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Apostila Pratica Nutricao
Apostila Pratica Nutricao
Instituto biomdico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Apresentao
O aprendizado terico e prtico de microbiologia, incluindo a bacteriologia, muito
importante para o profissional da rea de nutrio.
As reas de atuao em controle microbiolgico de alimentos, treinamento de
manipuladores, tecnologia na produo de alimentos, entre outras, exigem um profundo
conhecimento desta disciplina.
A apostila o material de apoio s aulas prticas disponibilizado aos alunos. Esta contm
explicaes tericas e prticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma
clara e didtica.
A disciplina j possua uma apostila de aulas prticas desde 2001, mas necessria
constante renovao para que os assuntos sejam abordados de maneira atualizada e direta para
despertar o interesse dos alunos.
Cada assunto apresenta uma introduo contendo a teoria do tema abordado, assim como
a sua aplicao e importncia no exerccio da profisso, objetivando o melhor entendimento do
tema, dos materiais a serem utilizados, da execuo e dos resultados obtidos.
No final de cada assunto o aluno poder tirar as suas concluses da prtica executada e
encontrar algumas questes de fixao. A apostila apresenta, tambm, figuras ilustrando a
atividade a ser realizada, facilitando a compreenso do aluno.
Finalmente procurou-se acentuar a importncia e aplicao de cada prtica no contexto
das atividades de um nutricionista de modo a estimular o aprendizado.
Esperamos que voc, aluno, aproveite ao mximo este recurso didtico!
Lembre-se, qualquer dvida, no hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores!
Os autores.
ndice
Cuidados fundamentais
Alguns experimentos que ns realizaremos podem ser perigosos se voc manipular os
materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente.
So necessrias algumas medidas de segurana quando se trabalha com
microorganismos e substncias qumicas, alm de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos
cortantes e outros materiais.
Se voc tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, no hesite em chamar o
professor ou o monitor para te auxiliar.
- Mantenha o microscpio livre de poeira, vapores cidos e do contato com reagentes. Para
mant-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o p e a multiplicao de fungos (Obs: as
capas devem ser lavadas periodicamente).
- No manusear o equipamento com as mos sujas ou molhadas.
- Jamais comer ou beber prximo ao equipamento.
- Na remoo do equipamento, segure-o firmemente com uma das mos no brao e outra na
base, ou com as duas no brao, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de
trabalho de superfcie plana, evitando qualquer movimentao brusca. Nunca desloque o
aparelho com a lmpada acesa ou logo aps ter sido apagada.
- Muita ateno necessria quando se observa a preparao em meio lquido, pois h sempre o
risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho retirar o excesso de lquido com
papel de filtro, antes de colocar a lmina sobre a platina; em de acidente, enxugar
imediatamente com papel absorvente macio.
Fundamentao terica
Meios de Cultura
Naturais
Quanto composio
Definidos
Artificiais
Indefinidos
Quanto
ao
estado Lquido
Semi-slido
Slido
Simples
Enriquecido
De
enriquecimento
Diferencial
Indicadores
De estoque
Tcnicas de Semeadura
De acordo com as caractersticas fsicas dos meios de origem e destino, alm da finalidade
da inoculao, podem-se utilizar diferentes tcnicas de inoculao.
A transferncia de inculo de um meio para outro tambm denominada genericamente
como repique.
A seguir, veremos quais so as tcnicas de inoculao:
Meio inclinado em
tubos
ou
de
pequena
massa
de
Picada
Central:
semear
com
agulha
bacteriolgica, no centro do Agar. Dependendo da
finalidade, o inculo deve penetrar at 2/3 do tubo
ou at o fundo deste.
Objetivo: utilizado para verificar fermentao e
motilidade em algumas tcnicas.
Meio em camada
alta
Meio em placa de
Petri
ou
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
executar e determinar a finalidade das principais tcnicas de semeadura de bactrias em
diferentes meios (lquidos, semi-slidos e slidos), tanto em tubos quanto em placas;
caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um;
identificar e executar as tcnicas de assepsia em laboratrio.
Material
Para a atividade prtica sero utilizados:
- Placa de Petri com Agar
- Tubo com Agar inclinado
- Placa de Petri estril
- Tubo com Agar semi-slido
- Tubo com Agar em camada alta
- Cultura bacteriana em caldo e em Agar
- Amostra de gua em tubo (para a tcnica do pour plate)
- Pipetas estreis
- Ala e agulha bacteriolgicas
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Execuo da prtica
- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colnia com auxlio de uma ala
bacteriolgica e transferir para o tubo com caldo, atravs do processo de difuso.
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- com o auxlio de uma pipeta estril, transferir 1 ml da amostra de gua para uma placa estril e
adicionar o meio fundido, realizando a tcnica do pour plate.
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Exerccios de fixao
1. Qual a diferena entre os meios de enriquecimento e seletivo?
2. Qual a finalidade da tcnica do spread plate ou tcnica do espalhamento?
3. Por que no devemos cruzar as estrias na tcnica do esgotamento em estrias?
4. Por que devem ser realizadas as tcnicas asspticas?
5. Por que utilizamos diferentes meios durante a anlise de um determinado material (p.ex.:
alimento)?
