UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CINCIAS DA SADE CENTRO E CINCIAS NATURAI E EXATA-BIOFSICA

ELETROFORESE

Aline Marin, Brbara

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E&'iane Me(a%ri

San&a Maria, RS, Bra#il )**+

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ELETROFORESE
A eletroforese uma tcnica baseada na separao de partculas, que ocorre quando as mesmas so dissolvidas ou suspensas em um eletrlito, atravs do qual uma corrente eltrica aplicada. tambm usada na identificao de substncias, no estudo de homogeneidade de sistemas biolgicos e na determinao de pontos isoeltricos. sta tcnica consiste na migrao de molculas ioni!adas, em soluo, de acordo com suas cargas eltricas e pesos moleculares em campo eltrico. "olculas com carga negativa migram para o plo positivo #nodo$ e molculas com carga positiva migram para o plo negativo #c%todo$. Arne &iselus desenvolveu a eletroforese livre, para o estudo de protenas em soro #atravs do qual ganhou o 'remio (obel em )*+,$, um tipo de eletroforese em que as substncias a serem separadas esto em soluo ou suspenso, e que no emprega suporte. Este mtodo de soluo livre era bastante limitado devido a essas solu-es estarem su.eitas a uma srie de influ/ncias fsicas do ambiente que lhes causam perturba-es, tais como ondas mecnicas e at mesmo movimentos de conveco do lquido pelo aquecimento da soluo causado pela aplicao da diferena de potencial. stas perturba-es fa!em com que a eletroforese, nessas condi-es, se.a um processo muito pouco reprodutvel, com as cargas de mesma nature!a no migrando .untas, mas sim, dispersas. 'ara contornar esses problemas, desenvolveram0se sistemas em que tais perturba-es 1 eletroforese so minimi!adas. sses sistemas utili!am matri!es rgidas 0 conhecidas como suportes 0 com as quais a soluo interage e que diminuem as perturba-es mecnicas e os movimentos de conveco no lquido. 2istem diferentes meios0suporte, tais como papel de filtro, slica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. A eletroforese que utili!a suporte tambm conhecida como eletroforese de !ona, e foi iniciada por 34nig em )*56 #mesmo perodo em que a eletroforese livre era descrita por &iselius$ na separao de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meio0suporte, mas s mais tarde, em )*+7, foi retomada por "artin e colaboradores. 8ependendo do suporte que utili!amos para a eletroforese e da nature!a das macromolculas, podemos separ%0las mais com base na carga ou mais com base em seu tamanho. 9s suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as molculas com base no tamanho molar #sendo praticamente o :nico tipo de suporte para eletroforese utili!ado para a separao de fragmentos de %cidos nuclicos$. ;% a eletroforese em suporte de papel muito eficiente no que di! respeito a separao de partculas com grande diferenas de cargas, como por e2emplo a separao de protenas que, devido 1 variada composio de seus amino%cidos, apresentam grandes diferenas na carga total. m ra!o de algumas partculas serem substncias anfteras, ou se.a, capa!es de adquirirem carga positiva ou negativa em funo do p<, indispens%vel manter constante o p< do meio durante a eletroforese, pelo uso de solu-es0 tampo.

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9s principais tipos de eletroforese so= letroforese em gel letroforese capilar

,- ELETROFORESE EM

EL

uma tcnica de separao de molculas onde as partculas que so carregadas negativamente por um composto denominado >8> #detergente dodecil sulfato de sdio$, com e2ceo do 8(A que .% possui um car%ter de c%tion, migram em um determinado gel durante a aplicao de uma diferena de potencial em direo a um eletrodo positivo, sendo que este criado por uma corrente eltrica, e posteriormente so aplicadas sobre o gel. 'ara a separao das molculas nesta tcnica, temos que levar em considerao o tamanho da molcula, sendo que as de menor massa migram mais rapidamente do que as de maior, pois possuem mais agilidade de mobilidade. m alguns casos o formato da molcula tambm influencia, pois dependendo do formato as mesmas tero mais facilidade de migrar pelo gel. importante ressaltar que a eletroforese utili!ada normalmente para a separao de protenas e molculas de 8(A e ?(A. ,-, SUBDIVIS.ES DA ELETROFORESE EM ,-,-, ELETROFORESE EM EL/

