeta. E por esse motivo, os pases do hemisfrio norte vm procurando incessantemente rotas tecnolgicas que permitam a produo de um biocombustvel eficiente, tanto do ponto de vista ambiental quanto do ponto de vista econmico (BNDES, 2008). A tendncia de estudos, como j havia sido reportado por VSQUEZ et al. (2007), desenvolver processos biotecnolgicos que permitam a utilizao de biomassas residuais de composio lignocelulsica, como palha de milho e arroz, bagao de cana-de-acar e resduos da indstria de celulose, abundantemente geradas nos setores agrcolas e florestais, para a produo de bioetanol de segunda gerao. O bioetanol de segunda gerao vem sendo produzido pela hidrlise e fermentao de materiais lignocelulsicos desde o fim do sculo XIX, mas somente nos ltimos 20 anos essa tecnologia tem sido proposta para atender o mercado de combustveis. Os principais programas de pesquisa e desenvolvimento so conduzidos nos Estados Unidos e na Europa, basicamente em escalas experimentais de produo, mas seu sucesso poderia transformar o bioetanol em um biocombustvel passvel de ser produzido em quase todas as regies do mundo, aproveitando a alta disponibilidade de resduos orgnicos de diversas fontes. Praticamente todos os resduos de biomassa, produzidos nas atividades agrcolas e industriais, e mesmo o lixo urbano, apresentam elevados teores de materiais lignocelulsicos (MACEDO et al., 2008).
A populao humana produz milhes de toneladas de resduos agroflorestais anualmente. O Brasil, por exemplo, produziu em 2007 aproximadamente 400 milhes de toneladas de subprodutos agroflorestais, incluindo os resduos gerados na indstria de celulose (PEREIRA Jr. et al., 2008). Os materiais lignocelulsicos so formados por estruturas duras e fibrosas, compostas majoritariamente pelos polissacardeos celulose e hemicelulose (cerca de 70% da massa seca), entremeados por outra macromolcula formada por lcoois aromticos, a lignina, aos quais se encontram unidos por ligaes covalentes e de hidrognio (Figura 2.1) (LEE, 1997). Em menores propores, e dependendo da origem do vegetal, tambm podem ser encontrados resinas, cidos graxos, fenis, taninos, compostos nitrogenados e sais minerais, principalmente, de clcio, potssio e magnsio (NEUREITER et al., 2002). As tecnologias para a obteno de bioetanol de segunda gerao, produzido a partir de materiais lignocelulsicos, envolvem a hidrlise dos polissacardeos da biomassa em acares fermentveis e sua posterior fermentao. Para executar essa tarefa, o processo de hidrlise utiliza tecnologias complexas e multifsicas, com base no uso de rotas cidas e/ou enzimticas para a separao dos acares e remoo da lignina (PEREIRA Jr. et al., 2008).
Figura 2.1. Esquema estrutural simplificado das fibras do material lignocelulsico (LEE, 1997)
A composio e a estrutura da biomassa tm forte influncia na natureza e nos rendimentos dos processos de hidrlise e fermentao. Sendo que a composio bsica da biomassa lignocelulsica depende do vegetal de origem e, no
caso de biomassas agroflorestais residuais, da regio, idade e perodo de coleta do material. Na Tabela 2.1 pode ser visualizada a variao da composio qumica bsica de algumas biomassas de composio lignocelulsica.
Tabela 2.1. Composio qumica parcial de alguns materiais lignocelulsicos Material lignocelulsico Farelo de cevada Sabugo de milho Folhas de milho Bagao de cana Palha de arroz Palha de trigo Palha de sorgo Casca de aveia Eucalyptus grandis Eucalyptus globulus Celulose (%) 23,0 31,7 37,6 40,2 43,5 33,8 34,0 30,5 40,2 46,3 Hemicelulose (%) 32,7 34,7 34,5 26,4 22,0 31,8 44,0 28,6 15,7 17,1 Lignina (%) 24,4 20,3 12,6 25,2 17,2 20,1 20,0 23,1 26,9 22,9
Fonte: TAMANINI & HAULY (2004); CANETTIERI et al. (2001); MUSSATO & ROBERTO (2002)
Desta maneira, faz-se necessrio conhecer a estrutura e as principais caractersticas dos principais componentes da biomassa lignocelulsica: celulose, hemicelulose e lignina.
2.1.1. Celulose A celulose (23% - 50% da matria seca da biomassa lignocelulsica) um polmero linear que contm at 15.000 unidades de -D-glicoses unidas por ligaes glicosdicas -1,4 carbono-carbono e por ligaes de hidrognio intramoleculares (ligaes entre unidades de glicose da mesma molcula) e intermoleculares (entre unidades de glicose de molculas adjacentes) (Figura 2.2) (ARANTES & SADDLER, 2010). As ligaes intermoleculares so responsveis pela rigidez; e as ligaes intramoleculares so responsveis pela formao de fibrilas, estruturas altamente ordenadas que se associam formando as fibras de celulose. As fibrilas apresentam
desde regies com elevado grau de cristalinidade, nas quais as cadeias de glicana esto firmemente ligadas em paralelo, at regies com menor grau de ordenao, chamadas de regies amorfas. Na regio cristalina, as fibras tm maior resistncia trao, ao alongamento e solvatao (absoro de solvente) que na regio amorfa, onde a fibra possui sua maior flexibilidade (VSQUEZ et al., 2007). O ndice de cristalinidade e o grau de polimerizao so propriedades importantes para a classificao dos polmeros celulsicos. O grau de polimerizao informa a freqncia relativa de ligaes glicosdicas internas e terminais, disponveis para atuao de celulases. Pode ser definido com base no nmero mdio de monmeros e no peso mdio do polmero, assim como inferido a partir de sua viscosidade. J o ndice de cristalinidade est associado reatividade do substrato e pode ser quantificado pelo mtodo de difrao de raios X (D`ALMEIDA, 1988). Estas caractersticas, juntamente com o envoltrio de lignina, conferem macromolcula celulose grande resistncia hidrlise, o que representa um grande desafio para a utilizao dos materiais lignocelulsicos em aplicaes biotecnolgicas, como a produo de etanol de segunda gerao (ARANTES & SADDLER, 2010).
Ligao de hidrognio intramolecular
Ligao de hidrognio intermolecular
Celobiose Figura 2.2. Estrutura qumica da celulose (MORAIS, 2005)
10
2.1.2. Hemicelulose Por sua vez, a frao hemicelulsica (15% - 45% do material lignocelulsico seco) consiste em cadeias ramificadas de acares, cujas unidades incluem principalmente aldopentoses, como xilose e arabinose, e aldohexoses, como glicose, manose e galactose. Esta macromolcula contm ainda, cidos hexurnicos, como os cidos -D-glucurnico, D-4-O-metilglucurnico e -D-galacturnico, e deoxiexoses (Figura 2.3). A variedade de ligaes e de ramificaes, assim como a presena de diferentes unidades monomricas, contribui para a complexidade da estrutura hemicelulsica e suas diferentes conformaes (KOOTSTRA et al., 2009). Diferentemente da celulose, a hemicelulose apresenta baixa massa molecular (100-200 unidades glicosdicas) e no contm regies cristalinas, sendo, portanto, mais suscetvel hidrlise qumica sob condies mais brandas. Porm, a fermentao dos acares de cinco carbonos (pentoses) ainda no to desenvolvida quanto os processos envolvendo a glicose (SUN & CHENG, 2005).
Figura 2.3. Componentes da frao hemicelulose (MORAIS, 2005)
A Tabela 2.2 resume as principais caractersticas da celulose e hemicelulose. O entendimento destas caractersticas de fundamental importncia para a
11
definio das estratgias de aproveitamento das biomassas como matrias-primas para a produo de bioetanol e de outras substncias qumicas.
Tabela 2.2. Diferenas entre hemicelulose e celulose CELULOSE Unidades de glicose unidas entre si Alto grau de polimerizao (1000 a 15000 unidades de glicose) Forma arranjo fibroso Apresenta regies amorfas e cristalinas atacada lentamente por cido inorgnico diludo a quente insolvel em lcalis Fonte: PEREIRA Jr. et al. (2008) HEMICELULOSE Unidades de diferentes pentoses e hexoses ligadas entre si Baixo grau de polimerizao (60 a 300 unidades de acares) No forma arranjo fibroso Apresenta somente regies amorfas atacada rapidamente por cido inorgnico diludo a quente solvel em lcalis
2.1.3. Lignina J a estrutura bioqumica da frao lignina (10% - 30%) no est relacionada a molculas simples de acar, no sendo pretendida por isso, para a produo de bioetanol por rotas fermentativas. Essa frao, no entanto, desempenha um papel fundamental para o sucesso da tecnologia de hidrlise, uma vez que dificulta o acesso celulose. A estrutura da lignina apresenta forma tridimensional e formada por unidades de p-propilfenol, com substituintes metoxila no anel aromtico, unidas por ligaes do tipo ter e que estabelecem ligaes cruzadas entre si. Esta macromolcula formada pela polimerizao de trs diferentes monmeros: lcool cumrico, lcool coniferlico e lcool sinaplico (Figura 2.4) (LEMOS, 2001). A lignina representa um dos maiores estoques de carbono/energia da natureza e o maior depsito de estruturas qumicas aromticas, constituindo-se em uma fonte potencial de valiosos insumos para a indstria qumica. Apesar de ser possvel produzir diversos produtos com base na lignina, atualmente o foco dos estudos tem se voltado para o uso desse material como fonte de energia para os processos, o que garantiria a auto-suficincia e, eventualmente, at a possibilidade de exportar alguma energia eltrica excedente. Naturalmente, essa situao
12
positiva tanto para a viabilidade econmica da tecnologia quanto para os quesitos ambientais, j que reduziria a dependncia por recursos energticos fsseis externos (PEREIRA Jr. et al., 2008).
lcool trans-coniferlico
lcool trans-sinaplico
lcool trans-para-cumarlico Figura 2.4. Precursores primrios da lignina (DALMEIDA, 1988)
2.1.4. Pr-tratamentos A converso da maioria dos materiais lignocelulsicos a lcool a partir da celulose requer pr-tratamento antes da hidrlise deste polissacardeo ser realizada. O objetivo do pr-tratamento remover a hemicelulose e a lignina, reduzir a cristalinidade da celulose e aumentar a porosidade dos materiais; alm disso, deve evitar a degradao ou perda de carboidratos e a formao de bioprodutos que possam inibir os microorganismos fermentadores. Existem diversos tipos de prtratamentos, com diferentes rendimentos e efeitos distintos sobre a biomassa e conseqente impacto nas etapas subseqentes. Dentre os vrios mtodos de prtratamento, os mais comumente utilizados so pirlise, Steam explosion, Amomnia fiber explosion, CO2 explosion, ozonlise, hidrlise cida, hidrlise alcalina, deslignificao oxidativa e processo Organosolv (SUN & CHENG, 2005). Apesar do resduo proveniente do sistema de decantao da indstria de celulose, matria-prima utilizada neste trabalho, ser composto por celulose, hemicelulose e lignina, no necessria a submisso desta biomassa a etapas de pr-tratamentos antes da realizao da hidrlise da celulose, uma vez que no seu
13
processo de origem, realizada a deslignificao das polpas, permitindo a remoo da maior parte da lignina e da hemicelulose. Esta importante caracterstica coloca este resduo numa posio altamente promissora e competitiva com os outros resduos agroflorestais lignocelulsicos para a produo de bioetanol de segunda gerao, em virtude das etapas de pr-tratamentos representarem custos adicionais na produo deste biocombustvel.
2.1.5. A celulose no contexto de biorrefinaria O termo biorrefinaria relativamente novo, referindo-se ao uso das biomassas e seus resduos, portanto matrias-primas de fontes renovveis, de forma integrada e diversificada para a produo de combustveis, produtos qumicos, energia e outros materiais de interesse no mercado industrial, com a gerao mnima de resduos e emisses de gases nocivos. O conceito de biorrefinaria anlogo ao das atuais refinarias de petrleo, as quais produzem uma variedade de combustveis e produtos qumicos a partir do petrleo in natura (PEREIRA Jr. et al., 2008). A utilizao de biomassas lignocelulsicas dentro do contexto de biorrefinaria baseada em duas diferentes plataformas: a plataforma bioqumica, que emprega processos biolgicos na converso dos acares extrados das biomassas por processos de hidrlise; e a plataforma termoqumica, cujo conceito j est inferido no nome, que emprega processos termoqumicos para a converso de biomassas na presena ou ausncia de O2 (PERVAIZ & CORREA, 2009). Dentro do contexto da plataforma bioqumica, tanto os monmeros da celulose quanto os da hemicelulose, podem ser utilizados como blocos de construo de diferentes e diversos produtos. A partir da hidrlise total da celulose, obtm-se somente glicose, que devido a existncia de uma via metablica comum e exclusiva na maioria dos seres vivos, pode ser biologicamente convertida em bioetanol, cidos orgnicos, glicerol, sorbitol, manitol, frutose, enzimas, polmeros, entre outras substncias. A glicose pode ser ainda convertida quimicamente ou enzimaticamente em hidroximetilfurfural, que um importante intermedirio para a produo de dimetilfurfural (DMF). O bioetanol por sua vez, foco deste presente trabalho, pode ter inmeras aplicaes, dentre elas: como combustvel veicular ou
14
aditivo de combustvel; empregado na produo de molculas como butadieno, steres e etileno; aplicado na indstria farmacutica, alimentcia e cosmtica (PEREIRA Jr. et al., 2008). A Figura 2.5 mostra esquematicamente as substncias que podem ser produzidas a partir da glicose proveniente da celulose.
POLISTERES
BORRACHA SINTTICA POLIHIDROXIALCANOATOS VITAMINA C POLMEROS
POLMEROS FURNICOS
CIDO LEVULNICO
BUTADIENO STERES CIDO ACTICO
DM CELULOSE REGENERADA TER STERES GLICOSE CELULOSE ENZIMAS HMF SORBITOL
ETILENO
ETANOL
BUTANOL ACETONA GLICEROL CIDO CTRICO CIDO BUTRICO CIDO GLUTMICO CIDO LTICO CIDO GLUCNICO CIDO SUCCNICO
Figura 2.5. Biorrefinaria de matrias-primas lignocelulsicas: produtos da celulose (PEREIRA Jr. et al., 2008)
Entretanto, para que tais substncias possam ser produzidas a partir da glicose da celulose, faz-se necessrio hidrolisar este polissacardeo a fim de disponibilizar seus monmeros para os processos ulteriores.
2.1.6. Hidrlise enzimtica da celulose A hidrlise enzimtica da celulose catalisada por enzimas altamente especficas que so chamadas de celulases; na realidade, trata-se de um complexo enzimtico composto por pelo menos trs grandes grupos de celulases: endoglucanases, que clivam randomicamente as ligaes internas da regio amorfa, liberando oligossacardeos com terminaes redutoras e no redutoras livres; exoglucanases, subdivididas em celobiohidrolases, que so responsveis pela hidrlise dos terminais redutores (CBHs do tipo I) e no redutores (CBHs do tipo II),
15
e glucanohidrolases (GHs), que so capazes de liberar molculas de glicose diretamente dos terminais do polmero; e -glucosidases, que hidrolisam a celobiose e oligossacardeos solveis de baixo grau de polimerizao (menor que 7) a glicose. As enzimas do complexo celulsico sofrem inibio pelo seu produto de hidrlise (ARANTES & SADDLER, 2010). Individualmente, as enzimas do complexo celulsico no hidrolisam a celulose de maneira eficiente, sendo necessria uma ao complementar e sinrgica, ou seja, uma ao em conjunto para que o rendimento das celulases quando atuam simultaneamente seja melhor do que a soma dos rendimentos individuais. So conhecidas pelo menos trs formas de sinergia (LYND et al., 2002): Sinergia endo-exo: as endoglucanases atuam nas regies amorfas, liberando terminais redutores e no redutores, nos quais atuaro as CBHs do tipo I e do tipo II, respectivamente. Sinergia exo-exo: as CBHs I e CBHs II atuam simultaneamente nos terminais redutores e no redutores liberados pelas endoglucanases. Sinergia exo-BG e endo-BG: as exoglucanases e endoglucanases liberam celobiose e oligossacardeos, respectivamente, que so substratos da -glucosidase. Durante a hidrlise de substratos solveis, ocorrem basicamente os seguintes fenmenos: a adsoro das celulases aos stios disponveis no substrato celulsico; formao de um complexo ativo celulases-substrato; hidrlise das ligaes glicosdicas do polmero celulsico; e dessoro do complexo celulsico do substrato hidrolisado (ZHANG & LYND, 2004). Muitos fatores podem afetar a hidrlise enzimtica da celulose, como por exemplo, a concentrao de substrato, a atividade da celulase e as condies da reao (temperatura, pH, bem como outros parmetros). Para melhorar o rendimento e a taxa de hidrlise, necessrio otimizar o processo e reforar a atividade das celulases (SUN & CHENG, 2002). Quando comparada com a hidrlise cida, a hidrlise enzimtica da celulose geralmente conduzida em condies mais brandas (pH 4,8 e temperatura entre 45 e 50C), no causa problemas de corroso e permite maiores rendimentos
16
(75%- 85%), alm de possibilitar a fermentao simultnea sacarificao (processo SSF - Simultaneous Saccharification and Fermentation) que ser discutido posteriormente. Devido seu grande potencial de evoluo, muitos especialistas vem a hidrlise enzimtica como a chave para a produo de bioetanol de segunda gerao a um custo competitivo em longo prazo (PHILIPPIDIS & SMITH, 1995; LYND et al., 2002). Tanto as bactrias como os fungos (aerbios ou anaerbios, mesfilos ou termfilos) podem produzir celulases que hidrolisam materiais lignocelulsicos. Dentre as bactrias, as espcies Cellulomonas fimi e Thermomonospora fusca so as mais estudadas para a produo de celulases. Dentre os fungos que produzem celulases, esto Sclerotium rolfsii, Phanerochaete chrysosporium e os dos gneros Trichoderma, Aspergillus, Penicillium e Schizophyllum. De todos estes gneros, Trichoderma tem sido o mais amplamente estudado para a produo de celulases (DUFF & MURRAY, 1996).
2.2. A INDSTRIA DE CELULOSE
As primeiras matrias-primas usadas na fabricao de celulose em escala industrial foram as madeiras do pinheiro e do abeto das florestas das zonas frias do norte da Europa e Amrica do Norte. Outras espcies - o vidoeiro, a faia e o choupo preto nos Estados Unidos e Europa, o pinheiro no Chile e Nova Zelndia e o eucalipto no Brasil, Espanha, Portugal, Chile e frica do Sul - so utilizadas na indstria de celulose. Praticamente qualquer rvore pode ser utilizada para produzir celulose. Cada espcie produz fibras de celulose com caractersticas especficas, o que confere ao papel propriedades especiais (CAMPOS, 1997). Atualmente, a produo de celulose baseia-se principalmente em florestas plantadas, embora alguns pases asiticos, europeus e a Amrica do Norte ainda utilizem florestas nativas. O Brasil utiliza essencialmente espcies de eucalipto de florestas plantadas, localizadas principalmente nos estados de Minas Gerais, So Paulo, Esprito Santo, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Bahia, Par e Maranho (BRACELPA, 2010).
17
Eucalipto (do grego, eu + = "verdadeira cobertura") a designao vulgar das vrias espcies vegetais do gnero Eucalyptus, ainda que o nome se aplique a outros gneros de mirtceas. O gnero inclui mais de 700 espcies, quase todas originrias da Austrlia, e se adapta a praticamente todas as condies climticas (BINKLEY et al., 2003). O eucalipto oferece diversas vantagens em comparao a outras espcies florestais utilizadas no mundo para a produo de celulose, inclusive as nativas. Graas ao clima favorvel do Brasil e ao avano alcanado em pesquisa e tecnologia florestal, o eucalipto apresenta o menor ciclo de crescimento quando comparado com outras rvores, podendo ser colhido em apenas 7 anos para a produo de celulose, quando atinge at 35 metros de altura (Tabela 2.3). Tambm utilizado para extrao de leos essenciais com os quais so fabricados produtos de limpeza, alimentcios, perfumes e remdios. E com a madeira, tradicionalmente, so produzidas tbuas, sarrafos, lambris, ripas, vigas e postes, entre outros (BRACELPA, 2010).
Tabela 2.3. Comparao de rotao e rendimento de rvores rvore Eucalipto Eucalipto Eucalipto Eucalipto Eucalipto Btula Pinus spp Pinus radiata Pinus radiata Pinus elliottii Pinus de Oregon Picea abies Picea glauca Piece mariana Pas Brasil frica do Sul Chile Portugal Espanha Sucia, Finlndia Brasil Chile Nova Zelndia EUA Canad (costa) Sucia, Finlndia Canad Canad (leste) Rotao (anos) 7 8-10 10-12 12-15 12-15 35-40 15 25 25 25 45 70-80 55 90 Rendimento (m3/ha ano) 41 20 30 12 10 4 35 22 22 10 7 4 3 2
Fonte: BRACELPA (2010)
18
No comeo, a celulose de eucalipto era vista como fibra secundria, de menor valor. Mas, gradativamente, passou a ser muito requisitada pela indstria papeleira, em funo das caractersticas nicas da fibra (FORRESTER et al., 2006). A fibra de eucalipto trata-se de uma fibra rgida e curta. Na verdade, a fibra mais curta entre as espcies de madeira dura no mundo e seu comprimento mdio pode chegar a apenas 0,65 mm. As fibras da btula, do choupo, da faia e do carvalho so 15% a 40% maiores. E as fibras das conferas medem muito mais que o mnimo de 2 mm. Alm disso, a fibra de menor granulao dentre aquelas mais comumente encontradas no mercado de celulose. A granulao igual ao peso da fibra dividido por seu comprimento (STAPE et al., 2010). Como sua fibra curta e de baixa granulao, o eucalipto apresenta um nmero alto de fibras por grama, sendo comumente encontrados valores na faixa de 20 milhes. A ttulo de exemplo, o pinheiro do sul dos Estados Unidos est no extremo oposto, com 1 milho de fibras por grama. As propriedades especialssimas de suas fibras tornam a pasta celulsica do eucalipto a melhor matria-prima para a maioria dos tipos de papel. Quando devidamente processada, a pasta de celulose de eucalipto alcana todas as exigncias de alta qualidade, agregando mais valor ao produto final (ARACRUZ, 2009). As florestas plantadas de eucalipto visam garantia do suprimento de matria-prima para as indstrias de papel e celulose, siderurgia a carvo vegetal, lenha, serrados, compensados e lminas e painis reconstitudos (aglomerados, chapas de fibras e MDF) (LOPES, 1998). No Brasil, para o cultivo do eucalipto existem duas regies em termos climticos: tropical e subtropical. A regio sudeste, predominantemente tropical, concentra a maior rea de plantio. A localizao do plantio e o comportamento da espcie so os principais parmetros que delimitam o uso de eucalipto. Na Tabela 2.4 algumas espcies de eucalipto so caracterizadas, indicando o uso de sua madeira, bem como o seu comportamento no tipo de rea agrcola em que plantada (EMBRAPA, 2007). O Setor Florestal Brasileiro conta com, aproximadamente, 530 milhes de hectares de florestas nativas, 43,5 milhes de hectares em Unidades de Conservao Federal e 4,8 milhes de hectares de florestas plantadas com
19
eucalipto, pinus e accia-negra. As atividades florestais no Brasil geram mais de 2 milhes de empregos, contribuindo com mais de 20 bilhes de dlares para o PIB (Produto Interno Bruto), exportando mais de US$ 4 bilhes (8% do agronegcio) e contribuindo com 3 bilhes de dlares em impostos por ano, arrecadados de 60.000 empresas (BRACELPA, 2010).
Tabela 2.4. Caracterizao de espcies de eucalipto Espcie de eucalipto E. dunnii Localizao da propriedade agrcola Em regies sujeitas a geadas severas e freqentes Em regies sujeitas a geadas severas e freqentes Uso da madeira Fins energticos (fonte de energia ou carvo vegetal) e serraria Fins energticos (fonte de energia ou carvo vegetal) Fins energticos (fonte de energia ou carvo vegetal), celulose de fibra curta, construes civis e serraria Uso geral Fins energticos, mveis, estruturas, caixotaria, postes, escoras, moures, celulose Fins energticos, serraria, postes, dormentes, moures, construes Fins energticos (fonte de energia ou carvo vegetal), construes civis e uso rural Comportamento da espcie Apresenta rpido crescimento e dificuldade na produo de sementes Boa forma do fuste, intensa rebrota, fcil produo de sementes e requer volume alto de precipitao pluviomtrica anual Maior crescimento e rendimento volumtrico das espcies e aumenta a qualidade da madeira com a durao do ciclo Crescimento menor que E. grandis e boa regenerao por brotao das cepas Madeira mais densa que E. grandis e menos suscetvel deficincia de Boro rvores recomendadas para regies de dficit hdrico anual elevado Excelente forma do fuste, durabilidade natural e alta resistncia a insetos e fungos
E. benthamii
E. grandis
Em regies livres de geadas severas Em regies livres de geadas severas Em regies livres de geadas severas Em regies livres de geadas severas Em regies livres de geadas severas
E. urophylla
E. saligna
E. camaldulensis
E. cloeziana
Fonte: EMBRAPA (2007)
2.2.1. Produo de celulose Para produo de papel utiliza-se como matria-prima a pasta de celulose, que por sua vez produzida a partir da madeira. As etapas da produo de madeira constituem-se basicamente na produo de mudas e no plantio destas, que pode ser mecanizado, manual ou semi mecanizado. Em seguida, as rvores so colhidas