6. Para uma cultura que esteja guardada h muito tempo (sob refrigerao), qual o tipo de meio
devemos utilizar para retornar a utiliz-la numa atividade prtica?
7. Para determinar a presena de um microorganismo especfico num material que esteja muito
contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar?
13
Observaes
14
Fundamentao terica
As bactrias esto presentes em todos os ambientes.
Muitas vezes, sua presena no prejudicial, como os microorganismos que colonizam a
nossa pele e o nosso trato gastrintestinal.
Algumas vezes esta presena at benfica, como a utilizao de microorganismos na
indstria de alimentos na produo de alimentos fermentados, como diversas bebidas. Quem
nunca ouviu falar em alimentos pr e pr biticos? So alimentos que contm em sua composio
microorganismos vivos que, quando no nosso organismo, causam reaes benficas (como
auxiliar a regulao do trnsito gastrintestinal), ou estimulam os microorganismos da nossa
microbiota normal a exercer seu papel benfico no nosso organismo (como a produo de
vitamina K pelas bactrias do nosso trato gastrintestinal).
Mas, nem sempre a relao alimento x microorganismos x homem benfica. Diversos
microorganismos tm a capacidade de nos causar doenas, at mesmo os microorganismos da
nossa microbiota normal (em casos de reduo da atividade imunolgica, causando doenas
oportunistas), e muitos casos podem ser veiculados por alimentos.
importante ressaltar que os alimentos por si s no so fontes de contaminao, mas
podem veicular esta contaminao adquirida, podendo causar doenas. As principais fontes de
contaminao so o solo e a gua, as plantas, os utenslios utilizados na preparao do alimento
(contaminao cruzada), o trato gastrintestinal do homem e de animais, os prprios
manipuladores de alimentos, a rao animal, a pele dos animais, e at o ar.
A indstria de alimentos vem crescendo e a preocupao com a obteno de alimentos
com qualidade tanto do ponto de vista tecnolgico (o alimento deve ser nutritivo, competitivo,
aceitvel no mercado, etc.) quanto microbiolgico (segurana alimentar) est cada vez mais
desenvolvida.
O nutricionista tem papel fundamental nesse controle, pois a manipulao, preparo e
conservao inadequados esto freqentemente associados a doenas (intoxicaes ou
infeces) microbianas. O manipulador de alimentos deve ter treinamento constante para que no
contamine o alimento com tcnicas e hbitos anti-higinicos.
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Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
constatar a presena de bactrias no ambiente;
compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene na produo e manipulao de
alimentos, visando evitar a contaminao dos mesmos por bactrias ambientais ou por portadores
de microorganismos patognicos;
diferenciar fontes de contaminao e veculos de contaminao;
comentar sobre o papel de bactrias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos.
Material
- 2 Placas de Petri com Agar
- swab estril
Execuo da prtica
Bactrias no ambiente:
- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da rea de segurana. Cada grupo deixar
a placa em exposio por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos)
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Exerccios de fixao
1. Qual o papel do nutricionista na qualidade microbiolgica dos alimentos?
2. Por que necessrio tomar medidas de controle no ambiente em que se preparam e/ou
manipulam alimentos?
3. O que contaminao cruzada?
4. Os alimentos podem ser considerados fonte de contaminao?
5. Quais so as principais fontes de contaminao dos alimentos?
Observaes
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Fundamentao terica
Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e compreender seu
modo de ao, importante que alguns conceitos muito utilizados sejam definidos:
Desinfeco: reduo do nmero de microorganismos em uma matria inanimada (ambientes,
superfcies, objetos, alimentos)
Sanitizao: igual a desinfeco (termo utilizado na indstria de alimentos)
Esterilizao: destruio total de microorganismos em um material
Anti-sepsia: reduo do nmero de microorganismos em matria viva (pele)
Assepsia: conjunto de tcnicas e/ou medidas asspticas, que visam a no contaminao de
algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo)
Definidos estes conceitos, podemos comentar sobre os principais meios de controle
microbiano, que pode ser feito atravs de agentes qumicos ou fsicos.
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Calor
mido
O calor mido mais eficaz que o calor seco, pois a gua melhor condutora de calor quando
comparada com o ar.
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Radiaes
No ionizantes
Luz Ultravioleta
- possui atividade mxima num comprimento de onda de 260 nm
- desinfetante
- geralmente utilizado em ambientes
- no penetrante desinfeco apenas superficial
- a lmpada tem vida til de 200 horas (aproximadamente)
- age no DNA microbiano, gerando mutaes letais
Ionizantes
Radiao Gama
- esterilizante
- mais energtico que UV, atua num comprimento de onda menor
- age ionizando componentes celulares, levando morte
- muito utilizado em produtos hospitalares descartveis
- seu uso nas indstrias de alimentos est crescendo
- possui baixo poder de penetrao desinfeco apenas superficial
Filtrao
Clarificante
Esterilizante
- possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vrus.
Outros
Presso osmtica
Adio de NaCl
- tambm conhecida como salga
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano. Tambm pode causar lise osmtica da clula bacteriana.
