Quim. Nova, Vol. 31, No.

5, 1218-1223, 2008
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*e-mail: ronei@iqm.unicamp.br
PROCEDIMENTOS ANALTICOS PARA IDENTIFICAO DE ANTOCIANINAS PRESENTES EM EXTRATOS
NATURAIS
Paulo Henrique Maro e Ronei Jesus Poppi*
Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas SP, Brasil
Ieda Spacino Scarminio
Departamento de Qumica, Universidade Estadual de Londrina, CP 6001, 86051-970 Londrina PR, Brasil
Recebido em 19/7/07; aceito em 20/9/07; publicado na web em 2/4/08
ANALYTICAL PROCEDURES FOR IDENTIFYING ANTHOCYANINS IN NATURAL EXTRACTS. Anthocyanins are among
the most important plant pigments. Due to their potential benefits for human health, there is considerable interest in these natural
pigments. Nonetheless, there is great difficulty in finding a technique that could provide the identification of structurally similar
compounds and estimate the number and concentration of the species present. A lot of techniques have been tried to find the best
methodology to extract information from these systems. In this paper, a review of the most important procedures is given, from the
extraction to the identification of anthocyanins in natural extracts.
Keywords: anthocyanins; analytical procedures; identification.
INTRODUO
A cor um dos mais importantes atributos de qualidade de um
alimento, exercendo uma enorme influncia em seu valor esttico e
servindo de base para a aceitao de uma grande variedade de pro-
dutos alimentcios por parte dos consumidores.
1
Em produtos na-
turais, a maioria das substncias responsveis pela colorao per-
tence classe dos flavonides. Os flavonides possuem estrutura
marcada pela presena de um esqueleto com 15 tomos de carbo-
no na forma C
6
-C
3
-C
6
, e so divididos em classes dependendo do
estado de oxidao do anel central de pirano.
2
A Figura 1 apresenta
a estrutura qumica dos principais tipos de flavonides.
3
A classificao do tipo de flavonide presente em um extrato de
planta baseia-se inicialmente no estudo das propriedades de solubili-
dade e reaes de colorao. Este procedimento seguido por anlise
cromatogrfica do extrato da planta. Os flavonides podem ser separa-
dos por procedimentos cromatogrficos e os componentes individuais
identificados, quando possvel, por comparao com padres.
As duas classes de flavonides consideradas como mais importan-
tes so os flavonis e as antocianidinas.
4
As antocianidinas apresen-
tam como estrutura fundamental o ction flavlico
5
(2-fenilben-
zopirilium), representado na Figura 2a. A Figura 2b apresenta um exem-
plo de estrutura de antocianidina, conhecida como cianidina.
Os pigmentos ocorrem geralmente na forma de antocianinas,
6
que so derivadas das antocianidinas. As antocianidinas no possu-
em grupos glicosdeos e a maioria possui hidroxilas nas posies 3,
5 e 7. J nas antocianinas, uma ou mais destas hidroxilas esto
ligadas a acares, sendo os mais comuns glicose, xilose, arabinose,
ramnose, galactose ou dissacardeos constitudos por esses aca-
res, aos quais podem estar ligados cidos fenlicos, como p-
coumrico, cafico, fenlico e vanlico. O acar presente nas mol-
culas de antocianinas confere maior solubilidade e estabilidade a
estes pigmentos, quando comparados com as antocianidinas.
5
A
Figura 3 um exemplo de estrutura de antocianina presente na
maioria dos vegetais, a cianidina 3-glucosdeo.
O termo antocianina, derivado do grego de flor e azul (anthos =
flores; kianos = azul), foi inventado por Marquart em 1853 para se
referir aos pigmentos azuis das flores. Percebeu-se mais tarde que
no apenas a cor azul, mas tambm vrias outras cores observadas
em flores, frutos, folhas, caules e razes so atribudas a pigmentos
quimicamente similares aos que deram origem ao flor azul.
7
Com a mesma origem biossinttica dos outros flavonides na-
Figura 1. Estrutura qumica dos principais tipos de flavonides
3
Figura 2. (a) Estrutura do ction flavlico e (b) estrutura da antocianidina
cianidina
Figura 3. Estrutura da antocianina cianidina 3-glucosdeo
1219 Procedimentos analticos para identificao de antocianinas presentes em extratos naturais Vol. 31, No. 5
turais, as antocianinas so estruturalmente caracterizadas pela pre-
sena do esqueleto contendo 15 tomos de carbono na forma C
6
-
C
3
-C
6
, porm, ao contrrio dos outros flavonides, as antocianinas
absorvem fortemente na regio visvel do espectro, conferindo uma
infinidade de cores, dependendo do meio de ocorrncia.
