Laboratorio Pragas Uft2

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI
PROCEDIMENTOS EM TCNICAS LABORATORIAIS VEGETAIS
Mauren C.A.Silveira Biomdica Graduanda Eng. Biotecnolgica
SUMRIO
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PRECAUES..........................................................................5 PREPARO DE SOLUES....................................................................7 FRMULAS E PROBLEMAS MAIS COMUNS...............................................................................................7 MOLARIDADE (M G/L)....................................................................................................................7 PERCENTUAL (% - G/ML)....................................................................................................................7 OUTRAS RELAES.............................................................................................................................7 DILUIES DE SOLUES.....................................................................................................................8 SOLUES PARA TCNICAS DE EXTRAO VEGETAL...............................9 CIDO CLORDRICO 2,5 N.....................................................................................................9 GUA DEPC 0,1%......................................................................................................................9 GUA LIVRE DE RNASE........................................................................................................10 CLORETO DE LTIO (LICL) 5M...........................................................................................10 EDTA 0,5M PH 8.0.....................................................................................................................10 EDTA 500 MM; PH 8.0..............................................................................................................10 FENOL:CLOROFRMIO:LCOOL ISOAMLICO (25:24:1)..........................................11 GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETDIO)..................................................11 HIDRXIDO DE SDIO 10N - NAOH 10N...........................................................................11 NACL 5M -DEPC.......................................................................................................................11 NACL 5M ...................................................................................................................................12 RNASE A 10MG/ML.................................................................................................................12 SDS 20%......................................................................................................................................12 TAMPES..................................................................................................................................13 TRIS HCL LIVRE DE RNASE.............................................................................................................13 TRIS HCL 1M.................................................................................................................................13 SOLUO TAMPO (WASH BUFFER)...................................................................................................13 TAE 50X......................................................................................................................................14 TBE 10X.......................................................................................................................................14 TE PH 8.0......................................................................................................................................14 TAMPO FOSFATO DE SDIO 1M........................................................................................................14 STE...............................................................................................................................................15 TAMPO DE AMOSTRA PARA ELETROFORESE.........................................................................................15 TAMPO FOSFATO SALINA- PBS 10X................................................................................................16 FUNES DOS MATERIAIS, SOLUES E PROCEDIMENTOS.............................16 MACERAO ..........................................................................................................................16 CENTRIFUGAO..................................................................................................................16 TIPOS DE CENTRFUGAS......................................................................................................................17 VELOCIDADES DE SEPARAO DE COMPONENTES.....................................................................................18 CENTRIFUGAO X SOLVENTES..........................................................................................................19 ESPECTROFOTOMETRIA.....................................................................................................19 ELETROFORESE.....................................................................................................................21 ELETROFORESE EM GEL.....................................................................................................................22 Gel de Agarose...........................................................................................................................23 Gel de Poliacrilamida.................................................................................................................24