20
para que a madeira seja disponibilizada para a produo de celulose. A produo de celulose constitui-se de quatro etapas: picagem, polpao, branqueamento e secagem, as quais sero descritas a seguir (Figura 2.6) (ARACRUZ, 2009).
Figura 2.6. Fluxograma de blocos da produo da pasta de celulose Elaborado com base em ROSA (2003)
Picagem Na etapa de picagem, a madeira chega como toras, com 5,5 m de comprimento e dimetro variando entre 7 cm e 40 cm. Estas toras so armazenadas em ptios e depois enviadas a um descascador, sendo a casca posteriormente queimada para gerao de energia. As toras descascadas seguem atravs de esteiras at o picador, onde so cortadas em pedaos pequenos chamados cavacos. Os cavacos so peneirados de forma que fiquem dentro de uma faixa de dimetro estabelecida, retirando lascas e finos, e transportados por correias at os digestores, onde se inicia o processo de polpao (ARACRUZ, 2009).
Polpao Para produzir a polpa, os cavacos so submetidos s seguintes etapas: cozimento; depurao e lavagem; deslignificao e lavagem; e estocagem (LOPES, 1998).
21
Cozimento: o objetivo do cozimento dos cavacos separar a lignina, extrativos e outros materiais no celulsicos, responsveis pela unio das fibras de celulose. Durante este processo os cavacos so colocados em autoclaves, chamados de cozinhadores ou digestores, onde so tratados com produtos qumicos (licor de cozimento, NaOH, Na2S) e submetidos temperatura, presso e tempos variveis dependendo do produto final desejado at que se consiga a dissoluo do maior grau possvel do material no celulsico.
Depurao e lavagem: o objetivo da depurao separar os materiais no cozidos, como impurezas, areia, ns e palitos. Em seguida, realiza-se a lavagem para separar as fibras (liberadas durante o processo de cozimento) das substncias extradas da madeira (dissolvidos durante o cozimento) e dos materiais qumicos (licor de cozimento).
Deslignificao e lavagem: o objetivo da deslignificao a dissoluo da lignina residual atravs de um tratamento com oxignio. A seguir a lignina retirada da massa celulsica atravs de uma segunda lavagem, resultando numa polpa pr-branqueada.
Estocagem: a celulose pr-branqueada armazenada na torre de estocagem e encaminhada ao processo de branqueamento ou diretamente para as unidades de secagem e/ou mquinas de papel.
Branqueamento O objetivo do branqueamento melhorar as propriedades ticas da pasta celulsica (brancura, alvura, opacidade e estabilidade da pasta). um processo fsico-qumico no qual so removidos os derivados da lignina (remanescentes na pasta celulsica aps o processo de polpao) e adicionados produtos que modificam quimicamente as substncias existentes na pasta, descolorando-a. Aps este processo a pasta est pronta para ser enviada para as mquinas de papel e/ou unidades de secagem. Neste processo, a polpa tratada com qumicos, como perxido de hidrognio, dixido de cloro, oxignio e soda custica contendo cloro, que propiciam o clareamento da polpa at o grau requerido pela indstria, o que depende da finalidade que a pasta de celulose ter (ROSA, 2003).
22
Secagem Aps o branqueamento, a celulose enviada para a secagem. Nesta operao a gua retirada da celulose, at que esta atinja o ponto de equilbrio com a umidade relativa do ambiente (90% de fibras e 10% de gua), obtendo-se assim a pasta de celulose pronta para venda e uso na produo de papel (LOPES, 1998).
2.2.2. Resduos gerados na produo de celulose Dentre os resduos da indstria de celulose, esto os resduos da madeira, provenientes do descascamento e picagem das toras e do peneiramento dos cavacos; resduos do digestor, como alcali ativo, licor negro e inmeros insumos qumicos; resduos celulsicos do sistema de decantao, oriundos da etapa de polpao e branqueamento; e resduos de outras etapas, como resduos florestais, lama de cal, ClO2, lodo biolgico e cinza. Estima-se que para cada 100 toneladas de celulose produzida, 48 toneladas de resduos sejam geradas (PEDRAZI, 2005). As alternativas possveis para a destinao dos resduos de madeira so a compostagem, produo de energia, uso como lenha e carvo vegetal, produo de painis etc. Atualmente, a empresa Aracruz Celulose gera, aproximadamente, 165 mil ton/ano de casca (55% umidade) e 90 mil ton./ano de cavacos residuais (45% umidade). Com esses resduos, gera-se em mdia, 2,6 toneladas de vapor/ tonelada de biomassa seca e a mdia de gerao de energia eltrica de 8 toneladas vapor/ MW. O excedente de energia vendido, bem como o excedente de biomassa. Esses valores variam de acordo com o suprimento de biomassa (ARACRUZ, 2009). Como a madeira do eucalipto constituda de elementos anatmicos dos quais os mais importantes so as fibras, quando so gerados resduos fibrosos, perde-se um material valioso rico em celulose. Essa perda implica no aumento dos custos, no s pela perda de matria-prima, mas tambm por ter mais um resduo a ser manuseado, transportado e disposto. Por essa razo, gerar resduos slidos fibrosos em fbricas de celulose um grande problema (PEDRAZI, 2005). Em relao ao licor negro que sai do digestor, grande parte das fbricas produzem energia a partir de sua queima e/ou o reutilizam no processo aps um tratamento que o converte novamente em licor branco, que utilizado no cozimento.
23
Desta maneira, as fbricas reduzem a quantidade de licor negro liberado nos efluentes lquidos. Os rejeitos do digestor so resduos problemticos, pois possuem alcalinidade ativa, pH alto, lixiviam lquido escuro, e com isso, possuem impacto ambiental substancial (ARACRUZ, 2009). Em relao aos resduos celulsicos do sistema de decantao, so gerados nas diferentes etapas do processo, como depurao, deslignificao e branqueamento. Estes resduos so ricos em fibras celulsicas e quando vo para os efluentes, causam problemas de slidos suspensos e de DQO (Demanda Qumica de Oxignio) elevados. Essas fibras ou exigiro grandes decantadores para a sua remoo como lodo, ou iro para os cursos dgua causando inmeros problemas de poluio. Se forem despejadas nos rios, podem se acomodar nas guelras dos peixes, causando sua mortandade, e/ou acumular-se na forma de sedimentos nos fundos dos rios, podendo sofrer fermentaes que geram odor desagradvel (LOPES, 1998). Este resduo celulsico gerado juntamente com outros resduos, como o licor negro e insumos qumicos residuais do digestor, que so coletados e encaminhados para tubulaes nicas que os levam para os decantadores, equipamentos situados no final do processo, onde o efluente lquido separado dos slidos. Atualmente, a empresa Aracruz Celulose produz, aproximadamente, 30 mil toneladas/ano destes resduos celulsicos, que so clarificados e aproveitados como subprodutos, por exemplo, na produo de embalagens, caixas (por exemplo, caixa de ovos), suportes, papis higinicos, capa de caderno, etc. (ARACRUZ, 2009). Por ser esse resduo fibroso uma biomassa, portanto composto
majoritariamente por celulose, hemicelulose e lignina, o mesmo pode ser aproveitado na produo de inmeros produtos de interesse industrial que podem conferir um valor agregado muito maior. Dentre esses produtos, encontram-se polmeros, cidos (actico, succnico, urnico, etc.), monossacardeos, fenol, xilitol, sorbitol, combustvel lquido, como o etanol, e produtos qumicos em geral. Assim, pode-se translocar essa biomassa de sua posio de resduo para a posio de matria-prima, excluindo assim, um componente do cenrio de resduos gerados pelas indstrias (PEREIRA Jr. et al., 2008). Desta maneira, esse resduo celulsico produzido na indstria de celulose constitui a matria-prima de interesse deste trabalho para a produo de bioetanol
24
como combustvel veicular. Baseado neste propsito faz-se necessrio submeter o citado resduo hidrlise enzimtica, a fim de disponibilizar seus monmeros de glicose para serem utilizados pelos microorganismos fermentadores.
2.2.3. Aspectos econmicos da indstria de celulose A indstria brasileira de celulose encerrou 2009 com a produo de 13,5 milhes de toneladas de celulose, aumentando 6% em relao a 2008 (Figura 2.7), quando o Brasil ocupou a quarta posio no ranking dos maiores produtores mundiais de celulose (Tabela 2.5). Em relao exportao brasileira de celulose em 2009, 8,2 milhes de toneladas foram destinadas ao mercado externo, principalmente para os pases europeus (46%) (Figura 2.8) (BRACELPA, 2010). O setor de celulose, juntamente com o setor de papel, formado por 220 empresas instaladas em 450 municpios de 17 estados brasileiros, mantendo 110 mil empregos diretos (65 mil nas atividades industriais e 45 mil pessoas dedicadas rea florestal). O faturamento do setor de celulose e papel em 2009 foi de 28,4 bilhes de reais e foi responsvel pela arrecadao de 2,1 bilhes de reais de impostos (BRACELPA, 2010).
16 Produo (milhes de ton) 14 12 10 8 6 4 2 0 1970 1980 1990 2006 Ano 2007 2008 2009
Figura 2.7. Evoluo da produo brasileira de celulose Elaborado com base em BRACELPA (2010)
25
Tabela 2.5. Maiores produtos mundiais de celulose em 2008 Pas 1. EUA 2. China 3. Canad 4. Brasil 5. Sucia 6. Finlndia 7. Japo 8. Rssia 9. Indonsia 10. Chile 11. ndia 12. Alemanha Demais Total Produo (mil tonelada) 51.479 21.477 20.299 12.697 12.071 11.720 10.670 7.430 6.435 4.985 3.662 2.902 26.591 192.418
Elaborada com base em BRACELPA (2010)
Amrica do Norte 18 %
sia / Oceania 12 %
China 24 %
Europa 46 %
Figura 2.8. Destinos das exportaes brasileiras de celulose (BRACELPA, 2010)
26
2.3. O BIOETANOL NO CONTEXTO DE 2 GERAO DE BIOCOMBUSTVEIS
2.3.1. Dimenses tcnicas e ambientais do uso de bioetanol como combustvel veicular Qualquer que seja sua origem biomassa ou processos petroqumicos e carboqumicos , o etanol um combustvel, ou seja, libera significativas quantidades de calor ao se queimar. Contudo, o etanol apresenta algumas diferenas importantes em relao aos combustveis convencionais derivados de petrleo. A principal delas o elevado teor de oxignio, que constitui 35% em massa do etanol. As caractersticas do etanol possibilitam a combusto mais limpa e o melhor desempenho dos motores, contribuindo para a reduo das emisses poluidoras. Alm disso, comporta-se como um verdadeiro aditivo para a gasolina (GOLDEMBERG et al., 2008). Na Tabela 2.6 esto sintetizadas as principais caractersticas do etanol e de uma gasolina tpica.
Tabela 2.6. Propriedades da gasolina e do bioetanol Parmetro Poder calorfico Densidade Octanagem RON (Research Octane Number) Octanagem MON (Motor Octane Number) Calor latente de vaporizao Relao ar/combustvel estequiomtrica Presso de vapor Temperatura de ignio Solubilidade em gua Fonte: GOLDEMBERG & MACEDO (1994) Unidade kJ/kg kJ/litro kg/litro __ __ kJ/kg __ KPa C % volume Gasolina 43.500 32.180 0,72 0,78 90 100 80 92 330 400 14,5 40 65 220 ~0 Etanol 28.225 22.350 0,792 102 130 89 96 842 930 9,0 15 17 420 100
O etanol, ou lcool etlico, uma substncia com frmula molecular C2H6O, que pode ser utilizada como combustvel em motores de combusto interna com ignio por centelha (ciclo Otto) de duas maneiras: 1) em misturas de gasolina e
27
etanol anidro; ou 2) como etanol puro, geralmente hidratado (GOLDEMBERG et al., 2008). Segundo a legislao brasileira, considerando teores em massa, o etanol anidro deve conter menos de 0,6% de gua, enquanto para o etanol hidratado, esse teor deve estar entre 6,2 e 7,4%. O etanol hidratado puro deve ser usado em motores fabricados ou adaptados especificamente para esse fim, em particular com a adoo de taxas de compresso mais elevadas, visando utilizar adequadamente a octanagem mais alta do etanol frente gasolina e obter ganhos de eficincia de 10%. Aps dcadas de aperfeioamento de motores especialmente fabricados para etanol, a tecnologia automotiva est suficientemente desenvolvida para permitir que veculos a etanol puro hidratado tenham desempenho, dirigibilidade, condies de partida a frio e durabilidade absolutamente similares aos motores a gasolina, especialmente em pases com invernos moderados (BNDES, 2008). A partir de 2003 foram lanados comercialmente no Brasil, veculos com os motores flexveis (flex-fuel), capazes de utilizar, sem qualquer interferncia do motorista, desde 100% de etanol hidratado at uma gasolina com 20% a 25% de etanol anidro (JOSEPH, 2005). Como conseqncia de sua composio, comparativamente s gasolinas tpicas, a combusto da gasolina com etanol e do etanol puro em motores produz menores emisses de monxido de carbono (CO), xidos de enxofre (SOx), hidrocarbonetos e outros compostos poluentes (GOLDEMBERG et al., 2008). Segundo MACEDO et al. (2008), s no ano de 2003, emisses equivalente a 27,5 milhes toneladas de CO2 foram evitadas devido substituio da gasolina por etanol. E com o consumo de etanol em carros flex brasileiros, entre maro de 2003 e janeiro de 2010, evitou-se a emisso de 83,5 milhes de toneladas de gs carbnico na atmosfera (SZWARC, 2010). Por outro lado, elevam-se as concentraes dos aldedos (compostos do tipo R-CHO) e dos xidos de nitrognio (NOx). Entretanto, sinaliza-se uma preocupao especial com as emisses de aldedos associadas ao uso de etanol, pois essas substncias apresentam potencial cancergeno e podem se apresentar em teores mais elevados no escapamento dos motores que utilizam etanol do que naqueles a gasolina pura. Todavia, os catalisadores reduzem esses poluentes a nveis
28
tolerveis, sem agravantes (ABRANTES et al., 2005). A emisso mdia de aldedos nos veculos novos brasileiros de 0,014 g/km para os veculos a etanol e 0,002 g/km para os veculos a gasolina (contendo 22% de etanol anidro), ndices inferiores ao atual limite de 0,020 g/km estabelecido pela legislao ambiental brasileira (CONAMA, 2009). Na Figura 2.9 apresentada a reduo da emisso de gases dos veculos produzidos no Brasil ao longo das dcadas de 80 e 90, devido ao desenvolvimento tecnolgico dos motores e da introduo do etanol (BNDES, 2008). Segundo estudos realizados na Austrlia, a adoo de 10% de etanol na gasolina permitiu decrescer em 32%, 12% e em mais de 27% as emisses de CO, hidrocarbonetos e aromticos, respectivamente, reduzindo o risco carcinognico em 24% (BNDES, 2008). No caso da utilizao de etanol anidro, foram possveis atingir redues de 57% de CO, 64% de hidrocarbonetos e 13% de NOx (SANTOS et al., 2000).
Figura 2.9. Evoluo das emisses de gases dos veculos brasileiros (BNDES, 2008)
2.3.2. Evoluo do bioetanol combustvel no mercado O desenvolvimento histrico do uso do bioetanol como combustvel veicular permitiu que essa alternativa energtica se tornasse um componente regular da
29
matriz energtica brasileira. As Figuras 2.10, 2.11 e 2.12 sintetizam bem o processo de expanso da produo de bioetanol durante as ltimas dcadas. Na Figura 2.10, nota-se como a produo de bioetanol de primeira gerao (anidro e hidratado), produzido a partir da cana-de-acar, respondeu bem expanso da demanda desse biocombustvel (UNICA, 2009), sinalizada, por sua vez, na Figura 2.11, pela evoluo do teor de bioetanol anidro na gasolina desde o incio de seu uso (BNDES, 2008), e na Figura 2.12, pelo crescimento da produo de veculos a bioetanol hidratado (ANFAVEA, 2008).
Figura 2.10. Evoluo da produo de cana-de-acar, etanol e acar no Brasil (UNICA, 2009)
Ano
Figura 2.11. Teor mdio de etanol anidro na gasolina brasileira (BNDES, 2008)
30
Ano
Figura 2.12. Evoluo da produo de veculos a etanol hidratado e de sua participao nas vendas de veculos novos (ANFAVEA, 2008)
O aumento da demanda desse biocombustvel se manteve mais ou menos constante, apesar do grande estancamento das vendas de veculos a bioetanol hidratado na dcada de 90. Assim, desde os anos 1970, o bioetanol de primeira gerao vem sendo usado regularmente em volumes importantes no Brasil. Outra forma de avaliar a atratividade do bioetanol frente aos combustveis convencionais comparando o preo mdio de venda ao consumidor do bioetanol hidratado com o preo praticado para a gasolina comum (Figura 2.13). No caso dos veculos flexible fuel, movidos a lcool e/ou a gasolina, o bioetanol adotado, em geral, at um limite de 70% do preo da gasolina. Nesse contexto, observa-se que, durante a maior parte dos ltimos anos, utilizar o bioetanol em vez da gasolina foi mais interessante, exceto durante poucos e curtos perodos quando seu preo elevou-se ao final da safra, porm reduzindo com seu incio, como indicado na Figura 2.13 (ANP, 2009). Baseado em todas as vantagens proporcionadas pelo uso do etanol comparado a gasolina, registrou um grande aumento das vendas desse biocombustvel. A Figura 2.14 apresenta as vendas de lcool etlico, incluindo o lcool hidratado e o lcool anidro misturado na gasolina classe C, e de gasolina automotiva, incluindo apenas a da classe A, no Brasil (1999-2008) (ANP, 2009).
31
Figura 2.13. Evoluo dos preos mdios para o consumidor do bioetanol hidratado e da gasolina comum no Brasil (ANP, 2009)
Figura 2.14. Vendas de lcool etlico e de gasolina automotiva no Brasil (ANP, 2009)
Na Figura 2.15 apresentada a evoluo da produo de etanol de primeira gerao dos Estados Unidos (EUA), que utiliza o milho como matria-prima, e do Brasil, a qual foi ultrapassada pela produo estadunidense em 2005. Em 2008, a produo brasileira encerrou em 22,5 bilhes de litros de etanol, contra 34 bilhes de litros produzidos pelos EUA, que ocupou a primeira posio no ranking de produo mundial de etanol, seguido ento do Brasil, Unio Europia (UE) (2,8
32
bilhes) e China (1,89 bilhes), como pode ser visualizado na Figura 2.16 (MAPA, 2010; RFA, 2010). Segundo o MAPA (2010), a produo de etanol brasileira em 2009 foi 27,7 bilhes de litros e na safra de 2009/2010, posio em 01 de fevereiro deste ano, j de 25,1 bilhes de litros.
40 35
Produo (bilhes de litros)
30 25 20 15 10 5 0 1998 2000 2002 2004 2006 2008
Brasil EUA
Ano
Figura 2.15. Evoluo da produo de bioetanol do Brasil e dos EUA Elaborado com base em MAPA (2010) e RFA (2010)
Figura 2.16. Produo mundial de bioetanol combustvel em 2008 Elaborado com base em RFA (2010)
33
Com a crescente produo de bioetanol de primeira gerao no Brasil, a rea de cultivo de cana-de-acar dever ser expandida para atender crescente demanda nacional e internacional. Entretanto, para evitar a expanso desmedida das reas de cultivo, tm-se desenvolvido processos biotecnolgicos que permitam a utilizao de biomassas residuais de composio lignocelulsica, abundantemente geradas nos setores agrcolas e florestais, para a produo de bioetanol de segunda gerao. Perspectivas norte-americanas mais otimistas afirmam que em 2022 sero produzidos aproximadamente 60 bilhes de litros de biocombustveis celulsicos ou de segunda gerao, como pode ser visualizado na Figura 2.17. De acordo com esta Figura, a produo de biocombustveis de segunda gerao apresentar o maior crescimento quando comparada com o bioetanol de milho, de primeira gerao.
40
Biocombustveis avanados Biocombustvel celulsico Biodiesel Etanol de milho
30 Bilhes de gales
20
10
0
2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 2018 2019 2020 2021 2022
Ano
Figura 2.17. Perspectivas da produo de biocombustveis Fonte: VERENIUM, 2008
2.3.3. Progresso das aes ambientalistas Em 1975, o Programa Brasileiro de lcool (Prolcool) foi criado com o propsito de reduzir as importaes de petrleo atravs da produo de etanol a partir da cana-de-acar. A produo de etanol subiu de 0,6 milhes m3, em 1975,
34
para 18 milhes m3 no perodo de 2006-2007, com o aumento da produtividade agrcola e industrial (LIMA et al., 2001; BNDES, 2008). Em 1997, um importante acordo foi realizado na cidade de Kyoto (Japo), que ficou conhecido como Protocolo de Kyoto, no qual foram estabelecidos os mecanismos e limites para a reduo das emisses de gases do efeito estufa (GEE) (perfluorcarbono, hexafluoreto de enxofre, metano, xido nitroso, hidrofluorcarbono e dixido de carbono) de 5,2% entre 2008 e 2012, em relao aos nveis verificados em 1990 (PEREIRA, 2006). Se o Protocolo de Kyoto for implementado com sucesso, estima-se que a temperatura global reduza entre 1,4C e 5,8C at 2100, entretanto, isto depender muito das negociaes aps o perodo 2008/2012, pois h comunidades cientficas que afirmam categoricamente que a meta de reduo de 5% seria insuficiente para a mitigao do aquecimento global (LOUETTE, 2007). Em 2009, no perodo de 7 a 18 de dezembro, realizou-se em Copenhague (Dinamarca) a 15 Conferncia das Naes Unidas sobre Mudana do Clima, conhecida como COP 15, reunindo lderes de todo o mundo que pretendiam definir o comportamento dos pases para a diminuio do aquecimento global, atravs de um tratado que ampliasse e prolongasse o Protocolo de Kyoto. Dentre as intenes aprovadas em COP 15, encontram-se a de cada pas se empenhar para que o aumento da temperatura do planeta no ultrapasse 2C e a criao de um fundo de 10 bilhes de dlares por ano at 2012, que ajudar os pases pobres a enfrentar problemas de mudanas climticas (FOLHA ONLINE, 2009).
2.3.4. Produo de bioetanol de segunda gerao Tanto para a produo de etanol de primeira gerao, a partir de cana-deacar, quanto de segunda gerao, a partir de biomassas de composio lignocelulsica, a via fermentativa a via mais importante para a obteno do lcool etlico no Brasil. Um dos fatores que torna a produo de bioetanol por fermentao a forma mais econmica de sua obteno, o grande nmero de matrias-primas naturais e residuais existentes em todo pas (PEREIRA Jr. et al., 2008).
35
O microorganismo que mais se emprega na fermentao alcolica a levedura Saccharomyces cerevisiae, devido sua capacidade de assimilar facilmente a glicose da cana ou da celulose de biomassas residuais (SNCHEZ & CARDONA, 2008). Dentre as bactrias, a mais promissora a Zymomonas mobilis, que tem alta eficincia energtica resultando num alto rendimento de etanol (maior que 90%). Uma das desvantagens do uso desta bactria na fermentao do caldo de cana e de outros meios com sacarose a formao de polissacardeos, que aumenta a viscosidade do meio de fermentao, e de sorbitol, um produto da reduo da frutose que diminui a eficincia da converso de sacarose a etanol (LEE & HUANG, 2000). A fermentao alcolica inicia-se com a gliclise, tambm chamada de via Embden-Meyerhof, na qual ocorre a oxidao da glicose em dois cidos pirvicos em duas etapas, podendo ocorrer na presena de oxignio ou no. Na primeira etapa, duas molculas de ATP so utilizadas enquanto uma molcula de glicose fosforilada, reestruturada e quebrada em dois compostos de trs carbonos: gliceraldedo 3-fosfato (GP) e diidroxiacetona fosfato (DHAP), que imediatamente convertida em GP. Na segunda etapa, as duas molculas de GP so oxidadas, em muitos passos, em duas molculas de cido pirvico. Nessas reaes, duas molculas de NAD+ so reduzidas a NADH e quatro molculas de ATP (adenosina trifosfato) so formadas pela fosforilao em nvel de substrato, com saldo final positivo de duas molculas de ATP para cada molcula de glicose que oxidada. Aps a gliclise, as duas molculas de cido pirvico so convertidas em duas molculas de acetaldedo e duas molculas de CO2. As molculas de acetaldedo so ento reduzidas por duas molculas de NADH para formar duas molculas de etanol, o produto final da fermentao (Figura 2.18) (TORTORA et al., 2005). Juntamente com o etanol e o CO2, o metabolismo anaerbico leva tambm a formao e excreo de glicerol, cidos orgnicos (succnico, actico, pirvico e outros), lcoois superiores, acetaldedo, acetona, butilenoglicol e outros componentes de menor significado quantitativo. Alm disso, ocorre simultaneamente o crescimento das leveduras. Estima-se que 5% do acar metabolizado pela levedura sejam desviados para gerar tais produtos secundrios da fermentao, resultando num rendimento de 95% em etanol; entretanto, em condies industriais,
36
nas quais fatores qumicos (pH, oxigenao, nutrientes minerais e orgnicos, inibidores), fsicos (temperatura, presso osmtica) e microbiolgicos (espcie, linhagem e concentrao do microorganismo, contaminao bacteriana) afetam a levedura, rendimentos de 90% normalmente so obtidos (GUTIERREZ et al., 1991; ALVEZ, 1994).
Glicose
2 Etanol
Hexoquinase
Glicose 6-fosfato
Fosfoglicoisomerase
2 Acetaldedo
Frutose 6-fosfato
Fosfofrutoquinase
2 cidos pirvicos
Frutose 1,6-difosfato
Aldolase
Piruvato quinase
2 cido fosfoenolpirvico (PEP)