- muito utilizada em produtos crneos (carne seca, pescado)
Adio de outros slidos (acares)
- utilizado na fabricao de compotas e alimentos em calda
- reduz a atividade de gua do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
- muito empregado para conservao de frutas e hortalias
Dessecao
Liofilizao
Baixas temperaturas
Refrigerao
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lcool Etlico
um dos mtodos qumicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo
custo, relativa eficcia e fcil aplicao. Pode ser usado como desinfetante ou anti-sptico.
Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 70%), pois nessa condio
possui maior poder penetrante.
O lcool absoluto possui poder bacteriosttico, enquanto o lcool hidratado a 70% possui
poder bactericida.
So apontados diversos mecanismos de ao para o etanol:
- ao detergente: solvente de lipdeos
- ao desidratante: retira gua das clulas
- ao desnaturante: agindo sobre protenas celulares
Fenis e Derivados
O fenol um desinfetante fraco, porm utilizado como um desinfetante de referncia
para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto mais
ativo que o fenol.
Atua como desnaturantes de componentes proticos
Dentre os cresis, o mais importante a creolina, uma mistura de cresis muito utilizada
para pisos e sanitrios.
O hexaclorofeno muito utilizado na antissepsia cirrgica.
Halognios
Os principais halognios utilizados no controle microbiano so o Cloro e o Iodo.
Cloro: usado como desinfetante de guas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ao
dado pela reao:
Cl2 + H2O HCl + HClO
O cido hipocloroso instvel, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O2, que eliminar
os microorganismos atravs de oxidao de componentes celulares.
Iodo: reage de forma irreversvel com aminocidos aromticos de protenas celulares
(fenilalanina e tirosina), desnaturando-as. Devido grande possibilidade de alergias, seu uso
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22
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiolgico;
descrever os agentes fsicos e qumicos utilizados no controle microbiano;
entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilizao, diferenciando calor mido
de calor seco
compreender as diferenas encontradas na ao dos diferentes mtodos de anti-sepsia
utilizados.
23
Material
- Culturas bacterianas
- 2 Placas de Petri com Agar
- Solues anti-spticas
- Gaze estril
- Trip e tela de amianto
- Recipiente com gua em ebulio
Execuo da prtica
Agentes Qumicos
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- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espao respectivo ao
tempo 0
- para os prximos espaos, colocar as culturas em banho-maria fervente at atingir o tempo
especificado:
- 5 minutos reinocular
- 10 minutos reinocular
- 20 minutos reinocular
Exerccios de fixao
1. Qual a diferena entre anti-sepsia e assepsia?
2. Qual o modo de ao do calor seco? E do calor mido? Qual o mais eficaz?
3. Qual o tipo de calor mais utilizado para a indstria de alimentos? Por qu?
4. Por que o lcool etlico utilizado como desinfetante e anti-sptico deve ser hidratado?
5. Qual o mecanismo de ao dos cidos utilizados na conservao de alimentos?
6. Por que a autoclave, embora funcione numa temperatura muito mais baixa que os fornos ou
estufas de esterilizao, tambm possuem ao esterilizante?
25
Observaes
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Fundamentao terica
A colorao de Gram baseia-se na diferena das paredes celulares das diversas bactrias
e como estas sero coradas de forma distinta.
As bactrias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoprotena
recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoprotenas e substncias
lipdicas. J as consideradas Gram positivas possuem uma nica e espessa camada de
glicoprotena.
Antes de iniciar a colorao, necessrio fazer um esfregao, ou seja, pegar uma colnia
previamente isolada ou uma alada de uma cultura pura e transferir para uma lmina limpa. Se for
utilizada uma colnia, deve-se adicionar uma gota/alada de soluo salina a 0,9%,
homogeneizando-a. importante que o esfregao seja bem preparado, para que, ao final da
colorao, seja possvel a visualizao das bactrias. Tambm importante no esquecer de fixar
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Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
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Material
- Lminas
- Culturas bacterianas em meio lquido e slido
- Alas e agulhas
- Bateria da colorao de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, lcool, gua)
- Papel de filtro
- leo de cedro (leo de imerso)
- Microscpio
- Bico de Bunsen
Execuo da prtica
Etapas
Transferir uma alada da cultura ou uma colnia Ao fazer o esfregao a partir de diferentes
da placa para uma lmina de microscpio limpa. culturas deve-se observar alguns detalhes:
de placa: deve-se coletar apenas 1 colnia,
espalhando-a pela lmina isso evitar a
observao de colnias diferentes na lmina e
que seja coletado um inculo muito carregado, o
que dificultar a visualizao das clulas
coradas.
de caldo: deve-se coletar apenas uma alada
e espalh-la na lmina isso evita que seja
coletado um inculo muito carregado.
Com o auxlio da ala, espalhar a cultura.