7
Devido sua solubilidade em gua,
8
as antocianinas ocorrem nos
tecidos de plantas dissolvidas no fludo da clula vegetal, que geral-
mente apresenta pH levemente cido.
6
As antocianinas mais comumente
encontradas em frutas so derivadas principalmente de seis
antocianidinas: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina,
petunidina e malvidina. A nomenclatura dos pigmentos derivada da
fonte (do vegetal) em que eles foram primeiramente isolados.
9
As di-
ferenas entre as vrias antocianinas esto no nmero de grupos
hidroxlicos na molcula, no grau de metilao destes grupos, na natu-
reza e no nmero de acares ligados molcula e na posio dessas
ligaes, bem como na natureza e no nmero de cidos alifticos e/ou
aromticos ligados ao(s) acar(es) na molcula de antocianina.
1
Uma caracterstica marcante das antocianinas est no fato de
que em solues aquosas, apresentam diferentes estruturas em fun-
o do pH. De modo geral, em meio extremamente cido (pH entre
1-2), as antocianinas apresentam colorao intensamente avermelhada
devido ao predomnio da forma ction flavlico (AH
+
). Para um meio
com pH maior que 2, observado um equilbrio entre o ction flavlico
e uma estrutura conhecida como pseudobase carbinol (B). Com o
aumento do pH, as antocianinas perdem a cor at se tornarem prati-
camente incolores em pH aproximadamente 6, devido predomi-
nncia da espcie pseudobase carbinol. Em valores de pH acima de
6,0, tanto a estrutura pseudobase carbinol quanto anidrobase quinoidal
(A) podem formar a espcie cis-chalcona (C
C
). A formao desta
ocorre com a ruptura do anel heterocclico o que, dependendo do
tipo de antocianina, pode tornar a reao irreversvel. A formao da
cis-chalcona a partir da anidrobase quinoidal pode ocorrer por dois
caminhos diferentes: de maneira direta, resultado de um aumento
brusco de pH, ou com a formao das espcies anidrobase ionizadas
(A
-
), possivelmente provenientes de um aumento gradual de base
entre os valores de pH 6,5 e 9. Ao iniciar-se a ionizao das
antocianinas, so formadas estruturas de anidrobases que exibem
colorao azul. Em meio extremamente alcalino, observa-se o equi-
lbrio entre formas ionizadas de chalconas cis e trans, apresentando
colorao amarelada. Baseando-se em trabalhos anteriores,
10,11
jun-
tamente com estudos recentes, sugere-se que as possveis transfor-
maes estruturais das antocianinas em meio aquoso em funo do
pH podem ser representadas pela Figura 4.
O aquecimento um fator que acelera a degradao das
antocianinas. Em presena de ctions de Al, Fe, Sn e outros metais,
as antocianinas formam produtos insolveis que, no caso do alum-
nio, encontram aplicaes como corantes que apresentam estabili-
dade ao calor, pH e oxignio superior das antocianinas livres. Alm
do pH, a luz um outro fator de grande importncia na alterao da
cor das antocianinas. A transformao mais intensa quando o fator
luz combinado com o efeito do oxignio. As antocianinas tambm
podem se combinar com HSO
3
-
presente em muitos alimentos for-
mando produtos incolores provenientes da ligao deste com o car-
bono 4 (Figura 2a) da antocianina. A estabilidade das antocianinas
ao descoramento aumentada consideravelmente pela presena de
cidos fenlicos. O mesmo efeito observado pela presena de
flavonides no-antocinicos, especialmente os flavonis, como por
exemplo a rutina. Compostos como o acetaldedo, amino cidos,
taninos, dentre alguns outros, tambm conferem aumento na estabi-
lidade da molcula. Esse aumento na estabilidade atribudo
copigmentao, ou seja, associao entre antocianina e flavonol
(copigmento) por ligaes de hidrognio, de modo que o flavonol
venha a formar uma estrutura protetora envolvendo a antocianina.
11
Existe um grande interesse no estudo das antocianinas em diver-
sas reas, como na sade, devido ao seu grande potencial teraputico,
na indstria, com destaque para as aplicaes na fabricao de vi-
nhos e como corantes naturais,
12
e tambm na rea de ensino em
qumica, onde servem como indicadores de pH.
5,13
No entanto, a
Figura 4. Possveis transformaes estruturais das antocianinas em meio aquoso em funo do pH
1220 Quim. Nova Maro et al.
utilizao de antocianinas apresenta restries em funo de limita-
es, como a disponibilidade de matria-prima produtora de pig-
mentos na quantidade e qualidade requerida, as dificuldades envol-
vendo processos de obteno (extrao, purificao e isolamento), o
poder corante reduzido quando comparado aos produtos sintticos e,
principalmente, a baixa estabilidade apresentada pelas antocianinas.