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DNA ............................................................................................................................................25 SENTIDO 5- 3...............................................................................................................................28 PROTENAS ..............................................................................................................................29 RNA.............................................................................................................................................30 ENZIMAS MODIFICADORAS DE CIDOS NUCLICOS...............................................34 NUCLEASES E RIBONUCLEAES.........................................................................................34 NUCLEASES..............................................................................................................................35 Enzimas de restrio tipo II .......................................................................................................36 ............................................................................................................................36 Nuclease Bal 31..........................................................................................................................36 Nuclease S1................................................................................................................................36 Desoxirribonuclease I (DNAse I)...............................................................................................37 Nuclease Microccica................................................................................................................37 Exonuclease III...........................................................................................................................38 RIBONUCLEASES....................................................................................................................38 Ribonuclease A (RNAse A).......................................................................................................38 Ribonuclease H (RNAse H).......................................................................................................38 Ribonuclease T1.........................................................................................................................39 DNA POLIMERASES...............................................................................................................39 DNA Polimerases DNA Dependentes....................................................................................39 DNA Polimerase I .....................................................................................................................40 Fragmento Klenow.....................................................................................................................41 T4 DNA Polimerase...................................................................................................................42 T7 DNA Polimerase...................................................................................................................42 Taq DNA Polimerase.................................................................................................................42 DNA POLIMERASES RNA DEPENDENTES.........................................................................................43 AMV Transcriptase Reversa .....................................................................................................43 DNA Polimerase - Independente de Molde................................................................................44 RNA POLIMERASES ..............................................................................................................44 RNA Polimerases DNA Dependentes.....................................................................................45 RNA Polimerases DNA Independentes...................................................................................45 Polinucleotdeo Fosforilase........................................................................................................46 LIGASES ....................................................................................................................................46 T4 DNA Ligase..........................................................................................................................46 T4 RNA Ligase..........................................................................................................................47 FOSFATASES E QUINASES...................................................................................................47 Fosfatases...................................................................................................................................47 Quinases ....................................................................................................................................48 SOLUO TAMPO................................................................................................................48 TAMPO DE CORRIDA..........................................................................................................49 TAE (TRIS-ACETATO-EDTA)...............................................................................................49 CTAB 2%....................................................................................................................................49 NACL 5M......................................................................................................................................50 EDTA (CIDO ETILENO DIAMONO TETRACTICO) 0,5 M PH 8,0............................50 CLOROFRMIO (LCOOL ISOAMLICO) (E/OU FENOL)...........................................50 INCUBAO EM BANHO-MARIA.......................................................................................51 -MERCAPTOETANOL 0,2%...........................................................................................................51 PVP (POLIVINILPIRROLIDONA) .......................................................................................51
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BROMETO DE ETDEO..........................................................................................................51 BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)................................................................................51 DPEC...........................................................................................................................................52 TRIS- HCL; PH 7,4......................................................................................................................52 PROTENA K.............................................................................................................................52 ETANOL OU ISOPROPANOL................................................................................................52 ACETATO DE SDIO (SAIS).................................................................................................52 TCNICAS MAIS UTILIZADAS..........................................................53 INOCULAO DE VIROSE EM CURCUBINCEAS........................................................53 EXTRAO DE DNA VEGETAL PELO MTODO CTAB............................53 