Para o inculo coletado de caldo no
Se tiver sido colhida colnia da placa, adicionar necessrio adicionar soluo salina. Mas para
colnia coletada de placa necessrio fazer a
salina estril para facilitar o espalhamento.
diluio na lmina, evitando que o esfregao
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Passar a lmina com o esfregao sobre a chama importante fixar o esfregao para que este no
do Bico de Bunsen, at que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a
completamente seco.
utilizao de um e outro corantes
Colorao do esfregao
Etapas da Colorao
Cobrir o esfregao com soluo de Cristal O Cristal Violeta penetra a parede de ambos os
Violeta por cerca de 1 minuto.
tipos de clulas (Gram + e Gram -)
A seguir, lavar em gua corrente com o A lavagem com gua importante aps cada
pissete.
etapa para que uma substncia utilizada no
interfira na ao da prxima.
Nesse caso, a lavagem serve para retirar o
excesso de corante.
30
Cobrir o esfregao com soluo de Lugol fraco O Lugol uma soluo de Iodo e funciona como
por cerca de 1 minuto.
mordente neta etapa da colorao, ou seja, ele
fixa o corante Cristal Violeta na parede da clula,
pois forma um complexo grande: o CV-I
Novamente lavar com gua, e ento lavar com O lcool absoluto, ou soluo de lcool-acetona,
lcool absoluto at que no saia mais corante funciona como diferenciador da colorao:
da lmina (10 15 segundos).
nas Gram +, o lcool desidrata a matriz
glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os
poros da parede e impedindo a sada do
complexo CV-I, corando a clula de roxo:
Lavar com gua corrente em abundncia, importante prestar com bastante ateno nesta
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Cobrir o esfregao com fucsina por cerca de A fucsina age de diferentes formas nas
30 segundos.
diferentes clulas:
nas Gram +, os poros esto reduzidos,
impedindo que a fucsina penetre na parede
celular, no alterando a cor roxa:
Lavar com gua e secar suavemente com Aps secar suavemente a lmina, observar ao
papel.
microscpio na objetiva de imerso (100x), com
leo de cedro/mineral e identificar a clula
corada.
Para decorar!!!
Vi
Lulu
Ali
A
Fumar
(Cristal Violeta) (Lugol) (lcool) (gua) (Fucsina)
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Exerccios de fixao
1. Em que se baseia o mtodo da colorao de Gram?
2. Por que o lcool considerado como agente diferenciador da colorao de Gram?
3. Qual o papel do mordente (lugol)?
Observaes
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Fundamentao terica
Uma bactria considerada sensvel a um antimicrobiano quando o seu crescimento
inibido, in vitro, por uma concentrao trs, ou mais vezes, inferior quela que o antimicrobiano
atinge no sangue, caso contrrio ela considerada resistente. O meio termo (bactrias
moderadamente resistentes) dado por aquela cujo crescimento inibido por concentraes
intermedirias. Na interpretao dos resultados, consideramos as bactrias intermediariamente
resistentes como resistentes.
A concentrao inibitria do antimicrobiano pode ser determinada direta ou indiretamente.
A determinao direta feita pelos chamados mtodos da diluio, e, a indireta, pelo mtodo de
difuso em placa com discos impregnados com as drogas.
- Mtodo de Diluio (MIC): No mtodo de diluio, concentraes variadas do
antibitico, obtidas pela diluio em Caldo ou Agar, so inoculadas com o microrganismo. A
concentrao mais baixa do antibitico que evita o crescimento aps a incubao de 12 a 24
horas a concentrao inibitria mnima, a medida da sensibilidade.
- Mtodo da Difuso do Disco: Nos testes pelo mtodo de difuso, discos de papel
impregnados com o antibitico so colocados uniformemente na superfcie do Agar semeado com
o microrganismo. Forma-se, ento, um gradiente de concentrao pela difuso do antibitico a
partir do disco para o Agar com conseqente inibio do crescimento do microorganismo sensvel
ao determinado (os) antibitico (os).
Devido sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os mtodos de
difuso com disco (de Bawer e Kirby) tm preferncia sobre os de diluio para os testes de
rotina, mas indispensvel que sejam, rigorosamente padronizados, pois a presena de algumas
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Mecanismo de ao
Classes de antimicrobianos
Antimicrobianos
- agem na etapa da sntese da parede que - b-lactmicos (penicilina,
que atuam a nvel ocorre externamente membrana plasmtica monobactmicos)
da parede celular
- impedem a unio de cadeias peptdicas
- aumentam atividade das autolisinas
- se ligam face externa da membrana
Antimicrobianos
que atuam a nvel
da
membrana
citoplasmtica
Antimicrobianos
- aminoglicosdeos e tetraciclinas: se ligam
que atuam a nvel subunidade 30s do ribossomo, tornando-o
dos ribossomos
no funcional, impedindo a incorporao de
aminocidos
- cloranfenicol, lincomicina e clindamicina: se
ligam subunidade 50s do ribossomo,
impedindo a unio de novos aminocidos
- eritromicina: se liga subunidade 50s do
ribossomo e impede a translocao
Aminoglicosdeos
(estrptomicina, gentamicina)
- Tetraciclinas (tetraciclina,
doxiciclina)
- Cloranfenicol
- Macroldeos (eritromicina
Estreptograminas
(lincomicina, clindamicina)
Antimicrobianos
- metronidazol: reduzido, se tornando txico
que atuam a nvel e quebrando a molcula de DNA
do DNA
- rifampicina: combinam-se com RNApolimerases, bloqueando a transcrio do
DNA
- derivados quinolnicos: inibem a ao das
girases
- Metronidazol
- Derivados quinolnicos
(cido
naxadlico,
ciprofloxacino)
- Macroldeos (rifampicinas)
Antimicrobianos
que atuam a nvel
do
metabolismo
intermedirio
10
Concentrao
300
aproximada de
microrganismos
(x106/ml)
600
900
1.200
1.500
1.800
2.100
2.400
2.700
3.000
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
conceituar antibiograma (TSA) e identificar os grupos ou quadros clnicos nos quais o
antibiograma indicado;
diferenciar os mtodos de diluio (CIM ou MIC) do mtodo de difuso e descrever as etapas
para a realizao deste ltimo;
compreender a influncia de alguns fatores no dimetro do halo e inibio;
ler e interpretar resultados possveis de um antibiograma;
citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito atravs de outras tcnicas.