Isomerase Enolase
Diidroxiacetona fosfato (DHAP)
Gliceraldedo 3-fosfato (GP)

Triose-fosfato desidrogenase
2 cido 2-fosfoglicrico
Fosfogliceromutase
2 cido 1,3difosfoglicrico
Fosfoglicero-quinase
2 cido 3fosfoglicrico
Figura 2.18. Fermentao alcolica Elaborado com base em TORTORA et al. (2005)
37
2.3.5. Estratgias para a produo de bioetanol de segunda gerao Com o intuito de aproveitar ambas fraes polissacardicas (celulose e hemicelulose) das biomassas residuais de composio lignocelulsica para a produo de bioetanol de segunda gerao, quatro estratgias so concebidas, cada uma com diferente estgio de desenvolvimento, que sero descritas a seguir. Hidrlise e Fermentao em Separado (Separated Hydrolysis and Fermentation SHF) a concepo mais antiga, na qual a hidrlise da celulose, aps o prtratamento da biomassa para a hidrlise e solubilizao da hemicelulose, ocorre num estgio separado da fermentao, bem como a produo de celulases que so utilizadas na hidrlise da celulose. Neste tipo de estratgia os acares provenientes da hemicelulose aps o pr-tratamento podem ser convertidos a etanol em um fermentador separado, sendo o slido remanescente, denominado celulignina, encaminhado para a hidrlise da celulose (PEREIRA Jr. et al., 2008). O fluxograma apresentado na Figura 2.19 descreve o processo SHF. A principal vantagem dessa estratgia permitir que a hidrlise e a fermentao possam ser conduzidas nas condies timas. Geralmente, a temperatura tima para as celulases est entre 45oC e 50oC, dependendo do microrganismo produtor. E a temperatura tima para a maior parte dos microrganismos produtores de etanol est entre 30oC e 37oC (OLSSON et al., 2006). Por outro lado, a principal desvantagem a inibio do complexo celulsico pelos acares liberados na hidrlise, principalmente celobiose e glicose que se acumulam no meio, conferindo uma hidrlise incompleta da celulose e rendimentos no muito altos (WINGREN et al., 2005). Segundo TAHERZADEH & KARIMI (2007), outra desvantagem do SHF a possibilidade de contaminao. Como o tempo envolvido na etapa de hidrlise muito longo, a soluo de glicdios torna-se uma fonte disponvel para os microrganismos indesejados. Alm disso, as prprias enzimas podem constituir uma fonte potencial de contaminao. Em escala industrial, seria muito difcil esterilizar
38
as celulases, j que isso deveria ser feito por filtrao, pois a autoclavao inativaria as enzimas.
Figura 2.19. Diagrama da Sacarificao e Fermentao em Separado (SHF) Elaborado com base em TAHERZADEH & KARIMI (2007)
Sacarificao e Fermentao Simultnea (Simultaneous Saccharification and Fermentation SSF) Como o nome indica, neste processo, a hidrlise enzimtica e a fermentao das hexoses (acares C6) ocorrem na mesma etapa, enquanto a hidrlise da hemicelulose ocorre em etapa diferente, bem como a produo das celulases, como pode ser visualizado na Figura 2.20 (TAHERZADEH & KARIMI, 2007). Essa estratgia de processo apresenta inmeras vantagens, dentre elas: a reduo da inibio das celulases pelos seus produtos de hidrlise, uma vez que os glicdios no se acumulam no meio; menor complexidade e custo do processo, comparado ao SHF, pois reduz o nmero de reatores; minimizao dos riscos de contaminao, devido s baixas concentraes de acar livre no meio; e maiores
39
rendimentos de hidrlise, j que o equilbrio das reaes enzimticas so deslocados no sentido de formao de mais produto, visto que a glicose concomitantemente consumida (VSQUEZ et al., 2007). Entretanto, o desfavorecimento da cintica enzimtica devido necessidade de conduzir o processo dentro da faixa tima do microorganismo fermentador constitui uma desvantagem. Em relao a este aspecto, estudos tm sido realizados no sentido de produzir celulases que atuem em valores de pH e temperatura prximos daqueles timos para o processo fermentativo (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
Figura 2.20. Diagrama da Sacarificao e Fermentao Simultnea (SSF) Elaborado com base em TAHERZADEH & KARIMI (2007)
Sacarificao e Co-fermentao Simultnea (Simultaneous Saccharification and Cofermentation SSCF) Outro modo de operao o SSCF, no qual a co-fermentao se refere fermentao de ambos acares, pentoses e hexoses, que ocorre no mesmo reator,
40
juntamente com a sacarificao da celulose (Figura 2.21). A hidrlise da hemicelulose e a produo de celulases ocorrem separadamente (TEIXEIRA et al., 2000).
Figura 2.21. Diagrama do processo de Sacarificao e Co-Fermentao Simultnea Elaborado com base em TAHERZADEH & KARIMI (2007)
Como vimos anteriormente, no reator do SSF, somente as hexoses so convertidas a etanol e as pentoses so fermentadas em outro reator, por um organismo diferente. J no processo de SSCF, tanto as hexoses quanto as pentoses so fermentadas por um nico microrganismo em um mesmo reator (HAMELINCK et al., 2005). Para isso, necessria a aplicao da engenharia gentica para desenvolver um microrganismo que fermente ambos os acares. Existem vrios exemplos na literatura de microorganismos modificados geneticamente para essa finalidade (LAWFORD & ROUSSEAU, 1998; Mcmillan et al., 1999; TEIXEIRA et al., 2000).
41
Bioprocesso consolidado (Consolidated Bioprocess CBP) Em todos os processos descritos anteriormente se faz necessria uma unidade separada dedicada produo de enzimas, ou as enzimas devem ser adquiridas de um produtor externo. No CBP, tanto a produo de enzimas quanto a de etanol, produzido a partir dos acares da hemicelulose e celulose, so conduzidas em um nico reator e realizado pelo mesmo microorganismo (Figura 2.22) (TAHERZADEH & KARIMI, 2007).
Figura 2.22. Diagrama do Bioprocesso Consolidado (CBP) Elaborado com base em TAHERZADEH & KARIMI (2007)
Duas estratgias podem ser seguidas para a obteno de organismos para o Bioprocesso Consolidado. A primeira estratgia envolve a modificao de microrganismos naturalmente produtores de etanol, a fim de torn-los produtores eficientes tambm de celulases e/ou xilanases, se a hidrlise da hemicelulose tambm for enzimtica. A segunda estratgia segue o caminho oposto, ou seja, modificar excelentes produtores de celulases com a finalidade de transform-los tambm em eficientes produtores de etanol (LYND et al., 2005).
42
Segundo LYND et al. (2002), todavia no existem organismos ou consrcios de microrganismos capazes de produzir celulases nos nveis desejados e tambm produzir etanol com alta produtividade e altas concentraes, embora vrios organismos j combinem ambas as funes. FUJITA et al. (2004) desenvolveram uma cepa de S. cerevisiae em cuja superfcie celular foram expressos trs tipos de enzimas celulolticas, obtendo um rendimento de 0,45 g/g (gramas de etanol por grama de carboidrato consumido), o que corresponde a 88,5% do rendimento terico. Outro trabalho similar a este foi publicado por DEN HAAN et al. (2007), demonstrando a possibilidade de se desenvolver cepas de leveduras capazes de crescer e de converter celulose em etanol e uma nica etapa. O CBP parece ser uma abordagem alternativa com visvel potencial e o ponto final na evoluo da produo de bioetanol de segunda gerao, a partir de materiais lignocelulsicos. A aplicao do CBP no vincula custos de operao ou investimento de capital para a compra de enzimas ou sua produo, apresentando assim vantagens em relao ao custo de produo (LYND et al., 2005). Independentemente da rota tecnolgica, importante notar o enorme peso que o custo da biomassa tem sobre o custo final do bioetanol. Em geral, nas estimativas realizadas para os pases do hemisfrio norte, o custo da biomassa representa cerca de 40% do custo do bioetanol, e grande parte das redues do custo do biocombustvel para o futuro se baseia na reduo do valor da biomassa. Evidentemente, isso cria grandes expectativas quando se considera algumas regies do planeta, para as quais existem opes de biomassa com custos bem mais baixos, como por exemplo, a cana-de-acar no Brasil, ou de resduos agroflorestais, como os da indstria de celulose, que tem custo de produo irrelevante (BNDES, 2008).
2.3.6. Principais resultados reportados na literatura Na Tabela 2.7 esto resumidas algumas condies utilizadas na produo de bioetanol de segunda gerao por SSF, estratgia de processo mais empregada, a partir de biomassas de composio lignocelulsica.
Tabela 2.7. Condies empregadas no SSF para produo de bioetanol de segunda gerao na literatura (HE: Hidrlise Enzimtica; MO: Microorganismo) Carga enzimtica Material Prtratamento PrHE Celulases (FPU/g) -glucosidase (UI/g) Teor de slido (%) Conc. celular (g/L) Conc. de etanol (g/L) Tempo (h) Qp (g/L.h)
MO
Referncia
Lama de cal da indstria celulose Cavaco de Pinus Palmiste
No
No
15,0
30,0
S. cerevisiae
0,05
45,0
150
0,30
KANG et al., 2010
H2SO4 e NaHSO4 No Exploso com vapor (SO2) e deslignific. perxido alcalino Exploso com vapor (SO2) e deslignific. perxido alcalino Exploso com vapor (SO2) Exploso com vapor (SO2) Exploso com vapor (SO2)
12 h 48 h
15,0 6,0
22,5 _
8 30
S. cerevisiae S. cerevisiae panificao
2,0 7,0
41,8 70,0
_ 216
_ 0,32
ZHU et al., 2010 JORGENSEN et al., 2010
Madeira de oliva
No
15,0
12,6
10
S. cerevisiae
29,4
72
0,41
RUIZ et al., 2006
Caule de girassol
No
15,0
12,6
10
S. cerevisiae
20,9
72
0,29
RUIZ et al., 2006
Picea abies Picea abies Picea abies
16 h
15,0
23,0
S. cerevisiae panificao S. cerevisiae panificao S. cerevisiae panificao
5,0
26,0
71
0,37
WINGREN et al., 2005 WINGREN et al., 2005 STENBERG et al., 1999
16 h
7,5
23,0
5,0
24,0
71
0,34
No
32,0
28,0
7,0
96
0,07
Carga enzimtica Material Prtratamento Exploso com vapor (SO2) Exploso com vapor (SO2) cido e deslignific. com NaOH cido e deslignific. com NaOH Exploso com vapor (H2SO4) cido (H2SO4) Hidrotmico Exploso com vapor (SO2) Exploso com vapor (H2SO4) Exploso com vapor (H2SO4) PrHE Celulases (FPU/g) 32,0 -glucosidase (UI/g) 28,0
Teor de slido (%) 5
MO
Conc. celular (g/L)
Conc. de etanol (g/L) 19,0
Tempo (h)
Qp (g/L.h)
Referncia
Picea abies Picea abies Bagao de cana Bagao de cana Bagao de cana Sabugo de milho Selagem de milho Palha de milho Palha de trigo Palha de cevada
No
S. cerevisiae panificao S. cerevisiae panificao S. cerevisiae panificao Z. mobilis S. cerevisiae
96
0,20
STENBERG et al., 1999 STENBERG et al., 1999 VSQUEZ et al., 2007 SANTOS et al., 2010 MARTIN et al., 2002 ZHANG et al., 2009 XU et al., 2009 HGREN et al., 2007 BALLESTEROS et al., 2006 LINDE et al., 2006
No
32,0
28,0
7,5
25,0
96
0,26
12 h
25,9
10
4,0
30,0
22
1,36
12 h
25,0
23
4,0
60,0
36
1,66
No
8,3
7,8
0,2
12
48
0,25
48 h 24 h
8,0 30,0
_ _
12,5 13
K. marxianus S. cerevisiae panificao S. cerevisiae panificao K. marxianus
10,0 0,2
5,68 20,0
48 194
0,12 0,10
16 h
10,0
16,7
10
1,0
26,7
96
0,28
No
15,0
12,6
10
0,2
0,6
72
0,01
No
20,0
25,0
10
Levedura
5,0
25,0
120
0,21
CAPTULO 3. Justificativa e Objetivos
45
CAPTULO 3
3. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
Neste captulo apresentada a justificativa para o desenvolvimento da presente pesquisa, assim como o objetivo geral do trabalho e os objetivos especficos idealizados para que esse fosse alcanado.
3.1. JUSTIFICATIVA
Petrleo, gs natural e seus derivados representam 55% do consumo mundial de energia. So esses combustveis que permitem a existncia dos meios de transporte rpidos e eficientes que temos hoje, bem como boa parte das atividades industriais. Lamentavelmente, a previso de durabilidade para as fontes de petrleo no ultrapassa mais do que algumas dcadas: como combustveis fsseis, as suas reservas so finitas; a segurana de abastecimento problemtica para muitos pases que os importam; e o seu uso a principal fonte dos gases que esto provocando mudanas climticas e o aquecimento global. preciso, pois, encontrar substitutos para esses combustveis. Nada mais racional do que produzi-los com base em matria orgnica renovvel (biomassa), da
46
qual, no passado distante, os combustveis fsseis foram produzidos pela natureza. Uma das opes o bioetanol, um excelente substituto para a gasolina que o principal combustvel renovvel usado em automveis no mundo. No Brasil, o etanol, produzido da cana-de-acar, j substitui hoje metade da gasolina que seria consumida e seu custo competitivo sem os subsdios que viabilizaram o programa no seu incio, o Procool. Com a crescente demanda do mercado nacional e internacional de lcool, faz-se necessrio expandir as reas de cultivo para que a mesma seja atendida. No entanto, para evitar a expanso desmedida das reas de cultivo, tm se desenvolvidos processos biotecnolgicos que permitam a utilizao dos resduos industriais lignocelulsicos j existentes para a produo de etanol de segunda gerao. Dentre estes resduos, os resduos celulsicos do processo de decantao da indstria de celulose constituem uma das fontes mais promissoras de carboidratos para a produo de etanol de segunda gerao. Dentro desta panormica, torna-se evidente a importncia do
desenvolvimento de processos de produo de etanol a partir do resduo oriundo do processo de decantao da indstria de celulose. neste contexto que esta pesquisa de dissertao se prope a desenvolver a sacarificao e fermentao simultnea (processo SSF) para a produo de bioetanol a partir da frao celulsica do resduo da indstria de celulose. Com isto, pretende-se ampliar a temtica dos trabalhos desenvolvidos nos Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos (LADEBIO) do Departamento de Engenharia Bioqumica da Escola de Qumica da UFRJ.
3.2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo geral a produo de bioetanol carburante empregando uma concepo de processo denominado SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) a partir da celulose contida na celulignina do resduo celulsico do sistema de decantao da indstria de celulose, utilizando linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae e visando estabelecer condies de processo que aumentem a produtividade e eficincia.
47
Para alcanar o objetivo descrito, alguns objetivos especficos foram definidos:
Avaliar a fermentabilidade do resduo fibroso (PM3) da indstria de celulose para a produo de bioetanol, comparando sua potencialidade com a da polpa coletada aps o cozimento (PM1) e a polpa coletada aps a etapa de deslignificao (PM2) para o mesmo propsito;
Realizar um estudo dos efeitos da carga enzimtica e da relao slido:lquido que influenciam a concentrao de glicose liberada na hidrlise enzimtica da biomassa residual PM1 e das polpas PM2 e PM3;
Determinar as melhores condies de hidrlise enzimtica do resduo PM3;
Otimizar o processo SSF do resduo PM3, validando-o com as condies estabelecidas;
Comparar a performance da levedura S. cerevisiae de panificao com a levedura industrial S. cerevisiae JP1;
Avaliar o desempenho do complexo celulsico LADEBIO produzido por uma linhagem de Penicillium funiculosum no processo SSF da biomassa residual PM3, comparando-o com as celulases da Multifect;
Avaliar a influncia da suplementao do hidrolisado com fontes de nitrognio, fosfato e sais sobre a concentrao de etanol.
CAPTULO 4. Materiais e Mtodos
48
CAPTULO 4
4. MATERIAIS E MTODOS
Neste
captulo
so
apresentados
os
materiais
utilizados
para
desenvolvimento da pesquisa e as diferentes metodologias empregadas em cada experimento realizado.
4.1. MATRIA-PRIMA
As trs biomassas utilizadas neste trabalho foram gentilmente cedidas pela empresa Aracruz Celulose e codificadas como PM1, PM2 e PM3 (Figuras 4.1 e 4.2). A biomassa PM1 consistiu da polpa coletada aps o cozimento, etapa do processamento onde os cavacos so tratados com licor branco, contendo hidrxido de sdio e sulfato de sdio, a fim de remover a lignina e separar as fibras celulsicas da madeira. A biomassa PM2 consistiu da polpa coletada aps a etapa de deslignificao. Nesta etapa do processamento, a polpa proveniente do cozimento era submetida a uma deslignificao com oxignio a fim de remover o contedo de lignina residual da polpa que alimenta a planta de branqueamento e enviar a lignina dissolvida de volta ao sistema de recuperao. E a biomassa PM3 era o resduo
49
celulsico proveniente do sistema de decantao, onde foram reunidas todas as fibras refugadas de algumas etapas do processo, ou seja, fibras que no tm qualidade requerida para constituir a pasta de celulose ou papel. Aps o recebimento dessas biomassas, o pH foi ajustado para 4,5 5,0 pela adio de cido clordrico, em virtude da natureza altamente alcalina, realizaram-se lavagem, empregando-se 35L de gua para cada quilo de biomassa, e secagem, apresentando teores de umidades de 7,8% (PM1), 8,2% (PM2) e 4,5% (PM3). Em todos os experimentos considerou-se a massa seca de cada biomassa. Todas as biomassas foram oriundas do processo de celulose que produzida majoritariamente a partir da madeira do hbrido de Eucalyptus grandis com E. urophylla, que foi modificado geneticamente no programa de melhoramento gentico clssico da empresa Aracruz Celulose.
Figura 4.1. Fluxograma da produo de celulose
PM1
PM2
PM3
Figura 4.2. Polpas PM1 e PM2 e resduo PM3 da indstria de celulose
50
4.2. CARACTERIZAO DAS BIOMASSAS PM1, PM2 E PM3
A caracterizao das polpas PM1 e PM2 e do resduo PM3 foi realizada no Centro de Tecnologia da Indstria Aracruz Celulose. Na caracterizao foi possvel quantificar a porcentagem de celulose, hemicelulose e lignina de cada biomassa.
4.3. MICROORGANISMO
Nos experimentos da avaliao da fermentabilidade das biomassas PM1, PM2 e resduo PM3, otimizao e validao do processo SSF de PM3, utilizou-se a estirpe comercial da levedura Saccharomyces cerevisiae (Fleischmann) empregada no processo de panificao, sendo a concentrao celular baseada na massa seca. Nos processos SSF realizados em biorreator, a fim de comparar o desempenho das celulases LADEBIO com o das enzimas Multifect e avaliar a influncia da suplementao do hidrolisado sobre a concentrao de etanol, utilizouse a linhagem industrial de S. cerevisiae JP1 - cedida pela Usina Japungu (Santa Rosa PB). Esta linhagem industrial foi selecionada devido sua robustez, resistncia a altas concentraes de substrato e produto e reduo do risco de contaminao. A manuteno, ativao e propagao desta linhagem de levedura so descritas a seguir.
4.3.1. Manuteno, ativao e propagao celular de S. cerevisiae JP1
Para manuteno, a levedura foi repicada em meio slido (Tabela 4.1), com pH 5,0, incubada a 30C por 24h e estocada sob refrigerao (4C).
Tabela 4.1. Meio de cultura para manuteno da S. cerevisiae JP1 Componente do meio de cultura Glicose Extrato de levedura Agar Fonte: PEREIRA Jr. (1991) Concentrao (g/L) 20,0 10,0 15,0
51
O cultivo de ativao das clulas para obteno do pr-inculo foi realizado em fracos cnicos de 500 mL, com 200 mL de meio lquido (Tabelas 4.2 e 4.3) com pH 5,0, contendo 3 colnias da levedura, mantidos a uma temperatura de 37C e sob agitao de 200 rpm. O tempo do cultivo de ativao foi determinado baseado na durao da fase log ou crescimento exponencial apresentada na cintica realizada.
Tabela 4.2. Meio de cultura para crescimento do pr-inculo Componente do meio de cultura Glicose Extrato de levedura Uria KH2PO4 Soluo de sais e cido ctrico Fonte: DANESI et al. (2006) Concentrao 20,0 g/L 10,0 g/L 1,25 g/L 1,1 g/L 40,0 mL/L
Tabela 4.3. Composio da soluo de sais minerais e cido ctrico Componente MgSO .7H O
4 2
Concentrao (g/L) 12,5 1,25 0,90 0,19
CaCl .2H O
2 2
FeSO .7H O
4 2
MnSO
4 2
CuSO .5H O
4
0,025 0,30 0,025
ZnSO .7H O
4 2
CoCl .6H O
2 2
NaMoO .2H O
4 2
0,035 0,050 0,009
H BO
3
KI Al (SO )
2 4 3
0,0125 12,5
cido Ctrico
Fonte: DU PEREZ et al. (1985)
A propagao do inculo foi conduzida em biorreator instrumentado (New Brunswick BioFlo 310) (Figura 4.3), contendo 1,2 L do meio de cultura utilizado
52
para a propagao do pr-inculo (Tabela 4.2 e 4.3) adicionado de 10% do volume do pr-inculo crescido pelo tempo determinado a partir da cintica realizada. O processo foi controlado automaticamente a uma temperatura de 37C, uma relao de aerao de 0,4 - 3,3 vvm e pH 4,5 mediante adio de NaOH (2M) ou HCL (2M). Para o crescimento do inculo, realizou-se batelada alimentada com pulsos, na qual a alimentao constitua-se de soluo de glicose concentrada (800 g/L), cujo volume adicionado foi calculado a fim de manter a concentrao de glicose do meio em torno de 20,0 g/L. A fim de se obter a concentrao de inculo desejada, determinou-se o volume apropriado de meio de propagao que foi centrifugado a 3000 rpm por 20 minutos. Em seguida as clulas foram resuspensas assepticamente no meio de fermentao.
Figura 4.3. Biorreator instrumentado
4.4. AVALIAO DA FERMENTABILIDADE DE PM1, PM2 E PM3 PARA PRODUO DE BIOETANOL