EXTRAO DE DNA VEGETAL PELO MTODO DE DOYLE E DOYLE...................56 MTODO PARA EXTRAO DE DNA DE CLULAS EUCARITICAS.....................59 ESTIMATIVA DE CONCENTRAO DE DNA, APS SUA EXTRAO..........................................................62 QUANTIFICAO DE DNA (E RNA) ATRAVS DE ESPECTROFOTOMETRIA................................................62 ESPECTROFOTOMETRIA PARA QUANTIFICAO DE DNA........................................................................63 ISOLAMENTO DE DNA PELO MTODO TRIZOL..........................................65 QUANTIFICAO E EXPECTATIVA DE RENDIMENTO DE DNA...................................................................67 REAO DE RESTRIO DE ENDONUCLEASE..........................................................................................68 Guia de Soluo de Problemas...................................................................................................69 VISUALIZAO DO DNA, APS SUA EXTRAO.....................................70 GEL DE ELETROFORESE......................................................................................................................70 ...........................................................................................................................................73 MULTIPLICAO DO DNA, APS SUA EXTRAO....................................74 PRINCPIOS DO MTODO REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR).....................................................74 VARIAO DO PCR .........................................................................................................................76 EXTRAO DE RNA VEGETAL PELO MTODO CTAB..................................77 ISOLAMENTO DE RNA PELO MTODO TRIZOL........................................79 Guia de Soluo de Problemas...................................................................................................84 ISOLAMENTO DE PROTENAS USANDO O MTODO TRIZOL.........................87 Guia de Soluo de Problemas...................................................................................................89 GEL PARA ELETROFORESE DE PROTENAS...........................................90 QUANTIFICAO DE PROTENAS....................................................90 MTODOS COLORIMTRICOS PARA PROTENAS...................................91 MTODO COLORIMTRICO BRADFORD PARA DETERMINAO DE PROTENA ......................................................................................................................................................92 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS....................................................................................94
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PRECAUES
As precaues a serem seguidas objetivam tanto a biossegurana quanto a eficincia dos mtodos utilizados.
Sempre usar luvas para manipulao de reagentes. Durante extraes de RNA as luvas devem ser trocadas se houver contato com superfcies ou material no tratado com DEPC.
A vidraria deve ser aquecida a 180C por no mnimo 8 horas, ou 2 horas a 210C.
Pode-se tratar vidraria e material de plstico com DEPC 0,1%, lavando com gua previamente tratada com DEPC e esterilizando-os em autoclave por 20 min a 121C.
O DEPC altamente txico devendo ser manipulado em capela de exausto com luvas, jaleco e culos de proteo.
Folhas coletadas para anlises devem ser rapidamente congeladas a fim de inibir ao de RNAses endgenas. Fenol, clorofrmio, formaldedo e -mercaptoetanol so txicos e devem ser manipulados em capela de exausto com EPIs.
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O brometo de etdeo mutagnico e moderadamente txico. Usar luvas e tomar cuidado ao retir-las ou quando for enxaguar as mos com luvas as luvas ainda (nunca com os dedos para cima).
A pipetagem deve ser feita com exatido, tomando o cuidado com excessos do lado de fora da ponteira.
As ponteiras devem ser autoclavadas antes do uso. O p do SDS irritante. Recomenda-se o uso de mscara. O tampo CTAB no dissolve antes de o pH atingir o nvel timo pedido na tcnica.
A soluo-tampo do meio para eletroforese de protenas deve ser meticulosamente testada quanto ao pH, pois as protenas so substncias anfteras, isto , variam a sua carga, positiva ou negativa, em funo do pH. Com um pH alterado a eletroforese pode revelar resultados falsos.
A luz UV mutagnica. Usar culos de proteo e luvas. Qualquer substncia ou soluo deve ser acondicionada com identificao necessria (nome do composto, pH, molaridade), data e validade.
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PREPARO DE SOLUES
Frmulas e problemas mais comuns
Molaridade (M g/L)
Molaridade a concentrao de uma SOLUO em molar. 1 molar = 1 mol de soluto em 1L de soluo final. 1 mol de soluto = soma de todas massas moleculares que compem o soluto. Ex. 1 mol de NaCl = 58,5g (Na = 23g e Cl = 35,5g) NaCl 1M = 58,5G DE NAcL em 1L de gua 58,5g/mol = 58,5MM MM = massa molar OBS. 1M de NaCl muito concentrado, quase saturado, mas a concentrao depende da massa molecular dos compostos da soluo.
Percentual (% - g/mL)
Pode ser expresso em m/v (massa/volume), v/v (volume/volume), m/m (massa/massa). Ex. NaCl 2% = 2g de NaCl em 100mL de soluo final. Para solutos lquidos: ex. Glicerol 10% = 10 mL de glicerol em 100 mL de soluo final ( 10 mL de glicerol + 90 mL de gua)
Outras Relaes
mg/mL, g/mL Ex. qualquer soluo de 100mL em concentrao 10 mg/mL = 1g de soluto em 100 mL de soluo final = 1000mg/100mL = 10mg/1mL
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI 0,001g = 1 mg 100g = 0,1 Kg ppm (partes por milho) Usado para solues muito diludas: massa de soluto (mg) = 1 = 10 ppm massa de soluo (Kg) 0,1 d = massa do soluto (g) volume da soluo (L) c = massa do soluto (g) volume da soluo (L)
Diluies de Solues
Para se obter diluies de solues tem que acrescentar solvente. Para calcular a relao entre as quantidades de soluto e solvente aps a diluio: Antes da Diluio Massa de soluto (g) Volume de soluo (L) Aps a Diluio Massa de soluto (g) x volume de soluo (L) Volume de soluo (L) x volume de soluo (L)
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Ou: C (g/L)1 x V (L)1 = C (g/L)2 x V (L)2 e
M (mol/L)1 x V (L)1 = M (mol/L)2 x V (L)2 Exemplo: Obter lcool etlico 70% a partir de lcool etlico 95%: lcool 70% = 700 mL de lcool + 300 mL de gua lcool 95% = 950 mL de lcool + 50 mL de gua lcool 100% = 1000 mL de lcool + 000 mL de gua Para 1L: 315,78 mL de lcool 95% + 684,22 mL de gua = 1 L de lcool 30% 95% x V1 = 30% x 1 L V1 = 0,31578 L = 315,78 mL 1 L 315,78 mL = 684,22 mL
SOLUES PARA TCNICAS DE EXTRAO VEGETAL
CIDO CLORDRICO 2,5 N