1
O conhecimento da estrutura dos pigmentos, a influncia de
fatores como pH, temperatura, a presena de cidos, acares,
ons metlicos e de substncias chamadas de copigmentos assu-
me importncia fundamental no estudo da estabilidade de
antocianinas, visando seu possvel uso em alimentos.
1
A determi-
nao de compostos fenlicos de grande importncia devido
relao destes compostos com as qualidades sensoriais dos ali-
mentos, como cor, sabor e aroma.
14
No entanto, os extratos de
plantas apresentam misturas de diferentes substncias, incluindo
diferentes classes de flavonides. As antocianinas, por exemplo,
presentes em ptalas de flores, esto sempre acompanhadas de
flavonas incolores que se apresentam como copigmentos, sendo
essenciais para a expresso da cor e fornecendo estabilidade
antocianina.
15
O conhecimento do tipo de antocianina tambm se
mostra fundamental no estudo de plantas ornamentais, onde a
predominncia de uma antocianina individual pode determinar a
cor do produto, influenciando diretamente na aceitao e no va-
lor comercial do mesmo.
16
Outra razo para a identificao de
antocianinas individuais est na anlise de vinhos adulterados: os
tipos de antocianinas dependem da espcie do gnero Vitis utili-
zada na fabricao do vinho, e so determinantes da colorao,
aroma e, principalmente, do sabor desta bebida.
17
Como os extratos vegetais so matrizes complexas, s vezes
necessrio que se purifique a amostra para realizar a identificao
das substncias presentes. Para o caso de identificao de substn-
cias individuais, se faz necessria a remoo de substncias interfe-
rentes e a separao de compostos de uma mesma classe, e para
estes fins a cromatografia um mtodo indispensvel, possibilitan-
do a posterior identificao e quantificao de compostos, com
alta sensibilidade e eficincia.
18
METODOLOGIA ANALTICA
O estudo de antocianinas presentes em extratos vegetais de-
pendente do objetivo da anlise: a deteco da presena de antocia-
ninas em uma planta pode ser realizada utilizando-se a tcnica de
cromatografia em papel (CP), baseando-se na propriedade de mu-
dana de cor em funo do pH apresentada pelas antocianinas; para
fins de identificao de antocianinas individuais, como o caso de
estudos de plantas ornamentais onde a identificao do tipo de
antocianina de fundamental importncia, podem ser empregadas
tcnicas mais avanadas, como cromatografia lquida de alta efici-
ncia (CLAE), espectrometria de massas (MS), ressonncia mag-
ntica nuclear de prtons (RMN de
1
H) e de carbono (RMN de
13
C), eletroforese capilar por zonas
19
(ECZ Capillary Zones
Electrophoresis, CZE), alm de equipamentos que combinam es-
tas e outras tcnicas (equipamentos hifenados).
Na identificao de um constituinte de uma planta, uma vez
que este tenha sido isolado e purificado, necessrio primeira-
mente determinar a classe do composto e, ento, encontrar qual
substncia em particular est presente dentro desta classe. Para as
antocianinas, a classe de compostos pode ser facilmente distinguida
por testes de colorao.
15
Como etapa inicial para o estudo de antocianinas, a deteco da
presena do pigmento na amostra pode ser realizada utilizando-se a
tcnica de cromatografia em papel, onde a presena ou ausncia do
pigmento antocianina pode ser determinada baseando-se em uma
reao que envolve mudana reversvel na colorao em funo do
pH. Para isso, o primeiro passo a obteno do extrato da planta.
As antocianinas so instveis em solues com pH neutro ou alca-
lino, e mesmo em solues com pH cido a cor pode desaparecer
gradualmente quando a soluo sofre exposio luz. Como estes
pigmentos so solveis em solventes polares, devem ser extrados uti-
lizando-se solues alcolicas de metanol ou etanol contendo cido
actico ou cido clordrico. O cido empregado na soluo diminui o
pH, prevenindo a degradao de antocianinas no aciladas.
12
A maio-
ria dos estudos emprega solues alcolicas de metanol acidificadas
com HCl, no entanto, na anlise de alimentos a soluo de metanol
deve ser substituda por etanol, devido toxicidade do metanol.
20
Aps
a macerao de quantidade adequada de amostra embebida na soluo
extratora, pode-se obter um extrato suficientemente concentrado para
a aplicao direta em cromatografia em papel.
No caso de necessidade de armazenamento, o extrato deve ser
mantido em local escuro e, preferencialmente, a baixas temperatu-
ras.
