UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN SETOR DE TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA

OTIMIZAO DE PARMETROS EM PROCESSOS FERMENTATIVOS

Trabalho acadmico apresentado disciplina Processos Fermentativos Industriais da Universidade Federal do Paran.

CURITIBA 2008

SUMRIO

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

INTRODUO ..................................................................................................... 2 MTODO CLSSICO .......................................................................................... 4 MTODO SIMPLEX ............................................................................................. 7 MTODO DE PLACKETT-BURMAN ................................................................ 13 SUPERFCIE DE RESPOSTA ........................................................................... 17 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 25 ANEXOS ............................................................................................................ 27

1. INTRODUO

A maioria dos estudos na rea de bioprocessos envolve o entendimento do mecanismo de produo, para selecionar o melhor biocatalisador (microrganismo ou enzima), as melhores condies ambientais que propiciam um melhor rendimento, a procura de recursos mais econmicos, mas que ainda produzam um rendimento satisfatrio. O estudo de um processo fermentativo envolve tambm o

desenvolvimento de uma estratgia de otimizao, obtendo-se assim um melhor rendimento do produto. A otimizao pode ser feita ajustando vrias etapas do processo, sendo algumas delas mais facilmente modificadas do que outras. So geralmente mexidos em alguns dos parmetros relacionados com os quatro pilares da fermentao: no microrganismo, no substrato, nas condies operacionais, e nos processos de recuperao do produto. O microrganismo pode ser melhorado atravs de tcnicas melhoramento de cepas. Espcies encontradas na natureza normalmente no produzem grandes quantidades de metablitos, e por isso muitas vezes necessrio melhorar essa produo para poder aplic-la em escala industrial atravs da seleo de variantes naturais, da exposio de microrganismos a agentes mutagnicos, ou da introduo de material gentico recombinante. O substrato pode ser modificado de forma a fornecer de maneira tima e econmica os nutrientes necessrios para o crescimento e a produo de metablitos. No entanto, nessa mudana deve respeitar a fisiologia do

microrganismo e suas necessidades nutricionais e fsico-qumicas. O meio de cultivo tambm pode ser modificado de forma a induzir um tipo de produo no microrganismo. Por exemplo, quando se deseja produzir biomassa, necessrio fornecer elementos que favoream o crescimento, como a aerao, mas no caso da produo de um metablito especfico, necessrio fornecer substratos que favoream determinada via e reprimam a produo de metablitos indesejveis. A determinao da concentrao adequada de substratos e o tipo utilizado podem implicar na realizao de muitos experimentos. Para auxiliar nesse caso, so utilizadas ferramentas estatsticas de planejamento experimental e anlise de dados. As condies operacionais do processo envolvem a aerao, o controle do pH, a temperatura e a agitao. Elas podem ser todas controladas dentro de um biorreator, e necessrio achar a condio tima para cada microrganismo.

Os processos downstream de recuperao do produto podem ser otimizados atravs da anlise das operaes unitrias realizadas e escolha das que fornecem um melhor rendimento e menor custo. Os pilares que podem ser modificados e necessitam de um planejamento experimental amplo e anlise estatstica so o substrato e as condies operacionais. Por exemplo, no caso da seleo de um substrato timo, alm da escolha do tipo de substrato empregado (que uma varivel discreta), necessrio determinar o nvel ou quantidade utilizado (que uma varivel contnua). Alm da anlise de dados, a rea de planejamento experimental de extrema importncia no ramo da estatstica. Quando o planejamento no feito de maneira adequada, pode-se obter uma grande quantidade de resultados estreis dos quais no possvel tirar nenhuma concluso. Um bom planejamento consiste em projetar o experimento eficaz construindo planos de trabalho que sejam capazes de fornecer exatamente o tipo de informao que procuramos e os dados obtidos possam ser analisados para produzir concluses vlidas e objetivas. O planejamento deve maximizar a quantidade de informao que pode ser obtida de uma dada quantidade de experimentos. Para isso, preciso saber primeiramente o que se deseja determinar e quais os fatores que influenciam a varivel independente. O delineamento dos objetivos e a seleo dos fatores envolvidos no processo so feitos geralmente com um modelo de processo do tipo black box (Figura 1) . Ele relaciona as variveis discretas, as variveis contnuas, os fatores que podem ser controladas e aqueles no podem ser ajustados. Cada um dos fatores que podem ser variados pode gerar ou no um resultado diferente. Em casos de poucas informaes sobre os fatores, necessrio obter conhecimento atravs de pesquisas bibliogrficas de trabalhos j realizados ou experincia prtica com outras pessoas. Nessa etapa feita uma triagem das variveis e descarte daquelas que no so significativas para o processo. Aps isso, ento possvel se dedicar otimizao propriamente dita, ou seja, procurar a combinao dos valores dos fatores selecionados que resultem na melhor resposta. Um processo de otimizao geralmente envolve as seguintes etapas: realizao de experimentos de varredura para caracterizar as variveis do sistema, usando um planejamento fatorial; localizao da regio tima ou ideal usando o mtodo simplex;

certificao e/ou ajuste fino da regio tima, usando planejamento fatorial e/ou superfcie de respostas, dependendo de quo apurados se desejam os resultados.

