Determinação de Naringina em suco

de toranja por voltametria de pulso

diferencial com dissolução catódica
utilizando eletrodo de mercúrio de
gota pendente
Camila
Caroline
Filipe

1
2
 INTRODUÇÃO
• Flavonóides são um grande grupo de ocorrência natural,
fenólicos com base na estrutura química da
2-fenilbenzopirona (flavona)

Flavona
Naringina

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 INTRODUÇÃO
• Diferem entre si, quer no padrão de metilação e hidroxilação, no grau de
insaturação ou o tipo de açúcar ligado à aglicona

• Demonstram ser fatores importantes para a cor, sabor aroma e

estabilidade de muitos produtos alimentícios à base de plantas ou de
bebidas. Especialmente em frutas cítricas

• Atividades terapêuticas, por exemplo, drogas antiinflamatórias,

antibacteriana, antimutagênica, antiviral e efeitos antimetastase de um
grande número de flavonoides são conhecidos, que é a razão pela qual
estes compostos também têm recebido maior atenção na indústria
farmacêutica nos últimos anos

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 INTRODUÇÃO
• A complexidade da amostra e o grande número de semelhanças
estruturais existente naturalmente nos flavonoides torna a análise
bastante complicada.

• Standard métodos de determinação flavonoide são :

– UV
– Espectrofotometria de absorção cromatográfica
– Cromatografia líquida (LC)
– Eletroforese capilar (CE) com eletroquímica UV
– Detecção eletroquímica
• Eles tem como base a oxidação dos grupos hidroxila fenólicos nos
flavonoides .

5
 INTRODUÇÃO
• Podem ser reduzidos através do grupo carbonila no anel g-pirona, mas a
maioria das investigações eletroquímicas são baseados na oxidação das
hidroxilas fenólicas.

• Reduções de flavonoides raramente são documentados . Razão pela qual

o foco foi concentrados principalmente no desenvolvimento de ensaios
eletroquímicos redutivos para determinação de flavonoides.

Naringina 6
 Aparelhagem
• EG e G (Princeton Pesquisa Aplicada PAR) 264A analisador polarográfico /
determinação por dissolução

• Analisador voltamétrico BAS CV-50W.

• Voltamogramas foram registrados tanto em um G e EG RE0089 gravador

de X-Y ou em um IBM compatíveis computador.

• A configuração convencional de três eletrodos foi utilizado consistindo em

um PAR303A ( eletrodo de mercúrio de gota pendente como eletrodo de
trabalho) eletrodo de Ag / AgCl de referência (KCl saturado) e um eletrodo
de fio de platina auxiliar.

• Agitação magnética (EG e G 305) foi empregado durante a período de

pré-concentração

7
Aparelhagem

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 Reagentes
• Naringina e outros flavonóides (hesperidina, quercetina, rutina e
luteolina) foram comprados da Roth e usados ​sem purificação adicional.

• Soluções estoque de 10 mg de naringina em 10 ml de água purificada

(1.72x10-3 mol l-1) foram estocadas no escuro à 48°C.

• Os eletrólitos de suporte consistiram em misturas (razão volume 1:1) de

acetonitrilo com soluções tampão de fosfato ou citrato em diferentes pH
e força iônica de 0,10 mol L-1.

• Soluções tampões foram realizadas através da dissolução da quantidade

adequada de sais fosfato ou citrato , ácido cítrico, citrato de sódio tri-
hidratado (Fluka ou Merck, de alta pureza) em água purificada.

• Acetonitrila (Fluka, de pureza elevada) foi armazenada sob argônio e

recém-destilada a partir de hidreto de cálcio antes da utilização.

9
 Procedimentos
• Um volume de 5 ml de tampão e 5 ml de acetonitrilo foi transferido para a
célula polarográfica 10 ml e desgaseificado com nitrogênio por, pelo
menos, 8 min.

• Foi feito um voltamograma da prova em branco do eletrólito de suporte e

registrado sob as mesmas condições da amostra (velocidade de varredura
5 mV s-1, tdrop = 1s, amplitude do pulso 50 mV).