15
A cromatografia em papel uma tcnica de separao por parti-
o lquido-lquido: a celulose constituda por vrias unidades de
glicose anidra ligadas por tomos de oxignio, de modo que um
lquido polar como a gua tem grande afinidade pelas hidroxilas de
cada glicose, formando ligaes de hidrognio, ficando retido e fun-
cionando como fase estacionria, e os lquidos menos polares
(solventes orgnicos) so repelidos e funcionam como fase mvel.
21
No estudo de antocianinas o solvente mais utilizado a soluo de
BAW (butanol - cido actico - gua, na maioria das vezes na pro-
poro 4 : 1 : 5).
22
Como a fase estacionria um lquido, o processo
de separao ocorre por partio, baseando-se nas diferentes solubi-
lidades dos componentes da amostra na fase estacionria.
Aps o desenvolvimento cromatogrfico, o aparecimento de
mancha(s) colorida(s) o primeiro indcio da possibilidade de exis-
tncia de antocianinas no extrato.
23
Baseando-se na propriedade apre-
sentada pelas antocianinas de variar a colorao de forma reversvel
em funo do pH,
10,22
possvel detectar se a mancha observada
devido presena de antocianinas ou outras substncias, como por
exemplo as betacianinas, presentes em beterraba (planta da famlia
Centrospermae). As betacianinas so pigmentos solveis em gua e
apresentam colorao vermelho-escura quando em meio levemente
cido, o que pode causar grande confuso em uma tentativa inicial
de classificao do tipo de pigmento. A principal betacianina a
betanina. No entanto, as antocianinas e as betaninas no ocorrem
simultaneamente em uma mesma planta: algumas plantas substitu-
em biossinteticamente as antocianinas por betaninas, como o caso
de plantas da famlia Centrospermae, como cacto (cacti), flores do
tipo bougainvillea, arbustros como os conhecidos como pokeweed,
Phytolacca e algumas plantas ornamentais como rabo de gato
(Amaranthus).
15
Neste caso, baseando-se na mudana de estruturas
decorrentes da variao do pH do meio (Figura 4), ao mudar o pH do
cromatograma para levemente alcalino pela exposio a vapores de
amnia, a mancha deve mudar de colorao. Devem-se tomar os
devidos cuidados para no tornar o meio alcalino a ponto de causar a
formao das chalconas ionizadas (ruptura do anel) o que, em al-
guns casos, torna a reao irreversvel. Caso a substncia mude de
cor, deve-se borrifar soluo cida, revertendo o pH para o valor
inicial e, dessa forma, voltando cor inicial. As betacianinas dife-
rem das antocianinas por serem mais instveis,
15
de modo que ao
mudar o pH para valores mais elevados (de 2 para 7, por exemplo) as
betaninas sofrem transformaes irreversveis em sua estrutura, en-
quanto que as antocianinas retomam a forma inicial.
Para estudos com finalidades apenas de deteco da presena de
antocianinas em extratos vegetais, o teste de cromatografia em papel
suficiente. Em estudos com finalidade de identificao de antocianinas
1221 Procedimentos analticos para identificao de antocianinas presentes em extratos naturais Vol. 31, No. 5
individuais, a cromatografia em papel deve ser encarada apenas como
teste preliminar pois, neste caso, existe a necessidade de purificao,
melhor separao e isolamento das antocianinas. A cromatografia em
camada delgada (CCD) pode ser uma alternativa atraente para a
cromatografia em papel, pois fases estacionrias diferentes podem ser
empregadas, possibilitando diferentes mecanismos de separao. As
principais vantagens da CCD quando comparada CP so a versatili-
dade e sensibilidade.
24
No entanto, apesar de um custo mais elevado,
as tcnicas mais avanadas apresentam melhor eficincia, melhor re-
soluo e resultados mais confiveis na separao, como o caso da
cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), eletroforese capilar
por zonas (ECZ) e cromatografia contra-corrente de alta velocidade
(CCCAV High-speed countercurrent chromatography, HSCCC).
Vrios mtodos tm sido utilizados com sucesso para a purifica-
o dos extratos brutos de antocianinas, contudo, o mtodo mais utili-
zado atualmente a extrao em fase slida (Solid Phase Extraction,
SPE) em cartuchos C
18
e Sephadex. Isto se deve simplicidade relati-
va para eliminao das impurezas, tais como substncias polares e
no fenlicas. O procedimento para purificao das antocianinas en-
volve a aplicao do extrato antocinico bruto no cartucho contendo
material sorvente, seguido da eluio dos componentes individuais
com solventes apropriados. As antocianinas ficam fortemente ligadas
aos adsorventes por seus grupos hidroxil no-substitudos. Desta for-
ma, primeiramente so eludas as substncias mais polares que as
antocianinas, tais como acares, cidos e substncias solveis, e pos-
teriormente so eludos os pigmentos antocinicos.
