MEIOS DE CULTURA

At cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios lquidos, quando Robert Koch e sua equipe introduziram os meios de cultura slidos, os quais permitiram o estudo de espcies isoladas (culturas puras), separando-as de espcies contaminantes. Meios de cultura consistem da associao qualitativa e quantitativa de substncias que fornecem os nutrientes necessrios ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla diversidade metablica dos microrganismos, existem vrios tipos de meios de cultura para satisfazerem as variadas exigncias nutricionais. Alm dos nutrientes preciso fornecer condies ambientais favorveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH, presso osmtica, umidade, temperatura, atmosfera (aerbia, microaerbia ou anaerbia), dentre outras. Os meios de cultura so classificados quanto ao estado fsico em slidos, quando contm agentes solidificantes, principalmente gar (cerca de 1 a 2,0 %); semi-slidos, quando a quantidade de gar e ou gelatina de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistncia intermediria, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tenses variadas de oxignio ou a verificao da motilidade e tambm para conservao de culturas; e lquidos, sem agentes solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativao das culturas, repiques de microrganismos, provas bioqumicas, dentre outros. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto a procedncia dos constituintes em naturais ou complexos, quando usa ingredientes com composio qumica no definida, tais como extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubrculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne, crebro, fgado, casena, etc.) e de microrganismos (levedura) e artificiais, sintticos ou ainda quimicamente definidos quando a composio qumica conhecida (usados para trabalhos de pesquisa) e seus componentes servem para suprir as exigncias nutritivas dos microrganismos, em fontes de carbono, nitrognio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando ento so conhecidas as necessidades nutricionais especficas. Quanto a composio qumica podem ser simples (meios bsicos) ou complexos. Bsicos so aqueles que permitem o desenvolvimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigncia em especial (Ex. caldo e gar simples). Especiais quando cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos, como meio de infuso de crebro e corao, gar suco de tomate, gar sangue, meio de Loeffler (com soro bovino), gar chocolate (agar simples fundido, adicionado de sangue e aquecido a 80C), Meio de Tarozzi (com fragmento de fgado - para anaerbios), Meio de Lowenstein, meios Shahidi Ferguson Perfringens (SFP), Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) , Baird-Parker (com gema de ovo) (meios ricos ou meios enriquecidos com as substncias citadas), etc. Objetivos Esta parte trata de familiarizar o aluno com o preparo e esterilizao de meios de cultura, bem como conhecer e discutir a aplicao dos diversos tipos de meios de cultura.

APLICAO DOS MEIOS DE CULTURA

De acordo com a finalidade bacteriolgica ou micolgica os meios especiais podem ser classificados em: Meios de pr-enriquecimento - so aqueles que permitem a dessensibilizao de microrganismos injuriados, i.e., para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (trmico ou qumico). Ex. gua peptonada, caldo lactosado (isolamento de salmonelas de leite em p). Meios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos nmeros ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios tm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que tambm podem inibir o crescimento de outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas (lquidos), Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. Diferenciais - quando contm substncias que permitem estabelecer diferenas entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), gar MacConkey para a diferenciao de enterobactrias, gar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e diferenciao de cocos Gram positivos (slidos). Seletivos - os que contm substncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: meios com telurito de potssio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae), gar SalmonellaShigella (SS) e gar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de sdio, meio Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibiticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC, SFP, , meio de Blaser, meio de Skirrow, etc.). A maioria deles tambm diferencial, permitindo diferenciar as colnias (slidos) dos microrganismos. Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metablicas permitindo caracterizao e identificao perfunctria ou presuntiva de muitos microrganismos (gar trplice acar e ferro, meio Instituto Adolfo Lutz, uria, etc.); Identificao - prestam-se para a realizao de provas bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos submetidos a identificao (meios Oxidao/Fermentao, gar Citrato, Caldo nitrato, meio semi-slido, caldo triptofano, meio de Sulfito Indol Motilidade, etc.; Dosagem - empregados nas determinaes de vitaminas, antibiticos e aminocidos; Contagem - empregados para a determinao quantitativa da populao microbiana (Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose, gar Baird-Parker, etc.); Estocagem ou manuteno - utilizados para conservao de microrganismos no laboratrio, i.e. garantem a viabilidade de microrganismos (gar Sabouraud, Meios com leite, gar suco de tomate, gar sangue, gar Simples, meio semi-slido, etc.).

