MTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR

II - CITOQUMICA

Sistemas de estudos in vitro

Preparaes citolgicas Citoqumica Autorradiografia Imunocitoqumica Clula Tecido rgo

Cultura Fertilizao Manipulaes

Anlises in situ

Estudos bioqumicos

Extraes/Purificaes Centrifugaes Dilises Eletroforeses Tecnologia do DNA/RNA

Mtodos de Estudos in situ Preparaes Citolgicas e Tcnicas Citoqumicas

O estudo do material biolgico ao Microscpio requer alguns procedimentos prvios que vo desde a escolha e coleta do material at a montagem final do preparado histolgico

Que os elementos a ser analisados no sejam difusveis; Que o produto da reao seja visvel (cor ou precipitado); Que a reao seja especfica/seletiva para o que se pretende analisar

Princpios da Citoqumica

Mtodos de Estudos in situ Preparaes Citolgicas e Tcnicas Citoqumicas

O sucesso de uma reao citoqumica depende principalmente dos passos anteriores ao da reao de colorao:

Coleta do material Fixao e agentes fixadores Agentes desidratantes

Coleta do Material
Preparado permanente Clulas preservadas para melhor demonstrao de sua estrutura Ideal = sejam mantidos estrutura e composio qumica quando in vivo 1) Montagem total: Material fino / transparente na lmina Fixao e colorao Vantagem: obteno de clulas inteiras (medidas e quantificadas)

Mesentrio Glndulas de insetos Membranas fetais

Glndulas Salivares de Rhodnius prolixus

Montagem total
Glndula Principal

Glndula Acessria

Ducto Acessrio Ducto Principal

Coleta do Material
2) Esfregao: consistem em promover o espalhamento de clulas livres sobre a lmina com o auxlio de outra lmina Clulas livres: sangue, linfa, smen, lquor Fixao e colorao Vantagem: obteno de clulas inteiras (medidas e quantificadas)

Coleta do Material
3) Espalhamento: Erroneamente esfregao Raspagem (esptula / palitos) de camadas superficiais (mucosas) Mucosas: bucal, anal, vaginal Fixao e colorao Vantagem: obteno de clulas inteiras (medidas e quantificadas)

Coleta do Material
4) Esmagamento: Esmagar, o material entre lmina e lamnula, Colorao concomitante ou posterior Vantagem: estudo de divises celulares

Cromossomos Ncleo/Nuclolo

Coleta do Material
5) Decalque ou Imprint: Coleta de ncleos de tecidos moles fgado, bao, rim. timo Retira-se rgo face cortada lavada com salina seca com papel pressiona contra a lmina (carimbo) Resultado: ncleos impressos Fixao e colorao Vantagem: - simples - estudo da quantidade de DNA

6) Cortes Histolgicos

TCNICA DE MICROSCOPIA DE LUZ PARA O ESTUDO DAS CLULAS E TECIDO

COMO PREPARAR UM CORTE HISTOLGICO ???

MATERIAL BIOLGICO

INIBIR A AUTLISE

PRESERVAR A MORFOLOGIA E A COMPOSIO QUIMICA DO TECIDO

FIXAO
COAGULAR E ENDURECER O TECIDO

FACILITAR A COLORAO

CONDUTA PARA BOA FIXAO

Fixao por imerso: o fixador entra em contato com o material biolgico aps a retirada do organismo. Fixao por perfuso: o fixador injetado na corrente sangnea, possibilitando a fixao em nvel pericelular e celular.

CRIOSTATO:
objetivo utilizar para o estudo da distribuio dos lipdeos.

FIXAO

uso de substncias que reagindo com as biomacromolculas estabilizam as mesmas.

QUMICA:

FORMOL (ALDEDO FRMICO a 40%) BOUIN (CIDO PCRICO, FORMALDEDO E CIDO ACTICO) KARNOVSKY ( PARAFORMALDEDO E GLUTARALDEDO

FATORES QUE ATUAM NO PROCESSO DE FIXAO

Tamponamento Temperatura Espessura da pea Volume de fixador Tempo de fixao

PROCESSAMENTO HISTOLGICO
DESIDRATAO: retirada da gua dos tecidos e a sua substituio por lcool. DIAFANIZAO: substituio do lcool presente nos tecidos pelo leo de cedro. IMPREGNAO: o leo substitudo por parafina a 60C. INCLUSO: o tecido colocado em caixas com parafina e ento solidificados.

