Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia do Piau- IFPI

Curso: Tecnologia em Radiologia

Disciplina: Biofsica
Mdulo: II Turno: Noite
Professor: Leudimar Ucha










CROMATOGRAFIA

Claudio Jos
Francisco Gilglaydson
Joyce Caroline
Ralph Andr




TERESINA-PI/FEVEREIRO DE 2014

INTRODUO

Os mtodos biofsicos de estudo correspondem a mtodos utilizados com
base no conhecimento fsico que se aplica na biologia, com o objetivo de obter
mtodos diagnsticos e de tratamento para o auxlio da Medicina e outras reas de
Sade. Existem trs tipos de mtodo de estudo para diagnstico:
Mtodos in vivo: usam o prprio paciente. Exemplos: fotografia, endoscopia,
densitometria ssea, tomografia computadorizada, radiografia, ultrassonografia e
ressonncia magntica.
Mtodos in vitro: usam uma mostra do paciente (sangue, fezes, urina, bipsia).
Exemplos:espectofotometria,centrifugao,eletroforese,microscopia,imunofluorescn
cia,radioimunoensaio,dilise,pHmetria e cromatografia.
Mtodos de eletrodiagnstico: usam-se os sinais eltricos vindos de algum local
do paciente para fazer um grfico. Exemplos: ECG, EEG, Holter, teste ergomtrico,
mapeamento cerebral e eletroneuromiografia.
A cromatografia uma tcnica relatada cientificamente h pouco mais de
cem anos e baseia-se na migrao de componentes de uma mistura entre duas
fases: a fase estacionria que retm elementos e a fase mvel que conduz a mistura
por meio de um soluto atravs da fase estacionria. uma tcnica que pode ser
utilizada para purificao de substncias, na deteco de substncias ou auxiliar a
separao de substncias indesejveis.
A cromatografia tem sido utilizada em diferentes reas do conhecimento. A
grande sensibilidade de tcnicas cromatogrficas possibilitou o seu uso de forma
rotineira em anlise de substncias em baixa concentrao, como no caso do
doping, controle de alimentos e medicamentos, contaminao ambiental, na
toxicologia entre muitas outras aplicaes (NAKASHIMA, 2005; ANVISA, 2012;
CHINCHOLE et al., 2012; GILBERT-LPEZ et al., 2012; XU et al., 2012).
Assim, visando ampliao do campo de conhecimento realizou se este
trabalho.Os mtodos biofsicos de estudo atuam como uma ferramenta
imprescindvel para o diagnostico mdico.

DESENVOLVIMENTO

A cromatografia um processo fsico de separao, no qual os componentes
a serem separados distribuem-se em duas fases: fase estacionria e fase mvel. Os
componentes a serem separados so distribudos entre duas fases, uma das quais,
estacionria e outra mvel atravs da primeira. A separao devida diferena de
constantes de distribuio de cada um dos componentes da amostra, ou seja,
diferenas como massa e carga eltrica so que favorecem a separao. As foras
que atuam no processo so foras eletromagnticas ou gravitacionais.
Em sua expresso mais simples, podemos definir a cromatografia como um
processo de anlise imediata por migrao diferencial dos componentes de uma
mistura, dentro do sistema cromatogrfico. Para melhor compreenso vrios
aspectos precisam ser abordados: histria, mecanismos nos processos
cromatogrficos, classificao, termos tcnicos, detectores e principais usos.
1)HISTRIA :
A cromatografia foi relatada pela primeira vez h pouco mais de 100 anos por
Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919). No perodo de 1899 1901 Tswett
trabalhou em sua primeira pesquisa com a estrutura fsico-qumica da clorofila das
plantas, sendo que no ano de 1903 relatou uma nova categoria de anlise adsortiva
(ETTRE, 2000). O trabalho de Tswett foi apresentado em forma de tratado para a
Sociedade de Cincias de Varsvia, no qual descreveu os resultados preliminares
de suas pesquisas com extrato de folhas, utilizando uma coluna de vidro recheada
com carbonato de clcio, separando os constituintes do extrato pela passagem de
ter dietlico (COLLINS, 2006).
No entanto, as denominaes de cromatografia e cromatograma somente
surgiram no segundo trabalho de Tswett, publicado em 1906. A palavra
cromatografia designava o processo de separao, tendo sua origem do grego
chroma, com o significado de cor, e tambm do grego graphe, significando
escrever. J a palavra cromatograma refere-se s bandas separadas na coluna
(COLLINS, 2006; NOGUEIRA, 2006)

