Casos Clínicos

• Dr. Rodrigo Elisandro Mendes

• Pós-doutorando da Disciplina de Infectologia
• Universidade Federal de São Paulo - EPM

• Dra. Eliete A. M. Frigatto

• Laboratório Central - Hospital São Paulo
• UNIFESP - EPM
Caso 1
Paciente de 49 anos internou com quadro Paciente tratado com cefepima
febril em 25/03/05 apresentando infecção sem melhora. No quinto dia
em lobo inferior esquerdo. Sendo isolado
após o início do tratamento foi
em hemocultura um BGN e posteriormente
identificado como Enterobacter aerogenes. colhido nova hemocultura com
crescimento de Enterobacter
aerogenes.
•Antibiograma:
•Antibiograma:
•Cefalotina: 256 µg/ml
•Cefalotina: 256 µg/ml
•Cefoxitina: 256 µg/ml
•Cefoxitina: 256 µg/ml
•Cefotaxima: 32 µg/ml
•Cefotaxima: 64 µg/ml
•Ceftazidima: 256 µg/ml
•Ceftazidima: 256 µg/ml
•Cefepima: 2 µg/ml
•Cefepima: 4 µg/ml
•Imipenem: 0,5 µg/ml
•Imipenem: 0,5 µg/ml
•Piperacilina/Tazobactam: 4 µg/ml
•Piperacilina/Tazobactam: 2 µg/ml
•Amicacina: 256 µg/ml
•Amicacina: 256 µg/ml
•Gatifloxacina: 1 µg/ml
•Gatifloxacina: 0,5 µg/ml
Caso 1
Teste de disco-aproximação
Caso 1
Teste de discos combinados
Caso 1
Etest
 Caracterização dos mecanismos de resistência à
cefepima e ertapenem em Enterobacter spp. isolados de
infecções de corrente sanguínea de pacientes internados
no Hospital São Paulo
 84 AMOSTRAS DE
Enterobacter cloacae

7 AMOSTRAS DE
Enterobacter aerogenes
93 AMOSTRAS DE 14 Amostras (15%) apresentaram
Enterobacter spp. sensibilidade reduzida ou resistência à cefepima
UMA AMOSTRA DE
Enterobacter hormaechei

UMA AMOSTRA DE
Enterobacter amnigenus
Tabela 1. Perfil de sensibilidade e tipagem molecular das amostras de Enterobacter spp.
não-sensíveis à cefepima avaliadas.
MICs µg/mL
Strain # Specie Ribotype
Cefotaxime Ceftazidime Cefepime Imipenem Meropenem Ertapenem Pip/ Taz * Gatifloxacin
1 10.831 E. cloacae 256 64 256 0.5 0.25 4 256 8 222 -150 -S-2
2 10.480 E. cloacae 256 256 256 0.5 0.25 4 256 32 222 -150 -S-1
3 13.501 E. cloacae 256 256 256 0.5 0.5 4 256 32 222 -150 -S-1
4 13.550 E. cloacae 32 256 256 1 0.25 4 256 32 222 -150 -S-1
5 14.008 E. cloacae 32 256 256 2 0.25 0.25 256 32 222 -150 -S-1
6 11.334 E. cloacae 256 256 256 1 0.25 2 256 32 222 -150 -S-8
7 12.035 E. cloacae 256 256 256 2 0.25 0.25 256 32 222 -150 -S-8
8 10.833 E. cloacae 256 64 256 0.5 0.25 8 64 8 222 -150 -S-2
9 11.235 E. cloacae 256 64 256 0.5 0.25 1 256 32 222 -150 -S-1
10 10.739 E. aerogenes 256 32 32 1 0.25 0.25 64 0.25 222 -153 -S-7
11 13.125 E. cloacae 256 256 32 0.5 0.25 0.25 256 0.06 222 -153 -S-2
12 10.922 E. cloacae 256 256 32 0.5 0.25 0.25 4 1 222 -150 -S-4
13 11.247 E. cloacae 256 256 16 2 0.25  256 32 222 -150 -S-7
14 20.096 E. cloacae 256 256 16 1 0.25 4 256 32 222 -150 -S-1

*- Pip/Taz – Piperacillin/Tazobactam
Tabela 2. ß-lactamases encontradas nas amostras de Enterobacter spp. não-sensíveis à
cefepima avaliadas.
CIMs ESBL AmpC
Amostra ® Resultado
FEP Etest Teste de Hidrólise SYN 2190
10.831  256 Negativo Positivo Negativo ESBL
10.480  256 Negativo Positivo Negativo ESBL
13.501  256 Negativo Positivo Negativo ESBL
13.550  256 Negativo Positivo Negativo ESBL
14.008  256 Negativo Positivo Negativo ESBL
11.334 256 Negativo Positivo Negativo ESBL
12.035 256 Negativo Positivo Negativo ESBL
10.833 256 Negativo Positivo Negativo ESBL
11.235 256 Positivo Negativo Negativo ESBL
10.739 32 Positivo Positivo Negativo ESBL
13.125 32 Positivo Negativo Negativo ESBL
10.922 32 Positivo Negativo Negativo ESBL
11.247 16 Negativo Negativo Positivo AmpC
20.096 16 Negativo Negativo Positivo AmpC
 256 32-256 16

