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Controle epigenético da expressão gênica em plantas

Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA

Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação

Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose

Mudancas epigenenéticas típicas das plantas: normalmente transmitidas na meiose


Mecanismos da variação epigenética: Metilação do DNA

Mudanças no posicionamento do nucleossoma


Mudanças no empacotamento dos nucleossomas

Modificações covalentes do nucleossoma


Metilação: mecanismo mais connhecido

DNA-metil transferase; preferência pelo motivo CpG ou Cp

Metilação: mecanismos para garantir a heranca mitótica ou meiótica de


padrões específicos de metilação.
1) : ATPase tipo SNF2 (Lsh) aflouxa os contatos entre o DNA e as histonas

2) Metiltransf. da histona (Suv39H1) metila Lys hist. (estrela):


Configuração da cromatina permissível à metilação

3) “Targeting factor” reconhece a sequência a ser metilada,


e traz consigo os fatores para a metilação:
DNMT1: citosina-5-metil transferase
HDAC: desacetilase da histona
MeCP2: proteína de ligação ao DNA metilado

4) Sin3a +HDAC: desacetilação das histonas


resultando em sua condensação
Metilação e repressão transcricional
Mecanismo epigenético 1: Imprinting

Imprinting: a expressão de certos alelos difere dependendo da origem do gameta


Exs: mamiferos, fungos e plantas

Ex: pigmentação da semente de milho: alelos r (red):

Bom nível de expressão quando


transmitido pelo óvulo ::cor sólida da
semente

Baixo nível de expressão quando


transmitido pelo pólem ::cor variegada:

Diferenças fenotípicas: não depende da dosagem do gene R


mas sim de mudanças epigenéticas que são macho-específicas
Imprinting: sementes; mudanças epigenéticas relacionadas a dosagem gênica e
ligadas ao sexo

Grande desenvolvimento do endosperma


periférico e chalazal, mas sem celularização

Maternalização = redução da metilação


2x x 2x

Reduzido endosperma
periférico e chalazal

Transgênicos e Mutantes
hipometilados

Fenocópia 4x x 2x

Fenocópia 2x x 4x Fenocópia 2x x 6x
Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente

paternal
Mecanismo do imprinting (ratos)
Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot.

DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no “desliga expressão” H19 e IGF2

Estimuladores

Endoderme Mesoderma

Bloqueia o estimulador de Igf2

Específico para
mesoderme

?
Mecanismo epigenético 2: Paramutação

Interação alélica: a expressão de um alelo em um heterozigoto é alterada na


presenca de outro; herdável através da meiose

Alelo B(booster): B-I: pigmentacao forte; B’: pigmentacao fraca

B-I: mesmo gene: heterozigoto


transmite somente o alelo B’
B’: transcrição 10-20 vezes
menor

Alelo Pl; forte pigmentação das anteras;


Pl’: cor variegada

PI e P’: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo P’


DNA metilado: proteínas ligam-se ao DNA metilado
enzimas modificadoras das histonas formação da heterocromatina
fatores remodeladores da cromatina

Mecanismo da paramutação;

Mecanismo 1 Mecanismo 2
Promotor 1

Promotor 2

RNA
aberrante

Interação dos cromossomas


Transferência direta de elementos Sinal difusivel: RNA
da cromatina
Citosinas metiladas podem ser mantidas na replicação

Mutantes com alterações no mecanismo epigenético da regulação gênica

Milho: mop1: mediator of paramutation 1: bloqueia a paramutação do gene B e


de outros pigmentos

Arabidopsis: o caso dos genes PAI:


sintese triptofano:
2 genes, em 2 cromos.

ambos genes PAI tornam-se então metilados

Introdução de novos genes PAI não metilados tornam-se metilados

PAI: Phosphoribosilanathranilate isomerase


Estratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAI
Reação catalizada pela enzima PAI
[intermediário fluorescente] ………. X Triptofano

Planta transgênica
10 mutante 20 mutante
utilizado na
isolado isolado
seleção genética

Única sequência PAI que


pode ser expressa no
cromossoma 1 foi mutada

Met1 e CMT3: codificam para


duas diferentes
metil-transferases deDNA

Nivel de metilação = reostato


metilacoes
controle do nível de
expressão gênica redução na metilação
fluorescência
Mecanismo epigenético 3: Silenciamento
Detecção: plantas trangênicas; Arabidopsis, Petunia e tabaco
Repetição da presença de genes :::: silenciamento de outras sequências

Estrutura ou organização do cromossoma como causa do silenciamento


Petunia mutata : sem cor (sem o gene A1):

Introdução gene A1 do milho: cópia simples:


Flor torna-se pigmentada

Adição da segunda cópia de A1: transcrição


silenciada: herdável geneticamente

Variegação:
Silenciamento da segunda cópia

Gene silenciado A1 pode induzir silenciamento epigenético de outro gene A1 novo,


somente quando esse gene A1 expresso é inserido próximo do primeiro.
Mecanismos: TGA (transcriptional gene silencing) pela metilação

ddm1: afeta o reconhecimento da metilação


met1: afeta a metilação

mom1: TGS independente da metilação

PTGA (post-transcriptional gene silencing) pela metilação: não afeta a transcrição


Mecanismo epigenético 3: Silenciamento: Co-supressão
Transgene pode induzir o silenciamento de um gene endógeno e homólogo
Silenciamento não-herdável
Experiência da sobre-expressão da chalcone sintase
Co-supressão não herdável geneticamente: atividade
endógena é restabelecida quando ocorre a segregação do transgene

Silenciamento de viróides: enxerto


de planta contaminada por um vírus
em outra planta contaminada com
outro vírus:.

