Tarabalho Eletroforese

Universidade da Região da Campanha
Centro de Ciências da Saúde

Farmácia – Op.Unitárias
ELETROFORESE
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CONCEITO
 É uma técnica de separação baseada na migração
das moléculas carregadas, numa solução, em
função de aplicação de um campo elétrico.
 Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e

da natureza das macromoléculas, podemos separá-las pela
carga ou pelo tamanho.
 É uma técnica laboratorial de separação de frações

de proteínas, enzimas, DNA e RNA
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 Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel: O

gel é submerso em um tampão que possui íons para a
corrente passar e também para manter o pH mais ou
menos constante.
 Moléculas com carga negativa migram para o pólo posi

tivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para
o pólo negativo (cátodo).
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HISTÓRICO
 A eletroforese de proteínas foi realizada
pela primeira vez em 1937 (Arne Tiselius).
– “Eletroforese livre”: soro sanguíneo em cinco frações

protéicas principais;
– Prêmio Nobel: 1948
– Atualmente é utilizadas em vários setores: químicos,

bioquímicos, industrias farmacêuticas, ciência forense,
etc.
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Aplicações
 Identificação de pessoas: em testes de paternidade,
comparando o DNA do suposto pai, da mãe e do filho;
 na identificação de criminosos.
 Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes

de diagnóstico);
 Na Agropecuária (Animais e plantas

transgênicos).
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TÉCNICA DA ELETROFORESE
 Separação de material orgânico que apresenta cargas elétricas
definidas em pH específico
– Cuba eletroforética;
– Eletrodos (pólos positivos e negativos);
– Solução tampão: pH específico
– Pentes: para fazer poços aonde as amostras se

rão aplicadas
– Suporte para eletroforese;
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TÉCNICA DA ELETROFORESE
– Amostra a ser investigada.
– Brometo de Etídeo: corante fluorescente usado para

corar ácidos nucléicos.
Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente
mutagênico
– Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visua

lizar o DNA corado com EtBr.
Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV)
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SUPORTES UTILIZADOS EM ELETROFORESE
 Acetato de celulose
 Gel de agarose (concentração firme acima de 1%)

Vantagens: – Facilidade de manuseio – Conservação
Ideal – Baixo custo operacional
 Gel de amido (Alto grau de definição analítica das frações separadas)

Desvantagens: – Dificuldade na preparação do gel (tempo X material)
– Tempo de migração excessiva (12 a 16 h)
– Dificuldade na coloração das frações separadas
 Gel de poliacrilamida
 Eletroforese capilar
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ELETROFORESE NA VERTICAL
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ELETROFORESE NA HORIZONTAL
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VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE

 O corante mais comum para géis de agarose é o
Brometo de etídio (EtBr). Ele fluoresce sob luz UV quan
do intercalado nas bases deDNA (ou RNA)
 Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhan

do sob UV podemos ver as bandas de DNA.
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Como é feito o exame de paternidade?
1. Coleta do sangue 2. Extração do DNA 3. Amplificação do DNA 3. Digestão do DNA
4. Eletroforese 5a. Southern Blotting 5b. Hibridização da membrana de nylon
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Como é feito o exame de paternidade?
Figura Inclusão - Figura Exclusão - Observe

Observe que um dos que um dos alelos (banda)
alelos (banda) do filho é do filho é proveniente da
proveniente da mãe e o mãe. O outro alelo, no
6. Visualização outro alelo proveniente entanto, difere dos alelos
do suposto pai. Neste do suposto pai. Neste caso,
caso, a paternidade fica ocorreu uma exclusão de
comprovada. paternidade.
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Diagnóstico laboratorial da doença falciforme em neonatos e após o

sexto mês de vida
 A doença falciforme é uma desordem Gené
tica da hemoglobina, com alta prevalência
no Brasil.
 Doença hereditária que causa a malformação das

hemácias, que assumem forma semelhante a foices.
 Apresenta elevada morbidade e mortalidade, necessi

tando de identificação e tratamento precoces.
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 Portanto tornou-se o seu diagnóstico obrigatório pelos

testes de triagem neonatal, em todo o país.
 O diagnóstico laboratorial da doença no neonato basei

a-se na detecção da hemoglobina S utilizando-se prefe
rencialmente as técnicas de IEF e/ou HPLC (sensibilidade
e especificidade).
 A mortalidade na doença falciforme, principalmente por

infecção bacteriana ou por seqüestro esplênico, inicia-se
após os dois a três primeiros meses de vida, justificando
a importância do diagnóstico precoce.
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Diagnóstico laboratorial
 O diagnóstico das hemoglobinopatias é complexo e
envolve uma análise que deve considerar:
 dados clínicos e herança genética;
 idade da criança por ocasião da coleta;
 tempo de estocagem e condições de

armazenamento da amostra.
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Diagnóstico laboratorial em neonatos