• Para experimento de redissolução catódica uma pré-concentração

potencial (um -0.10 V ou - 0.20 V) foi aplicada por um determinado
período de tempo, seguido por um descanso de 15 s e uma varredura do
pulso diferencial polarográfico na direção do potencial negativo.

• Determinação da concentração de naringina foi realizada pela método de

adição de padrão interno.

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 Preparação da Amostra
• O suco de toranja foi vigorosamente agitado e uma alíquota de 10 ml foi
transferido para um béquer de 25 ml.

• Depois que o pH foi ajustado para 12 com 1 mol l-1 de NaOH, a um

volume de 2 ml da solução agitada foi adicionado 2 ml de acetonitrila e a
mistura foi centrifugada por 5 min a 5000 rpm em uma centrifuga de alta
velocidade .

• 10 ± 30 ml do centrifugado foi adicionado ao eletrólito de suporte (5 ml

de fosfato tampão (pH 12) e 5 ml de acetonitrila) que tinham sido
desgaseificados por 8 min.

• Potencial de acúmulo de - 0.10 V foi aplicada por 60 segundos e após um

descanso de 15 s o procedimento foi mantido como descrito acima.

11
 Experimentos de recuperação
• Para os experimentos de recuperação, quantidades conhecidas da de
naringina foram adicionados à água.

• Alíquotas de amostras de água pré-tratadas foram analisadas pelo

experimento de voltametria por decapagem catódica de acordo com o
procedimento descrito.

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 Resultados e discussões
• Estudos de VC em eletrodos de platina revelaram que a redução direta do grupo
carbonila do anel g-pirona ocorre em um do potencial bastante negativo - 1.6 V
(vs. Ag / AgCl).

• No entanto, durante a redução com DME em diferentes valores de pH, não houve
resposta voltamétrica por polarografia de pulso diferencial, mesmo com valores
de pH mais elevados (onde varreduras de potenciais mais negativo são possíveis).

• Experimentos de redução com outros flavonoides de potenciais mais facilmente

redutíveis mostrou que prótons devem ser envolvidos no processo de redução,
porque o pico correspondente à redução do grupo carbonila, em geral, torna-se
menor com aumento do pH e desaparecendo completamente em soluções
fortemente alcalinas.

• Assim, a redução direta do grupo carbonila não pode ser usado para a
determinação eletroanalítica de soluções aquosas de naringina.

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 Resultados e discussões
• Quando medidas voltamétricas com HMDE em soluções de maiores valores
de pH foram realizadas, partindo a varredura em 0 V e indo no sentido do
potencial negativo , dois novos picos em - 0.25 e - 0.42 V foram observados
em concentrações relativamente baixas de soluções aquosas de naringina,
não sendo pela redução de grupos funcionais de naringina, mas atribuído a
redução dos diferentes tipos de complexos de mercurio-naringina formados
na superfície do eletrodo.

• Em geral, a complexação de íons metálicos conduz a uma mudança de seu

potencial de oxidação em direção ao potencial negativo relativo ao potencial
redox encontrado para a oxidação do metal não complexado, onde a
magnitude da mudança de potencial depende da constante de dissociação
do complexo , do número de coordenação e da concentração do ligante.

• No caso da naringina a altura máxima dos dois picos depende muito da

concentração de naringina na solução, bem como as condições de
acumulação aplicada.

14
 Resultados e discussões

• O segundo pico é observado especialmente nas maiores concentrações de naringina (> 10

mg L-1) e maiores tempos de acúmulo.

• Formação de dois complexos mercúrio - naringina com diferentes estequiometrias ao invés

de formação por etapas de Hg(I)- e Hg(II) - sais de naringina é responsável pelo
aparecimento de duas ondas que são fortemente influenciados pelo pH da solução (Fig. (a) e
(b)).

15
 Resultados e discussões
• Ambos os picos apresentam um máximo de corrente em maiores valores
de pH.

• Este fenômeno pode ser facilmente explicado pelo fato da formação de

ânions naringina-fenolato que são mais fortes agentes complexantes do
que ocorre em soluções fortemente alcalinas de naringina (sem carga).

