UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CINCIAS DA SADE ICS DEPARTAMENTO DE CINCIAS DE BIOFUNO BIOQUMIA PARA BIOTECNOLOGIA TURMAS P07/P09

09 DOCENTE: ALINE MIRANDA / PAULO RIBEIRO

BRUNO CAVALCANTE GABRIELA SAMPAIO JLIA NEVES PATRCIA NASCIMENTO

CARACTERIZAO DE ENZIMAS

1.

Introduo
SALVADOR 2011

Enzimas, em grande maioria, so protenas com atividade funcional, responsveis pelo papel de catlise, ou seja, de promover aumento na velocidade de determinada reao. Em uma reao catalisada por enzima, a enzima liga-se ao substrato para formar um complexo, que por sua vez, leva formao das espcies do estado de transio, as quais podero formar o produto. Entende-se por cintica enzimtica a anlise quantitativa do efeito de cada um dos efeitos que influencia a atividade enzimtica avaliada atravs do aumento ou reduo da velocidade da reao catalisada. Neste contexto, a cintica enzimtica est diretamente associada concentrao de enzimas, de substrato, pH, temperatura, entre outros fatores, os quais iro determinar a atividade da enzima. O complexo enzima-substrato de fundamental importncia para a compreenso da cintica enzimtica, sendo esse um passo obrigatrio para que a enzima possa realizar seu papel cataltico. A ao enzimtica envolve dois passos relacionados a esse complexo, a primeira etapa a formao do complexo, quando o substrato se liga ao stio ativo da enzima, etapa inicial, e a segunda etapa, que ser a etapa lenta do processo, que ocorrer aps a reao qumica, quando a enzima ir se separar do substrato, e o produto ser liberado no meio. Essa segunda etapa ser mais lenta e ir limitar a velocidade da reao enzimtica. Enquanto houver enzimas livres a velocidade da reao ser proporcional a concentrao de substrato. Entretanto, a partir de certa concentrao de substrato todas as enzimas disponveis estaro associadas a um substrato e at que o complexo seja desfeito e o produto liberado essa enzima no poder reagir com outras molculas, ocorrendo ento um estado estacionrio. As enzimas tm um pH (ou uma faixa de pH) timo no qual a atividade cataltica mxima, e decresce quando em pH maior ou menor. Este pH timo pode ser mantido pelas prprias cadeias de aminocidos do stio ativo da enzima, eles podem funcionar como cidos de bases fracas quando encontrados em situaes crticas. Outras partes da protena, como a cadeia lateral ionizveis podem ter uma participao essencial nas interaes que mantem a estrutura protica, e consequente funo. As enzimas so sujeitas inibio. Inibidores so substncias que interferem na ao de uma enzima, tornando mais lenta a velocidade da reao. Existem duas formas pelas quais os inibidores podem afetar a reao enzimtica. Um inibidor reversvel pode ligar-se enzima e subsequentemente ser liberado, deixando-a em sua condio original. Um inibidor irreversvel reage com a enzima produzindo uma protena que deixa de ser enzimaticamente ativa, de forma que a enzima original no pode ser regenerada.

2.

Objetivo

Observar a atividade da enzima catalase em diferentes condies (pH, temperatura, variao da concentrao de enzima e substrato). 3.

Material e Mtodos:
gua sangunea (3 gotas de sangue total em 100 ml de gua destilada) H2O2 4% Soluo de albumina H2SO4 1N NaOH 1N Solues tampo pH 4,5; 6,0; 7,0; 8,0 e 10,0 Soluo de cianeto de sdio (NaCN) a 1% 3.1. Efeito da temperatura: a)Distribuir os reagentes como indicado na tabela abaixo, respeitando a ordem dos mesmos (da esquerda para direita). Incubar os tubos s temperaturas indicadas por 10 minutos. b)Aps a adio da gua sangunea, homogeneizar os reagentes por uma nica inverso, tampando os tubos. Esperar 10 minutos e anotar o resultado (em mm de espuma formada a partir da superfcie do liquido).