Figura 1- Definio dos fatores envolvidos.

Fonte: NIST / SEMATECH.

2. MTODO CLSSICO

O mtodo clssico, ou tambm chamado no ingls de mtodo de onevariable-at-a-time, consiste na anlise de uma varivel de cada vez. Isso feito atravs da variao de uma varivel enquanto todas as outras so mantidas como constantes. Otimizao pelo mtodo clssico pode ser extremamente laboriosa, cara e consumir muito tempo quando h muitas variveis. Para fazer uma anlise de todas as possibilidades possveis, ser necessrio examinar cada combinao da varivel independente em nveis apropriados, gerando xn experimentos, onde x o nmero de nveis e n o nmero de fatores.

Essa tcnica perfeitamente vivel para trs nutrientes em duas concentraes (2 3 ensaios), mas no para seis nutrientes em trs concentraes (729 ensaios). Esse mtodo de anlise proporcionar somente resultados discretos e no podero existir interaes entre variveis. A Figura 2 apresenta os resultados do mtodo clssico quando utilizado em variveis que apresentam alguma relao. A condio tima obtida foi de 85%, longe do rendimento timo verdadeiro que poderia ser obtido de 90% para esses dois fatores. Para encontrar as melhores condies, teria sido necessrio repetir o mtodo clssico em cada etapa, a fim de verificar que o verdadeiro timo foi atingido. Isto exige muitas experincias seqenciais, uma longa demorada e trabalho excessivo.

Figura 2- Exemplo de anlise de clssica e linhas de contorno do rendimento real.

Fonte: VOGEL & TODARO, 1997.

Em resultados que se comportam na forma de cristas o timo poder no ser alcanado, como apresentado na superfcie da Figura 3. No exemplo, toma-se x2 constante e varia-se x1 ao longo do segmento AB e suas extenses encontra-se um timo em B. A presena da crista que cresce para o nordeste no ser detectada e B ser falsamente aceito como timo real. Devemos salientar que quanto maior a interao entre as variveis, maior ser a probabilidade de localizao de um falso

timo. Portanto, o esse mtodo univariado muito bom para sistemas onde as variveis otimizadas so independentes.

Figura 3- Falha do mtodo na presena de cristas.

Fonte: < www.chemkeys.com >

Devido complexidade do metabolismo microbiano, interaes entre as variveis so inevitveis, especialmente quando se utilizam substratos comerciais que so uma mistura complexa de muitos nutrientes. Para suprir a necessidade desses experimentos e executar um menor nmero de anlises para determinar as condies timas, foram desenvolvidos outros mtodos de planejamento

experimental que permitem encontrar os resultados desejados de maneira rpida e eficiente. O artigo em ANEXO 1 mostra uma anlise de um fatorial completo da ao de duas variveis em dois nveis, gerando 2 2 experimentos, na ao da atividade de uma enzima imobilizada. Observou-se a concentrao de Cd+ em 0,05mM e 0,1mM, e o tempo de interao do on com a enzima (5 minutos e 50 minutos) na atividade de urease vegetal. A partir dos resultados tambm foi construda uma superfcie de resposta, cuja metodologia ser discutida mais frente.

3. MTODO SIMPLEX

O mtodo simplex baseado nas tcnicas desenvolvidas por Spindley et al. (1962). Esse mtodo consiste em seguir um caminho em direo s condies timas ao longo da superfcie de resposta, a qual pode no ser conhecida, encontrando a direo que deve ser seguida. Esse mtodo tenta otimizar n variveis fazendo inicialmente n+1 experimentos. Os resultados deste conjunto inicial de ensaios so ento utilizados para prever as condies do prximo experimento e a situao se repete at que a combinao tima atingida. Assim, aps o primeiro conjunto de experimentos a otimizao prossegue com experimentos individuais. A previso feita atravs da representao grfica dos ensaios, onde as variveis esto presentes nos eixos, sendo que nesse mtodo so as variveis que so plotadas, e no os resultados do experimento. As primeiras condies experimentais so escolhidas de forma que os pontos sobre o grfico formem os vrtices de um poliedro descrito como simplex. Dessa forma, o simplex em zero dimenses um ponto (no tendo ento direes para onde se mover, pois no tem nenhum grau de liberdade), em uma dimenso um segmento de reta (permitindo a movimentao em somente uma direo), em duas dimenses um tringulo, e em trs dimenses um tetraedro (Figura 4). Quando so utilizadas dimenses superiores no possvel a representao grfica, mas seu clculo possvel atravs de tcnicas de lgebra, sendo que o simplex nesse caso chamado de hipertetraedro. Alguns autores afirmam que o simplex necessariamente deve ser um tringulo eqiltero, mas isso no verdade, pois segundo WALTERS et al (1991) ele pode assumir qualquer forma. Por ser mais fcil de se visualizar, ser utilizado o exemplo do tringulo eqiltero na determinao da condio tima de concentrao de carbono e nitrognio para um determinado processo.