Silenciamento de outro vírus:


Transmissão do sinal por toda a
planta:

Efeito a nível pós-transcripcional


Eventos epigenéticos na poliploidização
(70% angiosperma; 95% pteridófitas)

Diferencas no número de cormossomas


ou organização

podem romper o pareamento e distribuição Híbrido


Duplicação
F1
gênica
: duplicação dos cromossomas

Inicio da formação de um poliplóide: “choque”:


Duplicação
gênica
- silenciamento genes duplicados;
- reduzir “infidelidade” cromossomal Autopoliploide

Alopoliplóide

Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias

Vantagens dos alopoliplóides: manter a natureza híbrida indefinidamente

Mudanças durante o estabelecimento da um autopoliplóide: eliminação de sequências de DNA, expansão heterocromatina,


translocacao recíproca de segmentos de cromossomas: ajudam diferenciar os cromossomas homólogos dos homeologos
Silenciamento nos alopoliplóides: metilação: uso do aza-dC
Modelo explicativo do silenciamento em poliplóides
Causas potencias da origem da variabilidade em poliplóides
Seleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticas

ddm1: mutação no gene (SNW/SNF2) : fator de remodelação da cromatina;

Mamíferos mudanças na estrutura da cromatina devem anteceder a metilação


Sem fenótipo visível; autofecundação: progenia anormal::desestabilização da
programação epigenética

Paradoxo? reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são
normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais

Plantas antisenso para MET1;


redução em 30% no nível de metilação
Hipermetilação
do gene SUPERMAN
e do gene AG
Hipermetilação
do gene SUPERMAN

Problema para a obtenção de plantas transgênicas: - súbito silenciamento do transgenes

1a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica
Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos
no controle do florescimento (repressores epigeneticos)

Genes do florescimento precoce: genes de proteinas associadas a cromatina

Repressores epigenéticos
Mutantes tfl2, emf: 1) florescem precocemente, 2) florescem sob DC, flor terminal,
3) proteínas de reserva da semente são expressas antes

35S:TFL1 35S:EMF1 + DL 35S:EMF1 + DC

4 sépalas duas folhas caulinares flores e brotos


nova influorescência flor terminal (2 silíquas) originados na mesma
novo broto terminal regiao

Importância da remodelagem da cromatina no controle da expressão gênica


e dos processos de desenvolvimento

Pouco compeendido como esses fatores de remodelagem da cromatina funcionam em plantas


PGTS (post-transcriptional gene silencing):primeiramente descoberto em
plantas

Primeiro gene regulatório para PGTS foi descoberto em Neurospora

Mediado por moléculas de RNA pequenas (<70 nucleotídeos)

PGTS: um poderoso meio para manipular a expressao em sistemas animais::RNAi

PGTS: mais conhecido em Drosophila e levedura (Saccharomyces)

Plantas usam as mudancas epigenéticas para se adaptar a mudancas genômicas ou


ambientais::flexibilidade
Flexibilidade: reprogramação dos estágios de desenvolvimento

Funções: 1) proteção contra efeitos deletérios da transposição de transposons


2) Resistência contra viroses (Produzem dsRNA)
DICER

Pode ser transmitido entre


células e a longas distâncias

PGTS
(Silenciamento pós-transc.
RNA curto de interferência (siRNA)
Dupla fita
Perfeitamente complementar ao RNA alvo
Direciona a clivagem endonucleolítica
RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado
Não conservado entre as espécies
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Cromossomal ou citoplásmico
Comprimento médio de 25 nucleotídeos
Micro RNA (miRNA)
Fita simples
Parcialmente complementar ao RNA alvo
Mecanismo de ação desconhecido
RNA dupla fita pareado, mas com alças
Frequentemente conservado entre as espécies e filos
Originado de um RNA percursor de maior tamanho RNA curto temporal (stRNA)
Cromossomal (IGR)
Fita simples
Tamanho médio de 70 nucleotídeos Parcialmente complementar ao RNA alvo
Inibe a tradução do mRNA
RNA dupla fita pareado, mas com alças
Altamente conservado entre as espécies e filos
Altamente conservado entre as espécies e filos
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Cromossomal (IGR)
Tamanho médio de 70 nucleotídeos
Mecanismos pelos quais
os microRNAs promovem
o silenciamento
RNAse tipo III

Complexo de
endonucleases
Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P)

Metilação da histona

Recrutamento: criação de um sítio de


nucleação da heterocromatina

Difusão do processo de diferenciação da heterocromatina:


Silenciamento do locus mat2P
61 alvos potenciais: 41 são fatores transcricionais

Desen. floral

Desen. floral

Dicer

Separação de orgãos
Dif. Merist. Axilar e da folha

Det. Da especificade de RISC: mutantes: arquit. mod

Desen. floral

Desen. floral

Identidade floral
Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP TRV: tobacco rattle virus
TRV-00: vírus sem inserto
TRV-P: contendo 359 nt 3’ da GFP
TRV-35S: 347 nt do promotor da GFP
Luz UV

Nuclear Run of: taxa de transcrição

PGS
PTGS

Luz UV
Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico

HC-Pro: proteína viral que


suprime o silenciamento

SilGUS: locus de silenciamento


de GUS

Silenciamento Supressão do silenciamento sistêmico


sistêmico
RNAi: poderosa ferramenta

atFAD2: Desaturase de A. thaliana


AttP1/AttP2: clonagem por
Recombinação utilizando o sistema
Gateway

Gene orientação
Senso substitui ccdB
Gene orientação
anti-senso substitui ccdB
Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2
Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway
Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante
RNAi