ESBL ESBL AmpC

36 KDa
35 KDa

Figura 1. Perfil de proteínas de membrana externa das amostras de Enterobacter spp.

não-sensíveis à cefepima avaliadas.
Caso 2
• Paciente 6 anos, do sexo feminino, com
diagnóstico de leucemia linfoblástica aguda
em 1996.
– 06/01/99 - Sépsis - Hemocultura: Klebsiella oxytoca
(cefepime e tobramicina por 3 semanas);

– 22/2/99 - Após QT a paciente volta a ficar séptica e

novamente é isolado em hemocultura K. oxytoca
(resistente a cefepime).
Caso 2
Pergunta!!!
• A paciente adquiriu uma
nova infecção
por K. oxytoca?

• A paciente está tendo

uma recaída?
Caso 2  1 2

PFGE: SpeI 37C -

NEB2*, 5”- 60”, 6
V/cm, 23 horas.
Caso 2
Perfil de proteína de membrana
externa (OMP)

Gel de poliacrilamida 10%

Caso 5
Enterobacter spp. com diminuição de
sensibilidade a ertapenem
• Durante fevereiro de 2005 foram isolados 14
Enterobacter spp. de pacientes em serviço de diálise no
Hospital do Rim – UNIFESP – EPM;
• As amostras bacterianas apresentaram MICs para
ertapenem entre 4 e 16 µg/ml e MICs < 0,12 µg/ml
para imipenem e meropenem;
• Oito amostras isoladas durante o período foram melhor
caracterizadas;
Caso 5
Enterobacter spp. com diminuição de
sensibilidade a ertapenem

• Entre as 8 amostras avaliadas, 7 apresentaram o

mesmo ribogrupo (222-150-S-1);
• Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de
AmpC (SYN 2190) não demonstraram diferenças
de MICs para nenhum dos carbapenems testados;
• Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de
bomba de efluxo (reserpina) não demonstraram
diferenças de MICs para nenhum dos
carbapenems testados;
Caso 5
Enterobacter spp. com diminuição de
sensibilidade a ertapenem
• Teste para avaliação de ponto isoelétrico (pI)
identificou uma forte banda com pI 8.0;
1 2 3 4 C-
Caso 5

Enterobacter spp. com diminuição de

sensibilidade a ertapenem
• Avaliação do perfil de proteínas de membrana externa
(OMP) demonstrou a diminuição da expressão de duas
OMPs de aproximadamente 49 e 54 kDa;

 C C 1 2 3 4

54 kDa
49 kDa
 5
4
3
2
Fl u or e s c en c e Fl u or e s ce n ce Fl u o r e s c enc e Fl u or e s c ence 1
Fl u or e scenc e

-25
25
50
75
100

0
25
50
75

-25
0
100
125
150

100
125

25
50
75

-25
25
50
75
25
50
75

0
0

100
125
100
125
150

-25
-25

15
15

15
15
15
15. 9 5 15. 8
17. 4
18. 1 5
18. 7 5* 18. 7 5* 18. 7 5* 18. 7 5* 18. 7 5*

20
20

20
20
20

19. 6 19. 5 5 19. 4 5 19. 5 19. 4

20. 2 20. 1 5 20. 2 5 20. 5 5
20. 9
22
23. 2 22. 9 5
23. 7 23.23. 37 5

25
25

25
25
25

26 25. 7 5 25. 8

28. 2 28. 1 5 28. 0 5

30
30

30
30
30

Time (seconds)
Time (seconds)

Time (seconds)
Time (seconds)
Time (seconds)

35

35

35
35
35

40
40

40
40
40

42* 41.42* 6 5 42* 42* 41.42* 5

45
45

45
45
45

L
1
2
3
4
5
 Comparação das atividades antimicrobianas de ertapenem e
imipenem contra enterobactérias: O laboratório de microbiologia
deve rotineiramente testar imipenem e ertapenem?

• 2307 amostras de Enterobacteriaceae foram avaliadas.

• Os resultados de CIMs entre ertapenem e imipenem foram
concordantes em 98,4% (2270/2307) das amostras.
• Apenas 1,6% (37/2307) das amostras avaliadas apresentaram
resultados de categorias de sensibilidade entre ertapenem e
imipenem discordantes 0,9% (21/2307) erros leves e 0,7%
(16/2307) erros muito graves).
• Estas discordâncias foram observadas em K. pneumoniae
produtora de ESBL (05 erros leves e 13 erros muito graves),
Serratia spp. (01 erro leve) e em amostras de Enterobacter spp.
hiperprodutoras de AmpC (15 erros leves e 03 erro muito grave).
 Comparação das atividades antimicrobianas de ertapenem e
imipenem contra enterobactérias: O laboratório de microbiologia
deve rotineiramente testar imipenem e ertapenem?