Com o propsito de avaliar o potencial das polpas PM1 e PM2 e do resduo PM3, dois processos SSF para a produo de etanol foram realizados com cada
53
biomassa. Os processos foram conduzidos em fermentmetros de 500 mL, contendo 200 mL de hidrolisado, utilizando uma relao slido:lquido (S:L) 1:4 para cada grama de slido, adicionou-se 4 mL de meio reacional (tampo citrato de sdio e cido ctrico + enzima) e concentrao celular de 2 g/L. Cada processo foi mantido a uma temperatura de 37C e sob agitao de 200 rpm. Antes do processo SSF, realizou-se uma pr-hidrlise enzimtica com 12 h de durao, em 47C, utilizando celulases comerciais Multifect (Genencor) com carga enzimtica de 32 FPU/g de slido e meio tamponado com citrato de sdio e cido ctrico (pH 5,0). O complexo celulsico apresentava 100 FPU/mL de atividade FPsica, 125 U/mL de atividade -glucosidsica e 5.500 U/ml de atividade CMCsica que foram determinadas pelo mtodo GHOSE (1987). Uma amostra de cada experimento foi coletada aps a pr-hidrlise enzimtica, para quantificao de acares. A concentrao de etanol equivalente foi utilizada para construir os perfis cinticos do SSF. E no final desse processo, uma amostra de cada experimento foi coletada para quantificao de acares e etanol.
4.5. ESTUDO COMPARATIVO DA HIDRLISE ENZIMTICA DE PM1, PM2 E PM3
Para o estudo comparativo da hidrlise enzimtica das biomassas PM1, PM2 e PM3, foi realizado um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) com cada biomassa, considerando 2 variveis independentes em 2 nveis e com 3 repeties do ponto central, cujas condies foram variadas nas faixas especificadas na Tabela 4.4. A varivel de resposta escolhida foi a concentrao de glicose.
Tabela 4.4. Intervalo utilizado para construir o DCCR para a hidrlise enzimtica de PM1, PM2 e PM3 Fatores Relao slido:lquido (g:mL) Carga enzimtica (FPU/g) - 1:11 7 -1 1:10 10 0 1:7,5 17,5 +1 1:5 25 + 1:4 28
A hidrlise enzimtica foi realizada em frascos cnicos, contendo 200 mL de meio reacional mais biomassa, agitados a 200 rpm, utilizando celulases comerciais
54
Multifect, meio tamponado com citrato de sdio e cido ctrico (pH 5,0) e a uma temperatura de 47C. Para a construo dos perfis cinticos da hidrlise enzimtica, foram coletadas amostras em intervalos de tempo apropriado.
4.6. OTIMIZAO DO PROCESSO SSF DE PM3
A fim de otimizar o processo SSF e determinar as melhores condies, realizou-se planejamentos seqenciais constitudos de um Delineamento Composto Central Rotacional e de um planejamento univarivel.
4.6.1. Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR)
No DCCR, avaliou-se 2 variveis independentes em 2 nveis e duplicatas do ponto central, cujas condies foram variadas nas faixas especificadas na Tabela 4.5. A concentrao final de etanol foi selecionada como varivel de resposta.
Tabela 4.5. Intervalo utilizado para construir o DCCR para o processo SSF de PM3 Fatores Concentrao de inculo (g/L) Tempo de pr-hidrlise enzimtica (h) - 0,4 11,8 -1 1 13 0 2,5 16 +1 4 19 + 4,6 20,2
O processo SSF foi realizado em fermentmetros contendo 200 mL de hidrolisado, a uma temperatura de 47C e sob agitao de 200 rpm. As condies da pr-hidrlise enzimtica utilizadas foram determinadas a partir do planejamento de hidrlise realizado. Ao final da pr-hidrlise enzimtica, uma amostra de cada experimento foi coletada para quantificao de acares disponveis para a levedura no incio do SSF. A concentrao de etanol equivalente foi utilizada para construir os perfis cinticos do SSF. E no final desse processo, uma amostra de cada experimento foi coletada para quantificao de acares e etanol.
55
4.6.2. Planejamento univarivel
No planejamento univarivel avaliou-se o efeito da varivel independente concentrao celular em 5 nveis: 2,0 g/L; 4,0 g/L; 6,0 g/L; 8,0 g/L; e 10,0 g/L. Cada experimento foi realizado em duplicata. A concentrao final de etanol foi selecionada como varivel de resposta. O processo SSF foi realizado nas mesmas condies do DCCR para o processo SSF, mudando apenas a concentrao celular e utilizando o tempo de pr-hidrlise enzimtica de acordo com o DCCR. Ao final da pr-hidrlise enzimtica, uma amostra de cada experimento foi coletada para quantificao de acares. A concentrao de etanol equivalente foi utilizada para construir os perfis cinticos do SSF. E no final desse processo, uma amostra de cada experimento foi coletada para quantificao de acares e etanol.
4.6.3. Validao das melhores condies do processo SSF
A partir dos planejamentos seqenciais realizados, determinaram-se as melhores condies relao S:L, carga enzimtica, tempo de pr-hidrlise enzimtica e concentrao celular visando maximizar a concentrao final de etanol. Desta maneira, realizaram-se 4 processos SSF utilizando as melhores condies do processo. A validao foi realizada em frascos agitados, contendo 200 mL de hidrolisado, utilizando celulases Multifect, S. cerevisiae de panificao, temperaturas de 47C na pr-hidrlise e 37C a partir do incio da fermentao e sob agitao de 200 rpm. Ao final da pr-hidrlise enzimtica, foram coletadas amostras para quantificao de acares e os perfis cinticos do SSF foram construdos com as concentraes de etanol equivalente. No final do processo (36 h), foram coletadas amostras de cada experimento para quantificao de acares e etanol.
4.7. DESEMPENHO DAS CELULASES LADEBIO NO PROCESSO SSF DE PM3
Ao determinar as melhores condies da pr-hidrlise enzimtica (relao S:L e carga enzimtica) e do SSF (tempo de pr-hidrlise enzimtica e concentrao celular), realizou-se um processo utilizando o complexo celulsico LADEBIO e outro
56
empregando celulases comerciais Multifect. Os dois processos SSF foram conduzidos em biorreator instrumentado (New Brunswick BioFlo 310) contendo 800 mL de hidrolisado e controlado automaticamente a uma temperatura de 37C, 200 rpm de agitao e pH 4,5, mediante adio de NaOH (2M) ou HCL (2M). A pr-hidrlise enzimtica foi realizada em frascos cnicos agitados, cujo tempo de durao quando se utilizou enzimas LADEBIO foi modificado para 18 h, devido as caractersticas da hidrlise enzimtica. A linhagem industrial S. cerevisiae JP1, que foi propagada atravs da metodologia descrita no item 4.3.1, foi utilizada em ambos os processos. O complexo celulsico LABEBIO foi produzido pela linhagem Penicillium funiculosum ATCC11797 nos Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos da Escola de Qumica da UFRJ. Em relao s atividades, essas enzimas apresentaram 12000 U/L de FPsica, 277186 U/L de CMCsica e 81650 U/L de glucosidsica. No incio dos processos, coletou-se uma amostra de cada experimento para quantificao de acares disponveis no incio da fermentao. E durante a fermentao, amostras foram coletadas em intervalos regulares para construir os perfis cinticos do SSF. Esses dois processos foram realizados com o objetivo de comparar o desempenho das celulases LADEBIO com o das enzimas Multifect no processo SSF de PM3 e definir com quais celulases a pesquisa daria continuidade.
4.8. SUPLEMENTAO DO HIDROLISADO
A literatura sinaliza a importncia de suplementar o meio de fermentao alcolica com fontes de nitrognio, fosfato e sais minerais com a finalidade de melhorar o desempenho da levedura e aumentar sua produtividade volumtrica (SREEKUMAR et al., 1999; DANESI et al., 2006). Com base nessas afirmaes, o hidrolisado de PM3 para fermentao foi suplementado com fosfato de potssio, uria, extrato de levedura e solues de sais minerais e cido ctrico em concentraes equivalentes aquelas do meio de cultura utilizado para o crescimento do pr-inculo e inculo, apresentado na Tabela 4.2 e 4.3.
57
O processo SSF foi conduzido em biorreator (New Brunswick BioFlo 310), contendo 800 mL de hidrolisado suplementado uma vez no incio do processo, empregando inculo de S. cerevisiae JP1, controlado automaticamente a uma temperatura de 37C, 200 rpm de agitao e pH 4,5, mediante adio de NaOH (2M) ou HCL (2M). A pr-hidrlise enzimtica foi realizada em frascos agitados, utilizando celulases Multifect. Todos os hidrolisados foram reunidos, homogeneizados e divididos para o reator cujo hidrolisado foi suplementado e para o reator com hidrolisado que no foi suplementado. Isso foi realizado para que cada processo comeasse com a mesma concentrao de acares e o estudo sobre a importncia da suplementao no fosse comprometido. Vale ressaltar que o processo com hidrolisado no suplementado realizado foi descrito no item 4.7, pois o mesmo tambm serviu para comparar o desempenho das celulases LADEBIO com o das Multifect. Ao final da pr-hidrlise enzimtica, uma amostra foi coletada para quantificao de acares. E ao longo do processo, amostras foram coletadas em intervalos regulares para construir o perfil cintico do SSF.
4.9. MTODOS ANALTICOS
4.9.1. Determinao de acares e etanol
Os perfis cinticos dos processos SSF realizados em frascos agitados foram construdos a partir da concentrao de etanol equivalente, determinada pelo acompanhamento da perda de massa do sistema de fermentao (fermentmetro) (Figura 4.4) registrada em intervalos de tempo regulares. O fermentmetro composto de frasco cnico acoplado a um dispositivo que permite o desprendimento de CO2 e que impede a entrada de ar no sistema. Desta maneira, a concentrao de etanol equivalente foi calculada por meio de converso estequiomtrica, ou seja, sabendo-se que a partir de uma molcula de glicose foram produzidas duas molculas de CO2 e duas de etanol, determinou-se a concentrao de etanol equivalente a partir do CO2 desprendido.
58
Figura 4.4. Fermentmetro
Aps a coleta das amostras de todos os experimentos, que foram centrifugadas a 9000 rpm por 15 minutos, seus sobrenadantes foram diludos e submetidos quantificao de acares e/ou etanol. A quantificao de acares redutores totais (ART) foi determinada colimtricamente, em triplicata, pelo mtodo DNS (cido 3,5 Dinitrosaliclico) (MILLER, 1959). A determinao da concentrao de glicose, xilose, celobiose e etanol foi realizada por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE), com o auxlio de uma coluna HPX-87P (BioRad) utilizando gua como fase mvel a uma vazo de 0,6 mL/minuto e uma temperatura de separao de 80C.
4.10.2. Quantificao celular
As amostras coletadas durante a cintica de propagao do pr-inculo e inculo de S. cerevisiae JP1 foram diludas e submetidas a leituras de absorvncia realizadas em espectrofotmetro (SpectrumLab 22pc) em um comprimento de onda de 600 nm. A concentrao celular foi determinada pela curva de regresso entre
59
as medidas de absorvncia e massa seca de biomassa. A correlao foi obtida a partir da regresso linear dos pontos, como pode ser visualizada na Figura 4.5.
1,2 1,0
Absorvncia
CC =
ABS 0,1431 FD 1,9775
R2 = 0,9897
0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Concentrao celular (g/L)
Figura 4.5. Regresso linear e coeficiente de correlao para a quantificao de biomassa de S. cerevisiae JP1 CC concentrao celular (g/L); ABS absorvncia; FD fator de diluio
CAPTULO 5. Resultados e Discusso
60
CAPTULO 5
5. RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo so apresentados os resultados e as respectivas discusses obtidos nas seguintes etapas do trabalho: caracterizao das biomassas PM1, PM2 e PM3; avaliao da fermentabilidade de PM1, PM2 e PM3; estudo comparativo da hidrlise enzimtica de PM1, PM2 e PM3; otmizao do processo SSF de PM3; e processos SSF de PM3 conduzidos em biorreator.
5.1. CARACTERIZAO DAS BIOMASSAS PM1, PM2 E PM3
Na Tabela 5.1 esto apresentados os resultados da caracterizao da polpa coletada aps o cozimento (PM1), da polpa coletada aps a deslignificao (PM2) e do resduo celulsico do sistema de decantao da indstria de celulose (PM3). Verifica-se que os balanos de massas no totalizam 100%, ficando em 95,7% para PM1, 96,3% para PM2 e 98,8% para PM3. Dados citados na literatura tambm mostram fato semelhante para o bagao de cana-de-acar (91%), palha de trigo (95%), sabugo de milho (95%) e grama (88,4%) (PANDEY et al., 2000; SUN & CHENG, 2002). Possivelmente, o no fechamento do balano em 100% deve-se aos
61
domnios pcticos e proticos existentes na parede celular e s resinas extrativas e compostos inorgnicos, os quais no foram quantificados (McCANN & ROBERTS, 1991; CARPITA & GILBEAULT, 1993). importante verificar que o teor de celulose da polpa PM1 um pouco menor que o da PM2, enquanto o teor de lignina de PM1 maior (150%) do que o da PM2. Isso explicvel pelo fato da polpa PM2 ter passado pela etapa da deslignificao, a qual visa reduzir ainda mais o contedo de lignina e, consequentemente, o teor relativo de celulose aumenta, mas no na mesma proporo. Em relao ao resduo PM3, verifica-se que os teores de celulose e hemicelulose so discretamente maiores do que aqueles de PM1 e PM2. Lembrando que o resduo PM3 constitui-se de fibras celulsicas que foram refugadas de diferentes etapas do processo.
Tabela 5.1. Caracterizao das biomassas PM1, PM2 e PM3 Componente da biomassa Celulose (%) Hemicelulose (%) Lignina (%) PM1 77,4 15,6 2,7 PM2 79,4 15,1 1,8 PM3 80,9 16,2 1,7
5.2. AVALIAO DA FERMENTABILIDADE DE PM1, PM2 E PM3 PARA PRODUO DE BIOETANOL
Na Figura 5.1 podem ser visualizadas as concentraes de glicose, celobiose e xilose, quantificadas aps 12 h de pr-hidrlise enzimtica das polpas PM1 e PM2 e do resduo PM3 antes do processo SSF ser realizado a fim de avaliar o potencial dessas biomassas para a produo de bioetanol. Verificou-se que com todas as biomassas lograram-se altas concentraes de glicose aps a etapa de pr-hidrlise enzimtica. As biomassas PM1 e PM2 conferiram concentraes de glicose muito similares, embora PM2 tenha uma porcentagem de celulose um pouco maior e menos lignina, caractersticas conferidas pelo processo de deslignificao, o qual deveria tornar as molculas de celulose um pouco mais suscetveis ao ataque enzimtico. Enquanto PM3 forneceu apenas 19% a menos de glicose em relao a PM1 e 17% em relao a PM2.
62
Embora este resduo no apresente as caractersticas requeridas para constituir a pasta de celulose, apresenta grande potencial como fonte de acares fermentveis.
120
Celobiose
Glicose
Xilose
Concentrao (g/L)
100 80 60 40 20 0 PM1 PM2 PM3
Biomassa
Figura 5.1. Concentrao de acares aps 12 h de pr-hidrlise enzimtica, utilizando relao S:L 1:4 e 32 FPU/g de carga enzimtica
Na Figura 5.2 encontram-se os perfis cinticos dos processos SSF construdos com base na concentrao de etanol equivalente. Aps 96 h de processo foram obtidas concentraes mdias de etanol, medidas por CLAE, de 70,3 g/L com PM1, 78,8 g/L com PM2 e 71,1 g/L com PM3 (Figura 5.3). Embora PM3 tenha conferido menor concentrao de glicose do que as outras biomassas, como discutido anteriormente, a fermentao de seu hidrolisado resultou numa concentrao de etanol similar a de PM1 e apenas 10% menor do que a de PM2, denotando o seu potencial para a produo deste biocombustvel. Considerando que, em cada processo, a produo de etanol tenha praticamente estabilizado em torno de 65 h, os valores de produtividade volumtrica atingidos com PM1, PM2 e PM3, foi de 1,1 g/L.h, 1,23 g/L.h e 1,1 g/L.h, respectivamente. Na Tabela 5.2 esto sumarizadas as concentraes de acares e etanol atingidas no final da pr-hidrlise enzimtica ou incio do processo SSF e no final deste processo. A partir desta tabela, verifica-se que as concentraes de xilose permaneceram praticamente constantes, indicando que a estirpe comercial de S. cerevisiae no capaz de fermentar este acar, como amplamente reportado na literatura; que as concentraes de glicose foram muito reduzidas ao final do SSF, denotando que este acar foi facilmente fermentado por esta levedura; e que a
63
enzima -glucosidase apresentou boa atividade, uma vez que as concentraes de celobiose encontraram-se prximas de zero ao final do SSF.
120 100 Etanol equivalente (g/L) 80 60 40 20 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Tempo (h)
PM1 PM2 PM3
Figura 5.2. Perfis cinticos do processo SSF das biomassas PM1, PM2 e PM3, empregando 2 g/L de S.verevisiae de panificao
90 Concentrao (g/L) 75 60 45 30 15 0
Celobiose
Glicose
Xilose
Etanol
PM1
PM2 Biomassa
PM3
Figura 5.3. Concentrao de acares e etanol aps 96 h de SSF
Tabela 5.2. Concentraes de acares e etanol no incio e final do SSF (96 h) Biomassa Incio SSF Concentrao (g/L) Celobiose PM1 PM2 PM3 11,1 11,1 7,5 Glicose 102,7 100,5 83,4 Xilose 17,7 16,8 14,2 Celobiose 0,4 0,6 1,2 Final SSF Concentrao (g/L) Glicose 5,8 4,1 1,6 Xilose 15,6 17,0 15,1 Etanol 70,3 78,8 71,1
64
Observa-se que, tanto as polpas PM1 e PM2 quanto o resduo PM3 apresentaram-se como excelentes matrias-primas para a produo de bioetanol combustvel. No entanto, PM3 possuiu fibras celulsicas que no tiveram qualidade para se constituir em polpas celulsicas, diferentemente de PM1 e PM2 que so utilizadas no processo de polpao (ARACRUZ, 2009). Contudo, as trs biomassas foram mais detalhadamente investigadas na prxima srie de experimentos.
5.3. ESTUDO COMPARATIVO DA HIDRLISE ENZIMTICA DE PM1, PM2 E PM3
Nesta etapa do trabalho objetivou-se realizar um estudo sobre a hidrlise enzimtica de PM3, bem como comparar seu potencial como fonte de glicose com o das polpas PM1 e PM2. Para isso, realizou-se um Delineamento Composto Central Rotacional para cada biomassa avaliando os efeitos da relao slido:lquido (S:L) e da carga enzimtica sobre a concentrao de glicose, selecionada com varivel de resposta. As Figuras 5.4, 5.5 e 5.6 mostram os perfis cinticos da hidrlise enzimtica de PM1, PM2 e PM3, respectivamente. As concentraes de acares obtidas ao final do tratamento enzimtico de PM1, PM2 e PM3 podem ser visualizadas na Tabela 5.3, 5.4 e 5.5, respectivamente, cujos resultados mostraram que as maiores concentraes de glicose foram obtidas nos experimentos com as maiores relaes S:L (experimentos 1 - 1:5 e 2 - 1:4), ou seja, com maiores teores de slido. Em relao s eficincias de hidrlise, para a polpa PM1, com o experimento 1 (S:L 1:5 e 25 FPU/g) obteve-se a maior concentrao de glicose (95,9 g/L), correspondendo a uma converso de 65,8% (calculada a partir da concentrao inicial de celulose), enquanto no experimento 9 (S:L 1:7,5 e 28 FPU/g) atingiu-se a maior converso (71,8%), porm com concentrao de glicose 15% menor (81,6 g/L) quando comparada quela obtida no experimento 1. Para a polpa PM2, no experimento 11 (S:L 1:4 e 17,5 FPU/g), alcanou-se a maior concentrao de glicose (95,6 g/L), resultando em uma converso de 53,1%; no entanto a maior converso (70,2%) com esta biomassa foi obtida no experimento 3 (S:L 1:10 e 25 FPU/g), resultando em somente 56,8 g/L de glicose.
65
Acares redutores totais (g/L)
140 120 100 80 60 40 20 0 0 10 Tempo (h) 20 30
1 (1:5; 25 FPU/g) 2 (1:5; 10 FPU/g) 3 (1:10; 25 FPU/g) 4 (1:10; 10 FPU/g) 5 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 6 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 7 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 8 (1:7,5; 7 FPU/g) 9 (1:7,5; 28 FPU/g) 10 (1:11; 17,5 FPU/g) 11 (1:4; 17,5 FPU/g)
Figura 5.4. Hidrlise enzimtica da biomassa PM1 conduzida a 47C, 200 rpm e pH5
140
1 (1:5; 25 FPU/g) 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 2 (1:5; 10 FPU/g) 3 (1:10; 25 FPU/g) 4 (1:10; 10 FPU/g) 5 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 6 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 7 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 8 (1:7,5; 7 FPU/g) 9 (1:7,5; 28 FPU/g) 10 (1:11; 17,5 FPU/g) 11 (1:4; 17,5 FPU/g)
Tempo (h)
120 1 (1:5; 25 FPU/g) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 2 (1:5; 10 FPU/g) 3 (1:10; 25 FPU/g) 4 (1:10; 10 FPU/g) 5 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 6 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 7 (1:7,5; 17,5 FPU/g) 8 (1:7,5; 7 FPU/g) 9 (1:7,5; 28 FPU/g) 10 (1:11; 17,5 FPU/g) 11 (1:4; 17,5 FPU/g)
Tempo (h)
66
Tabela 5.3. Concentrao de acares liberados na hidrlise enzimtica (HE) de PM1 Experimento 1- 1:5; 25 FPU 2- 1:5; 10 FPU 3- 1:10; 25 FPU 4- 1:10; 10 FPU 5(C)- 1:7,5; 17,5 FPU 6(C)- 1:7,5; 17,5 FPU 7(C)- 1:7,5; 17,5 FPU 8- 1:7,5; 7 FPU 9- 1:7,5; 28 FPU 10- 1:11;17,5 FPU 11- 1:4; 17,5 FPU (C) ponto central ART (g/L) 119,8 95,7 76,0 60,7 91,8 97,9 91,9 63,0 96,1 60,3 125,1 Glicose (g/L) 95,9 76,7 43,3 42,2 71,1 73,5 71,1 49,8 81,6 49,4 88,3 Celobiose (g/L) 5,3 5,8 1,2 1,2 4,4 4,7 4,2 2,1 2,4 5,4 3,6 Xilose (g/L) 18,7 13,5 6,0 5,9 12,8 13,0 12,6 8,8 15,1 8,0 17,3 Eficincia HE (%) 65,8 52,6 54,8 53,4 62,5 64,7 62,6 43,8 71,8 68,3 50,3
67