• Logo, a formação e o acúmulo de complexos mercúrio -naringina na

superfície do eletrodo ocorre mais prontamente em soluções básicas
elevando a corrente do pico de dissolução. O potencial máximo do pico 1
muda ligeiramente para valores mais negativos com o aumento do pH,
enquanto que o segundo pico é o primeiro a ser mudado para valores
mais negativos e novamente ligeiramente para valores mais positivos com
o aumento do pH (Fig. a).

16
 Resultados e discussões
• Sabi-se que os flavonóides com hidroxila substituintes são capazes de formar
complexos com vários íons metálicos , este fato tem sido raramente aplicada à
determinação de flavonóides usando CSV .

• Para otimizar o processo de acumulação e obter a maior diversos fatores que afetam a
pré-concentração de naringina (em diferentes concentrações) na superfície de
eletrodos foram estudados, por exemplo:
– Composição do eletrólito de suporte
– Acumulação potencial
– Tempo de preconcentração.
• Os melhores resultados sobre altura do pico de extracção e janela de potencial
acessível foram obtidas em misturas de solventes de tampão alcalino (pH 12) e
acetonitrila em um volume proporção de 1:1.

• Assim, para todas as medições posteriores esta mistura de solventes foi escolhido como
o eletrólito de suporte.

17
 Resultados e discussões
• Os gráficos ilustram a dependência da altura do pico de dissolução dos
picos 1 e 2 sobre o potencial de acumulação e um tempo de acumulação
de 10s.

Neste caso (Fig. b) os melhores

Uma acumulação potencial entre resultados são obtidos quando uma
-0.05 e V -0.15 deve ser acumulação potencial entre - 0.20 e V
aplicada para a obtenção da - 0.30 é escolhida para a etapa do
máxima altura do pico 1 (Fig. a). tempo de preconcentração. 18
 Resultados e discussões
• Desde a altura dos dois picos (dependente da concentração) e a influência
do tempo de acumulação na corrente do pico de dissolução de ambos os
picos foram estudados em soluções de diferentes concentrações de
naringina.
•Logo, os parâmetros
experimentais finais (escolha
de um determinado pico de
decapagem , extracção e
tempo de preconcentração) têm
de ser selecionados de acordo
com faixa de concentração
estudada, enquanto o primeiro
pico é adequado para a
determinação de concentrações
mais baixas naringina, o
segundo pico pode ser usado
em intervalos de maior
concentração
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 Resultados e discussões
• 1° Pico - faixa de concentração entre 0,10 mg l -1 e 2,0 mg L-1, potencial de
acúmulo de 0,05 V e tempo de pré-concentração de 10 s. Corrente é
função da concentração, segundo a equação ip[µA]= - 0.0324 + 0.414 C
[mg l-1] (coeficiente de correlação 0.9991, n=5). O desvio padrão relativo
(r.s.d.), foi encontrado inferior a 1,5%.

• 2° Pico - Para a determinação de naringina em concentrações entre

10 mg l-1 e 40 mg l-1 . O potencial de pré-concentração de - 0,20 V e um
tempo de pré-concentração de 30 s. Onde ip[µA]= - 0.186 + 14,7 C [µg l-1]
(coeficiente de correlação 0.9969, n=5) . O (r.s.d.), foi encontrado inferior
a 4,9%.

• Para verificar a precisão dos experimentos do procedimento de

recuperação foram realizado testes com soluções contendo quantidades
conhecidas de naringina entre 0,20 e 1,0 mmol L -1. Obteve-se uma
recuperação média de 97,2% com um erro relativo médio de 4,1% ( n =5).

20
 Determinação de naringina em
suco de toranja
• Testes com amostras reais de suco de toranja contendo naringina .

• Em geral a concentração do gosto amargo de naringina em sucos de toranja é

relativamente elevada, foi utilizado cerca de 1 ± 3 ml de suco de toranja à
solução de eletrólitos e por escolha do segundo pico de dissolução em - 0.42
V.