PROCESSAMENTO HISTOLGICO

INCLUSO EM PARAFINA E RESINAS HISTOLGICAS

INCLUSO

Diferentes planos dos cortes histolgicos

Micrtomo Leica RM2155 Cortes blocos parafina e resina - lminas

Navalha parafina

Navalha resina Navalha diamante

DISTENSO DOS CORTES

DESPARAFINIZAO

HIDRATAO

COLORAO

Corte histolgico

Clarificao

Citoqumica / Histoqumica
rea da biologia celular e estrutural dedicada aos estudos dos mtodos de colorao dos tecidos e constituintes celulares e subcelulares

Clulas x Tecidos
Elementos qumicos de Baixo P.M. (C, O, N, H, etc.) Matria Orgnica Baixo Contraste

Material a ser examinado ao M.L. - Fino - Transparente ( luz formao da imagem) Material Biolgico Colorao ou reaes

Citoqumica
Mtodos de colorao Princpios qumicos das reaes de colorao Procedimentos protocolares

Colorao do Material Biolgico

Componentes qumicos que podem ser avaliados pela tcnica citoqumica

cido Nuclicos Protenas Polissacardeos Lipdios ons (Complexos moleculares) Vitaminas e Enzimas

Pesquisa cientfica Diagnstico patolgico

Sucesso da reao citoqumica:

Elementos avaliados No difusveis no processamento cor insolvel

Produto da reao

Reao especfica para o composto celular analisado

Coleta Passos anteriores reao: Fixao Desidratao

Reaes Citoqumicas Natureza das reaes citoqumicas envolvidas

Ligaes eletrostticas Corante Ligaes covalentes

Substrato

Interaes hidrofbicas

Reaes Citoqumicas Mediadas por Ligaes Eletrostticas Afinidade eletrosttica: um corante ionizado em uma soluo reage com um substrato de carga inica oposta.

+
Substrato catinico Acidofilia Corante aninico

Substrato
aninico

Basofilia

Corante catinico

Basofilia

Corantes Bsicos (Catinicos +)

Substrato carregado negativamente (aninico) reage eletrostaticamente com um corante carregado positivamente (catinico). Corantes:

Azul de metileno

Azul de alcian Azul de toluidina

Basofilia

Basofilia Corantes catinicos reagem com grupamentos ionizveis na clula / no tecido, que apresentam cargas negativas (aninicos)

Fosfatos (cidos nuclicos) Grupamentos negativos Sulfatos (Glicosaminoglicanos sulfatados) Carboxilas (Protenas e acares cidos)

Basofilia

Corante interage com um componente tissular, corando-o com cor diferente da sua cor original. O azul de toluidina um corante bsico que interage com compostos polimricos ricos em grupamentos sulfato.

Metacromasia e Basofilia metacromtica

Alguns corantes bsicos, devido natureza planar de suas molculas, podem promover um empilhamento ordenado ao ligarem-se a substratos polianinicos: Fenmeno - metacromasia

Metacromtico

Ortocromtico

Reao de Acidofilia Corantes cidos (Aninicos)

Esses corantes reagem com os elementos que possuem cargas positivas na clula, como por exemplo, as protenas, que podem apresentar radicais bsicos de seus aminocidos ionizados (NH3+).

Orcena Fast green

Amarelo de Naftol Xilydine Ponceau

Srius Red

Ex.: Corante aninico Orcena lacto-actica

Corante se liga protenas histnicas ou totais, complexadas ao DNA da cromatina; Diferenciao entre eucromatina e heterocromatina (corante mais forte); Heterocromatina: Mais compacta e menor nmero de protenas.

Orcena lacto-actica Testculo de gafanhoto

Orcena lacto-actica Espermatognese em testculo de triatomneos

Hematoxilina Eosina

Hematoxilina (+) Substratos (-) Ncleos (grupam/os fostato do DNA) Azul

Eosina (-) Substratos (+) Citoplasma (grupam/o NH2+) Rosa

Hematoxilina Eosina
(Ribeiro & Lima, 2000)

Colorao de rotina para anlise geral da morfologia dos tbulos seminferos

(Mus muscullus) (ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)

HE
Estrutura dos tbulos seminferos Formao do grnulo pracrossomal

(Peruquetti, 2004) C G

Corantes cidos Coram estruturas bsicas do tecido. Ex: aminocidos bsicos (lisina, arginina, histidina)

Corantes bsicos Coram estruturas cidas do tecido. Ex: cidos nucleicos, aminocidos cidos (asprtico, glutmico).