Figura 4- Tipos de simplex dependendo da dimenso.

Fonte: WALTERS et al., 1991.

Os resultados do primeiro conjunto trs experimentos so ento utilizado para prever o prximo experimento. O primeiro conjunto de experimentos vrtices A, B e C so trs condies testadas (Figura 5). Os resultados dos trs experimentos so avaliados e a pior resposta pode ser identificada, sendo que nesse caso a pior foi na condio A. O desenho do simplex ento usado para determinar a prxima experincia. O novo tringulo eqiltero BCD construdo no lado oposto pior resposta (A) usando os vrtices j existentes B e C. Faz-se uma reflexo do ponto A com relao linha BC e projeta-se o ponto D, que estar mesma distncia dos pontos B e C. A reflexo nas outras dimenses est exemplificada na Figura 6. Na realizao da reflexo muitas vezes utilizam-se os termos centride do simplex para designar o centro de massa de todos os vrtices do simplex e centride da hiperface restante para o centro de massa dos vrtices aps a retirada do pior ponto. Esse ltimo centride aquele sobre o qual a reflexo do pior ponto passa, e ele est indicado na Figura 5.

Figura 5- Mtodo simplex.

Fonte: STANBURY, 1995.

Figura 6- Reflexo do vrtice.

Fonte: WALTERS et al., 1991.

Aps a realizao de uma srie de reflexes dos pontos de menor resultado, consegue-se chegar condio tima. Neste ponto o simplex comea a realizar crculos sobre ele mesmo, indicando a melhor concentrao foi atingida. Quando faz a reflexo e o novo vrtice exibe uma resposta menor, o simplex ir reincidir sobre o anterior, travando o movimento no sentido da otimizao. Neste caso, o deve-se fazer um novo simplex no lado oposto da condio que apresentar o segundo menor valor.

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Existem algumas modificaes desse mtodo, como a discutida por Nelder e Mead em 1965. Nessa modificao, se for decidido que o suposto ponto timo poderia ser alcanado de forma mais rpida se a distncia z da Figura 5 fosse aumentada, ento se pode normalmente expandida por um fator de 2. Se for conhecido que o ponto timo se encontra prximo, possvel diminuir a distncia z por um fator de 0,5, realizando uma contrao. Como exemplo, temos na Figura 7 um simplex inicial com vrtices B, N e W. Supondo que W o vrtice que fornece a pior resposta, B a melhor resposta e N a segunda pior resposta, pode-se fazer o mtodo simplex convencional e chegar no ponto R atravs da equao: P = Pc + b (Pc - W) P = vrtice para movimentao do simplex. Pc= centride. W = vrtice correspondente a pior resposta. b = coeficiente de movimentao do simplex.

Figura 7- Simplex modificado.

Fonte: < www.chemkeys.com >.

No mtodo simplex bsico, o nico valor permitido para movimentao do simplex b = 1, correspondente reflexo, gerando o vrtice R. Entretanto, para o mtodo modificado outros valores so permitidos e definidos aps cada observao da resposta em comparao com as respostas obtidas nos vrtices originais representados por B, N e W. Existem quatro possibilidades em relao resposta obtida em R a serem consideradas, as quais geram as seguintes regras de movimentao do simplex modificado:

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Se a resposta em R for melhor do que a resposta em B, indica que o simplex est caminhando na direo correta. Deve-se realizar uma expanso do simplex inicial. Fazendo b = 2 dobra-se o tamanho do simplex na direo desejada e realiza-se o experimento em S. Se a resposta em S for melhor que as anteriores, o novo simplex ser SBN.

Se a resposta em R for pior do que em W, significa que o simplex alm de no estar caminhando na direo correta, est com tamanho inadequado. Deve-se realizar uma contrao com mudana de direo do simplex RNB, gerando o vrtice T, para o qual b = - 0,5. Se a resposta em T for melhor do que em W, o novo simplex ser BNT.

Se a resposta em R for pior do que em N, mas melhor do que em W, significa que o simplex est grande demais, mas na direo correta. Fazse uma observao em U (b = 0,5). Se a resposta em U for intermediria a B e N, o novo simplex ser BUN, ou seja, fez-se uma contrao.

Se a resposta em R for intermediria a B e N, estas operaes no so recomendveis e o novo simplex ser BRN, procedendo-se como no caso do simplex bsico.