gua destilada HCL 37% 400 mL em bquer 104,2 mL
Completar o volume at 500 mL com gua destilada em proveta
GUA DEPC 0,1%

DEPC gua destilada autoclavada por 2 horas 0,5 mL 500 mL
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI gua destilada autoclavada por 2 horas = U.P.A
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GUA LIVRE DE RNASE

gua UPA DEPC Reagir por 1 hora Autoclavar por 30 minutos 500 mL 0,5 mL
CLORETO DE LTIO (LICL) 5M

Cloreto de Ltio gua destilada 2,12 g 10 mL
EDTA 0,5M PH 8.0

EDTA gua DEPC Ajustar o pH para 8.0 com NaOH Completar o volume para 100mL com gua DEPEC. 18,612 g 70 mL
EDTA 500 MM; PH 8.0

Na2EDTA.2H2O gua destilada Agitar com agitador magntico Ajustar pH para 8.0 com NaOH, aprox. 20g em pastilhas 186,1 g 800 mL
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI Completar o volume para 1L aps atingir o pH 8.0.
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FENOL:CLOROFRMIO:LCOOL ISOAMLICO (25:24:1)

Clorofrmio lcool isoamlico Fenol equilibrado 480 mL 20 mL 500 mL
GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETDIO)

Agarose TAE ou TBE 1X Adicionar brometo de etdio 1% Misturar suavemente. 2g 200 mL 1 L
Fundir em microondas. Deixar esfriar at 70C aprox.
HIDRXIDO DE SDIO 10N - NAOH 10N

NaOH gua destilada 400 g 1L
NACL 5M -DEPC
NaCl gua DEPC 146 g q.s.p. 500 mL
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NACL 5M
NaCl gua destilada Esterilizar em autoclave 292,2 g q.s.p. 1 L
RNASE A 10MG/ML
RNAse pancretica (RNAse A) Acetato de sdio 10mM; pH 5.2 Ferver por 15 min.Esfriar. Ajustar pH com 0,1 volume de Tris-HCL 1M; pH 7.4 Dividir em 1 mL Armazenar a -20C. 100 mg
SDS 20%
SDS gua destilada Banho-maria a 50C, no mnimo. gua destilada q.s.p. 1 L 200 g 700 mL
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TAMPES
Tris HCl Livre de RNAse

Estoque
Tris HCl 1,5 M ; pH 8,0 gua DEPC 0,1% Ajustar o pH para 8.0 com HCl
18,1 g 70 mL
Completar o volume para 100 mL com gua DEPC autoclavada aps adio de DEPC 0,1% reagindo por 1hora (val: 3 meses 4C)
Tris HCl 1M
Tris base gua destilada (sem DEPC) 121,1 g 800mL
Ajustar o pH desejado com HCl concentrado nas quantidades: Para pH 7.5 70 mL; para pH 7.6 60 mL; para pH 8.0 42 mL Obs: 60,55g de tris- 400 mL de gua dest. 30,25g de tris 200 mL de gua dest.
Soluo Tampo (Wash Buffer)