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Material
- Cultura bacteriana
- Tubo com soluo salina estril
- Swab estril
- Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland
- Pipeta estril
- Placa de Agar Mueller-Hinton
- 4 discos de antibiticos diferentes
- Pina
- Rgua graduada
Execuo da prtica
- ajustar a densidade do inculo acrescentando a cultura soluo salina at esta se igualar
turvao do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste feito por turbidez, e no
pela cor que o caldo se apresenta).
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Agar Mueller-Hinton
Composio do Meio (g/L)
Infuso desidratada de carne
Casena hidrolisada
Amido
Agar
Observaes
300,0
17,5
1,5
17,0
Smb.
Conc.
disco
Intermedirio
Sensvel
BB
30 mcg
14
15-18
17
10mcg
11
12-13
14
10 mcg
20
21-28
29
Ampicilina ao testar
Haemophilus sp.
10 mcg
19
20
Amicacina
AP
38
NA
30 mcg
13
14 -18
19
Bacitracina
BC
10 un.
9-12
13
100 mcg
17
18-22
23
100 mcg
13
14-16
17
30 mcg
14
15-17
18
Cefoxitina
14
15-17
18
2 mcg
14
15-16
17
Cloranfenicol
CO
30 mcg
12
13 -17
18
Colistina
CL
10 mcg
9-10
11
Eritromicina
EL
15 mcg
13
14-17
18
Estreptomicina
ET
10 mcg
11
12 -14
15
Gentamicina
GN
10 mcg
12
13-14
15
Konanilcina
KN
30 mcg
13
14-17
18
Nalidxico cido
AN
30 mcg
13
14-18
19
Neomicina
NO
30 mcg
12
13-16
17
Nitrofurantona
NT
300 mcg
14
15-16
17
Novoblocina
NV
30 mcg
17
18-21
22
Oxocilina
OX
6 mcg
10-13
14
Penicilina G. ao testar
Estafilococos
PN
10 un.
20
21-28
29
outros PN
10 un.
11
12-21
22
CT
Penicilina G. ao
microorganismos
testar
Penicilina G.
PL
500 un.
0-11
12
Polimixina
09-11
12
Sulfa-Trimetropim
STX
30 mcg
10
11-15
16
+ SFT
25 mcg
10
11 -15
16
Sulfazotrim
Trimetoprim)
(Sulfamotoxazol
Sulfonamidas
SF
300 mcg
12
13-16
17
Tetraciclina
TT
30 mcg
14
15-18
19
Tobramicina
TB
10 mcg
12
13-14
15
Vancomicina
VC
30 mcg
10-11
12
39
Exerccios de fixao
1. Qual a diferena entre os mtodos de difuso e impregnao em discos?
2. Por que o mtodo de impregnao do antimicrobiano em discos mais utilizada?
3. Qual a importncia da inoculao ser realizada de modo correto, permitindo crescimento
confluente?
4. Podemos comparar os halos de inibio obtidos com antimicrobianos diferentes ou em
diferentes concentraes?
Observaes
40
Fundamentao terica
Staphylococcus
41
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
Cocos Gram-positivos
Pigmentao Colonial
Amarela ou Branca
Branca
Branca
Catalase
Coagulase
+/-
Fermentao do Manitol
DNAse
Sensibilidade a Novobiocina
Reduo de Nitratos
Streptococcus
42
43
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
compreender o papel dos manipuladores de alimentos como potenciais reservatrios de S.
aureus produtores de enterotoxinas;
caracterizar e compreender o modo de ao dos meios utilizados para o isolamento de
Staphylococcus (Chapman ou A. Manitol Salgado) e Streptococcus (Agar Sangue);
caracterizar e compreender as provas bsicas de identificao e diferenciao de
Staphylococcus e Streptococcus (catalase, coagulase e DNAse), compreendendo o mecanismo
de ao destas.
Material
- swabs estreis
- tubo com soluo salina
- Agar Chapman
- Caldo Tioglicolato (ou Hitchens-Pike).