Quando os recursos adicionais de movimentao para o simplex (MSM) se mostrarem falhos (principalmente a contrao), isto , o simplex no se mover, recomenda-se uma reduo do simplex, tambm chamada de contrao macia. Conserva-se o vrtice B do simplex e faz-se novas observaes para determinar os outros novos vrtices N' e W' , representados na Figura 8 e determinados como segue: N' = (B + N) e W' = (B + W) 2 2

A idia, embora efetiva, sofre duas desvantagens distintas. Primeira, ela requer a avaliao de k novos vrtices do simplex reduzido para que o processo de otimizao possa continuar (onde k o nmero de fatores do procedimento em otimizao). Segunda, o tamanho do simplex cada vez que ocorre uma contrao macia reduzido e isto pode resultar na convergncia prematura do simplex na presena de erro experimental.

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Figura 8- Contrao macia do simplex.

Fonte: < www.chemkeys.com >.

Outras modificaes foram feitas por Brissey (1979), Keefer (1973), Nelson (1973), Burley (1973), Deming (1978) e Ryan (1980). Esse mtodo de otimizao tem algumas limitaes. Em primeiro lugar, devido sua natureza iterativa, um processo lento, podendo exigir muitos passos. Em segundo lugar, fornece apenas informaes limitadas sobre os efeitos das variveis. Aps a concluso do processo, apenas uma parte limitada da regio da superfcie ser explorada e, por conseguinte, ter-se- somente informaes mnimas sobre o efeito das variveis e suas interaes. Alm disso, o mtodo chega somente ao ponto timo mais prximo, no sendo conhecido se este ponto um mximo local ou um mximo absoluto para todo o processo. Apesar das limitaes, o mtodo extremamente importante na otimizao de uma tcnica, pois ele robusto, pode lidar com muitas variveis ao mesmo tempo, e sempre ir conduzir a uma condio tima. Alm disso, devido sua natureza iterativa, precisa-se conhecer pouco sobre o sistema antes de iniciar o processo. O mais importante o fato de que ele pode ser til na otimizao em grande escala, pois no cabvel realizar condies de funcionamento que resultem em baixo rendimento, e essa tcnica possibilita a melhora do processo a cada passo da otimizao do sistema. A principal dificuldade em utilizar o mtodo nessa escala a execuo dos experimentos iniciais, pois os gerentes muitas vezes no esto dispostos em produzir em condies menores que as timas. O sucesso da tcnica e a facilidade da sua utilizao dependem principalmente da escolha dos pontos iniciais. Se eles estiverem longe do ponto de resposta mxima e relativamente prximos uns dos outros, ento sero necessrios

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vrios passos at se chegar ao ponto ideal. O tamanho da variao de ser escolhido de forma que seja possvel observar efeito significativo entre os dois pontos, mas tambm no pode ultrapassar o ponto timo. Um segundo elemento a ser considerado magnitude efeitos. Se uma varivel medida ao longo de um intervalo de 0,1 a 1,0 enquanto outra medida ao longo de um intervalo de 1 a 100, a diferena entre a magnitude das variveis pode afetar o simplex. Pode-se utilizar fatores de escala para que todas as variveis sejam mantidas dentro da mesma ordem de grandeza. Na fase inicial dos experimentos, aconselhvel construir um simplex grande para que o mesmo se mova rapidamente sobre a superfcie de respostas e possa localizar a regio de timo. Para definir mais precisamente o timo, constri-se, ento, um simplex menor e continua-se a otimizao. Caso seja necessrio, possvel repetir o processo, tornando o simplex cada vez menor. claro que existe uma limitao para o tamanho do simplex, pois se o mesmo for muito pequeno, os erros experimentais podem mascarar os verdadeiros efeitos sobre a resposta e fazer com que o simplex desloque-se irregularmente dentro de uma rea prxima ao timo. O artigo em ANEXO 2 mostra a otimizao da produo de -amilase atravs do mtodo simplex. No inicio selecionou-se 5 variveis e 6 pontos iniciais e seguiuse a metodologia do simplex at ser atingido um ponto alm do qual a resposta no pde ser melhorada.

4. MTODO DE PLACKETT-BURMAN

Quando mais de cinco variveis independentes so investigadas, o mtodo de Plackett-Burman pode ser utilizado para encontrar as variveis significativas que so otimizadas em estudos posteriores. Esse mtodo foi desenvolvido pelos pesquisadores Plackett e Burman em 1946. Esta tcnica permite a avaliao de x-1 variveis em x experimentos. Esse valor de x deve ser um mltiplo de 4 (4, 8, 12, 16, 20, 24). Quando se utiliza esse mtodo, para satisfazer a condio de mltiplos de 4, aqueles os fatores no atribudos para uma varivel pode ser classificados como dummy variables. Fatores conhecidos que no tem significncia podem ser

