Bioinformática

BIOINFORMÁTICA
Discente: Euzanyr Silva
Crato - CE
2021
INTRODUÇÃO
 O arroz (Oryza sativa L.) é um dos

principais alimentos básicos do
mundo e é produzido principalmente
em países asiáticos.
INTRODUÇÃO
 Brasil
INTRODUÇÃO
 Dentre as várias doenças que afetam o arroz,

aquelas causadas por fungos micotoxigênicos são
mais importantes, devido ao risco à segurança
alimentar, pela contaminação do grão de arroz por
micotoxinas.
Fusarium
INTRODUÇÃO
 As espécies do complexo de
espécies F. fujikuroi (FFSC) são
frequentemente encontradas em
grãos de arroz, especialmente F.
fujikuroi , F. proliferatum e F.
verticillioides.
INTRODUÇÃO
 As espécies FFSC produzem uma ampla

gama de micotoxinas, incluindo:
• Fumonisinas;
• Moniliformin;
• Beauvericina;
• Enniatinas;
• Desoxinivalenol;
• Nivalenol;
INTRODUÇÃO
 No entanto, desde 2010, devido à grande diversidade

de espécies de Fusarium no arroz, várias ocorrências de
micotoxinas de vários tipos de toxicidade têm sido relatadas,
aumentando o risco para os consumidores
OBJETIVOS
i) identificar as espécies de FFSC com uma abordagem

molecular;
ii) estudar sua diversidade genética e sua relação filogenética;
iii) analisar o perfil de micotoxinas de FFSC em nível de espécie;

MATERIAIS E MÉTODOS
 Procedimentos de amostragem, coleta de cepas e isolamento
• 100 cepas do complexo de espécies Fusarium fujikuroi utilizadas;
• Obtidas a partir de levantamentos realizados nas principais regiões produtoras

de arroz do Brasil;
• Durante três épocas diferentes;

• As cepas foram originadas de três diferentes coleções:
a) amostra histórica (2012 a 2019) de 10 cepas do tipo FFSC isoladas de grãos maduros
produzidos no estado do Rio Grande do Sul (RS);
b) amostra contemporânea (safras 2014/15 e 2015/16) de 47 cepas isoladas de grãos

colhidos em lavouras de sete estados: RS, Goiás (GO), Mato Grosso (MT), Tocantins
(TO), Maranhão (MA ), Roraima (RR) e São Paulo (SP);
c) uma amostra contemporânea de campo (safra 2015/16) de 42 cepas isoladas de

panículas coletadas aleatoriamente, durante a colheita, em arrozais nos estados de
Santa Catarina (SC), RS e TO
• No total, mais de seiscentas amostras foram analisadas.
Para cada um, duzentos grãos foram semeados em papéis de filtro embebidos em solução
salina estéril em caixas de germinação (Gerbox) e incubados em temperatura ambiente (25
± 3 ° C) por 12 dias (Leslie e Summerrel,2006).
• Colônias com características do FFSC foram isoladas em cultura pura.
As análises foram feitas usando microscópio;

E uma cepa por amostra de grão foi isolada em MA2%;
• A identificação preliminar das cepas foi baseada em caracteres:
• Morfológicos dos conidiósforos;
• Células conidiogênicas;
• Presença ou ausência de polifialídeos;
• Cadeias de conídios;
 Extração de DNA, ensaios de PCR e sequenciamento
• O DNA foi extraído e purificado de micélio

fresco usando o kit “Wizard® Magnetic DNA
Purification System for Food” (Promega) de
acordo com o protocolo do fabricante.
 Extração de DNA, ensaios de PCR e sequenciamento
• As relações filogenéticas foram investigadas amplificando e sequenciando o

fator de alongamento da tradução dos genes:
Primers EF1 e EF2 ( O'Donnell et al., 1998).

• 1-α (TEF);
Primers CL1 e CL2 (O'Donnell et al., 2000)

• Calmodulina (CAL);
Iniciadores Bt2a e Bt2b (Glass e Donaldson, 1995)

• β-tubulina (TUB).
 Alinhamento de sequência e análise filogenética
• As sequências de DNA foram alinhadas pela plataforma de software
BioNumerics Seven (Applied Maths) e comparadas com aquelas do GenBank
usando a pesquisa BLASTn;
• Sequências de cepas FFSC foram alinhadas com sequências de cepas de
referência usando o alinhamento com o algoritmo Clustal W no software
MEGA 7.0;
 Alinhamento de sequência e análise filogenética
• As análises de Parcimônia Máxima foram implementadas no software MEGA

7.0 e a estabilidade dos clados foi avaliada usando 1000 réplicas de bootstrap
de parcimônia.
• Fusarium oxysporum e Fusarium inflexum foram usados como grupo externo.
• As sequências geradas foram depositadas na base de dados GenBank sob os

números de acesso LS423127-LS423234 (TEF), LS423343-LS423450 (CAL) e
LS423235-LS423342 (TUB)
 Análise de micotoxinas
• Um subconjunto de 61 cepas representativas de todas as espécies filogenéticas

foram selecionadas para determinar sua capacidade de produzir:
• Beauvericina (BEA);
• Fumonisinas (FB1 e FB2);
• Moniliformin (MON);
• Enniatina A (ENNA; ENNA1; ENNB e a