Tris HCl 1,5M EDTA 0,5M NaCl 2M BSA 3,33 mL 1 mL 200 mL 0,25g
Completar o volume com gua UPA com DEPC (re-autoclavar a gua UPA aps adicionar DEPC 0,1% reagindo por 1 hora) at 500mL
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TAE 50X
Tris base cido actico glacial EDTA 0,5 M; pH 8.0 gua destilada q.s.p. 242g 57,1 mL 100 mL 1000 mL
Ajustar o pH da soluo de EDTA com NaOH. Concentrao de uso 1X. Estocar temperatura ambiente.
TBE 10X
Tris base cido brico EDTA 500 mM; pH 8.0 gua destilada q.s.p. 1L 108 g 55 g 40 mL
TE pH 8.0
Tris HCl 1M; pH 8.0 EDTA 500 mM; pH 8.0 gua destilada q.s.p. 1 mL 200 L 100 mL
Tampo Fosfato de Sdio 1M

NaH2PO4.H2O 1M Na2HPO4 1M 13,8g + gua destilada q.s.p. 100 mL 14,2g + gua destilada q.s.p. 100 mL
Diluir nas seguintes propores de acordo com o pH desejado:
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NaH2PO4.H2O 1M 53,7 mL 42,3 mL 22,6 mL 15,5 mL 10,4 mL
Na2HPO4 1M 46,3 mL 57,7 mL 77,4 mL 84,5 mL 89,6 mL
pH 6.8 7.0 7.4 7.6 7.8
STE
NaCl 5M Tris-HCl 1M EDTA 500mM; pH 8.0 200 L gua destilada q.s.p. 100 mL 2 mL 1 mL
Tampo de Amostra para Eletroforese

Ficoll tipo 400 ou Glicerol EDTA 500 mM; pH 8.0 Azul de bromofenol Xilene Cianol FF gua destilada q.s.p. *Usar gua DPEC 0,1% para gis de RNA 3g 20 L 25 mg 25 mg 10 mL
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Tampo Fosfato Salina- PBS 10X

Na2HPO4 KH2PO4 NaCl KCl gua destilada q.s.p. Ajustar o pH para 7.4. Esterilizar em autoclave 14,4 g 2,4 g 80 g 2g 1L
FUNES DOS MATERIAIS, SOLUES E PROCEDIMENTOS
MACERAO
Em cadinhos com nitrognio lquido: as paredes celulares devem ser rompidas com o objetivo de liberar os constituintes celulares.
CENTRIFUGAO
Remoo dos resduos celulares e precipitao das protenas. A desproteinizao obtida atravs de um tratamento com fenol ou clorofrmio, pois esses solventes orgnicos desnaturam as protenas e enzimas, e so separadas aps centrifugao, permanecendo na interface entre a fase aquosa (superior) contendo os cidos nuclicos e a fase orgnica (inferior). A centrifugao depende do raio do rotor em cm, do ngulo fixo (tubo inclinado) ou ngulo varivel ou swingout (tubo pndulo). A fora centrfuga relativa (RCF) ou xg significa quantas vezes uma amostra acelerada em relao gravidade na superfcie da Terra (9,8 N/s2 ou 1xg).
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A centrifugao baseada no fato de um movimento circular a uma dada velocidade angular, resultar uma fora(F) que atua sobre a amostra. F diretamente proporcional ao raio do rotor (em cm) e ao quadrado da velocidade angular (w) em radianos: F= 2r Da ou RCF= 2r 980 RCF= 1,119.10-5 rpm2r ou w= (rpm) 30
Como r diretamente proporcional RCF, quando o raio aumenta, o RCF aumenta. No RPM a RFC varia de acordo com o raio que pode variar de acordo com o rotor usado. Por isso usa-se mais o xg do que o RPM. No caso de rotores de ngulo fixo, a distncia do raio do centro do rotor ao topo ou ao fundo do tubo com a amostra distinta. A RCF, ento, maior no fundo do tubo. No caso de rotores de ngulos pendulares, h um nico RCF.
Tipos de centrfugas
Microcentrfugas 0,5 a 1,5 mL de capacidade e at 14000 rpm em segundos. Centrfugas de mdia velocidade So geralmente preparativas. Apresenta vrios volumes, acelerao mxima at 20000 rpm e vrios tipos de rotores. Pode ser feita a separao de bactrias ou outras clulas do meio de cultura at o fracionamento celular. Ultracentrfugas A primeira foi da marca Svedberg e hoje existem as que atingem 60000xg. Podem ser preparativas para separao de molculas e/ou partculas ou tcnicas analtica para medir as propriedades fsicas de macromolculas. Apresenta o rotor em cmara blindada, sistema de alto vcuo para eliminar o atrito com o ar e o superaquecimento. Possui sistema de refrigerao. Os rotores so em liga de titnio e o disco na parte inferior do rotor possui uma superfcie clara e outra escura para a leitura ptica por fotoclula que capta o sinal quando o rotor gira e pode desligar a centrfuga, caso haja desbalanceamento dos tubos ou caso a velocidade mxima seja alterada.
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A unidade S de peso para compostos microssomais foi devido marca Svedberg que proporcionou tal medida. tecnicamente chamado de coeficiente de sedimentao (s): velocidade por unidade de fora. S de uma partcula a sua velocidade de sedimentao por unidade de campo de fora F. As unidades Svedberg (S) so expressas em 10-13segundos porque grande parte das molculas biolgicas sedimenta a velocidades iguais ou superiores a essa. Ex: albumina srica: coeficiente de sedimente de 4,5S Vrus da poliomielite: 150S Mitocndria: 15000- 65000S Ribossomos: 80S DNA de bacterifago: T5 50S tRNA de E. coli: 15 S tRNA de levedura: 4S
Velocidades de separao de componentes

