Aulas II - Prof Flavio - Controle de Qualidade Microbiológico - 2013

18/08/2013
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TESTE DE ESTERILIDADE
Mtodos do teste de esterilidade
Direto: inoculao direta no meio de cultura Mtodo mais simples. Indicado para suturas cirrgicas, algodo e gaze estril e dispositivos parenterais. Indireto: mtodo de filtrao em membrana Utiliza sistema de filtrao. Indicado para parenterais de maior volume.
Mtodos Indireto
Utiliza fluidos de diluio e lavagem. Utiliza membranas com dimetro de 50 mm e porosidade 0,45 m (geralmente 0,2 m). Filtro de nitrato de celulose: indicado para solues aquosas, oleosas e fracamente alcolicas. Filtro de acetato de celulose: indicado para solues fortemente alcolicas. Filtro de PTFE e PVDF: indicado para produtos oncolgicos e com solventes agressivos.
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REALIZADO EM CMARA DE FLUXO LAMINAR
Classe I ar horizontal; Classe II ar vertical; Classe III hermeticamente fechada com luvas acopladas. Tipo A recicla 70% e expulsa 30% do ar para a sala; Tipo B1 recicla 30% e expulsa 70% do ar para o exterior; Tipo B2 expulsa 100% do ar; Tipo B3 recicla 70% e expulsa 30% do ar para o exterior.
Filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air Filter) Eficincia de 99,7% Estrutura fsica projetada
Ligar 30 min antes. Limpeza do interior com lcool 70% Velocidade do ar = 0,35 a 0,55m/s
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EQUIPAMENTOS DE PROTEO
EPI macaco, gorro, mscara, luva e sapatilha Tcnica de manipulao e descarte
Meios de cultura
Meio fluido de tioglicolato Colorao rsea em 1/3 do tubo Usado para cultura de bactrias anaerbicas Temperatura de incubao: 32,5 2,5C Tempo: 14 dias Caldo de casena-soja Usado para cultura de bactrias aerbicas, fungos e leveduras. Temperatura de incubao: 22,5 2,5C Tempo: 14 dias
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Teste de adequao dos meios Teste de esterilidade dos meios (14 dias de incubao). Promoo de crescimento (inocular microrganismo teste). Padronizao do microrganismo teste (inculo) No mais que 100 UFC por frasco de meio de cultura.
Teste para penicilinas e cefalosporinas Mtodo direto: acrescentar -lactamase nos meios de cultura. Mtodo indireto: acrescentar -lactamase nos fluidos de lavagem. Controle negativo: sem amostra. Controle positivo: com microrganismo teste. Teste de validao para bacteriostase e fungistase Promoo de crescimento com amostra e microrganismo teste deve ser idntica ao controle (sem amostra).
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LEITURA RECOMENDADA
Disponvel em: www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm Volume 1 item 5.5.3.2.1 Teste de esterilidade
PIROGNIOS
Qualquer substncia capaz de induzir elevaes trmicas em animais e humanos, em resposta a injeo ou infeco. Os pirognios dividem-se em duas classes:
Exgeno Endgeno
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PIROGNIOS EXGENOS
So aqueles que se originam fora do corpo e induzem elevaes trmicas quando injetados. Incluem os pirognios de origem microbiana (endotoxinas) e no microbianos, que incluem alguns frmacos, esterides e fraes do plasma.
PIROGNIO ENDGENO
produzido internamente pelo hospedeiro em resposta ao estmulo de pirognios exgenos. considerado o mediador primrio da febre. Tambm chamado de pirognio granuloctico.
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ENDOTOXINAS
As endotoxinas so complexos de alto peso molecular associados membrana externa de bactrias Gram-negativas.
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AES BIOLGICAS DAS ENDOTOXINAS

So atribudas diversas atividades biolgicas unidade lipdeo A da endotoxina:
TOXICIDADE LETAL LEUCOPENIA NECROSE DA MEDULA SSEA REABSORO DO OSSO EMBRIONRIO QUEDA DE PRESSO SANGUNEA AGREGAO PLAQUETRIA REATIVIDADE DRMICA AUMENTADA EPINEFRINA
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CONTROLE DE QUALIDADE
Os nveis de endotoxinas so cruciais na liberao de produtos farmacuticos.
Injetveis
Acessrios de transfuso
Dispositivos implantveis
Terapia parenteral
NVEIS DE ENDOTOXINAS
Limites para produtos farmacuticos:
Produtos farmacuticos e biolgicos: 5 UE/Kg Radiomarcadores: 2,5 UE/Kg Parenterais de grande volume: 0,5 UE/mL gua para injeo: 0,25 UE/mL Drogas intratecais: 0,2 UE/mL Correlatos: 0,5 UE/mL Correlatos intratecais: 0,06 UE/mL
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MTODOS DE DESPIROGENIZAO
Um produto estril nem sempre est apirognico. Os mtodos de despirogenizao podem ser de 2 tipos.
Inativao da endotoxina Remoo da endotoxina
MTODOS DE INATIVAO
Hidrlise cido-base
HCl 0,05N 30min 100C ou NaOH 0,25N 1h 50C
Alquilao
xido de etileno
Oxidao
Perxido de hidrognio (gua para injeo)
Processo trmico
Calor seco 30min 250C
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MTODOS DE REMOO
Lavagem
Usa gua estril para injeo
Destilao
Indicada para parenterais de grande volume
Ultrafiltrao
Usada em vrios frmacos, incluindo antibiticos.
Osmose reversa
Produo de gua estril para injeo
TESTE DE PIROGNIO
Teste in vivo Teste in vitro
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TESTE DE PIROGNIO IN VIVO

