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Reduzido endosperma
periférico e chalazal
Transgênicos e Mutantes
hipometilados
Fenocópia 4x x 2x
Fenocópia 2x x 4x Fenocópia 2x x 6x
Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente
paternal
Mecanismo do imprinting (ratos)
Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot.
DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no “desliga expressão” H19 e IGF2
Estimuladores
Endoderme Mesoderma
Específico para
mesoderme
?
Mecanismo epigenético 2: Paramutação
Mecanismo da paramutação;
Mecanismo 1 Mecanismo 2
Promotor 1
Promotor 2
RNA
aberrante
Planta transgênica
10 mutante 20 mutante
utilizado na
isolado isolado
seleção genética
Variegação:
Silenciamento da segunda cópia
Alopoliplóide
Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias
Paradoxo? reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são
normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais
1a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica
Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos
no controle do florescimento (repressores epigeneticos)
Repressores epigenéticos
Mutantes tfl2, emf: 1) florescem precocemente, 2) florescem sob DC, flor terminal,
3) proteínas de reserva da semente são expressas antes
PGTS
(Silenciamento pós-transc.
RNA curto de interferência (siRNA)
Dupla fita
Perfeitamente complementar ao RNA alvo
Direciona a clivagem endonucleolítica
RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado
Não conservado entre as espécies
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Cromossomal ou citoplásmico
Comprimento médio de 25 nucleotídeos
Micro RNA (miRNA)
Fita simples
Parcialmente complementar ao RNA alvo
Mecanismo de ação desconhecido
RNA dupla fita pareado, mas com alças
Frequentemente conservado entre as espécies e filos
Originado de um RNA percursor de maior tamanho RNA curto temporal (stRNA)
Cromossomal (IGR)
Fita simples
Tamanho médio de 70 nucleotídeos Parcialmente complementar ao RNA alvo
Inibe a tradução do mRNA
RNA dupla fita pareado, mas com alças
Altamente conservado entre as espécies e filos
Altamente conservado entre as espécies e filos
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Cromossomal (IGR)
Tamanho médio de 70 nucleotídeos
Mecanismos pelos quais
os microRNAs promovem
o silenciamento
RNAse tipo III
Complexo de
endonucleases
Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P)
Metilação da histona
Desen. floral
Desen. floral
Dicer
Separação de orgãos
Dif. Merist. Axilar e da folha
Desen. floral
Desen. floral
Identidade floral
Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP TRV: tobacco rattle virus
TRV-00: vírus sem inserto
TRV-P: contendo 359 nt 3’ da GFP
TRV-35S: 347 nt do promotor da GFP
Luz UV
PGS
PTGS
Luz UV
Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico
Gene orientação
Senso substitui ccdB
Gene orientação
anti-senso substitui ccdB
Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2
Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway
Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante
RNAi