Tecido homogeneizado e filtrado A 2000 xg/10min: frao nuclear O sobrenadante fica com a frao ps nuclear Frao ps nuclear a 15000 xg/10min: frao mitocondrial O sobrenadante fica com a frao ps mitocondrial Frao ps mitocondrial a 100000xg/60min: frao microssomal O sobrenadante fica com a frao ps microssomal Frao ps microssomal a 300000xg/120min: polirribossomos e subunidade de ribossomos. O sobrenadante fica com o citossol.
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Centrifugao X Solventes
Na centrifugao diferencial usa-se meio aquoso de densidade baixa que separa o solvel no sobrenadante. Na ultra-centrifugao pode ser usado gradiente de densidade para ultra centrifugao zonal e ultra centrifugao em gradiente de equilbrio de densidade (isopnica). Na ultra-centrifugao zonal usa-se um gradiente leve (como a sacarose) preparado com uma concentrao compatvel com a do material a ser separado (entre 15% e 50%) A densidade mxima do meio deve ser inferior menos densidade das macro-molculas de interesse. Ocorre uma migrao das partculas em funo de sua massa molecular. A taxa de migrao fortemente definida pelo coeficiente de sedimentao (s). Ao fim do procedimento h zonas ou faixas de material separado ao longo do gradiente. Na ultra-centrifugao zonal uma centrifugao por longo perodo de tempo pode levar sedimentao no diferenciada. Na ultra-centrifugao isopnica as espcies analisadas movem-se em um gradiente at encontrarem um ponto em que sua densidade equivalente do meio, sem que se desloque, pois ela flutua num colcho formado pelo gradiente. Diz-se ento que a partcula/molcula atingiu sua densidade de flutuao (densidade boiante). Mesmo em uma centrifugao prolongada no h sedimentao por que a concentrao do gradiente superior maior densidade das partculas mais pesadas. Por isso para o solvente utilizado sal alta massa molecular, como o cloreto de csio. Para separao de molculas como cidos nuclicos (DNA e diferentes espcies de RNA), ribossomos e lisossomos.
ESPECTROFOTOMETRIA
Espectrofotmetro o aparelho utilizado para quantificao do comprimento de luz absorvido ou refletido por uma substncia. A cor a luz resultante de vrios comprimentos de onda que foram refletidos, assim, uma substncia que tem a cor vermelha sendo refletida, por que absorveu a cor azul.
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No espectrofotmetro h um prisma que decompe a luz em vrios comprimentos de onda. Uma fenda deixa passar apenas o comprimento de onde que se quer analisar. Atravs dessa fenda a luz atinge a substncia colocada dentro de uma cubeta de vidro ou quartzo. A luz que refletida do outro lado da cubeta medida por sua intensidade. Toda substncia tem um padro de absoro de energia caracterstico. Cada substncia tem um espectro de absoro especfico e um comprimento de onda especfico com o qual ocorre um mximo de absoro de luz. Com esses dados um pesquisador pode saber, por exemplo, se uma amostra de DNA est ou no contaminada com protenas, e vice-versa. Alguns dados relevantes so apresentados a seguir: dsDNA - 1,0 A260 = 50 g/mL = 0,15 mM/ nmero de pares de bases ssDNA 1,0 A260 = 33 g/mL = 0,10 mM/ nmero de pares de bases ssRNA - 1,0 A260 = 40 g/mL = 0,11 mM/ nmero de pares de bases Por exemplo: um fragmento de DNA com 100pb com leitura de A260 = 1,0 0,15 mM/100 = 0,0015 = 1,5 nM 1 g de um fragmento de DNA com 1000pb = 1,52 pmol = 9,1 x 1011 molculas 1 g do plasmdeo pUC19 (2686pb) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 molculas 1 g do plasmdeo pBR 322(4361pb) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 