ENNB1);
RESULTADOS
 Análise filogenética
Fig. 1 . Árvore filogenética inferida dos conjuntos
de dados combinados (TEF, TUB e CAL) de
membros do complexo de espécies Fusarium
fujikuroi analisados neste estudo. A história
evolutiva foi inferida usando o método da
Parcimônia Máxima. Os números nas
ramificações são valores de bootstrap baseados
em 1000 réplicas.
RESULTADOS
 Produção de micotoxinas
Tabela 1 . Beauvericina, moniliformina, fumonisinas e enniatinas produzidas por cepas do complexo de espécies Fusarium
fujikuroi cultivadas na cultura do arroz.
a
Micotoxinas analisadas: BEA = beauvericina; MON = moniliformin; FB 1 = Fumonisina B 1 ; FB 2 = Fumonisina B 2 ; FB 3 = Fumonisina B 3 ; ENNA = enniatina A; ENNA1 = enniatina
A1; ENNB = enniatina B; ENNB1 = enniatina B1;
b
Espécies de Fusarium : F. ver = F. verticillioides ; F. pro = F. proliferatum ; F. fuj = F. fujikuroi ; F. sp. = Fusarium sp .; F. vol = F. volátil ; F ant = F. anthophilum ; F. pse = F.
pseudocircinatum ; F. ste = F. sterilihyphosum ; F. beg = F. begoniae ;
c
Número de cepas analisadas de cada espécie (concentração mínima de micotoxina produzida por um isolado / concentração máxima de micotoxina produzida por um isolado);
RESULTADOS
a
b
c
RESULTADOS
fujikuroi cultivadas na cultura do arroz. Fusarium Begoniae
a
b
c
RESULTADOS
fujikuroi cultivadas na cultura do arroz. Fusarium Begoniae
a
b
c
RESULTADOS
a
b
c
RESULTADOS
a
b
c
RESULTADOS
a
b
c
RESULTADOS
a
b
c
RESULTADOS
a
b
c
RESULTADOS
a
b
c
RESULTADOS
a
b
c
DISCUSSÃO
 Primeiro estudo abrangente da diversidade e potencial toxigênico de

FFSC isolado das regiões de cultivo de arroz tropicais e subtropicais
mais importantes do Brasil.
 As nove espécies de FFSC relatadas aqui é o maior número de espécies

relatadas até agora para fungos isolados de panículas ou grãos.
 Entre eles, F. fujikuroi, F. proliferatum e F. verticillioides foram

dominantes, confirmando relatórios anteriores em todo o mundo (Carter
et al., 2008; Wulff et al., 2010).
DISCUSSÃO
 F. fujikuroi é conhecido por dominar em grãos de arroz e não em

muitas outras culturas (Sunani et al., 2020);
 Confirmando achados anteriores, esta espécie dominante foi

capaz de produzir, dependendo do isolado, uma quantidade
relativamente alta de beauvericina e moniliformin, mas F.
fujikuroi foi capaz de produzir todas as quatro classes .
DISCUSSÃO
 Outro patógeno, F. proliferatum é um patógeno comum do milho, mas também

é relatado em um grande conjunto de outros hospedeiros de plantas, incluindo
sementes de arroz e plantas de arroz.
 No Brasil, essa espécie foi recentemente relatada em grãos de arroz (Savi et

al., 2018).
 Filogeneticamente, F. proliferatum e F. fujikuroi são espécies toxigênicas

intimamente relacionadas (espécies irmãs) (Leslie et al., 2004).
 As altas quantidades de BEA, MON e FBs produzidos por nosso F. proliferatum

os isolados confirmam seu alto potencial toxigênico e presença no arroz.
DISCUSSÃO
 Como F. verticillioides é a espécie produtora de fumonisinas mais conhecida no
mundo, sua ampla ocorrência em sementes de arroz no Brasil é preocupante,
dado seu alto potencial para produzir FB 1, confirmado por nossos resultados.
DISCUSSÃO
 A nova espécie de Fusarium é um clado irmão de F. andiyazi, um patógeno de

sorgo conhecido na África (Marasas et al., 2001), mas também do arroz na
África, Ásia e Califórnia (Wulff et al., 2010).
 Este isolados são filogeneticamente idênticos aos isolados de uma linhagem

filogenética recentemente isolada de plantas de cana-de-açúcar exibindo sintomas de
pokkah boeng no Brasil, onde F. sacchari e F. proliferatum também foram detectados
(Costa et al., 2019).
DISCUSSÃO
 Esse Fusarium sp. isolados foram capazes de produzir FB 1 , MON,

BEA e ENNs, o que aumenta sua importância como contaminante
do arroz.
 O conhecimento desta diversidade aumentada de Fusarium no

arroz é essencial para a avaliação de risco e estratégias de gestão
para mitigação de risco.
CONCLUSÃO
 Nesse estudo aumenta consideravelmente o conhecimento da

diversidade de espécies de Fusarium que infectam o arroz.
 A legislação atual para limites máximos tolerados para

micotoxinas, considera apenas desoxinivalenol e a zearalenona
em grãos de arroz brasileiro (ANVISA, 2017).
CONCLUSÃO
 A importância do arroz como principal alimento básico para o

consumo doméstico e a presença de várias espécies de FFSC
produtoras de micotoxinas, reforçam a necessidade de expandir a
análise de micotoxinas no arroz para além das consideradas pela
legislação atual.
OBRIGADA!