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includos e designados como dummy variables. Esse tipo de varivel permite a estimao do erro experimental. A Tabela 1 mostra um exemplo de um planejamento do tipo Plackett-Burman para sete variveis (A-G) em dois nveis (alto e baixo). Nesse planejamento, duas variveis (E e G) so dummy variables que sero utilizadas para se obter uma estimativa do erro. Normalmente, trs variveis so suficientes para uma estimativa adequada do erro. No entanto, podem ser utilizadas mais se o nmero de experimentos no muito grande. Na tabela, cada linha horizontal representa um experimento e cada coluna representa o nvel em que um nico fator se encontra em cada experimento. Para os nveis de cada fator foi utilizada a denotao H para alto e L para baixo, mas podese tambm utilizar para a mesma finalidade +1 para alto e -1 para baixo. O intervalo escolhido entre esses dois nveis deve ser suficientemente grande para garantir que o ponto timo esteja dentro dele, mas deve-se ter cuidado com variveis muito sensveis, pois um intervalo muito grande poderia mascarar as outras variveis. As tabelas do planejamento de Plackett-Burman podem ser encontradas j prontas em programas de estatstica ou podem ser montadas. Se ela for montada pelo pesquisador, geralmente se pega a primeira linha da matriz em livros de planejamento experimental ou estatstica e completa-se as linhas seguintes repetindo o ltimo nvel da linha anterior e em seguida a ordem dos outros nveis a partir do comeo, como mostram as partes destacadas na Tabela 1. A ltima linha sempre ser todos os valores no nvel mais baixo ou todos no nvel mais alto. Analisando a varivel A, pode-se ver que para os ensaios em que A alto, B alto em dois dos ensaios e baixo nos outros dois. Do mesmo modo, C ser alto em dois ensaios e baixo em outros dois, assim como todas as outras variveis. Para os ensaios em que A baixo, B ser alto em dois e baixo em dois. Dessa maneira, os efeitos da mudana das outras variveis se cancelam quando se deseja determinar o efeito de A sobre a resposta. No caso desse exemplo, j conhecido que as variveis E e G no proporcionaram nenhuma variao.

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Tabela 1- Planejamento Plackett-Burman para sete variveis (Nelson, 1982).

Fonte: STANBURY, 1995.

Os efeitos das dummy variables so calculados da mesma forma que os efeitos das outras variveis. Se no houver interaes e erros na

medio da resposta, o efeito delas deve ser 0, assim como esperado. Se o efeito no for igual a 0, deve ter ocorrido uma falta de preciso durante o experimento ou erros analticos na medida da resposta. A anlise dos resultados obtidos permitir identificar as variveis significativas e classific-las por ordem de importncia para decidir qual delas deve ser mais investigada para determinar os valores timos. As etapas de anlise dos dados do exemplo dado so as seguintes: Determinar a diferena entre a mdia da resposta nos nveis H (alto) e L (baixo) para cada varivel independente e dummy variables:

O efeito de uma varivel independente sobre a resposta a diferena entre a resposta mdia para os quatro experimentos em nveis altos e a resposta mdia nos quatro experimentos em nvel baixo:

Esse valor deve ser prximo a zero para dummy variables. Estimar o quadrado mdio de cada varivel, que representa a varincia do efeito. Para a varivel A:

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Clculo do erro experimental atravs da mdia dos quadrados mdios das variveis E e G. No caso do exemplo ele seria:

Identificar as variveis significativas atravs do teste-F, que calculado:

Esse valor ento comparado com tabelas de probabilidade. Os valores obtidos para o exemplo so:

Ao se comparar esses valores com os encontrados na tabela, obtm-se que os fatores A, B e F so muito significativos, C tem uma significncia bem baixa e D no tem significncia. O prximo passo em um experimento seria utilizar os parmetros significativos (A, B e F) e otimiz-los mais ainda atravs da tcnica da superfcie de resposta que ser discutida mais frente. O clculo desses fatores tambm podem ser feitos por programas de estatstica, como o STATISTICA (data analysis software system) verso 7.0 da StatSoft Inc. (2004), o qual disponibiliza vrias ferramentas para o planejamento experimental, clculo de varincia e construo de superfcies de resposta. O artigo em ANEXO 3 mostra a utilizao da metodologia de Plackett-Burman para a o desenvolvimento de um meio de cultivo para Lactobacillus e produo de cido ltico. A aplicao do planejamento possibilitou verificar quais dos parmetros eram significativos ou no.

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5. SUPERFCIE DE RESPOSTA

Aps a deteco dos parmetros significativos em um processo, prxima etapa seria a determinao do nvel adequado de cada varivel independente significativa identificada pelo mtodo descrito anteriormente. Isso pode ser feito atravs da tcnica de superfcie de resposta (SR) desenvolvida primeiramente por Box e Wilson em 1951. Superfcies de resposta so semelhantes a mapas topogrficos, podendo ser representados na forma de superfcie ou de linhas de contorno. Quando se trabalha com linhas de contorno, os eixos do grfico so as variveis independentes e as linhas mostram um valor constante da resposta. Para construir o grfico, necessrio plotar os resultados (respostas) de uma srie de experimentos empregando as diferentes combinaes das variveis nos pontos delineados pelas condies experimentais. Pontos que do um mesmo resultado so unidos em uma mesma linha de contorno. O mtodo de superfcie de resposta no s ir determinar as melhores condies, mas tambm dar as informaes necessrias para a concepo de um processo. A montagem de uma superfcie de resposta um mtodo que faz uma abordagem cientfica para determinar as melhores condies, combinando modelos experimentais com a equao de primeira e segunda ordem de Taylor. O processo de otimizao determina a superfcie da curva da expanso de Taylor, que descreve a resposta. A equao de Taylor, que foi nomeada devido ao trabalho do matemtico ingls Brook, prope que qualquer funo contnua pode ser aproximada por uma srie de potncia. A superfcie de resposta utiliza a equao de Taylor para aproximar a funo que descreve a resposta. Essa equao tem a seguinte forma:

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Nesse tipo de anlise observa-se a alterao provocada por duas variveis, e elas so modificadas ao mesmo tempo, ao contrrio do que ocorre no mtodo clssico onde uma varia enquanto a outra mantida constante. Como j foi mostrado anteriormente na Figura 2, a mudana de uma varivel por vez pode no chegar no valor timo real. A tcnica da superfcie de resposta pode ser aplicada em diferentes nveis de sofisticao. Inicialmente os valores para as variveis nos primeiros experimentos so escolhidos aleatoriamente ou com pesquisa e experincia de trabalhos j realizados. Construindo um mapa de contorno, possvel encontrar uma indicao da rea em que a melhor combinao das variveis se encontra. necessrio ento fazer uma nova srie de experimentos dentro dessa zona indicada. Uma estratgia til para se chegar no ponto timo : Definir a regio de valores que ser explorada. Executar cinco experimentos aleatrios neste espao. Definir uma nova regio centrada no melhor resultado obtido nesses cinco experimentos e fazer esse novo espao menor do que o anterior, cortando cada dimenso pela metade. Executar mais cinco experimentos aleatrios neste novo espao. Continuar fazendo isso at no serem observadas melhorias, ou quando a continuao do experimento for invivel.

As aplicaes mais sofisticadas da superfcie de resposta utilizam modelos matemticos para analisar a primeira srie de dados experimentais e para prever a relao entre a resposta e as variveis. Estes clculos permitem prever contornos e facilitam a otimizao com menos experincias. Se trs ou mais variveis esto sendo examinadas, ento vrios mapas de contorno devero ser construdos. Na determinao do ponto timo de uma superfcie deve-se tomar cuidado com o tipo de perfil que ela apresenta. O ponto de timo ser um ponto de mnimo ou de mximo do grfico, e ele deve ser checado se um mximo local ou absoluto, para evitar falsos timos. A Figura 9 mostra alguns exemplos de perfis de curvas de nvel de superfcies.

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Figura 9- Tipos de perfis da superfcie de resposta gerados.

Fonte: STANBURY, 1995.

A utilizao da SR exige que determinados critrios devem ser cumpridos, como: Conhecer os fatores que so crticos para o processo. Quando h uma quantidade muito grande de variveis, o nmero de experincias exigidas para a construo da superfcie aumenta exponencialmente. Por isso, a maior parte planejamentos que envolvem a construo de uma superfcie de resposta tem o nmero de variveis limitado de 4 a 5. Felizmente para o escalonamento da maioria das fermentaes o nmero de variveis a serem otimizadas limitado, sendo que algumas delas esto presentes na Tabela 2.

Tabela 2- Variveis mais freqentes na fermentao.

Fonte: VOGEL & TODARO, 1997.

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Os fatores devem variar continuamente ao longo do intervalo de variao testado. Por exemplo, as variveis pH, taxa de aerao taxa, e taxa de agitao so contnuas e podem ser usadas em um modelo de superfcie de resposta. Variveis como tipo de fonte de carbono (amido de batata ou xarope de milho) ou fonte de nitrognio (extrato de levedura ou farinha de soja) so discretas (ou no-contnuas) e no podem ser otimizadas por superfcie de resposta. Contudo, o nvel do xarope de milho ou a quantidade de farinha de soja so variveis contnuas e podem ser otimizadas por esse mtodo.

Deve existir uma funo matemtica que correlaciona a resposta aos fatores.

O clculo da superfcie que melhor se ajusta aos resultados obtidos trabalhoso e difcil. Por isso atualmente so utilizados programas de computadores que realizam essa tarefa. A superfcie de resposta apresenta algumas vantagens frente outros mtodos de otimizao, como a maior quantidade de informao a partir das experincias, informaes sobre as interaes entre as variveis, obteno de mltiplas respostas ao mesmo tempo e informaes necessrias para a otimizao do processo. No entanto h algumas desvantagens, como: obteno do que acontece, mas no do porqu, e impossibilidade de prever com certeza resultados fora do intervalo de estudo. A SR um processo eficiente, pois utiliza um planejamento fatorial parcial, possibilitando um nmero mnimo de pontos experimentais exigidos, como mostra a Tabela 3. Um planejamento fatorial completo de trs nveis exigiria n3 experimentos, enquanto um fatorial completo em cinco nveis exigiria n 5 experimentos, onde n o nmero de variveis a serem otimizadas. O desenvolvimento de uma SR, por se um modelo fatorial parcial, requerem menos experimentos. Por exemplo, ao se analisar cinco variveis em cinco nveis diferentes, uma abordagem fatorial completa exige 3125 experimentos, enquanto a SR requer apenas 48 experimentos.