J para o resduo PM3, a maior concentrao de glicose foi de 80,6 g/L (experimento 1), correspondendo a 53,5% de eficincia de hidrlise. A maior converso obtida com esta biomassa residual foi 56,9%, obtida com o experimento 10, o qual resultou em apenas 42,6 g/L de glicose. De uma maneira geral, verifica-se que para todas as biomassas, um aumento no teor de slido diminui a converso de celulose glicose, corroborando os dados relatados na literatura (SEWALT et al., 1997; VLASENKO et al., 1997; FERRER et al., 2002; LU et al., 2002; MARTIN et al., 2002; MENEZES & AGUIAR, 2002; VARGA et al., 2002, PAN et al., 2005; BERLIN et al., 2006; KANG et al., 2010). Estes resultados mostraram que um compromisso deve existir entre as variveis de respostas do processo hidroltico (concentrao de glicose e eficincia de hidrlise). Ambas, no entanto, podem ser aumentada medida que se associe outro processo de transformao, j que fato conhecido que as enzimas do complexo celulsico sofrem inibio pelos seus produtos finais de hidrlise. Por outro lado, as menores eficincias de hidrlise enzimtica obtidas em sistemas reacionais mais impactados em slidos (altas relaes S:L) esto relacionadas aos problemas de transferncia de massa que dificultam a ao cataltica das enzimas. Na anlise estatstica dos resultados dos Delineamentos Composto Central Rotacional para a hidrlise enzimtica, o grfico de Pareto foi construdo utilizando o software STATISTICA verso 6.0, permitindo visualizar tanto graficamente como numericamente os efeitos padronizados ou tcalculados de cada varivel independente, assim como os de suas interaes. Neste grfico, os efeitos so representados por barras, sendo que apenas aquelas que ultrapassam o valor de 0,05 para o p-valor apresentam significncia estatstica. O valor deste parmetro garante, com um nvel de confiana de 95%, que um determinado fator influencia a varivel de resposta analisada (MONTGOMERY & CALADO, 2003). As Figuras 5.7, 5.8 e 5.9 apresentam os grficos de Pareto construdos a partir dos resultados dos Delineamentos Compostos Centrais Rotacionais realizados com PM1, PM2 e PM3, respectivamente, mostrando quais variveis independentes apresentaram efeitos estatsticamente significativos sobre a concentrao de glicose, selecionada como varivel de resposta, liberada na hidrlise enzimtica de cada biomassa.
68
Em relao a PM1, possvel visualizar que o maior efeito linear e positivo (36,26) foi gerado pela relao S:L, seguida do efeito linear positivo e quadrtico negativo da carga enzimtica e do efeito da interao entre tais variveis. O efeito quadrtico negativo da relao S:L no apresentou significncia estatstica a nvel de 95% de significncia, mas poderia ser considerado marginalmente significativo devido ao p-valor (0,063123) estar prximo do valor considerado para este parmetro (0,05), indicando assim a presena de curvatura. Desta maneira, tanto a relao S:L quanto a carga enzimtica tiveram influncia sobre a concentrao final de glicose. Baseado no grfico de Pareto para PM2, pode-se concluir que os maiores efeitos significativos foram gerados pela relao S:L (L) seguida da carga enzimtica (L). O efeito quadrtico da carga enzimtica foi considerado marginalmente significativo, enquanto o efeito da interao entre essas variveis no apresentou significncia estatstica. A partir da anlise do grfico de Pareto (Figura 5.9) para o resduo PM3, possvel visualizar que o efeito linear da relao S:L foi o nico que apresentou influncia estatsticamente significativa. O efeito linear gerado pela carga enzimtica foi considerado marginalmente significativo, uma vez que seu p-valor (0,068466) estava muito prximo do valor considerado (0,05), e, por isso, esta varivel no foi descartada. Os efeitos quadrticos da carga enzimtica e da relao S:L no foram estatsticamente significativos, mostrando que dentro da faixa estudada, no houve presena de curvatura. Atravs das superfcies de respostas geradas pelos modelos obtidos a partir dos resultados dos delineamentos realizados, verificou-se que para PM1 (Figura 5.10), PM2 (Figura 5.11) e PM3 (Figura 5.12), o aumento da relao S:L e da carga enzimtica, do nvel inferior (-1) para o superior (+1), conduziram a maiores valores finais da concentrao de glicose. Atravs dessas superfcies, foi possvel verificar que a hidrlise enzimtica no foi otimizada para nenhuma biomassa, uma vez que o ponto mximo da curvatura da superfcie no foi alcanado. Isto poderia ter sido obtido se aumentasse o teor de slidos, porm existe uma restrio operacional causada pelo pequeno volume de meio reacional em relao quantidade de slidos, o que dificulta a mistura mecnica e implica numa transferncia de massa insuficiente (WU & LEE, 1997).
69
Figura 5.7. Grfico de Pareto para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta do DCCR para a hidrlise enzimtica de PM1
70
Figura 5.10. Superfcie de resposta para a concentrao de glicose (g/L) como varivel de resposta do DCCR para a hidrlise enzimtica de PM1
71
72
Na Figura 5.13 possvel visualizar comparativamente o potencial das biomassas PM1, PM2 e PM3 como fonte de glicose.
PM1
120 100
PM2
PM3
Glicose (g/L)
80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Experimento
Figura 5.13. Concentrao de glicose aps hidrlise enzimtica de PM1, PM2 e PM3
Ficou evidenciado que as polpas PM1 e PM2 conferiram as maiores concentraes de glicose, obtidas com o experimento 1 e 11, respectivamente. Com a biomassa PM1, logrou-se mais glicose no experimento 1 pelo fato de ter sido usado maior carga enzimtica do que no experimento 11. J para PM2, o fator determinante foi o teor de slidos, pois mesmo com uma carga de enzimas 30% menor, obteve-se mais glicose no experimento 11 do que no 1. Chama-se ateno que esta biomassa possui um menor teor de lignina do que PM1 (Tabela 5.1). Em relao ao resduo PM3, importante ressaltar que apesar de sua hidrlise ter conferido menor concentrao de glicose do que PM1 e PM2, tambm apresentou grande potencial como fonte de glicose, cuja mxima concentrao obtida foi de 80,6 g/L. Admitindo-se que esse estudo almejou apenas comparar o potencial como fonte de acares do resduo PM3 com o das polpas PM1 e PM2, uma vez que a celulose do resduo rejeitada do processo de produo de celulose e a celulose das polpas no, e que PM1 e PM2 so matrias-primas da indstria de celulose, continuou-se a pesquisa apenas com o resduo PM3.
73
Baseando-se nos resultados e em todas as anlises estatsticas realizadas, determinou-se que as melhores condies para a mxima produo de glicose, dentro da faixa estudada, foram a relao S:L 1:4 e a carga enzimtica de 17,5 FPU/g de slido. Por isso, estas condies foram utilizadas em todas as etapas de pr-hidrlise enzimtica dos processos SSF posteriores com PM3.
5.4. PLANEJAMENTO SEQUENCIAL PARA OTIMIZAO DO PROCESSO SSF
Para a otimizao do processo SSF, realizou-se um Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR) avaliando os efeitos do tempro da pr-hidrlise enzimtica e da concentrao celular sobre a concentrao final de etanol. Sequencialmente, um planejamento univarivel foi conduzido variando apenas a concentrao celular. Em todas as etapas de pr-hidrlise enzimtica para a otimizao do processo SSF, as seguintes condies foram utilizadas: relao S:L 1:4; carga enzimtica de 17,5 FPU/g de slido, utizando celulases Multifect; meio tamponado com citrato de sdio e cido ctrico (pH 5,0); temperatura de 47C; agitao de 200 rpm.
5.4.1. DCCR
Na Figura 5.14 so apresentados os perfis cinticos dos processos SSF do DCCR construdos a partir das concentraes de etanol equivalente. Verifica-se que nos processos cujas maiores concentraes celulares foram utilizadas, o perfil cintico apresentou dois estgios: no primeiro, uma acentuada produo de etanol, indicada por uma maior inclinao das curvas; e no segundo, uma produo de etanol reduzida, indicada por uma inclinao das curvas menor. Este fenmeno, que havia sido primeiramente observado por VASQUEZ et al. (2007), foi decorrente de diferentes taxas reacionais de hidrlise e fermentao. No incio do processo SSF havia glicose suficiente, no sendo limitado o seu consumo pela levedura. medida que o processo transcorreu, a alta densidade celular fez
74
com que a taxa de hidrlise no atendesse plenamente a demanda das clulas por glicose no segundo estgio, ou seja, a produo de etanol passou a ser limitada pela taxa de liberao de glicose. Ressalta-se que esta concepo de processo, que pode ser denominado de processo hbrido (pr-hidrlise enzimtica seguida do processo de hidrlise simultnea a fermentao) garante um consumo de glicose e produo de etanol mais eficientes.
Figura 5.14. Perfis cinticos dos processos SSF do DCCR para PM3
Vale ressaltar que a taxa de liberao de glicose maior a 47C, temperatura na qual realizada a pr-hidrlise enzimtica, do que na temperatura do processo SSF (37C). Segundo CASTRO et al. (2010), as celulases perdem em torno de 15% de suas atividades quando a temperatura reduzida no processo SSF. A estratgia de se aumentar a temperatura no se aplica a este tipo de processo, j que a atividade microbiana ficaria comprometida e a produo de etanol seria afetada consideravelmente. Contrariamente, se no houvesse a etapa de pr-hidrlise enzimtica, para sistemas inoculados com altas densidades celulares, a taxa de fermentao estaria limitada desde o incio do processo, como observado em vrios trabalhos publicados na literatura (PHILIPPIDIS & SMITH, 1995; MARTIN et al., 2002; LINDE et al., 2006; RUIZ et al., 2006; JORGENSEN et al., 2010).
75
A Tabela 5.6 apresenta as concentraes de acares, etanol equivalente (determinado pelo desprendimento de CO2) e etanol (determinado por CLAE) alcanadas aps 48h de processo. Verifica-se que as maiores concentraes de etanol foram alcanadas com as maiores concentraes celulares.
Tabela 5.6. Concentrao de acares no incio do SSF e de etanol equivalente, acares e etanol no final do processo (48h) Experimento Incio SSF Concentrao (g/L) ART 1- 4 g/L; 19h 2- 4 g/L; 13h 3- 1 g/L; 19h 4- 1 g/L; 13h 5- 2,5 g/L; 11,8 6- 2,5 g/L; 20,2 7- 0,38 g/L; 16h 8- 4,6 g/L; 16h 9 (C)- 2,5 g/L; 16h 10(C)- 2,5 g/L; 16h 104,4 81,5 105,4 86,6 81,5 108,2 101,5 101,1 101,1 99,0 Glicose 80,3 57,4 71,2 60,4 59,9 83,6 73,8 69,7 78,1 69,9 Celobiose Glicose 1,7 0,0 1,4 4,8 3,3 2,8 1,8 2,1 2,4 2,3 4,6 4,2 3,2 7,9 4,8 4,2 6,6 4,4 4,4 4,3 Final SSF Concentrao (g/L) Etanol Celobiose equiv. 0,9 76,2 0,0 78,2 0,0 64,5 0,0 60,8 0,9 73,7 0,9 74,2 0,9 42,0 1,1 77,0 0,9 74,9 1,0 74,0 Etanol (CLAE) 71,7 70,2 58,2 58,2 72,6 67,6 52,7 77,6 65,1 66,2
(C) Ponto central; Etanol equiv. Etanol equivalente
Por esta dissertao apresentar um alto grau de originalidade, uma vez que no se encontra na literatura trabalhos que reportem a utilizao do resduo do sistema de decantao da indstria de celulose para a produo de bioetanol de segunda gerao atravs do processo SSF, fez-se necessrio comparar o potencial deste resduo com o de outros industriais para a produo desse biocombustvel utilizando a mesma concepo de processo. Com o tempo de 20,2 h de pr-hidrlise enzimtica logrou-se a mxima concentrao de glicose, 83,6 g/L. Esta concentrao foi muito superior quela reportada por VSQUEZ et al. (2007) (Tabela 2.7), que obtiveram 58,4 g/L de glicose aps 12 h de pr-hidrlise enzimtica do bagao de cana-de-acar prtratado, empregando celulases comerciais com carga enzimtica superior (25,9 FPU/g) e teor de slido menor (10%). SANTOS et al. (2010) (Tabela 2.7) alcanaram 76 g/L de glicose aps 12 h de pr-hidrlise enzimtica do bagao de cana-de-acar pr-tratado, porm com uma carga enzimtica (25,0 FPU/g) e teor de slidos (23 %) maiores do que aqueles
76
utilizados neste trabalho (17,5 FPU/g e 20%, respectivamente). Vale ressaltar que quanto menor a carga enzimtica utilizada, menor ser o custo total do processo. ZHANG et al. (2009) (Tabela 2.7) realizaram uma pr-hidrlise de 48 h com sabugo de milho, empregando 8,0 FPU/g de carga enzimtica e 12,5% de teor de slidos, e alcanou uma mdia de 0,205 g de acares redutores para cada grama de sabugo hidrolisado, duas vezes menor daquela alcanada no experimento 6, cujas condies permitiram alcanar 0,43 g de ART para cada grama de PM3 processado. Estes resultados mostraram o grande potencial do resduo PM3 como fonte de acares quando comparado com outras biomassas utilizadas nos trabalhos apresentados anteriormente. Com o experimento 8 alcanou-se a maior concentrao de etanol, 77,6 g/L, equivalendo a uma produtividade volumtrica de 1,62 g/L.h. WINGREN et al. (2005), que realizaram um processo SSF com madeira de Piceas abies, empregaram S. cerevisiae de panificao como inculo, cuja concentrao celular (5,0 g/L) foi muito prxima daquela utilizada no experimento 8 (4,62 g/L), obtendo apenas 26 g/L de etanol aps 55 h de fermentao, realizando tambm uma pr-hidrlise enzimtica de 16 h, mas resultando em uma produtividade volumtrica de 0,37 g/L.h. Os resultados obtidos no experimento 8 tambm foram muito superiores daqueles obtidos por HGREN et al. (2007) (Tabela 2.7), que realizaram uma prhidrlise enzimtica de 16 h com palha de milho, seguida do processo SSF que foi conduzido por 80 h, no qual utilizaram 1 g/L de S. cerevisiae de panificao e alcanaram uma concentrao final de etanol de 26,7 g/L. Para a anlise estatstica dos resultados obtidos no DCCR, alm do grfico de Pareto (Figura 5.15), tambm foi utilizada como ferramenta a anlise da varincia (ANOVA) (Tabela 5.7). Em ambos os casos foram includos todos os efeitos: lineares (L); quadrticos (Q); e a interao entre as duas variveis. Na anlise de varincia (Tabela 5.7) podem ser observados os valores do desvio quadrtico provocado por cada varivel (Soma quadrtica SQ) e seu grau de liberdade correspondente (GL). Com esses parmetros calculada a mdia quadrtica (MQ), que dividida pelo erro puro experimental, permite a determinao do parmetro F e, subsequentemente, do p-valor, utilizados na verificao da
77
hiptese nula. Altas ordens de magnitude dos parmetros SQ, MQ e F, geradores de p-valor <0,05, indicam uma influncia significativa da varivel sobre a concentrao final de etanol. A ANOVA, assim como o grfico de Pareto, mostrou que o nico efeito significativo estatsticamente foi gerado pela concentrao celular, que apresentou uma SQ com ordem de grandeza duas vezes maior que a dos outros parmetros, gerando um valor de F superior ao tabelado com um p-valor significativo, considerando 95% de confiana. Entretanto, os efeitos, tanto linear quanto quadrtico, do tempo de pr-hidrlise enzimtica no apresentaram significncia estatstica, cujos valores de SQ foram baixos, gerando valores de p-valor muito acima de 0,05. Apesar do efeito da concentrao celular ter sido o nico que apresentou significncia estatstica, o modelo apresentou um coeficiente de determinao alto (R2=0,924), inclusive com uma falta de ajuste no significativa e um erro puro baixo quando comparado com os resultados do planejamento experimental. A superfcie de resposta para a concentrao de etanol como varivel de resposta apresentada na Figura 5.16. Verificou-se que maiores concentraes celulares deveriam ser empregadas a fim de se obterem maiores concentraes de etanol. Considerando que o efeito do tempo de pr-hidrlise enzimtica no foi estatsticamente significativo, o menor tempo deveria ser selecionado, porm o hidrolisado liquefez com 16 h e somente com este tempo foi operacionalmente vivel utilizar o hidrolisado e inocular o microorganismo fermentador.
Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA) para concentrao final de etanol do DCCR Efeito (1) Concentrao celular (L) Concentrao celular (Q) (2) Tempo PHE (L) Tempo PHE (Q) Interao 1x2 Falta de ajuste Erro puro Total
2
SQ 460,77* 4,69 3,88 9,78 0,56 39,58 0,60 530,23
GL 1* 1 1 1 1 3 1 9
MQ 460,77* 4,69 3,88 9,78 0,56 13,19 0,60
F 761,61* 7,74 6,41 16,16 0,93 21,81
p-valor 0,023058* 0,219593 0,239433 0,155207 0,511590 0,155828
R = 0,924 (*) Fator com significncia estatstica; PHE pr-hidrlise enzimtica
78
Figura 5.15. Grfico de Pareto para a concentrao de etanol (g/L) como varivel de resposta do DCCR para o SSF de PM3
Figura 5.16. Superfcie de resposta para concentrao de etanol (g/L) como varivel de resposta do DCCR para o SSF de PM3
79
Baseando-se nos resultados obtidos e na anlise de dados realizada, determinou-se que a melhor condio dentro da faixa estudada nesse DCCR para o processo SSF com PM3 foi a concentrao celular de 4,62 g/L e o tempo de prhidrlise de 16 h. Porm, fez-se necessrio realizar um planejamento experimental univarivel, ampliando a faixa da concentrao celular visando o aumento da concentrao de etanol. Alm disso, verificou-se na Figura 5.14 que a reduo do tempo de processo de 48 h para 36 h resultaria numa perda de aproximadamente 10% de etanol, porm ao reduzir o tempo em 12 horas, poder-se-ia aumentar a produtividade final. Assim, determinou-se que os processos SSF realizados sequencialmente finalizariam com 36 h. A Figura 5.17 mostra as diferentes etapas do processo do experimento 8 (4,6 g/L e 16 h), ilustrando a liquefao da biomassa PM3 aps a hidrlise enzimtica.
Figura 5.17. Experimento 8 do DCCR para SSF de PM3. Condies: relao S:L 1:4, 17,5 FPU/g, 16 h pr-hidrlise enzimtica, 4,6 g/L inculo, 48 h fermentao. A incio da pr-hidrlise enzimtica. B - final da pr-hidrlise enzimtica. C - final do processo SSF
5.4.2. Planejamento univarivel
No planejamento univriavel, a varivel independente foi a concentrao celular, cuja faixa estudada variou de 2,0 g/L a 10,0 g/L, e a varivel dependente ou de resposta foi a concetrao final de etanol. A Figura 5.18 apresenta os perfis cinticos do processo SSF para diferentes concentraes iniciais de clulas. A anlise desta figura mostra que semelhana
80
dos processos fermentativos clssicos para a produo de etanol, a taxa fermentativa fortemente influenciada pelo tamanho do inculo, facilmente verificado no incio do processo SSF. Considerando o tempo de 6 h de fermentao, verificou-se de maneira mais acentuada que uma maior concentrao de etanol equivalente era alcanada medida que se empregava maior concentrao celular. Desta maneira, a produtividade volumtrica neste tempo (Qpi), considerando a concentrao de etanol equivalente, aumentou consideravelmente com o aumento do tamanho do inculo. As Qpi obtidas com 2,0 g/L, 4,0 g/L, 6,0 g/L, 8,0 g/L e 10 g/L foram 1,8 g/L.h, 2,6 g/L.h, 4,8 g/L.h, 5,2 g/L.h, e 6,5 g/L.h, respectivamente. Tais resultados condizem com os dados na literatura, os quais tambm relataram que maiores concentraes de levedura permitiram fermentaes mais rpidas (com maior Qp) (LIMA et al., 2001). As produtividades volumtricas alcanadas no final do processo (Qpf) no experimento 1, 2, 3, 4 e 5, considerando o etanol equivalente, foram 1,68 g/L.h, 1,93 g/L.h, 1,98 g/L.h, 2,09 g/L.h e 2,10 g/L.h, respectivamente. Ao verificar a reduo da diferena entre as Qpf alcanadas com cada concentrao celular, constatou-se que, quando se utilizou alta densidade celular, a taxa fermentativa no segundo estgio do processo, discutido no item 5.4.1, tambm foi limitada pela liberao de glicose pelas enzimas do complexo celulsico. O mesmo no ocorreu no experimento 1, no qual foram utilizadas 2,0 g/L clulas, indicando que a taxa de liberao de glicose atendeu bem a taxa fermentativa quando o tamanho do inculo era baixo. Segundo LIMA et al. (2001), o uso de maior concentrao celular no somente aumenta a produtividade volumtrica, mas tambm aumenta o controle sobre as bactrias contaminantes e restringe o crescimento da prpria levedura. Por outro lado, elevado teor de levedura exige maior consumo de acar para manter as clulas vivas, alm de resultar em maior competio pelos nutrientes do meio, dimuindo a viabilidade do fermento. A Figura 5.19 permite comparar facilmente a concentrao de etanol equivalente e etanol, determinada por CLAE, obtida em cada experimento e sua respectiva concentrao celular, mostrando que o emprego de um sistema simples de fermentao, denominado de fermentmetro, permitiu avaliar o desempenho de diferentes experimentos de maneira rpida e eficiente. Os valores de etanol
81
equivalente, calculado atravs de uma relao estequiomtrica, apresentam correspondncia com as concentraes de etanol determinadas analiticamente por CLAE.
90 80
Etanol equivalente (g/L)
70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40
1 - 2 g/L 2- 4 g/L 3 - 6 g/L 4 - 8 g/L 5 - 10 g/L
Tempo (h)
Figura 5.18. Perfis cinticos de SSF do planejamento univarivel
Etanol equivalente
90 80 70
Etanol (CLAE)
Etanol (g/L)
60 50 40 30 20 10 0 1 2,0 2 4,0 3 6,0 4 8,0 5 10,0
Concentrao celular (g/L)