3,12,25,26
Para a separao das antocianinas, tcnicas como a cromatografia
lquida de alta eficincia (CLAE), cromatografia contra-corrente
(CCC)
18
e eletroforese capilar por zonas (ECZ)
27
tm sido as mais
utilizadas. A cromatografia em papel e a cromatografia em camada
delgada tambm podem ser utilizadas na etapa de separao, no en-
tanto, no oferecem nenhuma outra vantagem alm do custo quando
comparadas com, por exemplo, a eficincia de separao apresenta-
da por CLAE e ECZ. Quando se trabalha com grandes quantidades
de extrato, uma alternativa a cromatografia em coluna aberta.
Atualmente, a tcnica mais utilizada, e uma das principais, para
separao de antocianinas a CLAE com fase reversa. Este tipo de
cromatografia utiliza instrumentos sofisticados que podem ser total-
mente automatizados. um tipo de cromatografia lquida que em-
prega colunas fechadas, recheadas de materiais especialmente pre-
parados e uma fase mvel que eluda a altas presses, apresentan-
do a capacidade de realizar separaes de uma grande quantidade de
compostos presentes em vrios tipos de amostras, em escala de tem-
po de poucos minutos, com alta resoluo, eficincia e sensibilida-
de. Alm de permitir excelente separao, esta tcnica possibilita
simultaneamente separar, identificar e quantificar pigmentos
antocinicos sem requerer purificao excessiva dos extratos.
25
Uma outra tcnica que pode ser empregada na separao de
antocianinas a cromatografia contra-corrente de alta velocidade
(HSCCC), descrita como um processo de separao no qual uma fase
lquida retida no espiral da coluna por fora centrfuga, enquanto
uma segunda fase lquida imiscvel passa continuamente por ela. Por
se tratar de uma tcnica de suporte-livre lquido-lquido, a reteno
dos solutos determinada exclusivamente por seus coeficientes de
partio, e o problema da adsoro dos solutos na fase estacionria
eliminado.
28
Segundo alguns autores,
29-31
as maiores vantagens desta
tcnica de separao quando comparadas com CLAE preparativa so
as menores quantidades de fase mvel requeridas, a no adsoro dos
analitos (compostos de interesse) na fase estacionria e a completa
recuperao da amostra. No entanto, a CLAE apresenta melhor reso-
luo e menor tempo de anlise que a tcnica de HSCCC.
As antocianinas encontradas na natureza so mveis em um cam-
po eltrico. Baseando-se neste fato, a eletroforese capilar, que uma
ferramenta analtica relativamente nova, tambm pode ser utilizada
na separao de antocianinas.
3
Em 2003, Senz-Lpez et al.
27
desen-
volveram um mtodo utilizando CZE para determinao de
antocianinas em vinho, mostrando que a tcnica pode ser uma ferra-
menta muito til para anlise de antocianinas. Recentemente, o mes-
mo grupo fez uma seqncia de estudos sobre antocianinas, tais como
ordem de migrao de antocianinas em vinhos
32
e anlise de vinho
envelhecido
33
utilizando CZE. A eletroforese capilar tem como van-
tagens alta sensibilidade, alta resoluo, baixo consumo de amostra
e gerao mnima de resduos. No entanto, quando comparada
CLAE, apresenta menor sensibilidade e menor eficincia na separa-
o
34
de antocianinas em amostras complexas, o que deve ser o fator
limitante, resultando na baixa quantidade de trabalhos publicados
utilizando esta tcnica para a separao de antocianinas.
A cromatografia gasosa outra tcnica que pode ser emprega-
da na separao de antocianinas. Nesta tcnica, a separao ba-
seia-se na diferente distribuio das substncias da amostra entre
uma fase estacionria slida ou lquida e uma fase mvel gasosa.
De acordo com o tipo de fase estacionria utilizada, a cromatografia
gasosa pode ser classificada em cromatografia gs-slido,
cromatografia de fase ligada e cromatografia gs-lquido, sendo
esta ltima a forma mais utilizada de cromatografia gasosa. Esta
tcnica mais utilizada para a separao de gases ou substncias
volteis,
21
no entanto, devido ao fato das antocianinas no apresen-
tarem volatilidade, existe a necessidade de derivatizao dos pig-
mentos, processo que dificulta o uso desta tcnica.