Durante os cem anos que se seguiram da publicao de Tswett a
cromatografia passou por grande evoluo. Em decorrncia de a tcnica ser
baseada em duas fases (mvel e estacionria) e da possibilidade de utilizao de
diferentes componentes nestas fases, a cromatografia demonstrou sua grande
flexibilidade. O controle do fluxo da fase mvel por gravidade, presso, ao capilar,
eletro-osmose, aliado ao fato de o processo poder ser realizado em diferentes
temperaturas, permitiu que a tcnica de separao pudesse ser aplicada desde
pequenos tomos a grandes quantidades de substncias (ETTRE, 2000).
Assim, a evoluo da tcnica iniciou-se na cromatografia lquida de adsoro
seguida pela cromatografia de partio. Posteriormente surgiu a anlise de gases e
amostras vaporizadas, seguida pelas trocas inicas, separao por tamanho
molecular e eletrocromatografia (ETTRE, 2000).
Mais recentemente a cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) tem sido
a tcnica analtica mais desenvolvida, difundida e utilizada nos laboratrios de
anlises qumicas e farmacuticas. Desta forma, nos ltimos 40 anos muitos
avanos em relao a esta tcnica foram alcanados, impulsionados pelo
desenvolvimento contnuo de novas partculas de fase estacionria, capazes de
gerar colunas mais seletivas, eficientes e qumica e mecanicamente estveis
(MALDANER & JARDIM, 2009). A expanso da HPLC tem sido direcionada ao
desenvolvimento de anlises mais rpidas, sem o comprometimento do
desempenho cromatogrfico. Assim com a reduo do tamanho das partculas da
fase estacionria e das colunas, com partculas menores que 2 m, surgiu a
cromatografia lquida de ultra eficincia (U-HPLC), sendo esta uma das mais
recentes evolues da tcnica cromatogrfica (MALDANER & JARDIM, 2009).
2 ) MECANISMO ENVOLVIDOS NOS PROCESSOS CROMATOGRFICOS:

Adsoro: processo baseado em interaes eletrostticas,
dipolares ou pontes de hidrognio, que ocorrem entre grupos
ativos presentes na superfcie da fase estacionria slida e a
fase mvel.
Partio: quando a fase estacionria um lquido, espalhado
na superfcie de um suporte slido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo
interfacial, ocorrendo por absoro, ou partio, que se baseia nas diferentes
solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria.

Troca inica: a fase estacionria constituda de uma matriz
onde so adicionados grupos funcionais ionizveis; a fase mvel geralmente uma
soluo inica com propriedades tamponantes.

Bioafinidade: utiliza grupos funcionais ligados quimicamente
matriz estacionria, que possuam especificidade biolgica.

Excluso: baseia se em um processo puramente mecnico.
Os componentes presentes na fase mvel podem ser
separados porque os menores so capazes de penetrar
facilmente em todos os poros da fase estacionria, enquanto as maiores so
excludas, acompanhando a fase mvel.
3)CLASSIFICAO DE ACORDO:
Fase mvel: solvente (gs ou lquido) que se move atravs do sistema (coluna
ou placa), carregando os solutos.
Fase Estacionria: slido (ou lquido impregnado em um slido) que
permanece fixo no sistema (coluna ou placa).
3.1. Pela forma fsica do sistema:
Cromatografia planar: a fase estacionria suportada numa superfcie plana ou
nos interstcios de um papel. A fase mvel se move atravs da fase estacionaria por
efeito da capilaridade ou da gravidade; pode ser:
Cromatografia em papel
Cromatografia em camada delgada.

Cromatografia em coluna: a fase estacionria mantida dentro de um tubo, em
geral bastante estreito, dentro do qual a fase mvel forcada por efeito de presso
ou pelo efeito da gravidade; pode ser:
Cromatografia lquida clssica (CLC)
Cromatografia em fase gasosa (CG)
Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE ou HPLC)
3.2. De acordo com a fase mvel:
Fase mvel: Gs (He, H
2
, Ar, N
2
)
Cromatografia em fase gasosa.
Fase mvel: Lquido
Cromatografia lquida clssica
Cromatografia lquida de alta eficincia
3.3. De acordo em a fase estacionria:
Lquida
Slida
Lquido pouco voltil
4) De acordo com o modo de separao:
Por adsoro - A fase estacionria um slido e a fase mvel pode ser lquido ou
gs.
Por partio - A fase estacionria um lquido e a fase mvel tambm um
lquido.
Por troca inica - A fase estacionria (fase ligada) altamente carregada, com
solutos com cargas de sinais contrrios seletivamente adsorvidos da fase mvel.

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

A cromatografia em papel uma tcnica de partio lquidolquido, estando
um deles fixado a um suporte slido. Baseia-se na diferena de solubilidade das
substncias entre duas fases imiscveis (DEGANI et al. 1998; ETTRE, 2000). A
cromatografia em papel uma das tcnicas mais simples e que requer menos
instrumentos para sua realizao, sendo muito til para a separao de compostos
polares (PERES, 2002). Necessita de uma pequena quantidade de amostra,
proporciona uma boa capacidade de resoluo, proporciona a separao e
identificao de compostos polares, como antibiticos hidrossolveis, cidos
orgnicos e ons metlicos.
O papel composto por molculas de celulose que possuem afinidade pela
gua, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica, atuando como suporte inerte
contendo a fase estacionria aquosa (polar).