Medida do aumento da temperatura corporal de coelhos aps injeo intravenosa da amostra a ser testada. Coelhos do mesmo sexo, raa, adultos, sadios, pesando 1,5kg no mnimo e com temperatura corporal 39,8C. Manter os animais em gaiolas individuais, livre de perturbaes e temperatura ambiente entre 20 e 23C. Usar termmetro calibrado no reto do animal.
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TESTE DE PIROGNIO IN VIVO

Injetar na veia marginal da orelha de 3 coelhos no menos de 0,5mL e nem mais que 10mL/kg. Registrar a temperatura em intervalos de 30min durante 3h. Nenhum dos 3 coelhos deve apresentar aumento de temperatura 0,5C. Caso apresente, repetir o teste com outros 5 animais. Nesse caso, no mximo 3 dos 8 coelhos podem apresentar aumento de temperatura corporal 0,5C. A soma dos aumentos de todos os coelhos no deve exceder 3,3C.
TESTE DE ENDOTOXINA IN VITRO

Usado para detectar ou quantificar endotoxinas bacterianas. Utiliza o extrato aquoso dos amebcitos circulantes do Limulus polyphemus, caracterizado como reagente LAL. O reagente LAL um extrato aquoso dos amebcitos, que so as clulas sanguneas da hemolinfa azul da espcie de caranguejo ferradura, composto de enzimas que reagem em presena de pequenas quantidades de endotoxina.
18/08/2013
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Mtodo de coagulao em gel Mtodo fotomtrico
Semi-quantitativo Baseado na formao de cogulo Quantitativo Mtodo turbidimtrico Mtodo cromognico
MTODO DA COAGULAO EM GEL

o procedimento mais simples e amplamente usado para deteco de endotoxinas. Volumes iguais de reagente LAL e da soluo a ser analisada so transferidos a tubos de ensaio. A mistura homogeneizada incubada em banho de gua a 37oC por uma hora. O ponto final da reao facilmente verificado pela remoo dos tubos e inverso a 180. A presena do gel que se mantm slido durante a inverso considerada positiva para endotoxinas.
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MTODO DA COAGULAO EM GEL

Proenzima
Endotoxina
Enzima ativada
Coagulognio
Coagulina
Formao de gel
MTODO TURBIDIMTRICO
Proenzima
Endotoxina
Enzima ativada
Coagulognio
Coagulina (turbidez)
Leitura em 340nm
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MTODO CROMOGNICO
Proenzima
Endotoxina
Enzima ativada
Coagulognio + substrato
Coagulina + p-nitroanilina
Leitura em 405nm

Os testes para endotoxinas devem incluir incubao de vrias concentraes de endotoxina padro para obter uma curva de calibrao.
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TESTE IN VIVO x TESTE IN VITRO

O ensaio de pirognio em coelhos tem a seu favor a situao do envolvimento de toda a reao fisiolgica do animal, constituindo um teste de segurana para os produtos injetveis, lquidos para infuso e perfuso, materiais cirrgicos e descartveis em geral. A desvantagem do teste in vivo ser mais susceptvel a interferncias, principalmente dos animais.
TESTE IN VIVO x TESTE IN VITRO

O teste in vitro especfico para endotoxinas bacterianas, mas no avalia os demais pirognios exgenos, tais como alguns frmacos, esterides e fraes do plasma. A principal vantagem do teste in vitro permitir a quantificao ou estabelecimento de limites para as endotoxinas, podendo ser empregado na avaliao dos processos de despirogenizao da indstria farmacutica.
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LEITURA RECOMENDADA
PINTO, T.J.A.; KANEKO, T.M.; PINTO, A.F. Controle Biolgico de Qualidade de Produtos Farmacuticos, Correlatos e Cosmticos. So Paulo: Atheneu, 3 ed., 2010. Captulo IX Pirognio e Endotoxina Bacteriana.
LEITURA RECOMENDADA
Disponvel em: www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/index.htm Volume 1 item 5.5.2.1 (Pirognios) e 5.5.2.2 (Endotoxinas)

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Inativao da endotoxina Remoo da endotoxina

Teste in vivo Teste in vitro

TESTE DE PIROGNIO IN VIVO

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TESTE DE ENDOTOXINA IN VITRO

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MTODO DA COAGULAO EM GEL

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TESTE IN VIVO x TESTE IN VITRO

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