As tcnicas de hidrlise podem servir como um complemento para
a identificao de antocianinas, auxiliando na separao das
antocianinas de seus acares e cidos ligados. A hidrlise cida ge-
ralmente realizada com cido clordrico concentrado em temperatu-
ras relativamente altas, provocando a ruptura das ligaes glicosdicas,
levando ao aparecimento dos acares e suas antocianidinas. As
antocianidinas e os acares podem, ento, ser identificados por tc-
nicas como cromatografia em papel. Para a identificao das
antocianidinas desejvel a comparao com padres. No caso da
hidrlise alcalina, provocada a ruptura entre as ligaes dos grupos
acil. A anlise desses grupos pode ser realizada aps a extrao do
solvente por tcnicas como espectroscopia e cromatografia.
25
Uma vez separadas e purificadas, as antocianinas podem ser
identificadas por vrias tcnicas, sendo que as mais utilizadas
so a espectrometria de ressonncia magntica nuclear de carbo-
no (RMN
13
C) e de prton (RMN
1
H), e espectrometria de massas
(MS), que, na maioria das vezes, aparece combinada com CLAE.
A introduo dos sistemas de deteco por arranjo de diodos
(DAD) e sua utilizao quando acoplado com CLAE abriram no-
vas perspectivas para a separao, identificao e quantificao
de antocianinas, devido possibilidade de se obter espectros com-
pletos na regio ultravioleta/visvel durante as anlises cromato-
grficas. Os mtodos de deteco e identificao de antocianinas
alm das tcnicas de espectrofotometria UV-Vis, podem envol-
ver sistemas de deteco de espectrometria de massas (MS) e
ressonncia magntica nuclear (RMN).
25
Para a identificao das antocianinas em alimentos e plantas po-
dem ser utilizados dois procedimentos: comparao direta, quando h
disponibilidade de padres, ou comparao indireta, se no houver
material padro. Neste caso, segundo Harborne,
15
uma comparao
cuidadosa com dados da literatura pode ser aceitvel. A comparao
indireta, embora seja um mtodo sujeito a erros, justificada pela
falta de padres e pelo longo e trabalhoso procedimento para identifi-
cao. No caso de uma nova espcie, o uso de tcnicas como CLAE,
RMN
13
C e RMN
1
H, MS, alm da combinao destas tcnicas, po-
dem fornecer informaes que ajudam na caracterizao do pigmen-
to. A tcnica de CLAE est na grande maioria das vezes apenas na
1222 Quim. Nova Maro et al.
etapa de separao, pois existe uma grande dificuldade na identifica-
o de antocianinas, no apenas em CLAE, mas em todas as outras
tcnicas, devido falta de padres de pigmentos antocinicos.
Com o intuito de minimizar a dificuldade da falta de padres e
dos trabalhosos procedimentos para a identificao de antocianinas,
em 1999, Goiffon et al.
35
propuseram um mtodo para identificao
baseado nos parmetros que afetam a reteno da cromatografia l-
quida. Na metodologia proposta, os autores relacionam o tempo de
reteno de vrias antocianinas com o tempo de reteno de uma
antocianina que est presente na maioria das frutas vermelhas: a
cianidina-3-glucosdeo. Sugere-se que essa relao dos tempos de
reteno () seria a forma de identificar as diferentes antocianinas.
Dessa forma, a identificao de antocianinas em frutas facilitada
consideravelmente, minimizando o problema da falta de padres.
Goiffon et al. determinaram o valor de para 40 antocianinas e
antocianidinas utilizando 2 tipos de eluentes, enquanto que na mai-
oria dos trabalhos descritos na literatura para identificao de
antocianinas cita-se apenas um tipo de fase mvel.
A espectrofotometria UV-Vis uma ferramenta auxiliar muito
importante nas anlises de antocianinas, principalmente quando
acopladas com tcnicas como a CLAE. As antocianinas apresentam
diferentes perfis espectrais dependendo do pH, devido predomi-
nncia de diferentes estruturas em cada meio, como pode ser ob-
servado na Figura 4. Segundo alguns pesquisadores, como Francis,
20
quando a antocianidina e o(s) acar(es) (so) conhecido(s), os
dados espectrais podem ser ferramentas muito teis na determina-
o da posio da ligao glicosdica. Este autor afirma que quan-
do uma antocianina possui uma molcula de acar ligada ao car-
bono da posio 5, em meio cido, observa-se um ombro na banda
de absoro em 440 nm, alm da banda do ction flavlico em 520
nm. No entanto, mesmo servindo como ferramenta complementar
para as anlises qualitativas, quando utilizada em conjunto com
anlises por CLAE, a espectrofotometria UV-Vis, quando aplicada
sozinha, apresenta maior utilidade em anlises quantitativas.