Figura 1.Cromatografia em Papel

CROMATOGRAFIA DELGADA

A cromatografia em camada delgada uma tcnica de adsoro lquido-
slido, na qual a separao se d pela diferena de afinidade dos componentes de
uma mistura pela fase estacionria (DEGANI et al., 1998). A CCD est embasada na
separao de substncias por meio das suas diferentes velocidades de migrao em
razo da afinidade relativa com solventes, fixando-se numa fase slida (XAVIER et
al., 2007). A CCD um mtodo simples, rpido e econmico, sendo a tcnica
predominantemente escolhida para o acompanhamento de reaes orgnicas
(DEGANI et al., 1998).
Neste mtodo a fase estacionria uma camada fina formada por um slido
granulado (slica, alumina e poliamida) depositado sobre uma placa que deve atuar
como suporte inerte. Na CCD gotas da soluo a ser separada so aplicadas em um
ponto prximo ao extremo inferior da placa. Aps a secagem da placa, ela
colocada em um recipiente contendo a fase mvel, de modo que somente sua base
fique submersa.O solvente (polares, apolares ou mistura de ambos -ex: gua,
etanol, metanol, clorofrmio, diclorometano, hexano, etc.) comea a molhar a fase
estacionria e sobe por capilaridade.Aps o deslocamento da fase mvel deixa-se a
placa secar, e posteriormente realizada a revelao da placa com reativos que
dem cor as substncias de interesse (PERES, 2002).



Figura 2.Instrumentos utilizados na CCD



Figura 3.Cromatografia CCD

Aplicaes:
-Estudos preliminares dos componentes de um extrato orgnico;
-Investigao de casos de envenenamento e ingesto de estimulantes por atletas;
-Estudos de reaes qumicas quanto presena de intermedirios estveis;
-Anlise da pureza de compostos;
-Anlise da eficincia de processos de destilao e cristalizao.

CROMATOGRAFIA LQUIDA CLSSICA
Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, de dimetros variados;a
coluna possuem uma torneira em sua extremidade inferior. Neste tipo de processo, a
fase estacionria colocada em um tubo de vidro (coluna cromatogrfica) colocado
na posio vertical. A coluna dotada de uma torneira na extremidade inferior (Fig.
4), que utilizada para controlar a vazo da fase mvel, que desce por gravidade.
Esses cilindros so preenchidos por um adsorvente colocado na coluna diretamente
ou suspendido em um solvente adequado.


Figura 4.Cromatografia lquida clssica

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA

A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) uma tcnica responsvel
por grandes avanos na rea cromatogrfica. A HPLC utiliza suporte com partculas
diminutas responsveis pela alta eficincia, sendo um mtodo adequado para
separao de espcies inicas e macromolculas (DEGANI et al., 1998). Devido
utilizao de colunas com grande capacidade de separao a realizao da HPLC
requer a utilizao de equipamentos especficos, com o uso de bombas e colunas
que suportem altas presses necessrias para eluio da fase mvel. Assim a
realizao da HPLC necessita da utilizao de um cromatgrafo composto de
bomba, coluna cromatogrfica, detector e registrador (DEGANI et al., 1998; PERES,
2002). Na HPLC a fase mvel deve ser um solvente que dissolva a amostra sem que
qualquer interao qumica ocorra entre ambas. A fase estacionria dever ser
compatvel com o detector, possuindo polaridade adequada para permitir a
separao adequada dos componentes da amostra. J a coluna cromatogrfica
deve ser confeccionada de material inerte e que resista a altas presses. Por fim os
detectores devem apresentar ampla faixa de aplicao, sendo que os mais utilizados
so os espectrais (PERES, 2002).
Recentemente a evoluo das colunas e da fase estacionria permitiu o uso
de partculas muito pequenas, desenvolvendo assim a cromatografia lquida de ultra
eficincia (U-HPLC). A U-HPLC um mtodo cromatogrfico com anlises mais
rpidas, consumo menor de solventes e com eficincia muito mais elevada que a
HPLC. No entanto, apesar de todas as vantagens da U-HPLC, o custo do
equipamento e a manuteno requerida devido a utilizao de condies extremas
de presso requer ainda maior desenvolvimento da tcnica (MALDANER & JARDIM,
2009).