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Tabela 3- Nmero de experimentos necessrios para a superfcie de resposta.

Fonte: VOGEL & TODARO, 1997.

O xito no uso do mtodo de SR exige um planejamento cuidadoso por parte do pesquisador antes do incio do trabalho. Os intervalos nos quais as variveis so testadas devem ser escolhidos com cuidado. Escolher um intervalo de amplitude muito pequena pode resultar em uma varivel no-significativa que ser descartada indevidamente, pois no porque a varivel no teve um efeito, mas sim porque o efeito da varivel ao longo do intervalo avaliado foi pequeno em comparao com o erro experimental. O intervalo deve ser grande o suficiente de modo a que a varivel tenha um efeito significativo sobre a resposta. Por outro lado, escolher um trecho muito grande pode tambm em uma varivel no-significativa a ser descartada, pois no porque a varivel no teve nenhum efeito, mas sim porque a equao de Taylor no pde explicar adequadamente o efeito da varivel. Quanto mais amplo for o intervalo, menor a probabilidade de que a equao de Taylor represente corretamente aos pontos. Portanto, intervalos que incluem mximos e mnimos absolutos devem ser evitados. Outro problema da tcnica incapacidade da superfcie de resposta em prever resultados fora da faixa avaliada. altamente aconselhado que experimentos preliminares sejam feitos para determinar os intervalos mais adequados para a anlise. Para conhecer-se o comportamento do processo nas condies alm das estudadas, necessrio realizar duas etapas: a modelagem e o deslocamento. Essas etapas so repetidas quantas vezes forem necessrias, com o objetivo de atingir a regio tima da superfcie investigada. A

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modelagem envolve o ajuste dos modelos s respostas dos planejamentos fatoriais. O deslocamento feito ao longo do caminho da mxima inclinao de um determinado modelo, que a trajetria na qual a resposta varia de forma mais pronunciada. Uma vantagem clara do planejamento da SR saber quantos experimentos e dos prazos de tempo necessrios para concluir o projeto, ao contrrio de mtodos como o simplex. Isso extremamente til para fins oramentais, bem como a atribuio dos recursos cientficos. Usando SR, o pesquisador tem a informao necessria para determinar se um projeto experimental vivel ou no. Com o mtodo clssico difcil determinar as interaes entre as variveis. J atravs da superfcie de resposta possvel calcular a interao entre elas, uma vez que todas elas so analisadas ao mesmo tempo. A superfcie de resposta tem a capacidade de modelar quantas variveis forem necessrias. Por exemplo, pode no ser apenas um interessado no rendimento timo, mas tambm no nvel de dificuldade em remover impurezas. Tanto o rendimento e o nvel de impureza podem ser modelados utilizando dados do mesmo conjunto de experincias. A SR fornece as informaes necessrias para o controle do processo. Por exemplo, a Figura 10 mostra o efeito da temperatura e grau de sacarificao no rendimento da produo de lcool. O grfico no s mostra as condies necessrias para um rendimento timo rendimento, mas tambm indica a sensibilidade do processo de mudanas de temperatura e do grau de sacarificao. Ele mostra o intervalo no qual estas variveis devem ser controladas para um timo rendimento: a temperatura deve ser controlada dentro de um intervalo de 5 graus e a sacarificao dentro de um intervalo de 10%. H duas grandes desvantagens na utilizao da superfcie de resposta. Em primeiro lugar, com relao aos resultados obtidos. Tem-se somente o que aconteceu, mas no por qual razo isso aconteceu. Em muitos casos, saber o que acontece pode levar a uma explicao da razo pela qual obteve-se tal resultado e indicar alternativas ou direes para pesquisas futuras. Por exemplo, no caso do grau de sacarificao, pode-se explicar baixos rendimentos em baixos graus de sacarificao devido demora no consumo do substrato, e em altos graus de sacarificao pode-se ter inibio pelo substrato. Ao ver os resultados da Figura 10, possvel justificar plausivelmente as causas dos resultados obtidos.

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Figura 10- Otimizao na produo de lcool.

Fonte: VOGEL & TODARO, 1997.