Bioinformática - Apresentação 1

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Discente: Euzanyr Silva

 O arroz (Oryza sativa L.) é um dos

 Dentre as várias doenças que afetam o arroz,

 As espécies FFSC produzem uma ampla

 No entanto, desde 2010, devido à grande diversidade

i) identificar as espécies de FFSC com uma abordagem

ii) estudar sua diversidade genética e sua relação filogenética;

iii) analisar o perfil de micotoxinas de FFSC em nível de espécie;

 Procedimentos de amostragem, coleta de cepas e isolamento

• 100 cepas do complexo de espécies Fusarium fujikuroi utilizadas;

• Obtidas a partir de levantamentos realizados nas principais regiões produtoras

• Durante três épocas diferentes;

 Procedimentos de amostragem, coleta de cepas e isolamento

• As cepas foram originadas de três diferentes coleções:

b) amostra contemporânea (safras 2014/15 e 2015/16) de 47 cepas isoladas de grãos

c) uma amostra contemporânea de campo (safra 2015/16) de 42 cepas isoladas de

 Procedimentos de amostragem, coleta de cepas e isolamento

• No total, mais de seiscentas amostras foram analisadas.

• Colônias com características do FFSC foram isoladas em cultura pura.

As análises foram feitas usando microscópio;

 Procedimentos de amostragem, coleta de cepas e isolamento

• A identificação preliminar das cepas foi baseada em caracteres:

• Morfológicos dos conidiósforos;

• Presença ou ausência de polifialídeos;

 Extração de DNA, ensaios de PCR e sequenciamento

• O DNA foi extraído e purificado de micélio

 Extração de DNA, ensaios de PCR e sequenciamento

• As relações filogenéticas foram investigadas amplificando e sequenciando o

Primers EF1 e EF2 ( O'Donnell et al., 1998).

Primers CL1 e CL2 (O'Donnell et al., 2000)

Iniciadores Bt2a e Bt2b (Glass e Donaldson, 1995)

 Alinhamento de sequência e análise filogenética

• As sequências de DNA foram alinhadas pela plataforma de software

BioNumerics Seven (Applied Maths) e comparadas com aquelas do GenBank

usando a pesquisa BLASTn;

• Sequências de cepas FFSC foram alinhadas com sequências de cepas de

referência usando o alinhamento com o algoritmo Clustal W no software

 Alinhamento de sequência e análise filogenética

• As análises de Parcimônia Máxima foram implementadas no software MEGA

• Fusarium oxysporum e Fusarium inflexum foram usados ​como grupo externo.

• As sequências geradas foram depositadas na base de dados GenBank sob os

• Um subconjunto de 61 cepas representativas de todas as espécies filogenéticas

• Fumonisinas (FB1 e FB2);

• Enniatina A (ENNA; ENNA1; ENNB e a

 Primeiro estudo abrangente da diversidade e potencial toxigênico de

 As nove espécies de FFSC relatadas aqui é o maior número de espécies

 Entre eles, F. fujikuroi, F. proliferatum e F. verticillioides foram

 F. fujikuroi é conhecido por dominar em grãos de arroz e não em

 Confirmando achados anteriores, esta espécie dominante foi

 Outro patógeno, F. proliferatum é um patógeno comum do milho, mas também

 No Brasil, essa espécie foi recentemente relatada em grãos de arroz (Savi et

 Filogeneticamente, F. proliferatum e F. fujikuroi são espécies toxigênicas

 As altas quantidades de BEA, MON e FBs produzidos por nosso F. proliferatum

 Como F. verticillioides é a espécie produtora de fumonisinas mais conhecida no

mundo, sua ampla ocorrência em sementes de arroz no Brasil é preocupante,

 A nova espécie de Fusarium é um clado irmão de F. andiyazi, um patógeno de

 Este isolados são filogeneticamente idênticos aos isolados de uma linhagem

 Esse Fusarium sp. isolados foram capazes de produzir FB 1 , MON,

 O conhecimento desta diversidade aumentada de Fusarium no

 Nesse estudo aumenta consideravelmente o conhecimento da

 A legislação atual para limites máximos tolerados para

 A importância do arroz como principal alimento básico para o

• Fusarium oxysporum e Fusarium inflexum foram usados como grupo externo.