Figura 5.HPLC

utilizada para:
-Qumica Forense (metablitos de drogas)
- Bioqumica (protenas, aminocidos, esterides).
- Cincias ambientais
- Alimentos (corantes artificiais, aflatoxicinas, aditivos, antioxidantes)
- Farmacologia (frmacos)
- Toxicologia (pesticidas)
CROMATOGRAFIA GASOSA

A cromatografia gasosa (CG) uma tcnica com alto poder de resoluo,
possibilitando a anlise de vrias substncias em uma mesma amostra.
Dependendo da substncia a ser analisada e do tipo de detector empregado pode-
se detectar cerca de 10-12g do composto por mL-1, o que permite que pequenas
quantidades da amostra sejam analisadas (PERES, 2002). Esta tcnica est
baseada na partio dos componentes de uma amostra entre a fase mvel gasosa e
a fase estacionria lquida ou slida, que propiciam a separao da mistura por meio
de processos fsicos e qumicos (DEGANI et al., 1998; PERES, 2002). A grande
limitao deste mtodo a necessidade de que a amostra seja voltil ou
termicamente estvel (PERES, 2002).


Figura 6.Cromatgrafo a gs
utilizada para: indstria petroqumica, alimentos e bebidas, biocidas,
medicamentos e meio ambiente.
4. DETECTORES:
um dispositivo que indica os componentes separados pela coluna.
Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem de substncias
que foram separadas. H 3 tipos:
Universais geram um sinal para qualquer composto.
Seletivos geram um sinal apenas para compostos com determinadas
caractersticas.
Especficos geram um sinal para compostos que tenham um determinado
elemento na sua estrutura.

5. PRINCIPAIS UTILIZAES DA CROMATOGRAFIA:
A cromatografia tem sido utilizada em diferentes reas do conhecimento. A
grande sensibilidade de tcnicas cromatogrficas possibilitou o seu uso de forma
rotineira em anlise de substncias em baixa concentrao, como no caso do
doping, controle de alimentos e medicamentos, contaminao ambiental, na
toxicologia entre muitas outras aplicaes (NAKASHIMA, 2005; ANVISA, 2012;
CHINCHOLE et al., 2012; GILBERT-LPEZ et al., 2012; XU et al., 2012).
A qumica a rea na qual as tcnicas cromatogrficas so mais utilizadas,
sendo muitos os trabalhos publicados que a empregam. Pode ser utilizada para
dosar compostos em alimentos (GILBERT-LPEZ et al. 2012; XU et al., 2012), no
monitoramento de componentes txicos no meio ambiente (MARRIOTT et al., 2003)
ou mesmo na indstria petroqumica (MHLEN et al., 2006). Dessa forma difcil
definir em qual rea dentro dessa cincia que mais se utiliza das tcnicas
cromatogrficas.
Na rea farmacutica a cromatografia tambm tem vasto campo de utilizao.
Pode ser empregada para dosar princpios ativos de drogas em medicamentos
(ANVISA, 2012), isolar componentes medicinais de plantas (L et al., 2012), auxiliar
em estudos de farmacocintica (AMORIM et al., 2008; GIORGI et al., 2009), validar
tcnicas de identificao de agentes (AMORIM et al., 2008), entre inmeros outros
usos. Na medicina a cromatografia utilizada para realizao de exames anti-doping
(NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012), monitorar nveis de drogas em
pacientes que estejam em tratamento (VERDIER et al., 2012), realizar diagnstico
de enfermidades (JELLUM, 1988; JEONG et al., 2009), em estudos forenses e na
toxicologia (NAKASHIMA, 2005; CHINCHOLE et al., 2012).
Na medicina veterinria a cromatografia tem a possibilidade de ser utilizada
em diversos meios, como em estudos de farmacocintica (AMORIM et al., 2008),
para monitorar resduos de drogas em produtos de origem animal (CARDOSO et al.,
1999; FELTRIN et al., 2007; ANVISA, 2009), na toxicologia (KAISER et al., 2010;
OLIVEIRA-FILHO et al., 2010; LEE et al., 2012), entre outros.


CONCLUSO
O uso da cromatografia abrange muitas reas do conhecimento, e suas
funcionabilidades so inumerveis. Os trabalhos envolvendo essas tcnicas
multiplicam-se dia a dia, o que torna difcil acompanhar sua evoluo nas diferentes
reas.
Apesar da grande utilidade da cromatografia, os equipamentos empregados
nas tcnicas mais modernas tm alto custo e demanda de pessoal especializado
para oper-los. Assim o uso dessas tcnicas fica restrita e muitas vezes h a
impossibilidade de realiz-las, e por vezes diagnsticos toxicolgicos no podem ser
estabelecidos com preciso.
Por fim, a cromatografia constitui um mtodo biofsico em ampla expanso no
mundo do conhecimento .
















REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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NOGUEIRA, J. M. F. Mikhail S. Tswett: Um legado para a cromatografia
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