INTERAÇÃO

ANTÍGENO-ANTICORPO

Dayse Locateli
2005
 Interação reversível
Ligações não covalentes:
 Complementariedade
•Pontes de Hidrogênio
Especificidade • Ligações iônicas
• Interações hidrofóbicas
• Interações de Van der Waals
 Afinidade
Força de interação entre um único sítio de ligação Ag-Ac
(em um único epítopo).

 Avidez
Força de interações total entre Ac e Ag.
Soma das afinidades de todos epítopos envolvidos

 Reação cruzada
Dois Ag diferentes apresentam um epítopo idêntico

Ac específicos para um epítopo se ligam a um epítopo não

relacionado, mas com propriedades químicas similares.
Aplicações

Pesquisa
Diagnóstico
Soroepidemiológia

Métodos:
 Precipitação
 Aglutinação
 Imunoensaios
Metodologias que utilizam:

1) Reagentes não marcados

• Reação de precipitação
• Reação de aglutinação

2) Reagentes marcados
• RIA
• ELISA
• Imunofluorescência
• Western Blot
 Reagentes não marcados

Detectam / quantificam as conseqüências da ligação Ag – Ac

 Reação de Precipitação

Interação: ac - ag solúvel forma uma

rede que pode desenvolver um
precipitado visível.

Anticorpos bivalentes
+
Antígenos multivalentes

PRECIPITADO
 1- Reação de precipitação em soluções

Reação quantitativa:
•Qtidade cte Ac
•Qtidade cresc. Ag

Qtidade precipitina
 2 - Reação de Precipitação em
gel
 Utiliza uma matriz de ágar
 Ag + Ac = linha de precipitação visível
a) Imunodifusão radial
(Método de Mancini)
• Ag ou Ac fixos
• Dosagem de proteínas séricas

b) Imunodifusão dupla

• Identidade de Ags = Ac de
reatividade conhecida
 Reações de Aglutinação

Ac + Ag particulado
aglutininas
Eritrócitos
Bactérias
Agregação visível de partículas Fungos
látex

• Efeito pró-zona
 Aglutinação Direta

Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação

• Detecção Acs específicos

• Quantificação

 Tipagem ABO
Testes confirmatórios para sífilis

 Aglutinação bacteriana
Presença de infecção
Diferenciação de espécies
 Aglutinação passiva

Ag solúveis associados a outras superfícies

(Partículas de látex ou superfície de hemácias)

+
Inibição da Aglutinação
 Reagentes Marcados

Detectam / quantificam diretamente a ligação Ag - Ac

 Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA

Ac marcados
com Enzimas + Ag + substrato = COR
(incolor)

Fosfatase alcalina
Peroxidase
B-galactosidase

 Direto = Ag  Qualitativos
 Indireto = Ac  Quantitativos
 ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

 ELISA Competitivo

 Aplicações do ELISA:
 Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa

 Vantagens:
 Teste de alta sensibilidade
 Permite quantificar Ag ou Ac das amostras
 Seguros e de baixo custo
Imunofluorescência
luz

Ac + fluorocromo  Ac +
Fluorocromo

r
ght
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Reagentes secundários:

Anticorpo secundário marcado com fluorocromo

proteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs
Isotiocianato de fluoresceína (FITC) VERDE
Ficoeritrina (FE) VERMELHA
 Fc

Aplicações:

• Identificar subpopulações de linfócitos

• Identificar espécies bacterianas
• localização de hormônios
• Detecção complexos ag-ac em doenças auto-
imunes
•Detecção anticorpos anti-DNA
• Teste qualitativo
 Citometria de Fluxo
 Separação de células ativadas por fluorescência
 Anticorpos contra moléculas de membrana ou
Antígenos do Conjunto de Diferenciação (CD)
 Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente
 Teste qualitativo e quantitativo

CD 18

CD 4

CD 125

CD 147
 Tamanho
 Granulosidade
 Fluorescência
 Aplicações:

 Determinar o tipo e no de
céls. sanguíneas brancas
CD4
 isolar populações celulares

 distribuição de céls de acordo

com a densidade dos Ag
CD8
 o tamanho celular.

CD20
 Uso de múltiplos anticorpos fluorescentes

HIV , Leucemias
Western Blotting

• Eletroforese de proteínas
• Diferença de tamanho (PM)
• Mobilidade da proteína
• Detecção Ag ou Ac
 Western Blotting

Gel
membrana de transferência
papel filtro
preenchimento
tela de suporte

Gel/ membrana/ filtro

Separação e detecção
Tampão de proteínas
• Identificação de Ac
( +) específico
Ac radiomarcado ou
(-)
Ac sec. ligado a enzima
 Radioimunoensaio RIA

• Hormônio
Moléculas marcadas com • proteínas séricas
ISÓTOPO • drogas 0,0001 microgramas/ mL
• vitaminas
• Ac
 Marcações:
– I125: emite raios gama
– H3: raios beta

 Aplicações:
Testes que necessitem de alta sensibilidade
Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue
Pesquisa

 Desvantagem:
 Não é um teste seguro!