molculas 1 g de DNA do bacterifago M13mp19 (fita dupla com 7249pb na forma) = 0,21 pmol = 1,3 x 1011 molculas 1 g de DNA do bacterifago (48502pb) = 0,03 pmol = 1,8 x 1011 molculas 1 pmol de um fragmento de DNA com 1000pb = 0,66 g 1 pmol de plasmdeo pUC19 (2686pb) = 1,77 g 1 pmol do plasmdeo pBR322(4361pb)= 2,88 g 1pmol de DNA do bacterifago M13mp19(fita dupla com 7249pb) = 4,78 g 1pmol de DNA do bacterifago (48502pb) = 32,01 1 Kbp de dNA pode codificar 333 aminocidos = uma protena de 37000 Da 10000 Da de protena = 270 pb
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI 50000 Da de protena = 1350 pb
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ELETROFORESE
A eletroforese usada para separar partculas moleculares pequenas e visualiz-las com colorao posterior. O princpio da eletroforese consiste na separao das partculas por carga eltrica, atravs de corrente eltrica imposta em superfcie aquosa salina (o sal permite o transporte de carga eltrica) que est em contato com um meio onde esto depositadas as partculas. As mais leves chegam ao plo com carga contrria sua primeiro que as partculas com cargas mais pesadas. Lembrando que DNA e RNA possuem carga negativa e, portanto, migram para o lado positivo, sempre. Essas partculas podem ser de DNA, RNA ou protenas que j foram clivadas em vrias partes. O meio ao qual sero depositadas deve ser slido ou semi-slido e no pode interferir na estrutura da partcula e deve permitir o deslizamento para o plo com carga contrria sua. Esse meio pode ser um papel de filtro, slica em gel, membrana de acetato de celulose, gel de agarose, gel de amido ou gel de poliacrilamida. A soluo salina tambm no pode interferir na composio das partculas, por isso usada soluo-tampo como meio de transporte de eltrons. Para a visualizao das estruturas separadas necessrio recorrer a posterior colorao do meio, que pode ser revelado a olho nu ou por fluorescncia com ajuda de luz ultravioleta ou quimiluminescncia. D-se o nome de banda s estruturas j separadas. A direo do pulso eltrico pode ser em sentido nico (negativo para positivo) ou em orientao ortogonal, onde o sentido alterado para zigue-zague para o caso de separao de partculas muito grandes. Essa tcnica chamada de eletroforese em gel de campo pulsado, pois o pulso eltrico interrompido para mudana de sentido. Para o sucesso da tcnica em sentido nico, que o mais comum, h dois fatores prioritrios a serem seguidos: a voltagem, corrente e potncia devem ser constantes, e a temperatura sob a qual se realiza a eletroforese deve ser monitorada, principalmente no caso de separao de molculas de protenas.
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Eletroforese em Gel
No caso dos meios em gel, as partculas se movimentam dentro dele. Antes da semisolidificao preciso colocar um pente no lugar onde sero depositadas as partculas a serem separadas, pois no lugar dos dentes do pente formam poos para o depsito das partculas. A eletroforese em gel pode ser feita em posio vertical ou horizontal, com um tipo de gel ou com dois tipos de gel. O gel preparado como a gelatina comum, a partir da agarose ou amido ou poliacrilamida que semi-solidificam em temperaturas mais baixas que 50C. A estrutura do gel depende da sua composio e cada estrutura apresenta uma porosidade por onde vo transitar as partculas. Alguns gis apresentam uma malha mais estreita que outros. O que determina que as estruturas de cargas mais leves e pesadas sejam mais bem separadas. Partculas mais pesadas indicam que os seus tamanhos so maiores que as partculas de cargas mais leves. Para ter um parmetro so usados marcadores moleculares com pesos conhecidos que migram ao lado das partculas analisadas. Eles devem ter a mesma natureza das partculas.