Figura 5.19. Concentraes de etanol equivalente e etanol (CLAE) do planejamento univarivel
82
A Tabela 5.8 sumariza as concentraes de acares (iniciais e finais), etanol (CLAE) e etanol equivalente dos experimentos de hidrlise enzimtica e fermentao silmultnea do planejamento univarivel. Verificou-se que a concentrao final de etanol aumentou medida que se empregou maior concentrao celular; porm, este aumento no ocorreu quando a concentrao de inculo passou de 8 g/L para 10 g/L, indicando que maior concentrao de etanol no seria alcanada se aumentasse ainda mais o tamanho do inculo. Isto est associado tolerncia das clulas de levedura ao principal produto do metabolismo fermentativo. Desta maneira, conclui-se que a partir de 8 g/L, o tamanho do inculo no foi o fator que mais influenciou a varivel de resposta, e sim a taxa de liberao de glicose pelas celulases, no havendo necessidade de impactar o sistema fermentativo com mais clulas.
Tabela 5.8. Concentrao de acares no incio do SSF e de etanol equivalente (equival.), acares e etanol no final dos processos SSF (36h) do planejamento univarivel Experimento Incio SSF Concentrao (g/L) ART 1- 2,0 g/L 2- 4,0 g/L 3- 6,0 g/L 4- 8,0 g/L 5- 10,0 g/L 95,5 92,6 94,0 95,8 100,4 Glicose 71,6 70,1 73,6 73,6 73,9 Celobiose Glicose 6,5 6,1 6,9 6,9 6,6 4,4 1,8 1,1 0,8 0,6 Final SSF Concentrao (g/L) Etanol Celobiose equival. 0,0 60,9 0,0 69,5 0,0 71,4 0,0 75,4 0,0 75,6 Etanol (CLAE) 53,1 60,2 61,2 66,6 65,8
Baseando-se em todos os resultados obtidos, concluiu-se que as condies do processo SSF foram otimizadas e que as mesmas conferiram uma concentrao mxima de etanol de 66,6 g/L em 36 h, correspondendo a uma produtividade volumtrica de 1,85 g/L.h. A eficincia do processo otimizado mostrou-se excelente quando se comparou a concentrao final de etanol alcanada neste trabalho e o tempo do processo SSF com a de outros trabalhos relatados na literatura que empregaram levedura de panificao (Tabela 2.7). STENBERG et al. (1999) alcanaram apenas 25 g/L de etanol empregando a estratgia SSF com 96 h utilizando a madeira de Picea abies, pr-tratada com exploso com vapor catalisada (SO2), carga de celulases de 32 FPU/g e carga adicional de -glucosidase de 28 UI/mL,
83
concentrao celular de 7,5 g/L, similar daquela deste trabalho, e inculo de S. cerevisiae de panificao. XU et al. (2009) desenvolveram um processo SSF com selagem de milho, que foi submetido a um pr-tratamento hidrotrmico e pr-hidrlise de 24 h, com carga enzimtica de 30 FPU/g. Neste processo, tambm se empregou S. cerevisiae de panificao (0,2 g/L), porm logrou-se somente 20 g/L de etanol em um tempo total de processo (194 h) quatro vezes maior e uma produtividade volumtrica (0,1 g/L.h), aproximadamente, doze vezes menor daqueles obtidos neste trabalho, 52 h e 1,14 g/L.h, respectivamente. WINGREN et al. (2005) e HGREN et al. (2007), cujos trabalhos foram apresentados anteriormente, alcanaram concentraes de etanol bem menores, 26,0 g/L em 71 h e 26,7 g/L em 96 h de SSF, respectivamente, e tambm realizaram pr-tratamento (exploso com vapor catalisada - SO2). importante ressaltar que, alm desses trabalhos apresentarem
concentraes de etanol e produtividades muito menores, nos processos com estas biomassas, madeira de Picea abies, selagem e palha de milho, foram realizados prtratamentos, etapa desnecessria na produo de etanol a partir de uma biomassa residual da indstria de celulose (PM3), o que a coloca em uma posio muito favorvel. Visando garantir a reprodutibilidade do processo SSF em frascos agitados, fez-se necessrio validar as melhores condies do processo SSF com o resduo PM3, citadas a seguir:
relao S:L 1:4; carga enzimtica de 17,5 FPU/g slido, utilizando celulases Multifect; tempo de pr-hidrlise enzimtica de 16h; 8 g/L de S. cerevisiae de panificao; 36 h de processo.
84
5.4.3. Validao das melhores condies do processo SSF em frascos agitados
A Figura 5.20 apresenta o perfil cintico do processo SSF de PM3, realizado em 4 rplicas, utilizando as melhores condies, descritas anteriormente, para esse processo. A Tabela 5.9 apresenta as concentraes de acares, etanol e etanol equivalente (fermentmetro) no incio e final do SSF. Tais resultados mostraram claramente que as melhores condies do processo SSF com o resduo PM3 foram validadas, corroborando a reprodutibilidade do processo em frascos agitados.
80
Etanol equivalente (g/L)
70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40
Tempo (h)
Figura 5.20. Perfil cintico do SSF na validao das melhores condies do processo SSF com PM3 em frascos agitados. Condies: relao S:L 1:4, carga enzimtica de 17,5 FPU/g, tempo de pr-hidrlise enzimtica de 16 h e 8 g/L inculo
Tabela 5.9. Concentrao de acares no incio do SSF e de etanol equivalente (equiv.), acares e etanol no final do SSF (36h) na validao das melhores condies: relao S:L 1:4, carga enzimtica de 17,5 FPU/g, tempo de prhidrlise enzimtica de 16 h e 8 g/L inculo Incio SSF Concentrao (g/L) ART 93,8 Glicose 73,7 Celobiose Glicose 7,1 0,0 Final SSF Concentrao (g/L) Etanol Celobiose equiv. 1,1 70,1
Etanol (CLAE) 65,0
85
Em todos os experimentos realizados at a validao das melhores condies do SSF foi utilizada a levedura S. cerevisiae de panificao. Porm, segundo CHERUBIN (2003), a utilizao de levedura de panificao em processos fermentativos propicia a contaminao bacteriana, que seria oriunda da prpria massa celular. Alm disso, visando produo em escala industrial, a levedura de panificao considerada menos resistentes s substncias txicas, como o alumnio, que podem ser encontradas no caldo fermentativo industrial e reduzirem significativamente a viabilidade e a taxa de fermentao desta levedura (ARANHA 2002). Desta forma, decidiu-se dar continuidade ao trabalho empregando uma linhagem industrial de S. cerevisiae, codificada como JP1, como agente fermentativo do processo SSF do resduo PM3.
5.5. PROCESSOS SSF CONDUZIDOS EM BIORRETAOR
Nesta seo so apresentados os resultados dos processos SSF conduzidos em biorretaor instrumentado. Trs condies foram ensaiadas, a saber: processo SSF utilizando S. cerevisiae JP1 e celulases Multifect; SSF empregando S. cerevisiae JP1 e celulases LADEBIO, visando comparar o desempenho dessas celulases com o das enzimas Multifect; e SSF com enzimas comerciais e hidrolisado suplementado com fontes de nitrognio, fosfato e sais minerais, a fim de avaliar a importncia da suplementao na produo de bioetanol.
5.5.1. Processo SSF empregando a linhagem industrial S. cerevisiae JP1 e celulases comerciais Multifect
A fim de se obter a concentrao de inculo desejada (8,0 g/L) da levedura S. cerevisiae JP1 em menor tempo, empregando-se apenas um vaso e no vrios frascos cnicos, realizou-se a propagao das clulas em biorreator. Para isso, utilizou-se 10% do pr-inculo crescido por 12 h em frascos cnicos agitados de acordo com a metodologia descrita no item 4.31. A propagao do pr-inculo por
86
12 h foi determinada uma vez que neste tempo as clulas ainda se encontravam em fase de crescimento, como pode ser visualizado na Figura 5.21. Como a obteno de grande massa celular no biorreator necessitava de alta concentrao de substrato (glicose), que no poderia ser fornecida em sua totalidade no incio do crescimento do inculo, realizou-se, portanto, uma batelada alimentada com pulsos. A concentrao inicial de glicose no meio de cultura (Tabela 4.2) foi de 35 g/L, tendo sido necessria apenas uma alimentao com soluo de glicose concentrada (800 g/L) a fim de se aumentar a concentrao deste acar para 20 g/L e alcanar a concentrao celular desejada.
Massa celular (g/L)
2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 5 10 15 Tempo (h) 20
Figura 5.21. Cintica do pr-inculo de S. cerevisiae JP1
A Figura 5.22 apresenta o perfil de crescimento da levedura S. cerevisiae JP1 em biorreator. importante ressaltar que a utilizao do pr-inculo contribuiu para a curva de crescimento no apresentar fase lag, perodo em que ocorre pouca ou nenhuma diviso celular. O mesmo no ocorreu na curva de crescimento do princulo (Figura 5.21), na qual a durao da fase lag foi de 4 horas, pois as leveduras se encontravam em estado de latncia, uma vez que no se reproduziram imediatamente ao serem inoculadas em um meio de cultura com composio qumica diferente. Nessa fase, a populao fngica passou por um perodo de intensa atividade metablica, principalmente sntese de enzimas e de molculas variadas.
87
A produtividade volumtrica em clulas atingida na propagao realizada em biorreator foi 0,91 g/L.h, cinco vezes maior daquela apresentada no crescimento do pr-inculo (0,19 g/L.h). Baseando-se nesses dados, verificou-se que a estratgia de crescer S. cerevisiae JP1 em biorreator mostrou-se extremamente eficaz, uma vez a obteno de grande massa celular em um curto perodo de tempo tambm implica na reduo do custo total do processo.
40 35
Glicose Clulas
10 8 6 4 2 0
Glicose (g/L)
30 25 20 15 10 5 0 0 1,5 3 4,5 6 7,5 9
Tempo (h)
Figura 5.22. Cintica do crescimento de S. cerevisiae JP1 em biorreator
O perfil cintico obtido do processo SSF utilizando S. cerevisiae JP1 e celulases Multifect apresentado na Figura 5.23. A partir dessa cintica pode-se deduzir que um tempo de 16 h no foi demasiado para a pr-hidrlise enzimtica, pois se pode observar claramente que, at a etapa de inoculao com a levedura, a liberao da glicose pelas celulases foi monotonicamente crescente. Verifica-se que a concentrao de celobiose durante o processo manteve-se prxima de 6,0 g/L, concentrao muito inferior daquela alcanada em fermentaes relatadas na literatura, nas quais celulases comerciais tambm foram utilizadas, mas com carga adicional de -glucosidase (WINGREN et al., 2005; LINDE et al., 2006; RUIZ et al., 2006; KANG et al., 2010; ZHU et al., 2010).
Massa celular (g/L)
88
Glicose
80 70
Celobiose
Xilose
Etanol
PHE
SSF
Concentrao (g/L)
60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Figura 5.23. Perfil cintico do processo SSF de PM3 em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases Multifect. Condies: relao S:L 1:4, carga enzimtica de 17,5 FPU/g, tempo de PHE de 16 h e 8 g/L de inculo PHE Pr-hidrlise enzimtica
A taxa de produo de etanol sofreu reduo a partir do tempo de 24 horas e manteve-se praticamente constante at o final do processo, quando foi alcanada a concentrao de 64,4 g/L de etanol. A concentrao final de etanol obtida no processo SSF de PM3 empregandose linhagem industrial de S. cerevisiae foi muito superior do que aquelas relatadas em vrios processos SSF na literatura (MARTIN et al., 2002; LINDE et al., 2006; RUIZ et al., 2006; KANG et al., 2010; ZHU et al., 2010) (Tabela 2.7). KANG et al. (2010) realizaram um processo SSF com lama de cal proveniente da indstria de celulose para a produo de bioetanol de segunda gerao. Neste trabalho, o resduo no foi submetido a pr-tratamento nem a etapa de pr-hidrlise enzimtica. Empregando celulases (15 FPU/g), -glucosidases (30 UI/mL), 6% de teor de slidos e 0,05 g/L de S. cerevisiae, alcanaram apenas 45 g/L de etanol aps 150 h de processo. RUIZ et al. (2010) produziram bioetanol a partir de madeira de oliva e caule de girassol, submetendo-os a pr-tratamentos com exploso a vapor catalisada
89
(SO2) e deslignificao com perxido alcalino, sem realizar pr-hidrlise enzimtica e utilizando S. cerevisiae com inculo. Somente aps 72 h de processo, alcanaram apenas 20,9 g/L e 29,4 g/L de etanol com caule de girassol e madeira de oliva, respectivamente LINDE et al. (2006) alcanaram 25 g/L de etanol aps 120 h de processo SSF realizado com palha de cevada. Enquanto MARTIN et al. (2002) obtiveram aps 48 h de SSF apenas 12 g/L de etanol produzido a partir de bagao de cana. ZHU et al. (2010) relataram que alcanaram 41,8 g/L de etanol a partir de cavaco de pinus, que foi submetido a pr-tratamento com H2SO4 e NaHSO4, empregando 2,0 g/L de S.cerevisiae, porm no explicitaram o tempo do processo. A Tabela 5.10 sumariza as concentraes de acares e etanol no incio e final do processo com PM3. importante verificar que a concentrao de xilose manteve-se constante duranto todo o curso do processo, denotando que a linhagem industrial S. cerevisiae JP1 no foi capaz de consumir xilose, como amplamente reportado na literatura. A glicosce no foi consumida em sua totalidade, mas manteve-se em concentraes bastante reduzidas at o final do processo, denotando que este monossacardeo foi facilmente fermentado pela levedura.
Tabela 5.10. Concentrao de acares e etanol no incio e final do processo SSF (64h) em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases Multifect Incio SSF Concentrao (g/L) ART 90,5 Glicose 74,5 Celobiose 6,3 Xilose 10,4 ART 15,2 Final SSF Concentrao (g/L) Glicose 4,4 Celobiose 4,9 Xilose 9,8 Etanol 64,4
5.5.2. Processo SSF empregando S. cerevisiae JP1 como inculo e consrcio celulsico LADEBIO
O perfil cintico obtido do processo SSF utilizando celulases LADEBIO produzidas por Penicilium funiculosum apresentado na Figura 5.24. Cabe ressaltar que as condies utilizadas neste processo foram as mesmas determinadas como melhores em estudos anteriores, exceto o tempo de pr-hidrlise, que foi 18 h, o
90
microorganismo fermentador, substituido pela levedura industrial, e o complexo celulsico, que o foco desta etapa de estudo.
Glicose
90 80
Celobiose
Xilose
Etanol
PHE
SSF
Concentrao (g/L)
70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Figura 5.24. Perfil cintico do processo SSF de PM3 em biorreator empregando celulases LADEBIO e S. cerevisiae JP1. Condies: relao S:L 1:4, carga enzimtica de 17,5 FPU/g, 18 h de pr-HE e 8 g/L de inculo. PHE Pr-hidrlise enzimtica
Empregando celulases LADEBIO alcanou-se uma concentrao de glicose ao final da pr-hidrlise enzimtica maior (84,1 g/L) do que aquelas obtidas quando celulases Multifect foram utilizadas (aproximadamente 73 g/L em 16 h). Ao considerar o tempo de 15 h para as celulases LADEBIO, uma vez que a comparao anterior foi baseada em 18 h (tempo necessrio para a biomassa liquefazer-se), essas enzimas conferiram concentrao de glicose um pouco maior (74,8 g/L) daquela obtida com as celulases comerciais. De acordo com o perfil cintico, se tivesse dado continuidade a pr-hidrlise enzimtica nesse experimento, que ainda mostrava taxa bem acentuada, maiores concentraes de glicose certamente seriam obtidas e maior concentrao de etanol poder-se-ia ser alcanada. Os resultados obtidos na hidrlise enzimtica do resduo PM3 indicaram que, assim como as celulases comerciais, as enzimas LADEBIO foram excelentes catalisadores.
91
Em relao taxa de produo de etanol, a mesma passou a ser praticamente constante com 4 h de fermentao. Neste tempo, a concentrao de etanol alcanada foi de 32,5 g/L e ao final do processo (64 h) aumentou para 52,6 g/L. Ao comparar o perfil cintico desse experimento (Figura 5.24) com o do anterior no qual se utilizou celulases Multifect (Figura 5.23), empregando a S. cerevisiae JP1 em ambos, verifica-se que esta levedura apresentou desempenho similar somente no incio do processo, quando havia grande disponibilidade de glicose. Aps a reduo deste acar a concentraes menores que 20 g/L, a produo de etanol passou a ser dependente da atividade enzimtica em ambos processos, ocorrendo maior limitao da taxa fermentativa quando utilizou-se enzimas LADEBIO. Isto pode ser explicado pela concentrao de celobiose ter se mantido 0 g/L durante todo o curso do processo, indicando que o consrcio enzimtico LADEBIO apresentou excelente atividade -glucosidsica, mantendo uma concentrao de glicose muito baixa no meio, que medida que era liberada, era prontamente consumida pela grande massa celular de levedura, gerando assim uma maior limitao desse microorganismo pela reduzida concentrao de glicose no meio. Como j havia sido reportado por CASTRO et al. (2010), a atividade relativa de -glucosidase no extrato bruto produzido por P. funiculosum (19%) proporcionalmente maior que a de -glucosidase das celulases Multifect (1,5%), o que implicou um acmulo de celobiose no meio no processo em que se utilizou as enzimas comerciais. Vale ressaltar que a iniciativa de empregar celulases produzidas in situ foi de extrema importncia, pois o custo das celulases comerciais encarecem muito o processo global, e que estudos mais aprimorados devem ser realizados, considerando que neste experimento no se utilizou as condies otimizadas para as celulases LADEBIO. Apesar de no terem sido empregadas na etapa de pr-hidrlise enzimtica as condies otimizadas para as celulases LADEBIO, foi alcanada, no final processo SSF com PM3, concentrao de etanol (52,6 g/L) maior do que aquelas relatadas por MARTIN et al. (2002) (12 g/L), LINDE et al. (2006) (25 g/L), RUIZ et al.
92
(2006) (21 g/L), KANG et al. (2010) (45 g/L) e ZHU et al. (2010) (41,8 g/L) que utilizaram celulases comerciais e cujos trabalhos foram descritos anteriormente (Tabela 2.7). A Tabela 5.11 sumariza as concentraes de acares e etanol no incio e final do SSF. Verifica-se que a concentrao de xilose manteve-se constante duranto todo o processo e que a glicose foi consumida quase em sua totalidade. Considerando que foi alcanada maior concentrao de etanol no processo em que se empregou celulases comerciais, optou-se por dar continuidade ao estudo com as celulases Multifect.
Tabela 5.11. Concentrao de acares e etanol no incio e final do processo (64h) em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases LADEBIO Incio SSF Concentrao (g/L) ART 87,5 Glicose 84,1 Celobiose 0,0 Xilose 9,1 ART 5,8 Final SSF Concentrao (g/L) Glicose 2,3 Celobiose 0,0 Xilose 9,4 Etanol 52,6
5.5.3. Processo SSF empregando S. cerevisiae JP1, celulases comerciais Multifect e hidrolisado suplementado com fontes de nitrognio, fosfato e sais minerais
O perfil cintico obtido no processo SSF com hidrolisado suplementado apresentado na Figura 5.25, mostrando comportamento muito similar ao do SSF no qual no se suplementou o hidrolisado (Figura 5.23), no que se concerne s concentraes de xilose, glicose e celobiose durante todo o curso do processo. Nas primeiras 7 h de fermentao, alcanou-se concentrao de 32 g/L, gerando uma produtividade volumtrica de 4,6 g/L.h, valor que no difere muito daqueles obtidos em fermentaes convencionais de etanol a partir do caldo de cana no Brasil (5 8 g/L.h). Esta produtividade inicial foi bem maior do que aquela obtida por VASQUEZ et al. (2007), que alcanaram 30 g/L de etanol a partir de bagao de cana em 10 h de fermentao, gerando uma produtividade volumtrica de 3,0 g/L.h.
93
A taxa de produo de etanol comeou a reduzir a partir de 56 h de processo. Neste tempo, a concentrao de etanol alcanada foi de 70,7 g/L. Ao final do processo (64 h), obteve-se 74,6 g/L de etanol, concentrao 15% maior que aquela obtida no SSF com hidrolisado no suplementado (64,4 g/L). Isto indicou que a suplementao do hidrolisado de PM3 com fontes de nitrognio, fosfato de potssio e soluo de sais minerais e cido ctrico teve influncia significativa sobre a concentrao final de etanol. A fim de se aumentar a concentrao deste biocombustvel, poder-se-ia realizar um estudo sobre a influncia de cada nutriente utilizado na suplementao e, desta forma, saber quais apresentam efeito positivo e significativo sobre a varivel de resposta, quais concentraes deveriam ser utilizadas e se algum nutriente tem efeito negativo, podendo assim no ser utilizado na suplementao, o que reduziria o custo total do processo.
Glicose
80
Celobiose
Xilose
Etanol
PHE
70
SSF
Concentrao (g/L)
60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo (h)
Figura 5.25. Perfil cintico do processo SSF de PM3 em biorreator com hidrolisado suplementado com fontes de nitrognio, fosfato de potssio, soluo de sais minerais e cido ctrico. Condies: relao S:L 1:4, celulases Multifect, carga enzimtica de 17,5 FPU/g e 8 g/L de S. cerevisiae JP1 PHE Pr-hidrlise enzimtica
94
A produtividade volumtrica alcanada no final do processo foi de 1,2 g/L.h, considerando tanto a etapa de pr-hidrlise enzimtica (16 h) quanto a de fermentao simultnea a sacarificao (48 h). Vrios trabalhos na literatura relataram produtividades muito menores daquela alcanada neste trabalho, a saber: MARTIN et al. (2002) alcanaram 0,25 g/L.h no processo SSF de bagao de cana; WINGREN et al. (2005) obtiveram 0,35 g/L.h no SSF com madeira de Picea abies; BALLESTEROS et al. (2006) atingiram 0,01 g/L.h a partir do SSF de palha de trigo; RUIZ et al. (2006) alcanaram 0,29 g/L.h e 0,41 g/L.h nas fermentaes de madeira de oliva e caule de girassol, respectivamente; e JORGENSEN et al. (2010) alcanaram 0,32 g/L.h no processo SSF de palmiste, enquanto KANG et al. (2010) lograram uma produtividade volumtrica de 0,3 g/L.h na fermentao da lama de cal proveniente da indstra de celulose (Tabela 2.7). A Tabela 5.12 sintetiza as concentraes de acares e etanol no incio e final do SSF.
Tabela 5.12. Concentrao de acares e etanol no incio e final do SSF (64h) em biorreator empregando S. cerevisiae JP1, celulases Multifect e hidrolisado suplementado Incio SSF Concentrao (g/L) ART 90,5 Glicose 73,9 Celobiose 6,1 Xilose 9,3 ART 12,3 Final SSF Concentrao (g/L) Glicose 3,9 Celobiose 5,0 Xilose 8,6 Etanol 74,6
A suplementao conferiu um aumento na concentrao de etanol e, consequentemente, na produtividade, conforme dados relatados pela literatura, que mostraram a importncia de adicionar nutrientes ao meio fermentativo
(SREEKUMAR et al., 1999; DANESI et al., 2006). A partir dos experimentos realizados, determinou-se as seguintes condies como as melhores para o processo SSF do resduo PM3 para produo de bioetanol de segunda gerao:
Relao S:L 1:4; Carga enzimtica de 17,5 FPU/g de slido, utilizando celulases Multifect; Tempo de pr-hidrlise enzimtica de 16 h;
95
8,0 g/L de S. cerevisiae JP1; Suplementao do hidrolisado com fosfato de potssio, uria, extrato de levedura e solues de sais minerais e cido ctrico.
Com tais condies foram possveis alcanar os seguintes resultados: 73,9 g/L de glicose aps 16 h de pr-hidrlise enzimtica e 74,6 g/L de etanol aps 48 h de fermentao, correspondendo a uma produtividade volumtrica nesta etapa de processo de 1,55 g/L.h.
5.6. CONSIDERAES FINAIS
Sabendo-se que o rendimento terico de etanol 0,511 g/g, obteria-se 37,8 g/L de etanol ao considerar a concentrao inicial de glicose (73,9 g/L) alcanada no final da pr-hidrolise deste experimento. Isso ocorreria se a estratgia para a produo de etanol escolhida fosse a Sacarificao e Fermentao em Separado (SHF). Entretanto, com a Sacarificao e Fermentao Simultnea (SSF) foi possvel obter 74,6 g/L de etanol em 48 h de fermentao, quase o dobro daquela que seria obtida no SHF se a converso da glicose a etanol fosse 100%, o que dificilmente aconteceria. O processo SSF permitiu que maiores concentraes de etanol fossem obtidas porque as celulases no foram inibidas pelos seus produtos, que prontamente foram consumidos pelo microorganismo, permitindo que essas enzimas continuassem atuando e liberando mais glicose para ser utilizada no processo fermentativo. Assim, com a estratgia SSF, foi possvel alcanar um rendimento de etanol 82% do terico, considerando a concentrao inicial de celulose. Na Tabela 5.13 pode ser visualizada de maneira bastante sumarizada a evoluo do presente trabalho, relatando as melhores condies do processo SSF que conferiram as maiores concentraes de acares e etanol em cada etapa do estudo. Tendo os resultados dos ensaios de fermentabilidade para o resduo PM3 como referncia, verificou-se que por meio dos estudos da hidrlise enzimtica, da otimizao do processo SSF e da suplementao do hidrolisado, obtiveram-se
96
significativas melhorias no processo, a saber: reduo da carga enzimtica em 45%, reduzindo apenas 11% a concentrao de glicose; e aumento da produtividade volumtrica em 46%, reduzindo, portanto, o tempo de processo SSF em 48 h e obtendo-se uma concentrao de etanol 5% maior (74,6 g/L).
Tabela 5.13. Condies utilizadas e resultados obtidos em cada etapa da pesquisa S:L (g/mL) CE (FPU/g) Tempo PHE (h) 12 Glicose (g/L) Inculo (g/L) Etanol (g/L) Tempo SSF (h) Qp (g/L.h)
Etapa
Teste fermentabilidabe
1:4
32
83,4
2,0
71,1
96
0,74
HE
1:4
17,5
28
76,9
I SSF
1:4
17,5
16
69,7
4,6
77,6
48
1,62
II SSF
1:4
17,5
16
73,6
8,0
66,6
36
1,85
Validao
1:4
17,5
16
73,7
8,0
65,0
36
1,81
SSF biorreator JP1 e Multifect SSF biorreator JP1 e LABEDIO SSF biorreator JP1, Multifect e suplementao
1:4
17,5
16
74,5
8,0
64,4
48
1,34
1:4
17,5
18
84,1
8,0
52,6
48
1,1
1:4
17,5
16
73,9
8,0
74,6
48
1,6
CE carga enzimtica; S:L relao slido:lquido; PHE pr-hidrlise enzimtica; HE DCCR para hidrlise enzimtica; I SSF DCCR para SSF; II SSF Planejamento univarivel para SSF; SSF biorreator JP1 e Multifect SSF em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases Multifect; SSF biorreator JP1 e LADEBIO SSF em biorreator empregando S. cerevisiae JP1 e celulases LADEBIO; SSF biorreator JP1, Multifect e suplementao SSF em biorreator empregando S. cerevisiae JP1, celulases Multifect e hidrolisado suplementado com fontes de nitrognio e fosfato e soluo de sais minerais e cido ctrico.
97
Uma das grandes vantagens de se produzir bioetanol a partir do resduo proveniente do sistema de decantao da indstria de celulose, codificado neste trabalho como PM3, a no necessidade das etapas de pr-tratamento, diferentemente do que ocorre com outros resduos celulsicos, como bagao de cana-de-acar (COZENS & MILLER, 1997; MARTIN et al., 2002; BETANCUR, 2005; VQUEZ et al., 2007; SANTOS et al., 2010), cavacos residuais, palha de cana-de-acar, trigo e arroz (DELGENES et al., 1990; NIGAN, 2001;