SENTRY Antimicrobial Surveillance

Program. Janeiro de 2003 a
dezembro de 2004.
Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão
de proteínas de membrana externa (OMPs)

• Paciente do sexo masculino, de 55 anos, submetido a transplante

hepático no ano de 2005;
• Durante pós-operatório evoluiu com quadro sugestivo de Síndrome do
Desconforto Respiratório Agudo;
• Pneumonia(?) – Terapia antimicrobiana com cefepime e clindamicina;
• Devido à ausência de melhora clínica e radiológica do infiltrado pulmonar
– novo esquema – meropenem, teicoplanina e fluconazol;
• LBA (27/04/2005) – crescimento de K. pneumoniae (Amostra 1);
• Piora clínica – novo LBA (23/05/2005), crescimento de K. pneumoniae
resistente à imipenem (Amostra 2);
• Esquema alterado para polimixina B, vancomicina e anfotericina B;
• O paciente evoluiu com piora progressiva e óbito em 29/05/2005.
Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão
de proteínas de membrana externa (OMPs)

• Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de AmpC

(SYN 2190) não demonstraram diferenças de MICs para
nenhum dos carbapenems testados;
• Testes de diluição em ágar com e sem inibidor de bomba de
efluxo (reserpina) não demonstraram diferenças de MICs
para nenhum dos carbapenems testados;
• Testes de hidrólise enzimática realizados - Negativos;
• Detecção fenotípica da produção de ESBL - Negativos;
Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão de
proteínas de membrana externa (OMPs)
 Seleção in vivo de mutante com ausência de expressão de
proteínas de membrana externa (OMPs)

75
A
50

25
 A B
0
Flu or e scence

-25

-50
19. 3 5
19.9 5

24.4 5

26.7 5
18. 6 *

41. 3 *
20. 8

23. 9
21. 5

28. 2

15 20 25 30 35 40 45
Time (seconds)

150
B

100

50
Fl u or e scence

-50
19. 4 5
20. 2 5

22. 4 5
23.24. 60 5

26. 7 5
18. 6 *

41. 3 *
24. 5

28.28. 26
20. 9
21. 8

15 20 25 30 35 40 45
Time (seconds)
 KPNcs – 33.003
33.399
acrA
KPN1963 – 28.458
28.604

KPNcs – 6.314
6.104

KPN1963 – 4.564
4.530

Avaliação da expressão de bomba de efluxo (acrA)

 Target Relative expression/ Overexpression
Strain Cta
gene target vs. reference geneb ratioc
acrA KPN1963 29.29 6.62e-08 13.1

KPNcs 34.13 5.06e-09

rrsEb KPN1963 5.76

KPNcs 7.09

a - Ct (critical threshold cycle) numbers represent an average from triplicate tests.

b - Relative expression = 2-T, where T = Cttarget - Ctreference.
c - Ratio between relative expression level of the target gene in the evaluated KPN
1963 strain versus the susceptible K. pneumoniae control strain.
Caso 6
Paciente de 9 anos com leucemia
mielóide aguda, imunoodeprimido,
internou apresentando picos febris
em 02/01/05. Sendo isolado em
hemocultura um BGN e
posteriormente identificado como
Stenotrofomonas malthophilia.

•Antibiograma:
•Cefalotina: 256 µg/ml
•Cefoxitina: 256 µg/ml
•Cefotaxima: 128 µg/ml
•Ceftazidima: 256 µg/ml
•Cefepima: 64 µg/ml
•Imipenem: 0,5 µg/ml
•TMP/SMT: 0,25 µg/ml
•Levofloxacina: 1 µg/ml
•Tetraciclina: 2 µg/ml
 Considerações

• Antimicrobianos preconizados:
– TMP/SMT
– Levofloxacina
– Minociclina

• Resistência intrínseca aos ß-lactâmicos

– Produção de MßL L1 e L2
 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
ANTIMICROBIANA EM GRAM-NEGATIVOS

Characterization of Novel Insertion Sequences in blaIMP-1

Integrons Among Gram-Negative Clinical Isolates in São
Paulo, Brazil.

RE MENDES, M CASTANHEIRA, MA TOLEMAN, HS SADER,

RN JONES, TR WALSH

Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil

University of Bristol, Bristol, United Kingdom
The JONES Group/JMI Laboratories, North liberty, IA
44th ICAAC, C1-298,
2004.
44th ICAAC, C1-298,
2004.
 MECANISMOS DE RESISTÊNCIA
ANTIMICROBIANA EM GRAM-NEGATIVOS

Hibridização de plasmídios contendo blaIMP-1

Acinetobacter spp. HSP
Acinetobacter spp. HSP

501 695 694

5248 9043 9033 13304 11775 4978 3486 pGEM 501 694 695 696 5248 9043 9033 13304 11775 4978 3486 pGEM blaIMP-1
696
 Obrigado
Rodrigo Elisandro Mendes
Laboratório Especial de Microbiologia Clínica –
LEMC
Laboratório ALERTA
Disciplina de Infectologia
UNIFESP – EPM

Supervisor do Setor de Diagnóstico Molecular

AFIP/Medicina Laboratorial
rodrigo.mendes@lemc.com.br
www.lemc.com.br