EL DE A AROSE

A agarose um polissacardeo composto por agar e pectina. 'ara preparar este gel, simplesmente fa!0se a mistura entre o p de agarose e soluo tampo. Aps fundir, coloca0se brometo de etidium, que tem ampla afinidade pelo 8(A, e revela sobre presena de @A#ultra violeta$ os Bcidos nuclicos. Cuando a mistura esfriar o gel estar% duro. sse endurecimento feito em um local apropriado, o mesmo local onde ser% feita a corrida da amostra. @m detalhe importante a colocao do pente no gel durante o endurecimento. 9 pente cria poos que sero utili!ados para a colocao das amostras. 'odemos ver este processo como uma corrida. Dada um colocado numa pista e na presena de uma corrente eltrica vai dei2ando o seu rasto. >o estes rastos que sero comparados no mtodo. 9 gel de agarose e usado pois tem uma maior e2tenso de separao para fragmentos longos de 8(A# identifica os %cidos nuclicos presente neste$. 9 tamanho e a conformao da molcula de 8(A, a concentrao do gel de agarose , a corrente eltrica aplicada e tipo de tampo usado influenciam a velocidade da partcula no gel.

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,-,-) ELETROFORESE EM EL DE 0OLIACRILAMIDA

A poliacrilamida uma mistura de dois polmeros, acrilamida e bisacrilamida. 'ara preparar este gel, basta adicionar os dois polmeros nas concentra-es dese.adas em um suporte de vidro e na presena de um catalisador. sta tcnica utili!ada, pois o gel poliacrilamida tem a capacidade de separar fragmentos muito pequenos de 8(A e que apresentam uma mnima diferena de massa, alm disso o gel pode recuperar e purificar determinada amostra. Apesar das vantagens, o gel de agarose mais utili!ado pois a poliacrilamida muito t2ica e difcil de ser preparada. (este tipo de gel a corrida feita em cubas verticais, e o carante utili!ado o mesmo da eletroforese em gel de agarose. 2istem dois tipos de gel de poliacrilamida= De#na&$ran&e= separa e purifica fitas simples de 8(A, e convenciona desnaturante pois e polimeri!ado pela uria. N1! %e#na&$ran&e/ separa e purifica fitas duplas de 8(A.

)- ELETROFORESE CA0ILAR
A eletroforese definida como o transporte, em soluo eletroltica, de compostos carregados eletricamente sob a influ/ncia de um campo eltrico, no qual a separao entre dois solutos ocorre de acordo com diferenas entre suas mobilidades eletroforticas. sta tcnica que foi introdu!ida em )*,), por ;orgenson e EuFacs e tem sido aceita cada ve! mais, como um importante mtodo analtico. m sua forma mais simples a eletroforese capilar uma apro2imao da tcnica original, descrita por &iselius para o estudo de protenas em soro, porm emprega0se um tubo capilar, preenchido com um eletrlito, tendo como principal vantagem o uso de capilares com dimetros internos e2tremamente pequenos #na fai2a de )G0)HHI Jm$ permite uma melhor dissipao do calor e, assim, possvel obter uma alta efici/ncia de separao com tempo redu!ido de an%lise. A eletroforese capilar uma tcnica aplic%vel na determinao de uma grande variedade de amostras, incluindo hidrocarbonetos arom%ticos, vitaminas hidrossol:veis e lipossol:veis, amino %cidos, ons inorgnicos, %cidos orgnicos, f%rmacos, catecolaminas, substncias quirais, protenas, peptdeos e muitos outros. @ma caracterstica que difere a eletroforese capilar das demais tcnicas a sua capacidade :nica para separar macromolculas carregadas eletricamente de interesse tanto em ind:strias de biotecnologia quanto em pesquisas biolgicas. @m e2emplo disso o pro.eto Kenoma <umano, que foi concludo recentemente, que teve como meta obter a seqL/ncia completa do 8(A humano e para isso foi necess%rio distinguir os diversos polinucleotdeos, com massas molares, por volta de MHH a GHH 8altons que diferiam entre si por um :nico nucleotdeo. >omente a eletroforese capilar tem resoluo suficiente para este tipo de separao. Alm disso, o 8(A humano contm cerca de tr/s bilh-es de nucleotdeos e as altas