BALLESTEROS et al., 2006; RUIZ et al., 2006). A produo de etanol sem pr-tratamentos pode reduzir muito o custo total do processo, no somente em escala laboratorial, mas principalmente em escala industrial (PEREIRA Jr. et al., 2008). Desta forma, a no necessidade de prtratamentos e a alta concentrao de etanol alcanada no processo SSF com PM3, mostrou que este resduo celulsico uma excelente e competitiva matria-prima para a produo de bioetanol de segunda gerao, gerando oportunidade para o setor de celulose aumentar o seu portfolio de produtos, dentro do contexto que vem sendo denominado de biorrefinaria. Mesmo que o resduo PM3 no seja gerado com a mesma magnitude que outros resduos, como o bagao de cana-de-acar (145 milhes toneladas/ano), principal foco das pesquisas que visam o aproveitamento de resduos
lignocelulsicos para a produo de bioetanol, importante destacar a necessidade de translocar qualquer biomassa residual de sua posio de resduo para a de matria-prima, visando no somente a reduo dos impactos ambientais causados pelas fontes fsseis, mas tambm reverter a dependncia de petrleo e atingir um crescimento sustentvel baseado em fontes renovveis que propiciaria o crescimento econmico, poltico e social de todas as naes.
CAPTULO 6. Concluses e Sugestes
98
CAPTULO 6
6. CONCLUSES E SUGESTES
Neste captulo so apresentadas as concluses inferidas com base nos resultados obtidos e anlises dos dados realizadas.
6.1. CONCLUSES
Considerando que os resultados obtidos no teste de fermentabilidade para PM1, PM2 e PM3 no constituram estudos de otimizao, pode-se concluir que as concentraes de etanol foram muito significativas, 70, 3 g/L, 78,8 g/L e 71,1 g/L, respectivamente, e sinalizaram desdobramentos importantes nas etapas posteriores do trabalho; No planejamento experimental (DCCR) para a hidrlise enzimtica de PM1, PM2 e PM3, concluiu-se que ambas as biomassas apresentaram grande potencial como fonte de glicose e que as variveis relao S:L e carga enzimtica apresentaram efeitos significativos sobre a varivel de resposta, concentrao final glicose;
99
Baseando-se nos resultados do DCCR para a hidrlise enzimtica, determinaram-se as melhores condies para serem utilizadas na etapa de pr-hidrlise enzimtica do processo SSF com PM3: relao S:L 1:4 e carga enzimtica de 17,5 FPU/g de slido, as quais permitiram a obteno de 77 g/L de glicose; Foi possvel concluir com o DCCR realizado para o SSF, que somente a concentrao celular teve efeito significativo sobre a concentrao de etanol, dentro da faixa analisada, no ocorrendo o mesmo para o tempo de prhidrlise enzimtica. As melhores condies do processo foram 4,6 g/L de clulas e 16 h de pr-hidrlise, alcanando 77,6 g/L de etanol em 48 h. Ficou evidente que o processo SSF foi otimizado aps o planejamento univarivel, o qual mostrou que a concentrao mxima de etanol foi obtida no experimento cuja concentrao celular foi 8,0 g/L. A mxima concentrao de etanol e produtividade volumtrica obtidas na fermentao foram 66,6 g/L e 1,85 g/L.h em 36 h, respectivamente; Baseando-se em todos os experimentos realizados, concluiu-se que as melhores condies para o processo SSF de PM3 conduzido em frascos agitados foram: relao S:L 1:4; carga enzimtica de 17,5 FPU/g, utilizando celulases Multifect; tempo de pr-hidrlise enzimtica de 16 h; e 8,0 g/L de S. cerevisiae de panificao. Com a validao das melhores condies do processo SSF, corroborou-se a reprodutibilidade do processo em frascos agitados; A estratgia de crescimento do pr-inculo em frascos agitados e do inculo de S. cerevisiae JP1 em biorreator mostraram-se extremamente eficazes no que concerne na obteno de alta concentrao celular em um curto perodo de tempo; Os processos SSF conduzidos em biorreatores indicaram que a maior concentrao de etanol (74,6 g/L) e produtividade (1,6 g/L.h em 48 h de fermentao) foram obtidas quando empregou-se: S. cerevisiae JP1, que fermentou facilmente o substrato; celulases Multifect; e hidrolisado
100
suplementado com fontes de fosfato e nitrognio e solues de sais minerais e cido ctrico. Podendo-se produzir 373 litros de bioetanol para cada tonelada de resduo PM3 processada; Tendo o teste de fermentabilidade realizado com o resduo PM3 como referncia, o presente trabalho permitiu reduzir a carga enzimtica em 45 % e aumentar a produtividade volumtrica de etanol em 46%; Por conseguinte, conclui-se que o resduo celulsico do sistema de decantao da indstria de celulose (PM3) constituiu uma excelente matriaprima para a produo de bioetanol de segunda gerao empregando o processo de Sacarificao e Fermentao Simultnea (SSF).
6.2. SUGESTES
A fim de se dar continuidade linha de pesquisa realizada nesta dissertao, so feitas as seguintes sugestes:
Desenvolver metodologias que permitam caracterizar rapidamente as fraes dos compostos lignocelulsicos do resduo PM3; Otimizar o meio de cultura para o crescimento do pr-inculo e inculo de S. cerevisiae JP1; Otimizar a hidrlise enzimtica de PM3 empregando celulases LADEBIO a fim de se determinar as melhores condies que confiram a mxima concentrao de glicose e melhorar o desempenho desse consrcio enzimtico no processo SSF; Otimizar as concentraes das fontes de fosfato e nitrognio, de sais minerais e cido ctrico, com o propsito de determinar quais variveis apresentam efeito positivo significativo sobre a concentrao de etanol e com isso aumentar a produtividade e reduzir o custo total do processo;
CAPTULO 7. Referncias Bibliogrficas
101
CAPTULO 7
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ABRANTES, R.; ASSUNO, J.V.; HIRAI, E.Y. (2005). Caracterizao das emisses de aldedos de veculos do ciclo diesel. Revista de Sade pblica. So Paulo, v. 39, n. 3, junho de 2005. ALVES, D.M.G. (1994). Fatores que afetam a formao de cidos orgnicos bem como outros parmetros da fermentao alcolica. Dissertao de Mestrado. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, USP. ANFAVEA Associao Nacional dos Fabricantes de Veculos Automotores. (2008). Anurio estatstico da indstria automobilstica brasileira. Disponvel em www.anfavea.com.br. Acesso em setembro de 2009. ANP Agncia Nacional de Petrleo, Gs Natural e Biocombustveis. (2009). Anurio estatstico brasileiro do petrleo, gs natural e biocombustveis. Disponvel em www.anp.gov.br. Acesso em maro de 2010. ARACRUZ. (2009). Produo de celulose. Disponvel em www.aracruz.com.br. Acesso em maro de 2009. ARANHA, D.A.D. (2002). Efeitos do alumnio sobre a fermentao alcolica. Dissertao de Mestrado. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), USP.
102
ARANTES, V. & SADDLER, J.N. (2010). Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis: the role of amorphogenesis. Biotechnology for Biofuels, v. 3, n. 4. Disponvel em www.biotechnologyforbiofuels.com/content/3/1/4. Acesso em fevereiro de 2010. BALESTEROS, I.; NEGRO, M.J.; OLIVA, J.M.; CABAAS, A.; MANZANARES, P.; BALLESTORES, M. (2006). Ethanol production from steam-explosion pretrated wheat straw. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 129-132, p.496-508. BERLIN, A.; GILKES, N.; KILBURN, D.; MAXIMENKO, V.; BURA, R.; MARCOV, A.; SKOMAROVSKY, A.; OKUNEY, O.; SOLOVIERA, I.; SADDLER, J.N. (2006). Evaluation of cellulase preparation for hydrolysis of hardwood substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 129-132, p. 528-545. BETANCUR, G.J.V. (2005). Avanos em biotecnologia de hemicelulose para produo de etanol por Pichia stipitis. Dissertao de Mestrado. Escola de Qumica, UFRJ. BINKLEY, D.; SENOCK, R.; BIRD, S.; COLE, T.G. (2003). Twenty years of stand development in pure and mixed stands of Eucalyptus saligna and nitrogen-fixing Facaltaria moluccana. Forest Ecology and Management, v. 12. p. 93-102. BNDS Banco Nacional de Desenvolvimento Econmico e Social. (2008). Bioetanol de cana-de-acar: Energia para o desenvolvimento sustentvel. Rio de Janeiro, 316p. BRACELPA Associao Brasileira de Celulose e Papel. (2010). Setor de celulose e papel. Disponvel em www.bracelpa.org.br. Acesso em fevereiro de 2010. CAMPOS, E.S. (1997). Anlise comparativa de pastas celulsicas branqueadas de eucaliptos para a fabricao de papis de impresso e escrita. Dissertao de Mestrado. Universidade Federal de Santa Maria. CANETTIERI, E.V.; SILVA, J.B.A.E.; FELIPE, M.G.A. (2001). Application of factorial design to the study of xylitol production from eucalyptus hemicellulosic hydrolysate. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.90, p.159-168. CARPITA, N.G. & GILBEAULT, D.M. (1993). Structural models os primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant Physiology, v. 3, p. 1-3. CASTRO, A.M.; CARVALHO, M.LA.; LEITE, S.G.F.; PEREIRA Jr., N. (2010). Cellulases from Penicillium funiculosum: production, properties and application to cellulose hydrolysis. Journal Industrial Microbiology and Biotechnology, v. 37, p. 151158. CHERUBIN, R.A. (2003). Efeitos da viabilidade da levedura e da contaminao bacteriana na fermentao alcolica. Tese de Doutorado. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), USP.
103
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente. (2009). Resoluo N 415 de 24 de Setembro de 2009. Disponvel em http://www.cntdespoluir.org.br. Acesso em de fevereiro de 2010. COZENS, J.C. & MILLER, J.R. (1997). Acid hydrolysis of bagasse for ethanol production. Renewable Energy, v. 2-3, n. 10, p. 285-290. DALMEIDA, M.L.O. (1988). Composio qumica dos materiais lignocelulsicos. In: Celulose e Papel, Tecnologia de Fabricao da Pasta Celulsica, Brasil, Instituto de Pesquisas Tecnolgicas do Estado de So Paulo S.A. - IPT-, 2 Edio, v. 1, Capitulo III, p. 45-106. DANESI, E.D.G.; MIGUEL, A.S.M.; RANGEL-YAGUI, C.O.; CARVALHO, J.C.M.; PESSOA Jr., A. (2006). Effect of C:N ratio and substrate source on glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) producton by recombinant Saccharomyces cerevisiae. Journal of Food Engineering, v. 75, p. 96-103. DELGENES, J.P.; MOLETTA, R.; NAVARRO, J.M. (1990). Acid hydrolysis of wheat straw and process consideration for ethanol fermentation by Pichia stipitis Y7124. Process Biochemistry International, August, p.132-135. DEN HAAN, R.; ROSE, S.H.; LYND, L.R.; VAN ZYL, W.H. (2007). Hydrolysis and fermentation of amorphous cellulose by recombinant Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering, v. 9, n.1, p. 87-94. DUFF & MURRAY, W.D. (1996). Bioconversion of forest products industry waste cellulosics to fuel ethanol: a review. Bioresource Technology, v. 55, p. 133. DU PEREZ, J.C.; KOCK, J.L.F.; MONTEIRO, A.M.T.; PRIOR, B.A. (1985). The vitamin requirments of Candica shehatae for xylose fermentation. FEMS Microbiology Letters, v. 28, n. 3, p. 271-275. EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria. (2007). Sistema de produo de eucalipto. Disponvel em www.embrapa.br. Acesso em junho de 2009. FERRER, A.; BYERS, F.M; SULABARAN-DE-FERRER, B.; DALE, B.E.; AIELLO, C. (2002). Optimizing ammonia precessing conditions to enhance susceptibility of legumes to fiber hydrolysis. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 98-100, p.123-133. FOLHA ONLINE. (2009). Cincia: 2009 comeou no frio e termina numa fria. Disponvel em www.folha.com.br. Acesso em janeiro de 2010. FORRESTER, D.I.; BAUHUS, J.; COWIE, A.L.; VANKLAY, J.K. (2006). Mixedspecies plantations of Eucalyptus with nitrogen-fixing trees: A review. Forest Ecology and Management, v. 233 p. 211-230. FUJITA, Y.; ITO, J.; UEDA, M.; FUKUDA, H.; KONDO, A. (2004). Synergistic saccharification, and direct fermentation to ethanol, of amorphous cellulose by use of an engineered yeast strain codisplaying three types of cellulolytic enzyme. Applied and Environmental Microbiology, v. 70, n. 2, p. 1207-1212.
104
GHOSE, T.K. (1987). Measurement of cellulase activities. Pure & Applied Chemistry, v. 59, n. 2, p. 257-268. GOLDEMBERG, J.; COELHO, S.T.; GUARDABASSI, P. (2008). The sustainability of ethanol production from sugarcane. Energy Policy, v. 36, p 2086-2097. GOLDEMBERG, J. & MACEDO, I. C. (1994). The brazilian alcohol program An overview. Energy for Sustainable Development, v. 1, n.1, p. 17-22. GUTIERREZ, L.E. ; AMORIM, H.V. ; BASSO, L.C. (1991). Inibidores da fermentao alcolica. STAB, Acar, lcool e subprodutos. Piracicaba, v. 9, n. 6, p.24-30. HAMELINCK, C.N.; HOOIJDONK, G.V.; FAAIJ, A.P.C. (2005). Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle- and longterm. Biomass and Bioenergy, v. 28, p. 384410. JORGENSEN, H; SANADI, A.R.; FELBY, C.; LANGE, N.E.K; FISCHER, M.; ERNST, S. (2010). Production of ethanol and feed by high dry matter hydrolysis and fermentation of palm kernel press cake. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 161, p. 318-332. JOSEPH JR., H. (2005). Ethanol fuel: vehicular application technology. So Paulo: Anfavea, Energy and Environment Division. KHANG, L.; WANG, W.; LEE, Y. (2010). Bioconversion of kraft paper mill sludges to ethanol by SSF and SSCF. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 161, p. 5366. KOOTSTRA, A.M.J.; BEEFTINK, H.H.; SCOTT. E.L.; SANDERS, J.P.M. (2009). Optimization of the dilute maleic acid pretreatment of wheat straw. Biotechnology for Biofuels, v. 2, n. 31. Disponvel em www.biotechnologyforbiofuels.com/content/2/1. Acesso em janeiro de 2010. LAWFORD, H.G. & ROUSSEAU, J.D. (1998). Improving fermentation performance of recombinant Zymomonas in acetic acid-containing media. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 70-72, n. 1, p. 161-172. LEE, J. (1997). Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol. Journal of Biotechnology, v. 56, p. 1-24. LEE, W.G. & HUANG, C.-T. (2000). Modeling of ethanol fermentation using Zymomonas mobilis ATTC 10988 grown on the media containing glucose and fructose. Biochemical Engineering Journal, v. 4, n. 3, p. 217-227. LEMOS, J.L.S. (2001). Estudo da produo de xilanases por Aspergillus awamori em bagao de cana. Tese de Doutorado. Programa de Psgraduao em Tecnologia de Processos Qumico e Bioqumicos. Escola de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro. LIMA, U.A.; AQUARONE. E.; BORZANI, W.; SCHIMIDELL, W. (2001). Biotecnologia industrial processos fermentativos e enzimticos. 1 ed. Editora Edgar Blcher, So Paulo, v. 3, 593 p.
105
LINDE, M.; GALBE, M.; ZACCHI, G. (2006). Simultaneous Saccharification and Fermentation of steam-pretreated barley straw. Lund University. 28th Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals. Nashville, Tennessee. LOPES, C.R.A. (1998). nalise da indstria de papel e celulose no Brasil. Dissertao de Mestradro. Instituto de Ps-graduao e Pesquisa em Administrao, UFRJ. LOUETTE, A. (2007). Gesto do conhecimento: compndio para a sustentabilidade: ferramentas de gesto de responsabilidade socioambiental. 1 ed. Ed. Antakarana Cultura, Arte e Cincia, So Paulo. Disponvel em www.compendiosustentabilidade.com.br. Acesso em fevereiro de 2010. LU, Y.; YANG, B.; GREGG, D.; SADDLER, J.N.; MANSFIELD, S.D. (2002). Cellulase adsorption and an evaluation of enzyme recycle during hydrolysis of steam-exploded softwood residues. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 98-100, p. 641-653 LYND, L.R.; WEIMER, P.J.; ZYL, W.H.V.; PRETORIUS, I.S. (2002). Microbial cellulose utilization: Fundamentals and Biotechnology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 66. n. 3, p. 506-577 LYND, L.R.; ZYL, W.H.V.; McBRIDE, J.E.; LASER, M. (2005). Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass: an update. Current Opinion in Biotechnology, v. 16. n. 5, p. 577-583. MACEDO, I.C.; SEABRA. J.E.A.; SILVA, J.E.A.R, S. (2008). Greenhouse gases emissions in the production and use of ethanol from sugarcane in Brazil: The 2005/2006 averages and a prediction for 2020. Biomass and Bioenergy, v. 32, p. 582-595. MAPA Ministrio de Agricultura, Pecuria e Abastecimento. (2010). Secretaria de Produo e Agroenergia. Departamento da cana-de-acar e Agroenergia. Produo brasileira de etanol. Disponvel em www.agicultura.gov.br. Acesso em fevereiro de 2010. MARTIN, C.; GALBE, M.; NILVEBRANT, N.; JNSSON, L.J. (2002). Comparation of the fermentability of enzimatic hydrolizates of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion using different impregnating agents. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 98-100, p. 699-715. McCANN, M.C. & ROBERTS, K. (1991). Architecture of the primary cell wall. In: LOYD, C.W., (ed.). The Cyttoskeleta / Bass of plant Growth and Form. London: Academic Press, p. 109-129. McMILLAN, J.D.; NEWMAN, M.M.; TEMPLETON, D.W.; MOHAGHEGHI, A. (1999). Simultaneous Saccharification and Cofermentation of dilute-acid pretreated yellow poplar hardwood to ethanol using xylose-fermenting Zymomonas mobilis. Applied Biochemistry of Biotechnology, v. 77-79, p. 649-665. MENEZES, T.J.B. & AGUIAR, L.C. (2002). converso enzimtica do bagao de cana-de-acar. Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento, n. 16, maio-junho.
106
MILLER, G.L. (1959). Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, v. 31, n. 3, p. 426428. MONTGOMERY, D. & CALADO, V. (2003). Planejamento de experimentos usando o Statistic. Editorial E-papers Servios editoriais, Rio de Janeiro, Brasil. MORAIS, S.A.L.; NASCIMENTO, E.A.; MELO, D.C. (2005). Chemical analysis of Pinus oocarpa wood PARTE I quantification of macromolecular components and volatile extractives. Revista rvore, v. 29, n. 3, p. 461-470. MUSSATO, I.S.; ROBERTO, I.C. (2002). Produo biotecnolgica de xilitol a partir da palha de arroz. Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento, Braslia, n.28, p.34-39, set/out 2002. NEUREITER, M.; DANNER, H.; THOMASSER, C.; SAIDI, B.; BRAUN, R. (2002). Dillute-acid hydrolysis of sugarcane bagasse at varying conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 98, p. 49-58. NIGAM, J.N. (2001). Ethanol production from hardwood spent sulfite liquor using an adapted strain of Pichia stipitis. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v. 26, p. 145-150. ODAC The Oil Depletion Analysis Centre. (2007). Diponvel em www.odac-info.org. Acesso em fevereiro de 2007. HGREN, K.; BENGTSSON, O.; GORWA-GRAUSLUND, M.F.; GALBE, M.; HAHNHGERDAL, B.; ZACCHI, G. (2006). Simultaneous Saccharification and Cofermentation of glucose and xylose in steam-pretreated corn stover at high fiber content with Saccharomyces cerevisiae TMB3400. Journal of Biotechnology, v. 126, n. 4, p. 488-498. OLSSON, L.; SOERENDEN, H.R.; DAM, B.P.; CHRISTENSEN, H.; KROGH, K.M.; MEYER, A.S. (2006). Separate and simultaneous enzymatic hydrolysis and fermentation of wheat hemicellulose with recombinant xylose utilizing Saccharomyces cerevisiae. Applied Biochemistry and Biotechnololgy, v. 129132, p. 117-129. PAN, X.; XIE, D.; GILKES, N.; GREGG, D.J. & SADDLER, N.J. (2005). Strategies to enhance the enzymatic hydrolysis of pretreated softwood with high residual lignin content. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 121-124, p. 1069-1079. PANDEY, A.; SOCCOL, C.R.; NIGAM, P.; SOCCOL, V.T. (2000). Biotechnological potential of agro-industrial residues: sugarcane bagasse. Biosource Technology, v. 74, p. 69-80. PEDRAZZI, C. (2005). Qualidade de chapas de partculas de madeira aglomerada fabricadas com resduos de uma indstria de celulose. Dissertao de Mestrado. Universidade Federal de Santa Maria, UFSM. PEREIRA Jr., N. (1991). Investigation of D-xylose fermenting yeast. Ph.D. Thesis. Department of Chemistry. The University of Manchester, U.K.
107
PEREIRA Jr., N.; COUTO, M.A.P.G.; SANTA ANNA, L.M.M. (2008). Biomass of lignocellulosic composition for fuel ethanol production and the context of biorefinery. In Series on Biotechnology, Ed. Amiga Digital UFRJ, Rio de Janeiro, v.2, 45 p. PEREIRA, R.E (2006). Avaliao do potencial nacional de gerao de resduos agrcolas para a produo de etanol. Dissertao de Mestrado Escola de Qumica. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Brasil. PERVAIZ, M. & CORREA, C.A. (2009). Biorrefinaria - Desenvolvimento de plataformas qumicas atravs de tecnologias integradas de biomassa. Polmeros: Cincia e Tecnologia, v. 19, n. 1, PP E9-E11. PHILIPPIDIS, G.P. & SMITH, T.K. (1995). Limiting factors in the Simultaneous Saccharification and Fermentation process for conversion of cellulosic biomass to fuel ethanol. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 51/52, p. 117-124. RFA Renewable Fuels Association. (2010). 2008 World fuel ethanol production. Disponvel em http://www.ethanolrfa.org. Acesso em Fevereiro de 2010. ROSA, C.A.B. (2003). Influncia no teor de lignina da madeira de Eucalyptus globulus na produo e na qualidade da celulose kraft. Dissertao de mestrado. Universidade Federal de Santa Maria UFSM. RUIZ, E.; CARA, C.; BALLESTEROS, M.; MANZANARES, P.; BALLESTEROS, I.; CASTRO, E. (2006). Ethanol production from pretreated olive tree wood and sunflower stalks by an SSF process. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 129-132, p. 631-643. SNCHEZ, O.J. & CARDONA, C.A. (2008). Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology, v. 99, p. 5270-5295. SANTOS, A.S.; VALLE, M.L.M.; GIANNINI, R.G. (2000). A experincia brasileira no desenvolvimento de um combustvel binrio cool-diesel. Economia e Energia, n. 20. Disponvel em http://www.ecen.com/eee20/adailson. Acesso em fevereiro de 2010. SANTOS, D.S.; CAMELO, A.C.; RODRIGUES, K.C.; CARLOS, L.C.; PEREIRA Jr., N. (2010). Ethanol production from sugarcane bagasse by Zymomonas mobilis using Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) process. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 161, p. 93-105. SEWALT, V.J.H.; BEAUCHEMIN K.A.; RODE L.M.; ACHARYA, S.; BARON, V.S. (1997). Lignin impact on fiber degradation. iv. enzymatic saccharification and in vitro digestibility of alfalfa and grasses following selective solvent deslignification. Bioresourse Technology, v. 61, p.199-206. SREEKUMAR, O.; CHAND, N., BASAPPA, S. (1999). Optimization and interaction of media components in ethanol production using Zymomonas mobilis by response surface methodology. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 88, n. 3, p. 334338.
108
STAPE, J.L.; BINKLEY, D.; RYAN, M.G.; FONSECA, S.; LOOS, R.A.; TAKAHASHI, E.N. (2010). The Brazil Eucalyptus potential productivity project: Influence of water, nutrients and stand uniformity on wood production. Forest Ecology and Management, v. 259, n. 9, p. 1684-1694. STENBERG, K.; BOLLK, M.; RCZEY, K.; GALBE, M.; ZACCHI, G. (1999). Effect of substrate and cellulase concentration on SSF of steam-pretrated softwood for ethanol production. Biotechnology and Bioengineering, v. 68, n. 2, p. 204-210. SUN, Y. & CHENG, J.J. (2005). Dilute acid pretreatment of rye straw and bermudagrass for ethanol production. Bioresource Technology, v. 96, p. 1599-1606. SUN, Y. & CHENG, J. (2002). Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresource Technology, v. 83, n. 1, p. 1-11. SZWARC, A. (2010). Etanol - Carros flex: uso de etanol j evitou emisso de mais de 83 milhes de toneladas de CO2. UNICA - Unio da Indstria de Cana-de-Acar. Disponvel em http://www.unica.com.br/noticias. Acesso em fevereiro de 2010. TAHERZADEH, M.J. & KARIMI, K. (2007). Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review. Bioresources, v. 2, n. 4, p. 707-738. TAMANINI, C. & HAULY, M.C.O. (2004). Resduos agroindustriais para a produo biotecnolgica de xilitol. Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 25, n. 4, p. 315-330. TEIXEIRA, L.C.; LINDEN, J.C.; SCHROEDER, H.A. (2000). Simultaneous Saccharification and Cofermentation of peracetic acid-pretreated biomass. Applied Biochemistry and Biotechnolgy, v. 84-86, n. 1-9, p. 111-127. TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. (2005). Microbiologia. 8 ed. Ed. Artmed, Porto Alegre, 894 p. UNICA Unio da Indstria de Cana-de-acar. (2009). Produo de etanol, acar e cana-de-acar no Brasil. Disponvel em www.unica.com.br. Acesso em fevereiro de 2010. VARGA, E.; SZENGYEL Z.; RCZEY, K. (2002). Chemical pretreatments of corn strover for enhancing enzymatic digestibility. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 98-100, p. 73-87. VSQUEZ, M.P.; DA SILVA, J. N. C.; DE SOUZA Jr., M.B.; PEREIRA Jr., N. (2007). Enzymatic hydrolysis optimization to ethanol production by Simultaneous Saccharification and Fermentation. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 137140, issues 12. VERENIUM The nature of energy. (2008). Energy independence and security act of 2007 (EISA). Disponvel em www.verenium.com. Acesso em dezembro de 2008.
109
VLASENKO, E.Y.; DING, H., LABAVITCH, J.M.; SHOEMAKER, S.P. (1997). Enzymatic hydrolysis of pretreated rice straw. Bioresourse Technology, v. 59, p. 109119. WINGREN, A.; GALBE, M.; ROSLANDER, C.; RUDOLF, A.; ZACCHI, G. (2005). Effect of reduction in yeast and enzyme concentrations in a SSF based bioethanol process. Applied Biochemistry and Biotechnology, v. 121-124, p. 485-499. WU, A. & LEE, Y.Y. (1997). Inhibition of the enzymatic hydrolysis of cellulose by ethanol. Biotechnology Letters, v. 19, p. 977-979. XU, J.; THOMSEN, M.H.; THOMSEN, A.B. (2009). Feasibility of hydrothermal pretreatment on maize silage for bioethanol production. Applied Biochemistry and Biotechnology, in press. ZHANG, J. & SMITH, K.R. (2007). Household air pollution from coal and biomass fuels in China: Measurements, health impacts, and interventions. Environ Health Perspect, v. 115, n. 6, p. 848855. ZHANG, M.; SHUKLA, P.; AYYACHAMY, M; PERMAUL, K; SINGH, S. (2009). Improved bioethanol production through Simultaneous Saccharification and Fermentation of lignocellulosic agricultural wastes by Kluyveromyces marxianus 6556. Applied Microbiology and Biotechnology, in press. ZHANG, Y.H.P. & LYND, L.R. (2004). Toward an aggregated understanding of enzymatic hydrolysis of cellulose: Noncomplexed cellulase systems. Biotechnology and Bioengineering, v. 88, n. 7, p. 797-824. ZHU, J.Y; ZHU, W.; BRYAN, O.P.; DIEN, B.S; TIAN, S.; GLEISNER, R.; PAN, X.J. (2010). Ethanol production from SPORL-pretreated lodgepole pine: preliminary evaluation of mass balance and process energy efficiency. Applied Microbiology and Biotechnology, in press.