Uma aplicao interessante da espectrofotometria UV-Vis no
campo da identificao de antocianinas foi realizada em 2000 por
Cabrita et al.,
36
onde foi proposta a identificao de grupos de
antocianinas. Os autores relatam que as antocianinas podem ser di-
vididas em dois grandes grupos de acordo com o perfil da curva
obtida no comprimento de onda de mxima absoro de cada
antocianina em funo do pH. As curvas caractersticas de cada gru-
po podem ser explicadas pelos grupos substituintes no anel B da
estrutura fundamental das antocianinas (Figura 2a). O nmero de
substituintes oxigenados (hidroxi ou metoxi) no anel B causa um
efeito batocrmico em valores de pH relativamente baixos, bem como
para valores de pH altos. Assim, os grupos hidroxi e metoxi apresen-
tam efeitos similares sobre as formas cromforas azuladas presentes
no equilbrio. Nesse trabalho foram utilizados morangos, arroz, Abies
koreana e blueberries como fontes de antocianinas, sendo que os
mesmos passaram por processos de purificao e isolamento com
CLAE de fase-reversa para posterior identificao utilizando-se res-
sonncia magntica nuclear, comprovando que a espectrofotometria
uma excelente ferramenta complementar nas anlises de
antocianinas. Mesmo apresentando como vantagem custo relativa-
mente baixo quando comparada com as tcnicas mais avanadas,
devido grande quantidade de substncias presentes em um extrato
vegetal, no se pode confiavelmente afirmar sobre a estrutura de um
pigmento apenas pela observao do espectro UV-Vis obtido.
Uma tcnica que pode disponibilizar excelentes informaes
sobre a frmula molecular de uma antocianina a espectrometria
de massas (MS). A espectrometria de massas, em sua essncia,
consiste na gerao de ons pela fragmentao das molculas da
amostra e a deteco dos fragmentos feita de acordo com a mas-
sa.
15
Os ons positivamente carregados produzidos so acelerados
em um campo magntico que dispersa e permite medidas relativas
de ons de diferentes razes massa/carga. O resultado da medida
da abundncia dos ons versus a massa constitui o espectro de mas-
sas, que consiste de uma srie de linhas variando em intensidade
em diferentes unidades de massa. Para a anlise de antocianinas,
geralmente empregam-se fontes de bombardeamento rpido de to-
mos
37
(Fast Atom Bombardment, FAB) e spray de eltrons
(Electrospray Ionization, ESI). Uma caracterstica importante da
ESI est no fato de que as amostras devem ser introduzidas na
forma de soluo, tornando possvel o acoplamento com muitas
tcnicas de separao, como a CLAE. A vantagem da tcnica de
espectrometria de massas est na capacidade de indicar a frmula
molecular exata da substncia sem a necessidade de grandes quan-
tidades de amostra, pois a tcnica pode trabalhar com quantidades
a nvel trao.
15
No entanto, deve-se tomar cuidado com a presena
de ismeros, o que provavelmente seu fator limitante. A melhor
forma de preveno contra este erro deve estar nas etapas de puri-
ficao e isolamento, aps deteco da presena de antocianinas
no extrato.
Com a possibilidade de utilizao de equipamentos avanados
que fornecem informaes tais como espectro de massa e RMN de
carbono e prtons, o procedimento para a elucidao da estrutura
de uma antocianina deve, em sua primeira etapa, levar ao reconhe-
cimento da frmula molecular, pois assim se pode ter uma idia
geral da molcula (isto , o nmero e o tipo de tomos). A obten-
o da frmula molecular comea com a localizao do pico do
on molecular obtido pelo espectro de massas. A partir deste ponto
os espectros de RMN podem trazer as informaes sobre a locali-
zao dos tomos de carbono e hidrognio na estrutura da molcu-
la. Observa-se que a confiabilidade dos resultados estar relacio-
nada com a pureza atingida.
A espectroscopia de ressonncia magntica nuclear (RMN) pode
disponibilizar informaes para a determinao da estrutura de um
composto orgnico, atravs da medida dos momentos magnticos de
tomos de carbono e hidrognio.
15
A espectroscopia RMN basica-
mente uma outra forma de espectroscopia de absoro, onde, sob con-
dies apropriadas em um campo magntico, uma amostra pode absor-
ver radiao eletromagntica na regio de radiofreqncias em uma
freqncia regida pelas caractersticas estruturais da molcula, sendo
que a absoro funo de determinados ncleos da molcula.
38-40
A tcnica de espectroscopia de RMN mais eficiente para a
elucidao estrutural a RMN em duas dimenses. As duas dimen-
ses referidas no espectro 2-D so os eixos de freqncia, onde o
experimento exige duas transformadas de Fourier perpendiculares
entre si em dois eixos de tempo independentes, que levam a dois
eixos de freqncia ortogonais.