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velocidades de an%lises, obtido pela eletroforese capilar, permitiram que milhares de nucleotdeos fossem seqLenciados em um :nico dia. )-, ELETROFORESE CA0ILAR EM 2ONA OU SOLU34O LIVRE A separao de ons a forma mais simples de eletroforese capilar e denominada eletroforese capilar em soluo livre ou em !ona. "uitos compostos podem ser separados rapidamente e facilmente por esta tcnica, pois a separao em nesta tcnica baseada nas diferenas nas mobilidades eletroforticas resultantes das diferentes velocidades de migra-es de espcies iNnicas no tampo, contido dentro do capilar. C!"! F$n5i!na e#& &65ni5a/ 9 capilar preenchido com uma soluo tampo de composio constante, a qual est% presente tanto no nodo como no c%todo. m uma amostra tem0se uma mistura de espcies carregadas eletricamente e espcies neutras, onde os ons, apresentam tamanhos e cargas diferentes. A amostra introdu!ida na e2tremidade andica #nodo$ do tubo e, ao ser aplicada uma diferena de potencial entre as e2tremidades da coluna, os ons migram atravs do tubo com diferentes velocidades e em diferentes sentidos. A velocidade e o sentido de migrao dependem do tamanho e da magnitude de carga de cada on. 8eve ser ressaltado que as espcies neutras no sofrem influ/ncia do campo eltrico e por isso migram con.untamente. (a eletroforese capilar de !ona, alm dos solutos, a soluo tampo, normalmente, move0se atravs do capilar sob o efeito de um campo eltrico # ste fenNmeno denominado flu2o eletroosmtico ou eletro0endosmtico$. 8urante uma operao convencional, o flu2o eletroosmtico origina0se no nodo e dirige0se ao c%todo devido 1 formao de uma dupla camada iNnica que ocorre na interface entre o capilar de slica fundida e a soluo nele contida. 9s grupos silanis presentes na superfcie do capilar so %cidos fracos que se ioni!am a partir de p< 50+ #estando totalmente ioni!ados em meio alcalino$, criando uma superfcie carregada negativamente. sta camada negativa na superfcie atrai para sua pro2imidade as espcies carregadas positivamente da soluo, formando uma camada positiva, a qual ser% mobili!ada pela presena do campo eltrico. A atrao dessa camada pelo c%todo arrasta a soluo do interior da coluna, criando assim um flu2o com perfil reto, em contraste com o perfil parablico que criado em sistemas pressuri!ados. 9 flu2o eletroosmtico proporciona duas grandes vantagens, sendo que a primeira delas que c%tions e nions podem ser separados numa :nica an%lise, e a outra vantagem que mesmo os ons com ra!-es cargaOraio muito diferentes podem ser analisados em um tempo relativamente curto devido 1 magnitude este flu2o. 9 p< da soluo tampo um dos parmetros que afeta fortemente a separao em eletroforese capilar em !ona, pois este parmetro afeta tanto o flu2o eletroosmtico, quanto a mobilidade eletrofortica dos analitos. Psto, tendo em vista 1 medida que o p< elevado tem0se um aumento do flu2o eletroosmtico, pois ocorre um aumento da dissociao dos grupos >i09< que se encontram nas paredes internas do capilar. 9 flu2o eletroosmtico tambm afetado pela concentrao do tampo e pela fora iNnica mas, sobretudo, pelo p<. (o que se refere ao controle da seletividade da separao dos analitos, a variao do p< afeta