44
Execuo da prtica
- colher material da nasofaringe (fossas nasais) com o auxlio de swab previamente umedecido
em soluo salina estril e inocular o meio Chapman com a tcnica de esgotamento em estria e
incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema a seguir:
45
- utilizando os reativos prprios, fazer as leituras das provas de catalase (H2O2), DNAse (HCl 1N)
e coagulase (plasma de coelho citratado)
46
OBSERVAO:
As principais provas bioqumicas utilizadas para a identificao de bactrias do gnero
Staphylococcus so:
Fermentao do Manitol: a primeira prova a ser realizada, j na primeira etapa da prtica.
verificada no meio de Chapman, ou Agar Manitol Salgado, que contm o indicador de pH
vermelho de fenol. Quando o microorganismo utiliza o manitol como fonte de carbono
(fermentando-o), produz cido no meio, reduzindo o pH e alterando a cor do indicador de
vermelho (laranja) para amarelo. Caso o microorganismo seja isolado em Agar Sangue, a prova
pode ser realizada em Caldo Vermelho de Fenol suplementado com 1,0% de manitol.
Prova da Catalase: se destina a verificao da presena da enzima catalase, uma superoxidodismutase. A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio com formao de
gua e oxignio molecular (H2O2 + catalase H2O + O2). A prova pode ser efetuada com o
crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue, pois este
possui catalase, levando a resultados falso-positivos. A verificao da produo dessa enzima por
determinada bactria pode ser feita adicionando-se perxido de hidrognio (H2O2 a 30%) cultura
em meio slido ou lquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Se o
microorganismo produzir catalase, o resultado positivo ser visto como desprendimento de gs
sobre colnia (borbulhamento).
Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento
em Agar Sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de perxido em uma
rea do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colnia a ser testada.
Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais rpido e intenso sobre a colnia.
Prova da Coagulase: Verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plasma atravs
da enzima coagulase. A coagulase estafiloccica se apresenta em duas formas: coagulase ligada
e coagulase livre.
A coagulase ligada converte fibrinognio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores
de coagulao, e pode ser detectada em teste direto em lmina, utilizando-se da suspenso de
Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e
observando-se a formao de cogulo no tempo de 1-2 minutos. Pode se tornar mais sensvel o
47
Agar Chapman
Composio do Meio (g/L)
Extrato de carne
Peptona
Manitol
Cloreto de sdio
Vermelho de fenol
Agar
Observaes
1,0
10,0
10,0
75,0
0,025
15,0
Observaes
5,0
15,0
5,5
0,5
2,5
0,5
0,001
0,75
Agar Sangue
Composio do Meio (g/L)
Triptona
Peptona neutralizada
Extrato de levedura
Cloreto de sdio
Sangue de carneiro
Agar
Observaes
14,0
4,5
4,5
5,0
7,0
12,5
Observaes
Agar DNAse
50
Observaes
20,0
2,0
5,0
12,0
** O Caldo simples (TSB) e o Agar inclinado (TSA) so meios simples, sem nenhum nutriente de
enriquecimento ou nenhum componente inibidor ou indicador, por isso, suas composies no
sero estabelecidas aqui. Caso haja interesse, disponibilizamos os Manuais de Meios aos alunos.
Exerccios de fixao
1. Qual a finalidade do Agar Chapman na primeira etapa da aula prtica?
2. De que maneiras podemos diferenciar os estreptococos dos enterococos?
3. Qual o mtodo de classificao de estreptococos foi utilizada na aula? Em que estase baseia?
4. Quais as principais provas para identificao bioqumica de estafilocococs e quais os seus
fundamentos?
5. Qual a finalidade da tcnica da Jarra com Vela?
Observaes
51
Fundamentao terica
O gnero Mycobacterium contm grande nmero de espcies, as patognicas de maior
importncia para o homem so Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e
Mycobacterium bovis. Com exceo da Mycobacterium leprae (que s pode ser cultivado em
cultura de clulas), as micobactrias podem ser cultivadas em laboratrio (in vitro), em meio de
cultura seletivo.
As bactrias desse gnero so bacilos finos, diferentes das demais bactrias em vrias
propriedades, a comear pela parede celular que composta de cidos graxos de cadeia longa
(cidos miclicos) e ceras (steres de cidos graxos). So aerbias estritas, possuindo tropismo
pela rvore respiratria. No so produtoras de esporos e possuem crescimento lento, graas
composio de sua parede celular, de carter altamente lipdico, dificultando a absoro de
nutrientes. Por esse mesmo motivo as micobactrias no se coram pela Colorao de Gram. Sua
parede celular rica em substncias lipdicas, como ceras e cidos graxos de cadeia longa, dificulta
a penetrao dos corantes utilizados neste mtodo. A velocidade de crescimento e a temperatura
tima para seu crescimento so variveis.