Deve-se lembrar que a SR utiliza tcnicas de regresso mltipla para determinar os coeficientes da expanso de Taylor. A SR no determina a funo que descreve os dados, a equao Taylor s faz uma aproximao da funo verdadeira. Para determinar o grau de ajuste da curva aos pontos, so utilizadas ferramentas estatsticas como o coeficiente de correlao, coeficiente de regresso, erro, e valor de T. O coeficiente de correlao uma medida da relao entre a expanso de Taylor e a resposta obtida. Esse coeficiente pode variar de 0 (absolutamente nenhuma correlao) at 1 ou -1 (correlao perfeita). Um coeficiente de correlao de 0,5 mostra uma correlao fraca, mas aproveitvel. O sinal positivo do coeficiente indica que a resposta aumenta medida que aumenta a varivel. J o sinal negativo indica que a resposta diminui medida que a varivel aumenta. Os coeficientes de regresso so os coeficientes dos termos da equao de Taylor. Eles podem ser determinados utilizando os valores reais para as variveis independentes ou valores codificados. Usando os valores reais mais fcil de calcular a resposta dos coeficientes uma vez que no necessrio passar por um processo de codificao. No entanto, existe uma perda de informaes importantes. O motivo para a codificao das variveis eliminar o efeito que a magnitude da varivel tem sobre o coeficiente de regresso. Quando so utilizados valores

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codificados, a importncia da varivel na previso dos resultados pode ser determinada a partir do valor absoluto do coeficiente. A frmula para a codificao de valores :

A partir desse coeficiente de regresso possvel determinar o erro entre o coeficiente real e o estimado, pois o coeficiente de regresso no

necessariamente o valor exato, mas sim uma estimativa para o coeficiente. A vantagem de tcnicas estatsticas que a partir desse valor de erro possvel determinar o quo vlida essa estimativa para o coeficiente. Quanto maior o erro, maior o intervalo entre o valor exato e o coeficiente. Esse erro deve ser o menor possvel. Erros maiores que 50% no so teis para prever resultados, pois podem causar interpretaes errneas. O clculo do erro da resposta estimada permite obter informaes relativas confiabilidade dos valores previstos pela equao de regresso. Quanto maior for o erro da estimativa, menos confiveis so os valores previstos. O teste T uma medida da significncia do coeficiente de regresso, ou seja, se ele tem um significado real ou deveria ser zero. Quanto maior o valor absoluto de T, maior a probabilidade de que o coeficiente real e deve ser usado nas previses. Um valor de T igual ou superior a 1,7 indica que h uma alta probabilidade de que o coeficiente real e a varivel tem um importante efeito sobre a resposta. Os artigos em ANEXO 3 e 4 mostram a construo de superfcies de resposta na otimizao de dois cultivos diferentes.

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6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

CHAUHAN, K.; TRIVEDI, U.; PATEL, K. C. Statistical screening of medium components by Plackett-Burman design for lactic acid production by Lactobacillus sp. KCP01 using date juice. Bioresource Technology, n98, p. 98103, 2007. ChemKeys. Planejamento experimental e otimizao . Disponvel em: <

http://www. chemkeys.com >. Acesso em: 20 de maio de 2008.

LEWIS, G. A.; MATHIEU, D.; -LUU, R. P.-T. Pharmaceutical Experimental Design. Marcel Dekker Inc., New York, 1999. NETO, B. de B.; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E. Como Fazer Experimentos Pesquisa e Desenvolvimento na Cincia e na Indstria. Coleo Livro-Texto, Editora da Unicamp, Campinas, SP, 2001.

NIST / SEMATECH. Engineering Statistics Handbook. Disponvel em: < http:// www.itl.nist.gov/div898/handbook/index.htm > Acesso em: 20 de maio de 2008. PRAKASH, O.; TALAT, M.; HASAN, S. H.; PANDEY, R. K. Factorial design for the optimization of enzymatic detection of cadmium in aqueous solutionusing immobilized urease from vegetable waste. Bioresource Technology, 2008.

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7. ANEXOS

ANEXO 1 FACTORIAL DESIGN FOR THE OPTIMIZATION OF ENZIMATIC DETECTION OF CADMIUM IN AQUEOUS SOLUTION USING IMMOBIIZED UREASE FROM VEGETABLE WASTE O. PRAKASH, M. TALAT, S. H. HASAN & R. K. PANDEY

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ANEXO 2 CULTURE MEDIA OPTIMIZATION OF -AMYLASE PRODUCING ORGANISM Mucor spp. USING THE VARIABLE SIZE-SIMPLEX ALGORITHM H. VAHIDI, B. SHAFAGI & Z. MIRZABEIGI

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ANEXO 3 STATISTICAL SCREENING OF MEDIUM COMPONENTS BY PLACKETTBURMAN DESIGN FOR LACTIC ACID PRODUCTION BY Lactobacillus sp. KCP01 USING DATE JUICE K. CHAUHAN, U. TRIVEDI & K. C. PATEL

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ANEXO 4 STATISTICAL OPTIMIZATION OF MEDIUM COMPONENTS FOR THE PRODUCTION OF CHITINASE BY Alcaligenes xylosoxydans R. VAIDYA, P. VYAS & H.S. CHHATPAR