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o grau de ioni!ao dos analitos e, portanto, suas mobilidades eletroforticas. (ormalmente, o tampo escolhido para promover a melhor separao entre os analitos e no necessariamente a velocidade eletroosmtica mais adequada . A an%lise qualitativa feita atravs da comparao dos tempos de migrao dos padr-es com os tempos de migrao das substncias presentes na amostra eOou atravs de espectros de @AOAis #detector por arran.o de diodos$ ou do espectro de massas #detector espectrNmetro de massas$. A quantificao das substncias, com concentra-es desconhecidas, presentes na amostra, feita atravs do procedimento usual de calibrao= ,- Pn.eo de solu-es dos padr-es de concentra-es conhecidasQ )- 9bteno das respostas do detector para cada composto, em funo da altura, %rea ou %rea dividida pelo tempo de migraoQ 7- Donstruo da curva analtica #resposta do detector versus concentrao$Q 8- Pn.eo das amostrasQ 9- 9bteno das respostas do detector para as amostrasQ :- Cuantificao das substncias atravs das curvas analticas. )-) ELETROFORESE CA0ILAR EM EL

A separao de biomolculas grandes, tais como 8(A, por D>E, 1s ve!es muito difcil de se obter devido 1 similaridade nas ra!-es massaOcarga. Assim D>E muitas ve!es no suficiente para separar estes tipos de substncias. @ma alternativa preencher o capilar com um gel, onde o principal mecanismo de separao est% baseado nas diferenas nos tamanhos dos solutos que migram atravs dos poros do polmero. sta tcnica denominada eletroforese capilar em gel. Rons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos. Alm disso, o gel serve como um meio anticonvectivo, minimi!ando a difuso dos solutos. le tambm previne a adsoro do soluto nas paredes do capilar e a.uda a eliminar a eletroosmose. A implementao da tecnologia para fabricao de capilares preenchidos com gel confrontou0se com v%rios problemas. 'rimeiramente, ocorria o fenNmeno de encolhimento do polmero durante o processo de fabricao no interior do capilar, o que gerava rupturas na estrutura final do gel. stas rupturas estruturais formavam bolhas de ar, que eventualmente causavam interrupo da corrente eltrica durante a eletroforese. 9utro aspecto relacionava0se com o uso de altas voltagens. (estas condi-es, o flu2o eletroosmtico era suficientemente forte para arrastar o gel para fora do capilar. 'or este motivo, o uso de agarose na fabricao de capilares foi logo descartado, porque alm do bai2o ponto de fuso, agarose contm grupos ioni!%veis, capa!es de gerar flu2o eletroosmtico. m )*,6, S. E. 3arger e A. >. Dohen apresentaram solu-es para ambos os problemas, descrevendo, a fabricao detalhada de capilares preenchidos com gis fisicos. 9 mtodo de 3arger e Dohen consiste num pr0tratamento do capilar com o reagente de dupla finalidade= eliminar o flu2o eletroosmtico atravs de uma ligao covalente com os grupos da superfcie capilar e evitar a e2truso do gel durante operao do sistema, atravs da ligao covalente com o gel a ser formado na etapa seguinte. 9 capilar ento preenchido com uma soluo tamponada e com catalisador. As e2tremidades do capilar so imersas em soluo tampo e a polimeri!ao do gel ocorre, aps algumas horas.