Tubo

gua oxigenad a (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

gua destilad a (ml) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

1 2 3 4 5

Soluo albumin a (gotas) 6 6 6 6 6

Temperatur a (c) 0 30 45 60 100

gua sangune a (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Resultad o (mm de espuma) 10 30 0

1.1.Efeito do pH: a) Distribuir os reagentes como indicado na tabela abaixo, respeitando a ordem dos mesmos (da esquerda para direita). b) Aps a distribuio, homogeneizar os reagentes por uma nica inverso, tampando os tubos. Esperar 10 minutos e anotar o resultado (em mm de espuma formada a partir da superfcie do liquido).

Tubo

gua destilada (ml) 2,0 2,0

Tamp o (2ml) 4,5 6,0 7,0 8,0 10,0 -

cido sulfrico (gotas) 2 -

NaOH (gotas ) 2

gua sangune a (ml) 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

Soluo albumin a 6 6 6 6 6 6 6

H2O2 (ml) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Resultado (mm de espuma) 6 11 17 13 16 18 5

1 2 3 4 5 6 7

1.1.Efeito da concentrao do substrato: a) Distribuir os reagentes como indicado na tabela abaixo, respeitando a ordem dos mesmos (da esquerda para direita). b) Aps a distribuio, homogeneizar os reagentes por uma nica inverso, tampando os tubos. Esperar 10 minutos e anotar o resultado (em mm de espuma formada a partir da superfcie do liquido).

Tubo

H2O2 (ml) 0.4 0,8 1,2 1,6 2,0

gua destilad a (ml) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 -

albumin gua a (gotas) sangune a (ml) 6 6 6 6 6 6 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

1 2 3 4 5 6

Resultad o (mm de espuma) 2 106 33 40 19 16

3.4. Inibio da catalase pelo cianeto: a) Distribuir os reagentes como indicado na tabela abaixo, respeitando a ordem dos mesmos (da esquerda para direita). b) Aps a distribuio, homogeneizar os reagentes por uma nica inverso, tampando os tubos. Esperar 10 minutos e anotar o resultado (em mm de espuma formada a partir da superfcie do liquido).

Tubo

H2O Destilad a (ml) 2,0 1,6 1,2 0,8 0,4 1,6 1,2 0,8 0,4

H2O sangune a (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

NaCN (gota) 3 3 3 3 3 3 -

Albumin a (gota) 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6

H2O2 (ml) 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,4 0,8 1,2 1,6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Resultad o (mm de espuma) 0 3 4 5 4 4 -

1.

Discusso:
Questo 1: Efeito da temperatura

a)De acordo com os resultados obtidos, qual a melhor para a atividade da catalase? Este resultado esperado? De acordo com os resultados, a melhor temperatura para a atividade da enzima de 30oC, registrado no tubo 2. O resultado foi esperado, uma vez que

aumentos na temperatura favorecem a velocidade de reao por aumentar a energia cintica das molculas. Alm disso, temperaturas elevadas repercutem no rompimento das pontes de hidrognio, levando a enzima perda de sua estrutura tridimensional (desnaturao), com sua consequente perda de atividade funcional.

Questo 2: Efeito do pH

a)Observe o grfico obtido. Como voc o interpreta? A catalase age no seu pH timo no organismo? Observamos pelo grfico que a enzima atinge elevados tamanhos (em mm) de espuma. Esta foi formada pela reao da enzima catalase, que, quando em contato com o perxido de hidrognio (H2O2), libera oxignio (O2). Sabemos que o pH sanguneo gira em torno de 7,4, seria de se esperar que a enzima catalase (presente no sangue) atingisse sua maior atividade em torno do pH neutro, porm o experimento no atingiu o esperado. Acreditamos que no foi possvel reproduzir com fidelidade o ambiente na qual esta enzima se encontra no corpo humano. Por isso, obtivemos resultados discrepantes da realidade. Seria correto a enzima catalase apresentar sua maior atividade enzimtica em torno do pH 7, mas foi observado uma maior atividade em torno do pH 10.