Impregnao por ons Prata

Impregnao pelo Nitrato de Prata

A tcnica de impregnao pela prata utilizada para marcar:

Nuclolos de ncleos interfsicos Regies organizadoras nucleolares (RONs) nos cromossomos

Nuclolo (ME)

CG CG CFD CFD CF CF

Durante a intrfase, a impregnao pela prata ocorre largamente no Centro Fibrilar (CF) e no Componente Fibrilar Denso (CFD); Testes citoqumicos e anlises qumicas indicaram que a prata tem afinidade pelas protenas acdicas (B23, C23)

Impregnao por ons prata

(Howell & Black, 1980)

Identificao de protenas nucleolares (B23 e C23) (nuclolos e corpsculos nucleolares)

(Mus muscullus) (ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)

Prata
Protenas nucleolares B23 e C23

(Peruquetti, 2004)

Aplicaes
A) Pesquisas citogenticas Bandamento cromossmico Indicar atividades de transcrio do DNAr Estudo da atividade nucleolar durante a gametognese B) Diagnsticos patolgicos Leucemias Tumores: ovrio mama tero tireide Protenas AgNOR Taxa de proliferao Grau de malignidade

Regio Organizadora Nucleolar

Regies cromossmicas com as quais os nuclolos se associam e que so responsveis pela reorganizao destes, no final da diviso celular, onde os genes de DNAr esto localizados

Reaes citoqumicas mediadas por ligaes covalentes

Muitas reaes citoqumicas so mediadas por ligaes covalentes, principalmente aquelas que precisam ser facilitadas por mordentes (componentes metlicos). Estas reaes so chamadas de reaes Tricrmicas.

Tricmico de Masson Tricrmico de Gmri Tricmico de Mallory

So tcnicas especficas para fibras do tecido conjuntivo e selecionam compostos celulares dos compostos fibrosos

Mtodos Tricrmicos de Colorao

Composio bsica - Dois ou + corantes aninicos - Mordentes (molculas de componentes metlicos): cido fosfofngstico / cido fosfomolibdico Resultados - Colorao seletiva para os componentes do tecido conjuntivo - Histopatologia - Pesquisa cientfica (Biologia celular e tecidual)

Tricrmico de Mallory

Epitlio intestinal (roxo); fibras colgenas (azul)

Tricrmico de Gmri

Tecido conjuntivo (azul esverdeado) Clulas: pigmentos de fucsina Ncleos: escuros

Tricrmico de Masson

Lngua Fibras musculares (lils) Fibras colgenas (azul) Ncleos (azul escuro)

Reaes Citoqumicas Mediadas por Ligaes Covalentes

Outro exemplo clssico deste tipo de reao so as reaes intermediadas pelo Reativo de Schiff: Reao de Feulgen (DNA); Teste do PAS (polissacardeos neutros)

Aldedos livres 2(R-CHO)

Leucoderivado da Fucsina bsica

Restaurao do grupo cromofrico (2 frmulas provveis)

Reao de Feulgen

Importncia da Reao de Feulgen

Verificar a influncia da ao de drogas, hormnios e do envelhecimento sobre o contedo do DNA; Detectar a presena de aneuploidias e poliploidias em vrios tipos de tumores. DNA Feulgen + RNA Feulgen -

Controle da reao: Extrao do DNA Feulgen -

Mecanismo da Reao de Feulgen

Duas etapas

A) Hidrlise cida (HCl) remove bases pricas Depurinao do DNA cido apurnico

B) Exposio do material hidrolisado ao reativo de Schiff ( cora somente aldedos livres)

Hidrlise cida

Depurinao

Ligao do corante molcula Reativo de Schiff

Fatores modificadores da resposta Reao de Feulgen

Disponibilidade de substrato a ser corado Influncia da fixao Variaes na etapa hidroltica: molaridade do cido / tempo / temperatura Ex.: HCl a 1N - 60o HCl 5N - temperatura ambiente Influncia da composio e de outras caractersticas do Reativo de Schiff

Tbulos Seminferos de Mus musculus

Reao de Feulgen
Tbulos seminferos reas nucleolares (-) (espermatcitos I Espermtides) Heterocromatina

(Peruquetti, 2004) C G

MATERIAL INCLUDO EM PARAFINA

MATERIAL INCLUDO EM PARAFINA

MATERIAL INCLUDO EM PARAFINA

MATERIAL INCLUDO EM HISTORRESINA

REFERNCIAS
MICHALANY, J., 1980. Tcnica Histolgica em Anatomia Patolgica. So Paulo: Editora Pedaggica e Universitria.

JUNQUEIRA, L. C. & CARNEIRO, J., 2005. Biologia Celular e Molecular. 8. ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro. DE ROBERTIS JR. E.M.F. 2006. Bases da Biologia Celular e Molecular. 4. Edio. Guanabara Koogan. MELLO, R.C.N. 2002. Clulas & Microscopia: princpios bsicos e prticas. Juiz de Fora: Editora UJFJ.