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@ma das principais vantagens de reali!ar separa-es eletroforticas em um capilar que o seu formato possibilita a dissipao eficiente do calor gerado pelo efeito ;oule. m DK , esta vantagem duplamente verificada, em ra!o da geometria do capilar e das propriedades anti0convectivas do gel. )-)-, ELETROFORESE DE CIDOS NUCLICOS 'or meio dessa tcnica possvel separar molculas em funo da sua massa #tamanho$, forma e compactao. &rata0se de uma tcnica r%pida, sensvel e precisa. A molcula em questo, por e2emplo o 8(A, migra em suportes #gis de agarose ou acrilamida$ por ao de uma corrente eltrica, com diferentes velocidades, dependendo do seu tamanho e forma. Cuando submetido a um campo eltrico, as molculas de 8(A migram para o plo positivo, pois so carregadas negativamente, e como fora oposta 1 migrao e2iste o atrito com o suporte #gel$. Cuanto maior a molcula, maior o atrito e mais lenta a migraoQ portanto, molculas de tamanhos diferentes tero migrado uma distncia diferente depois de algum tempo. A distncia que o fragmento percorreu a partir do ponto de aplicao comparada com a distncia que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. 9 8(A pode ser visuali!ado na presena de compostos intercalantes, sendo que o mais utili!ado o brometo de etdio. m presena desse composto, o 8(A emite fluoresc/ncia por e2posio 1 lu! @A e, assim, molculas de um mesmo tamanho so visuali!adas em um mesmo ponto do gel, formando uma fai2a fluorescente. >e na amostra submetida 1 corrente eltrica e2istir mais de um tamanho de molcula, estas sero separadas na migrao e, ento, sero visveis bandas em diferentes locali!a-es do gel. Sasicamente, duas matri!es slidas so utili!adas atualmente para eletroforese= gis de agarose e gis de acrilamida. A escolha do tipo de gel depende do tamanho do fragmento e da diferena de tamanho de diferentes fragmentos de 8(A que se quer visuali!ar. As duas substncias formam tramas de poros de tamanhos vari%veis, possibilitando a separao dos fragmentos, que ter% sua efici/ncia dependente da concentrao do polmero e da intensidade da voltagem e amperagem aplicadas. m qualquer um dos casos, estas substncias so dissolvidas numa soluo0 tampo eletroltica, obrigatoriamente a mesma que recobrir% o gel na cuba de eletroforese e possibilitar% a passagem de corrente eltrica #&ampo de Dorrida$. 'ara eletroforese de 8(A, normalmente utili!a0se o &S #&ris0Sorato 8&A$ e o &A #&ris0 Acetato 8&A$. Cuanto 1 aplicao das amostras no gel, importante ressaltar que antes disso, elas so misturadas a outra soluo #&ampo de amostra$, que tem como funo aumentar a viscosidade da amostra e assim impedir que esta comece a flutuar no tampo de corrida antes que a voltagem se.a aplicada no sistema. Alm disso, o tampo de amostra possui um corante que possibilita a visuali!ao do andamento da corrida. Apesar de sua versatilidade e relativo bai2o nvel de dificuldade de reali!ao, a eletroforese convencional tem a desvantagem de identificar os fragmentos apenas quanto ao tamanho e no quanto 1 seqL/ncia

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CONCLUS4O Ao trmino deste trabalho de pesquisa conclumos que a eletroforese um processo analtico de separao de misturas, cu.o principal agente o campo eltrico. ssa tcnica passou por evolu-es, com a introduo de um suporte como papel de filtro, slica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros. Atualmente o campo de aplicao da eletroforese tem sido amplamente difundido, devido % simplificao de aparelhagem utili!ada e tambm % disponibilidade de meios de suporte altamente purificados, o que veio diminuir em muito o tempo gasto na separao. As principais tcnicas de eletroforese so= eletroforese em gel, eletroforese capilar e capilar em gel. A tcnica de eletroforese capilar possui uma srie de vantagens, tais como a rapide!, versatilidade, um bai2o custo por an%lise, alto poder se separao #resoluo$ e um consumo mnimo de amostras, reagentes e solventes. Alm disso, oferece a possibilidade de automao e deteco on0line. ntretanto esta tcnica oferece algumas limita-es, pois no adequada para a determinao de compostos vol%teis, no0polares e de massa molar bai2a, os quais so melhores determinados por cromatografia gasosa. &ambm no muito adequada para a an%lise de polmeros no iNnicos de massa molar alta e no to sensvel quanto a cromatografia lquida de alta efici/ncia. A eletroforese de grande importncia para as ci/ncias, permitindo a separao e identificao de molculas de 8(A por meio da diferena de velocidade de migrao, identificao de pessoas em testes de paternidade pela comparao de 8(A, na ind:stria farmac/utica e at mesmo na agropecu%ria.

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