Questo 3: Efeito da concentrao do substrato

a)Observe o grfico V x [S] que voc obteve. Qual o efeito do aumento da concentrao de S? A princpio o aumento da concentrao do substrato gera um aumento na velocidade da reao (tubo 1 ao tubo 4), isso ocorre devido disponibilidade de enzimas na soluo, e enquanto elas estiverem livres o aumento da velocidade ser proporcional ao aumento da concentrao do substrato, o que pode ser observado no aumento da coluna de espuma de acordo com o aumento da concentrao de perxido de hidrognio. Em seguida (do tubo 4 ao tubo 6) apesar do aumento da concentrao do substrato a coluna de hidrognio no aumenta, o que mostra que as enzimas atingiram um ponto de saturao, o que significa que todas as enzimas disponveis esto associadas a substratos. A velocidade ento estaciona e se mantm constante. b)Os resultados obtidos so o que era esperado? Quais os resultados esperados? Os resultados obtidos no experimento no foram exatamente os que eram esperados. O esperado era que nos primeiros tubos coluna de espuma aumentasse, mostrando que a velocidade da reao estava aumentando, a partir de uma determinada concentrao a altura das colunas deveria se manter constante, mostrando que a velocidade mxima foi atingida e que mesmo que se aumentasse a concentrao do substrato no haveria mais enzimas livres disponveis para catalisar a reao. Nos tubos 1, 3 e 4 o experimento ocorreu conforme o esperado, o tubo 2 sofreu um desvio muito alm dos padres esperados, nos ltimos tubos (5 e 6) as colunas deveriam ter

se mantido com alturas semelhantes entre si e semelhantes mxima (tubo 4), o que no ocorreu.

Questo 4: Inibio:

a) O cianeto um inibidor da catalase? O cianeto sim um inibidor da catalase, ou seja, liga-se fortemente ao centro ativo desta enzima, impedindo a ligao do perxido de hidrognio. Na realizao do experimento a concentrao do inibidor manteve-se constante nos tubos 1 ao 6, variando apenas a concentrao do substrato. Nos tubos 7 ao 10 o inibidor no seria colocado e apenas a concentrao do substrato iria variar. Desta forma, seria possvel a visualizao da ao do inibidor na atividade da catalase, porm o inibidor, por erro de execuo do experimento, foi colocado nos tubos 7 ao 10; fato que invalidou o experimento. b) A inibio pode ser revertida aumentando-se a concentrao de S? Sim. Tendo em vista o fato de o cianeto ligar-se reversivelmente catalase, a competio pode beneficiar o substrato pela adio de mais substrato. Ou seja, quando a concentrao do substrato maior que a concentrao do inibidor, a probabilidade de uma molcula do inibidor se ligar enzima ser mnima.

1.

Concluso

As enzimas agem como catalisadoras nos processos qumicos celulares. Atuam contornando o problema de lentido da reao, fornecendo um ambiente especfico onde uma dada reao energeticamente mais favorvel, ou seja, diminuem a energia de ativao necessria para uma reao ocorrer. As enzimas afetam a velocidade, mas no o equilbrio qumico das reaes. A partir dos experimentos realizados podemos observar a ao da enzima catalase e sua reao com o perxido de hidrognio em diferentes circunstncias. Foi possvel perceber que mudanas de temperatura e pH assim como aumento de concentrao de substrato e presena de inibidores afetam a ao enzimtica. De forma sucinta podemos dizer que foi observada uma ao positivada do aumento de temperatura e do aumento de concentrao de substrato, ambas, entretanto, apresentam um limite, uma vez que, a grande maioria das enzimas so protenas esto suscetveis a sofrer desnaturao pela temperatura e s podem catalisar reaes no stio ativo, com um nmero limitado de substrato. A ao do pH pontual e especfica, para cada tipo de enzima existe um pH timo para ao mas a variao pode causar desnaturao da enzima. Por fim a ao de inibidores, que tambm foi testada, negativa, uma vez que ela se liga no sitio ativo da enzima impedindo a interao desta com o substrato, o que diminui a velocidade da reao. As enzimas so, portanto, ferramentas do organismo que atuam no aumento da velocidade das reaes qumicas, quando requeridas para manuteno da homeostase do organismo.

Bibliografia

Livros: CAMPBELL, Mary. K. Bioqumica. 3 edio. Artmed. So Paulo, 2006. p. 156199. LEHNINGER, Albert Lester ET AL. Princpios da Bioqumica. 5 edio, Artmed. So Paulo, 2011. p. 189-221.