 Baseia-se na detecção da hemoglobina S e deve se
guir as normas estabelecidas no PNTN (Portaria do Minis
tério da Saúde nº 822/01)
 Os métodos utilizados identificam, além da doença falci

forme, outras hemoglobinopatias, bem como as crianças
heterozigotas (portadoras de traço para hemoglobinopa
tias).
Company name
 Inicialmente, os programas de triagem utilizavam dois

procedimentos eletroforéticos associados:
 A eletroforese em acetato de celulose e pH alcalino
seguida da eletroforese em ágar citrato em pH ácido.
Company name
A primeira técnica diferencia

as hemoglobinas A da F e das variantes
mais freqüentes,
como as hemoglobinas S e C, mas é
incapaz de distinguir
as hemoglobinas A2 da C, O e E, bem
como as hemoglobinas
S da D ou da G devendo, portanto, ser
confirmada pela
eletroforese em ágar citrato em pH ácido.
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 A associação dessas técnicas não constitui o melhor

procedimento para triagem neonatal populacional, pois,
além de mais trabalhosa para realização em larga escala,
apresenta menor sensibilidade e especificidade para o
diagnóstico neonatal.
 Atualmente, a maioria dos programas de triagem Neo

natal substituiu os métodos convencionais pela eletrofo
rese por focalização isoelétrica (IEF)
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Figura 2. Visão parcial de gel de IEF com várias corridas

eletroforéticas. Legenda: NAFSC: controle na posição 16 do
gel de IEF Padrões: Hb FS, Hb FSC, Hb AS, Hb FAS;
Transfusão: Hb AF emrecém-nascido
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 e/ou pela cromatografia líquida de alta resolução

(HPLC).
Company name
Diagnóstico laboratorial após o 6º mês de vida
 os recém-nascidos diagnosticados à triagem neonatal

como prováveis doentes falciformes devem ser reavalia
dos laboratorialmente após o 6º mês de vida.
 Um teste simples como a pesquisa de drepanócitos,

embora incapaz de diferenciar os vários genótipos, pode
confirmar a presença da Hb S.
 A repetição da eletroforese confirma o perfil hemoglo

bínico num melhor momento, ocasião em que se aproxi
ma do perfil do adulto.
Company name
 Para os pacientes que não foram submetidos à triagem

neonatal e para diagnóstico diferencial entre as diferentes
formas de doença falciforme, além dos sinais e sintomas
clínicos, o seguintes exames podem ser utiliza dos:
 Eletroforese em pH alcalino em acetato de celulose;
 Eletroforese em pH ácido em ágar citrato ou gel de
 agarose;
 IEF;
 HPLC (kit beta tal);
 Pesquisa de drepanócitos e/ou teste de solubilidade;
Company name
 Dosagem da hemoglobina fetal pela técnica de

desnaturação alcalina ou por HPLC (kit beta tal);
 Dosagem de hemoglobina A2 por microcromatografia

em coluna ou por HPLC (kit beta tal);
 Hemograma completo (hematoscopia, VCM) e reticu

lócitos;
 Estudo do sangue dos pais (estudo familiar).
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DANIELLA QUADROS E CAMILA SIMÕES
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 Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e

 É uma técnica laboratorial de separação de frações

 Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel: O

 Moléculas com carga negativa migram para o pólo posi

– “Eletroforese livre”: soro sanguíneo em cinco frações

– Prêmio Nobel: 1948

– Atualmente é utilizadas em vários setores: químicos,

 Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes

 Na Agropecuária (Animais e plantas

– Eletrodos (pólos positivos e negativos);

– Solução tampão: pH específico

– Pentes: para fazer poços aonde as amostras se

– Suporte para eletroforese;

– Brometo de Etídeo: corante fluorescente usado para

– Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visua

SUPORTES UTILIZADOS EM ELETROFORESE

 Gel de agarose (concentração firme acima de 1%)

 Gel de amido (Alto grau de definição analítica das frações separadas)

VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE

 Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhan

Como é feito o exame de paternidade?

1. Coleta do sangue 2. Extração do DNA 3. Amplificação do DNA 3. Digestão do DNA

4. Eletroforese 5a. Southern Blotting 5b. Hibridização da membrana de nylon

Como é feito o exame de paternidade?

Figura Inclusão - Figura Exclusão - Observe

Diagnóstico laboratorial da doença falciforme em neonatos e após o

 Doença hereditária que causa a malformação das

 Apresenta elevada morbidade e mortalidade, necessi

 Portanto tornou-se o seu diagnóstico obrigatório pelos

 O diagnóstico laboratorial da doença no neonato basei

 A mortalidade na doença falciforme, principalmente por

 dados clínicos e herança genética;

 idade da criança por ocasião da coleta;

 tempo de estocagem e condições de

Diagnóstico laboratorial em neonatos

 Os métodos utilizados identificam, além da doença falci

Diagnóstico laboratorial em neonatos

 Inicialmente, os programas de triagem utilizavam dois

Diagnóstico laboratorial em neonatos

A primeira técnica diferencia

Diagnóstico laboratorial em neonatos

 A associação dessas técnicas não constitui o melhor

 Atualmente, a maioria dos programas de triagem Neo

Diagnóstico laboratorial em neonatos

Figura 2. Visão parcial de gel de IEF com várias corridas

Diagnóstico laboratorial em neonatos

 e/ou pela cromatografia líquida de alta resolução

Diagnóstico laboratorial após o 6º mês de vida

 os recém-nascidos diagnosticados à triagem neonatal

 Um teste simples como a pesquisa de drepanócitos,

 A repetição da eletroforese confirma o perfil hemoglo

Diagnóstico laboratorial após o 6º mês de vida

 Para os pacientes que não foram submetidos à triagem

 Eletroforese em pH alcalino em acetato de celulose;

 Eletroforese em pH ácido em ágar citrato ou gel de

Diagnóstico laboratorial após o 6º mês de vida

 Dosagem da hemoglobina fetal pela técnica de

 Dosagem de hemoglobina A2 por microcromatografia

 Hemograma completo (hematoscopia, VCM) e reticu

 Estudo do sangue dos pais (estudo familiar).

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