ELETROFORESE Monitor: Cristina Grumann A eletroforese uma tcnica de separao de partculas de acordo com sua carga eltrica e peso

o molecular. Permite a separao de fraes de molculas orgnicas como RNA, DNA, protenas e enzimas, pela migrao destas em um gel durante a aplicao de um potencial eltrico. O princpio da eletroforese utilizada para separao de DNA, por exemplo, baseiase na carga total negativa do DNA (dada pelos oxignios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da tcnica de PCR, podem ser separados pela aplicao de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estaro prximas ao polo positivo. Molculas de menor peso molecular tero mais facilidade de migrar pelo gel do que as de maior peso molecular, e percorrero uma distncia maior ficando mais prximas do plo positivo. Na tcnica, utiliza-se um cuba com dois compartimentos separados. Os eletrodos determinam os plos positivo e negativo em cada compartimento. Neles, coloca-se uma soluo salina que conduz eletricidade. Entre os compartimentos, ajusta-se o gel que deve ficar submerso. As amostras (de DNA, por exemplo) so colocadas com pipetas em pequenos poos no gel, que foram feitos com um pente durante a sua preparao. Antes, porm, elas so misturadas a um corante, chamado gel loading buffer. Esse corante uma soluo composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol) e glicerol e utilizado para aumentar a densidade das amostras, impedindo que elas saiam dos poos, alm de dar a colorao que serve como indicador do progresso eletrofortico. Para a migrao, aplicase voltagem e corrente eltrica ao sistema. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao, comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos so os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variveis e eqidistantes entre si, e que so aplicados em um poo no gel no incio do processo.

1. 2. 3. 4. 5.

Gel com 3 poos (S). Injeo dos ladders de DNA (marcadores de peso molecular) no primeiro poo. Injeo das amostras nos outros poos. Aplicao da corrente. O DNA se move em direo ao polo positivo. Fragmentos menores de DNA movem-se mais rapidamente do que os maiores. O DNA no visvel normalmente durante esse processo. Ento um corante adicionado para evitar que o DNA corra para fora do gel. Este corante tem um peso molecular menor do que o do DNA e corre mais rpido. 6. A eletroforese est terminada.

Eletroforese em gel de agarose Empregada rotineiramente para separao de cidos nuclicos. A agarose um polmero de elevado custo extrado de algas marinhas. Forma uma rede que segura as molculas durante a migrao. Dependendo da concentrao de agarose, tem-se uma diferena no gradiente de separao. Quanto maior a concentrao, maior a capacidade de distinguir fragmentos, ou seja, maior a definio. Os gis de agarose so, geralmente, corados com solues de brometo de etdio (EtBr), uma substncia intercalante que revela os cidos nuclicos ao fluorescer sob luz ultravioleta.

Foto de um gel de agarose corado com brometo de etdio e visualizado em um transluminador, aparelho que emite raios UV. As bandas podem ser identificadas como pequenas faixas fluorescentes.

Eletroforese em gel de poliacrilamida A poliacrilamida uma mistura de dois polmeros: acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida uma molcula linear, enquanto que a bisacrilamida em forma de "T". Misturando essas duas molculas, tem-se a formao de uma "rede". Diferentes relaes entre as concentraes dessa molculas permitem a criao de diferentes gradientes de separao. Para preparar um gel de poliacrilamida, deve-se misturar as duas substncias formadoras nas concentraes desejadas, coloc-las em um suporte de vidro, e adicionar Temed e S208, que atuam como catalizadores da polimerizao. A identificao dos produtos pode ser feita pelo brometo de etdio, mas o nitrato de prata mais utilizado. Tanto na eletroforese com gel de acrilamida como na com gel de agarose, a separao das molculas ter sua eficcia determinada tanto pela concentrao do polmero como pela intensidade da voltagem e amperagem aplicadas.