52
Positivo (+)
Positivo (++)
1 a 10 bacilos/campo em 50 campos
Positivo (+++)
Objetivo
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
executar a tcnica da colorao de Zihel Neelsen;
diferenciar a colorao de Zihel Neelsen da colorao de Gram;
relacionar a composio qumica da parede celular das micobactrias com os corantes de
Zihel;
diferenciar BAAR e BNAAR;
compreender o princpio do mtodo de Fontana Tribondeau;
53
Material
- Lminas com esfregaos fixados de escarro de paciente com tuberculose
- Fucsina de Zihel
- Azul de metileno
- Soluo de lcool (97%) e cido clordrico (3%)
- gua
- Papel de filtro
- leo de cedro
- Microscpio
- Bico de Bunsen
Execuo da prtica
Etapas
54
Passar a lmina com o esfregao sobre a importante fixar o esfregao para que este no
chama do Bico de Bunsen, at que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a
completamente seco.
utilizao de um e outro corantes
Colorao do esfregao
Etapas da Colorao
55
Lavar o esfregao com soluo de lcool importante que esta etapa seja realizada, pois
etlico:cido clordrico (97:3) at que no haja se restar algum corante na lmina, o prximo
mais desprendimento de corante.
corante a ser utilizado no se fixar na lmina,
no cumprindo seu papel.
56
Lavar com gua e secar suavemente com Aps secar, observar no microscpio, objetiva de
papel.
imerso (100x), com leo de cedro/mineral.
Principal corante
Cristal violeta
Fucsina fenicada
Fixador do corante
Lugol
lcool:cido clordrico
Corante de contraste
Fucsina
Azul de metileno
Exerccios de fixao
1. Em que se baseia o mtodo da colorao de Zihel Neelsen?
2. Por que os corantes desse mtodo so mais agressivos que os utilizados no mtodo de Gram
(por exemplo, a fucisna 5x mais concentrada)?
3. Por que os BAAR no se coram bem pelo mtodo de Gram?
57
Observaes
58
Fundamentao terica
O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminao de origem fecal foi proposto
uma vez que este microorganismo encontrado no trato intestinal do homem e de animais de
sangue quente. O indicador ideal de contaminao fecal deveria ser de rpida e fcil deteco, ser
facilmente distinguvel de outros microorganismos da microbiota do alimento, ter como hbitat
exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais, ocorrer em nmeros muito altos nas
fezes, entre outras caractersticas importantes.
59
60
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
Compreender o papel das enterobactrias como agentes de toxinfeces alimentares;
Caracterizar e compreender o modo de ao do meio EMB utilizado para o isolamento de
bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e no fermentadores da
lactose;
Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactrias;
Caracterizar as provas bsicas de triagem e confirmao bioqumica para identificao e
diferenciao de enterobactrias compreendendo seu mecanismo de ao.
Material
- Reativo de Kovacs
- Vermelho de Metila
- a-naftol VM
- soluo de KOH
61
Execuo da prtica
62
63
GLI
LAC
MAN
H2S
MOT
IND
CIT
VM
VP
URE
Salmonella
Escherichia
Klebsiella
Proteus
+/-
+/-
Observaes
10,0
10,0
2,0
0,4
0,065
15,0
inibidor
para
microorganismos Gram-positivos, graas aos
corantes presentes. As colnias apresentam
colorao
azul-esverdeada
e
algumas
apresentam brilho metlico luz refletida.
Observaes
3,0
3,0
20,0
5,0
10,0
10,0
1,0
0,3
0,3
0,024
12,0
Observaes
0,2
0,2
0,8
2,0
5,0
0,08
15,0
Observaes
20,0
6,1
0,2
0,2
3,5
65
Observaes
10,0
5,0
* gua triptonada: a nica diferena a substituio de peptona por triptona, que melhor fonte
de triptofano.
Caldo Uria
Composio do Meio (g/L)
Peptona
Glicose
Fosfato dissdico
Fosfato monopotssico
Cloreto de sdio
Vermelho de fenol
Soluo de uria a 40%
Observaes
1,0
1,0
1,0
20,8
5,0
0,004
50 (ml)
Observaes
5,0
5,0
5,0
Observaes
5,0
5,0
5,0
0,018
* carboidratos adicionados para verificao de fermentao: glicose (10%), lactose (10%), manitol
(10%)
Exerccios de fixao
1. Por que no podemos dizer que os alimentos so fonte de contaminao?
2. Quais so as provas que compem o conjunto de provas IMVC? Qual o fundamento de cada
prova?
3. Por que o Agar EMB utilizado na primeira etapa? Qual o seu mecanismo de ao?
4. Por que importante observar e registrar a cor de cada meio no momento da inoculao e aps
a incubao?
67
Observaes
68
Fundamentao terica
Contagem em Placa
69
70
Ponto de Coleta
gua da torneira
Poos e Cisternas
Rios, Lagoas
Mares
71
10 mL
1 mL
0,1mL
3 tubos
<3
11
11
14
15
20
21
28
30
23
39
64
73
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
>2400
Objetivos
Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:
compreender os fundamentos bsicos dos mtodos de quantificao de bactrias em gua e
alimentos, diferenciando a contagem direta em placas da enumerao indireta em caldo (NMP);
citar grupos de microorganismos quantificados normalmente em alimentos;
definir colimetria e citar suas fases e aplicaes;
compreender a denominao NMP e UFC;
expressar o resultado de uma contagem direta e uma indireta.