39
Uma das maiores vantagens de se
trabalhar com RMN em comparao com tcnicas como, por exem-
plo, a CLAE na identificao de antocianinas est no fato da no
necessidade de padres. No entanto, as dificuldades para este mto-
do esto na complexidade dos espectros e na influncia do solvente.
O acoplamento de diferentes tcnicas instrumentais constituin-
do os instrumentos hifenados ou tcnicas de segunda ordem, tais
como a cromatografia lquida com deteco por espectrometria de
massas ou deteco na regio UV-Vis atravs de um sistema de ar-
ranjo de diodos, vem sendo cada vez mais aplicado em laboratrios
de qumica analtica por permitir a obteno de informaes adicio-
nais provenientes da correlao de diferentes respostas, como por
exemplo, um espectro de absoro e um perfil cromatogrfico, obti-
dos simultaneamente de uma mesma amostra.
41,42
O uso de tcnicas
hifenadas, combinando separao e identificao das antocianinas,
comum. Desta forma, a identificao das antocianinas fica facili-
tada pela quantidade de informaes que pode ser disponibilizada
1223 Procedimentos analticos para identificao de antocianinas presentes em extratos naturais Vol. 31, No. 5
por estes equipamentos. Isto se deve alta seletividade, melhora no
limite de determinao e reduo no tempo de anlise.
5
O rpido e continuo desenvolvimento na instrumentao nos
ltimos anos, em particular aqueles que envolvem espectroscopia
de ressonncia magntica nuclear e espectrometria de massas, tem
proporcionado considervel mpeto para a elucidao estrutural em
todos os campos da qumica de produtos naturais. Para as
antocianinas, isto significa que estruturas extremamente comple-
xas podem ser determinadas. Em geral, essas determinaes no
requerem derivatizaes contnuas ou degradaes, porm, o uso e
a manuteno de equipamentos mais sofisticados eleva significati-
va o custo, limitando desta forma seus usurios e aplicaes.
Uma das maiores dificuldades da resoluo espectrofotomtrica
de sistemas qumicos a estimativa do nmero, da concentrao e
dos espectros das espcies envolvidas no sistema. Diferentes tcni-
cas estatsticas multivariadas tm sido utilizadas para se encontrar a
melhor metodologia para extrair informao destes sistemas, com o
objetivo de identificar as espcies presentes e determinar qualitati-
vamente e quantitativamente as concentraes de algumas ou todas
elas. Essas tcnicas so conhecidas como mtodos quimiomtricos. A
aplicabilidade de cada metodologia depende do conjunto de dados
(informao experimental) submetidos anlise.
43
Em pesquisas re-
centes, foram utilizados mtodos quimiomtricos associados a da-
dos espectrofotomtricos para auxiliar na identificao de
antocianinas extradas de flores do gnero Hibiscus.
44-46
Nestes tra-
balhos, observa-se que com a aplicao de mtodos quimiomtricos
em dados espectrofotomtricos, foi possvel identificar antocianinas
sem a utilizao de tcnicas muito dispendiosas: identificaram-se
equilbrios entre diferentes formas de antocianinas, onde os valores
calculados para as constantes de equilbrio se encontram em exce-
lente concordncia com valores sugeridos pela literatura.
CONCLUSES
No geral, observa-se que uma das maiores dificuldades na iden-
tificao das antocianinas individuais a falta de padres, e que a
escolha do mtodo a ser utilizado depende do objetivo da anlise.
Para a deteco da presena de antocianinas em um vegetal, um
simples teste utilizando-se cromatografia em papel pode ser sufi-
ciente. Mtodos pticos como UV-Vis so ferramentas comple-
mentares muito teis para a caracterizao de antocianinas. Identi-
ficaes de antocianinas individuais exigem mtodos mais avana-
dos como CLAE, espectroscopia RMN e espectrometria de mas-
sas. A combinao destas tcnicas pode trazer informaes sufici-
entes para a completa elucidao da estrutura de uma antocianina,
no entanto, devem-se tomar os devidos cuidados com anlise de
istopos no caso da MS, na escolha do solvente em RMN, alm de
um cuidado especial na etapa de separao e isolamento, que pode
influenciar em todo o resultado final.
De acordo com as pesquisas realizadas at hoje, fica claro que
no existe um critrio definido para a caracterizao de novas
antocianinas presentes em novas plantas.
AGRADECIMENTOS
P. H. Maro agradece Fapesp (processo 04/09231-6) pelo apoio
financeiro.
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