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

Caldo Simples - formulao: Extrato de carne ............ 0,3 g Peptona ......................... 1,0 g Cloreto de sdio ............ 0,5 g gua destilada .............. 100,0 ml O gar simples obtido adicionando-se 1,0 a 1,5 % de gar-gar ao meio de caldo simples (o meio pode ficar um pouco amolecido, a depender da qualidade do gar). Aumentando-se a concentrao de gar para 2,0% o meio fica bem slido e pode-se evitar que certos microrganismos se espalhem, como os Proteus. Preparao 1. Pesar as substncias e coloc-las em um bquer (a exceo do gar) 2. Acrescentar a metade dos 100 ml de gua destilada ou desmineralizada, medida com uma proveta 3. Dissolver os ingredientes em gua agitando continuamente com um basto de vidro ou com um agitador eltrico (uso de barra magntica), evitando a formao de espuma. Aps a formao de uma suspenso homognea, completar o volume do meio com o restante da gua 4. Quando necessrio, dissolver os ingredientes do meio de cultura em banho-maria, vapor fluente em autoclave ou utilizando a chama do bico de Bunsen, ou chapa aquecedora eltrica, protegida com tela de amianto, ou ainda em forno de microondas, at a ebulio, agitando sempre. Evitar o aquecimento desnecessrio 5. Filtrar em papel de filtro qualitativo para retirar as impurezas 6. Verificar o pH atravs de potencimetro ou fita indicadora de pH e ajustar para 7,2 usando soluo de cido ltico (0,1 %) ou hidrxido de sdio (1,0 N), com pipeta de 1 mililitro, gotejando aos poucos. O pH do agar simples ajustado antes da adio do gar-gar 7. Distribuir 50 ml do meio em tubos de ensaio (5 a 7 ml por tubo) 8. Tamponar os tubos, proteg-los com papel e amarr-los com barbante 9. Esterilizar em autoclave a 121C (1 atmosfera de presso) por 20 minutos. Deixar dois tubos sem esterilizar, incub-los a 37C por 24 a 48 horas, para constatar a necessidade de esterilizao. Observao: Alguns meios de cultura so preparados da mesma forma, porm se for necessrio utilizar algumas substncias termolbeis (uria) ou que reajam com as substncias dos meios (aminocidos, acares), as mesmas so esterilizadas parte ou por filtrao utilizando Filtro Seitz ou Filtros contendo membranas (de nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0,22um de dimetro (Millipore, Sartorius), e depois incorporadas, asspticamente, ao meio previamente esterilizado. Ainda, podem ser esterilizados por tindalizao, tambm conhecida como esterilizao fracionada (100C por

1 hora por 3 dias consecutivos, intercalados por incubao entre 30 a 45C), ou a 110C por 10 a 15 minutos, a depender do tipo e carga microbiana.

gar Simples

1. Aos 50 ml de caldo simples restantes, acrescentar 0,5 a 1,0 g de gar-gar 2. Colocar o bquer sobre uma tela de amianto (ajustada num trip metlico tendo por baixo o bico de Bunsen aceso) 3. Dissolver o gar no meio, mexendo sempre com um basto de vidro, para no aderir ao bquer, at a completa dissoluo, evidenciada pela ausncia de grnulos de gar nas paredes do recipiente, tornando-se lmpido. Isto somente se consegue com a ebulio do meio 4. Colocar em Erlenmeyer, tampar, proteger com papel e barbante 5. Esterilizar em autoclave a 121C por 20 minutos 6. Retirar do autoclave, esfri-lo a 50-70C e distribuir (cerca de 15 a 20 ml por cada placa) em placas de Petri (15 x 100mm) estreis. Ou ainda, caso necessrio, colocar em banhomaria a 45-55C, adicionar 10 ml de sangue oxalatado de coelho ou de ovino (gar Sangue), e distribuir em placas de Petri estreis. (previamente esterilizadas). Se antes da distribuio este meio for aquecido a 80C at ficar de cor marrom, temos o Agar chocolate.

Funo das substncias do gar e Caldo simples

Extrato de carne - Fonte de carbono orgnico, nitrognio, vitaminas e sais minerais e, nesse caso de energia Peptona protena semi-digerida que serve como fonte de nitrognio Cloreto de sdio - aumenta a presso osmtica e mantm a isotonia do meio gar-gar - Sulfato de cido poligalacturnico extrado de vrias espcies de algas do gnero Gellidum e outras algas afins. Tem como funo solidificar os meios e no metabolizado por bactrias de interesse clnico. Obs. 1. A adio de extrato de levedura (0,5%) e glicose (0,5 a 1,0 %) ao caldo simples enriquece o meio fornecendo vitamina B, fonte adicional de nitrognio e carbono, e pode at permitir o desenvolvimento de alguns microrganismos exigentes. 2. Os meios de cultura aps esterilizao devem ser incubados em condies ambientais (temperatura e atmosfera) adequadas para verificao da esterilidade (Prova da esterilidade). 3. A estocagem dos meios de cultura esterilizados e esfriados deve ser feita acondicionando-os invertidos, em sacos plsticos fechados, para reduzir a desidratao dos mesmos, colocando-os em refrigerao por, no mximo 15 dias.