TESTE DE ELISA

O teste de ELISA (do ingls Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay)

se baseia reaes antgeno-anticorpo detectveis atravs de reaes
enzimticas.
A enzima mais comumente utilizada nestas provas a peroxidase, que
catalisa a reao de desdobramento da gua oxigenada (H2O2) em H2O mais
O2.
Existem vrios modelos de testes de ELISA; em sua forma mais simples,
chamada ELISA indireto, um antgeno aderido a um suporte slido (placa de
ELISA) preparado; a seguir coloca-se sobre este os soros em teste ( ex. soro
humano), na busca de anticorpos contra o antgeno. Se houver anticorpos no
soro em teste ocorrer a formao da ligao antgeno-anticorpo, que
posteriormente detectada pela adio de um segundo anticorpo dirigido
contra imunoglobulinas da espcie onde se busca detectar os anticorpos
(humana, no caso), a qual ligada peroxidase. Este anticorpo anti-IgG, ligado
enzima denomina-se conjugado. Ao adicionar-se o substrato apropriado
para a enzima (isto , H2O2 dissolvida em uma substancia qumica que d uma
reao colorida quando H2O2 desdobrada). Os orifcios onde ocorreu a
reao antgeno-anticorpo apresentam uma colorao (varivel dependendo do
substrato).
Outro mtodo o chamado ELISA de bloqueio ou competio, em que a
presena de anticorpos em determinado soro revelada pela competio com
um anticorpo especfico (mono ou policlonal) dirigido contra o antgeno.
Igualmente, o resultado dado pela adio de um conjugado, porm a
colorao aparecer nos orifcios onde no havia anticorpos.
A seguir, temos um modelo de teste de ELISA de bloqueio, desenvolvido
por ns e utilizado amplamente em nosso laboratrio para o diagnstico de
anticorpos contra herpesvrus bovinos.
Mtodo:
1 Sensibilizar as placas de ELISA com o antgeno, previamente diludo
(no nosso exemplo, diludo a 1/200, correspondente diluio considerada
tima em titulaes anteriores), em tampo carbonato (vide frmulas no final),
100 ul por orifcio, e incubar overnight a 4 oC. Isto permitir a ligao do
antgeno placa.
2- No dia seguinte, remover a soluo de antgeno e lavar a placa 3
vezes com lquido de lavagem de ELISA (PBS-T20), em volume de 100 ul por
orifcio.
3- A placa pode ento ser armazenada para uso posterior (em sacos
plsticos fechados a 20 oC, ou utilizada imediatamente.
4- Acrescentar os soros a testar em uma diluio previamente
determinada ( em nosso exemplo), preparada em lquido de lavagem, em
volumes de 100 ul/orifcio. Incubar por uma hora a 37 oC.

5- Remover a diluio dos soros e lavar trs vezes com lquido de

lavagem.
6- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma diluio apropriada do
anticorpo monoclonal (1:1000 em nosso exemplo), preparada em lquido de
lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.
7 - Remover o anticorpo monoclonal e lavar trs vezes com lquido de
lavagem.
8- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma diluio apropriada do
conjugado (anti- IgG de camundongos; 1:1000 em nosso exemplo), preparada
em lquido de lavagem. Incubar por uma hora a 37 oC.
9- Remover a diluio de conjugado e lavar trs vezes com lquido de
lavagem.
10- Acrescentar 100 ml por orifcio de uma soluo de OPD
(ortofenilenodiamina) preparada em tampo citrato-fosfato acrescentado de
0,001% de H2O2. Incubar por 15 minutos a 37 oC.
11- A reao interrompida pela adio de 50 ml por orifcio de uma
soluo de H2SO4 2M.
12- Os resultados so obtidos com base na leitura da densidade tica
(D.O.) em espectrofotmetro com filtro de 492 nm.