Bioetanol 2a Geracao de Biomassa Residual

Enviado por

Dados do documento

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Bioetanol 2a Geracao de Biomassa Residual

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

PRODUO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAO A PARTIR DE BIOMASSA RESIDUAL DA INDSTRIA DE CELULOSE

Neumara Luci Conceio Silva

Dissertao apresentada ao Curso de PsGraduao em Tecnologia de Processos

Qumicos e Bioqumicos para a Obteno do Grau de Mestre em Cincias (M.Sc.)

Orientador: Nei Pereira Jr., Ph.D.

Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro 2010

PRODUO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAO A PARTIR DE BIOMASSA RESIDUAL DA INDSTRIA DE CELULOSE

Neumara Luci Conceio Silva

Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro 2010

PRODUO DE BIOETANOL DE SEGUNDA GERAO A PARTIR DE BIOMASSA RESIDUAL DA INDSTRIA DE CELULOSE

SECOND GENERATION BIOETHANOL PRODUCTION FROM RESIDUAL BIOMASS OF CELLULOSE INDUSTRY

CAPTULO 1. Apresentao do tema

1. APRESENTAO DO TEMA DE DISSERTAO DE MESTRADO

CAPTULO 1. Apresentao do tema

CAPTULO 1. Apresentao do tema

CAPTULO 1. Apresentao do tema

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

Ligao de hidrognio intramolecular

Ligao de hidrognio intermolecular

Celobiose Figura 2.2. Estrutura qumica da celulose (MORAIS, 2005)

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

Figura 2.3. Componentes da frao hemicelulose (MORAIS, 2005)

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

lcool trans-para-cumarlico Figura 2.4. Precursores primrios da lignina (DALMEIDA, 1988)

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

BORRACHA SINTTICA POLIHIDROXIALCANOATOS VITAMINA C POLMEROS

BUTADIENO STERES CIDO ACTICO

DM CELULOSE REGENERADA TER STERES GLICOSE CELULOSE ENZIMAS HMF SORBITOL

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

2.2. A INDSTRIA DE CELULOSE

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

Fonte: BRACELPA (2010)

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

Fonte: EMBRAPA (2007)

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

Elaborada com base em BRACELPA (2010)

Figura 2.8. Destinos das exportaes brasileiras de celulose (BRACELPA, 2010)

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

2.3. O BIOETANOL NO CONTEXTO DE 2 GERAO DE BIOCOMBUSTVEIS

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

Produo (bilhes de litros)

30 25 20 15 10 5 0 1998 2000 2002 2004 2006 2008

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica

Biocombustveis avanados Biocombustvel celulsico Biodiesel Etanol de milho

Figura 2.17. Perspectivas da produo de biocombustveis Fonte: VERENIUM, 2008

CAPTULO 2. Reviso Bibliogrfica