• No entanto, adição de uma maior quantidade de suco de toranja ao eletrólito

suporte levou a sérios problemas devido a componentes da matriz:
– Mudança do pH para menores valores de pH e, como conseqüência, uma
diminuição de sensibilidade da medida voltamétrica
– Outras substâncias, que estão presentes em grande excesso no suco de
toranja não tratado, são adsorvidas na superfície do eletrodo. Dando
origem, quer para picos de interferência ou para saturação da superfície
do eletrodo, tornando a quantificação de naringina por adição de padrão
interno impossível.
21
• Esses problemas podem ser resolvidos por tratamento prévio da amostra
de forma muito simples antes da medida voltamétrica (conforme descrito
na seção experimental) e usando volumes de amostra muito menor (<100
ml).

• Devido à alta sensibilidade do CSV amostras muito diluídas podem ser

analisadas e a influência dos efeitos da matriz se torna desprezível.

• Por causa da concentração de naringina ralativamnte baixa em amostras

diluidas, o primeiro pico (Ep em - 0.25 V) foi selecionado para o
procedimento e um potencial de acumulação de -0.15 V e um tempo de
acumulação entre 0 e 60 s foi aplicado.

22
• O gráfico mostra os
voltamogramas característicos
da dissolução catódica para a
determinação de naringina em
suco de toranja de frutas recém
prensadas, obtido por adição
de padrão interno. A curva de
calibração linear
correspondente seguido do
equação ip[µA]= - 0.013 + 0.044
C [mg l-1] ( n = 6, r= 0.9985, r.s.d
= 4.9% ). A concentração
naringina das cinco diferentes
marcas de sucos de toranja
foram determinados.

23
• Os valores obtidos por CSV estão em boa concordância com aquelas
reportadas por outros, que tinham usado LC com detecção eletroquímica
oxidante ou detecção electroquímica combinada com detecção UV

24
• Nos próximos graficos, resultados de um estudo de seletividade são apresentados.

• Estudos preliminares revelaram que outros flavonóides pode ser determinada de

forma semelhante por CSV, mas são necessários valores um pouco diferentes dos
parâmetros experimentais.

• Para estudos de seletividade em suco de toranja alguns típicos e mais frequentes

exemplos de flavonóides, como a rutina, hesperidina e quercetina, foram selecionados
entre a grande variedade de flavonóides.

• Sob condições otimizadas para a determinação de naringina em suco de toranja, a

presença dos flavonóides selecionados não interfiriram na determinação de naringina.

25
(a) 1 = branco; (b) 1 = branco;
2 = adição de 30 µ l suco 2 = adição de 40 µ l suco
de toranja pré-tratado , de toranja pré-tratado ,
3 = 5,48 nmol naringina. 3 = 16,4 nmol hesperidina.
26
(c) 1 = branco;
2 = adição de 40 µ l suco
de toranja pré-tratado ,
3 = além de 15,1 nmol rutina.
(d) 1 = branco;
2 = adição de 50 µ l suco
de toranja pré-tratado ,
3 = adição de 5,48 nmol quercetina
27
• Após o acréscimo da naringina a uma solução contendo suco de toranja
pré-tratado, um pico de realce de decapagem máximo em - 0.25 V foi
observado (gráfico a ), enquanto em caso da adição de hesperidina, rutina
ou quercetina pico em - 0.25 V permaneceu inalterado em altura, e picos
de dissolução apareceram em diferentes potenciais .

• Estes resultados em conjunto com os resultados apresentadospor outros

grupos por LC eletroquímico ou detecção por UV nos levaram a supor que
CSV em combinação com o procedimento de preparação da amostra
descrito neste documento é suficientemente selectivo para determinação
de naringina em suco de toranja

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 CONCLUSÃO
• Voltametria de redissolução catódica oferece um método sensível e
seletivo para determinaçãode naringina.

• Os resultados analíticos obtidos pela CSV são adequadamente exactos e

precisos e estão em boa concordância com aqueles obtidos através de
técnicas como como LC com UV ou detecção eletroquímica oxidativa.

• A principal vantagem do novo método é a sua maior sensibilidade e, por

causa da possibilidade de maior diluição da amostra, menos efeitos da
influência da matriz, portanto, o procedimento de CSV não é demorado,
porque uma única preparação da amostra é requerida antes da
determinação da naringina em amostras reais.

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