Material
- Frasco com amostra de gua para anlise
- Tubos de Caldo Lactose com tubos de Durhan (3 CL Duplo e 6 CL Simples)
- 1 pipeta de 10 mL
- 1 pipeta de 1 mL
- 1 tubo de 9,9 mL de diluente estril
- Placa estril
- 1 tubo com Agar Padro de Contagem (PCA) previamente fundido
74
Execuo da prtica
Primeiro dia
Contagem em placa
- Antes de realizar a tcnica, devemos realizar diluies decimais da amostra, para que a chance
de obteno de placas com nmeros de UFC contvel (30 - 300) seja maior.
- A tcnica utilizada ser a do pour plate, ou seja: transferir, com auxlio de uma pipeta estril, 1 ml
da amostra para uma placa de Petri vazia estril. Adicionar o Agar PCA (padro para contagem)
fundido e resfriado sobre a amostra e homogeneizar suavemente com movimentos circulares,
conforme mostra a figura a seguir:
- Deve-se fazer em duplicata a inoculao das diluies 100 (amostra no diluda) e 10-1, ou 10-1 e
10-2.
Tcnica do NMP
- Homogeneizar por agitao a amostra de gua e inocular os tubos de caldo lactosado utilizando
as pipetas estreis, da seguinte forma:
- Na primeira srie, note que a concentrao do caldo dupla, devemos inocular 10 ml de
amostra;
75
Segundo dia
- Contar as colnias no Agar, calcular o nmero mdio de colnias obtidas, multiplicar pelo fator
de diluio e expressar o resultado em UFC/mL.
OBSERVAO.: No nosso caso, o fator de diluio, ou fator de correo, ser 1, pois o volume
inoculado na placa de Petri foi 1 ml. O fator de correo importante para a expresso do
resultado, que deve ser em UFC/ml, pois transforma o resultado obtido em um resultado por 1ml.
Muitas vezes na rotina, utilizamos volumes de inculo diferentes de 1ml, como 0,1ml, ou
utilizamos inculos provenientes de diluies (10-1, 10-2, etc.). Nesse caso, para a expresso do
resultado devemos multiplicar o nmero de UFCs obtido por um nmero que ir corrigir a
distoro do resultado.
Uma dica: se o inculo utilizado for diludo decimalmente, o FD ser o inverso da diluio utilizada.
Ex.1: se o inculo utilizado for 0,1ml, qual ser o FD? 10, pois 10 x 0,1 = 1ml, ou de outra
maneira: 1 0,1 = 10.
Ex.2: se o inculo for 1ml da diluio 10-2, qual ser o FD? 100, pois 100 x 10-2 = 1, ou de
outra maneira 1 10-2 = 100.
Ex. 3: se o inculo utilizado for 0,5, qual ser o FD? 2, pois 2 x 0,5 = 1, ou de outra
maneira 1 0,5 = 2.
- Proceder leitura dos tubos positivos no caldo lactose (ou LST) e consultar a tabela para
expressar o resultado em NMP/100 mL (teste presuntivo).
76
- Incubar os tubos de calo VBBL a 35 37C por 24- 48 horas e os tubos de caldo EC a 44,5
45C por 24 48 horas.
Terceiro dia
- Proceder leitura dos tubos dos caldos EC e VBBL (teste confirmativo), considerando positivos
os tubos com formao de gs no tubo de Durhan. Vale a pena lembrar que os coliformes totais
sero positivos apenas no caldo VBBL e os coliformes fecais sero positivos em ambos os
caldos.
77
Caldo Lactose
Composio do Meio (g/L)
Extrato de carne
Peptona
Lactose
Observaes
3,0
5,0
5,0
* podemos substituir o caldo lactose por caldo LST (lauril sulfato triptose), procedendo a
incubao e a leitura da mesma forma.
Agar Padro para Contagem (PCA)
Composio do Meio (g/L)
Triptona
Extrato de levedura
Glicose
Agar
Observaes
5,0
2,5
1,0
9,0
Observaes
20,0
5,0
1,5
5,0
4,0
1,5
Observaes
10,0
pH do meio: 7,4 0,2
10,0
20,0
O meio contm 2 agentes seletivos: bile de boi
0,0133 e verde brilhante, que inibem o crescimento de
Gram +. Alm disso, a lactose tem o papel de
78
Exerccios de fixao
1. Qual a finalidade da colimetria?
2. Qual a diferena entre os mtodos diretos e indiretos de quantificao de bactrias?
3. Qual a fundamentao da etapa confirmativa da colimetria?
4. Como se realiza o clculo das UFCs na contagem em placa?
5. Por que devemos realizar diluies para executar as tcnicas de contagem em placa e do
NMP?
Observaes
79
Bibliografia
- Vigilncia e controle da qualidade da gua para consumo humano/ Ministrio da Sade,
Secretaria de Vigilncia em Sade. Braslia : Ministrio da Sade, 2006.
- Brown, A. E. Benson Microbiological Applications Laboratory Manual in General Microbiology.
8th Edition. The McGrawHillCompanies, 2001.
- Morello, J. A.; Granato, P. A.; Mizer, H. E. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology:
Applications to Patient Care. 7th Edition. The McGrawHill Companies, 2003.
- Harley, J. P. Prescott, L. M. Laboratory Exercises
McGrawHillCompanies, 2002.
80