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O processo de eletroforese pode ser contnuo ou descontnuo. Na composio do gel utilizada uma soluo tampo que pode ser a mesma que cobrir o gel para fazer a conduo eltrica (sistema contnuo) ou pode ser diferente (sistema descontnuo). No sistema descontnuo h dois tipos de gis: o gel concentrador e o gel separador, que usado na tcnica para separao de protenas (gel de poliacrilamida). A malha do gel de agarose mais larga que a malha do gel de poliacrilamida, assim, o gel de agarose permite a passagem, por exemplo, de DNAs com dezenas e at mesmo centenas de quilobases, mas no diferem no peso de pares de bases especficos. J o gel de poliacrilamida pode separar um nico par de bases, mas apenas em molculas com tamanhos de at algumas centenas de pares de bases. Por isso so usadas as enzimas de restrio anteriormente tcnica de separao em eletroforese, pois quebram as partculas em pedaos conhecidos.
Gel de Agarose
A agarose um polissacardeo (como gar e pectina) linear extrado de algas marinhas que dissolve em gua fervente e gelifica quando resfria, formando redes minsculas. O dimetro dos poros da matriz formada diretamente proporcional concentrao do polmero utilizado. Poder de resoluo do gel de agarose
Intervalo de tamanho de molculas de DNA separadas em gis contendo diferentes concentraes de agarose*
Concentrao de agarose no gel (% [m/v]) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0
Faixa de tamanho de DNA dupla fita e linear (Kb) 5-60 1-20 0,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2
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*Adaptado de Sambrook e Russel, 2001.
Para a visualizao do DNA a tcnica pode ser acrescentada de brometo de etdeo que um anlogo de base que se intercala na molcula de DNA e emite fluorescncia violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presena ocorre reduo de velocidade de migrao, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma. A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear (III). A forma I migra mais rpido que a forma III em gis comuns. A forma II a mais lenta de todas.
Gel de Poliacrilamida
Usado para tcnica de separao de protenas. Pode ser usado o SDS (dodecil sulfato de sdio) na composio do gel. A protena deve ser previamente desnaturada por aquecimento na presena de -mercaptoetanol para romperem as pontes de dissulfeto e os polipeptdeos adquirirem a carga negativa do SDS. A migrao do complexo SDS-protena no depende da conformao protica, mas do seu tamanho. Na saturao, cerca de 1,4g de SDS ligado por grama de protena, o que corresponde a uma molcula de SDS para cada dois resduos de aminocidos. O sistema SDS-Page formado por dois gis diferentes: o gel concentrador e o gel separador. O gel concentrador formado por uma malha de grande porosidade (gel de poliacrilamida 5%). Tem funo de compactar a amostra em um pequeno volume, depositando-a sobre a superfcie - limite do gel separador como uma banda estreita. O gel separador tem uma malha mais estreita (poliacrilamida a 8-20%) que tem a funo de separar os complexos SDS-protena em funo de suas massas moleculares. O que permite que a amostra seja compactada para a faixa estreita entre os dois gis a diferena de pH entre a constituio do gel e o tampo de corrida utilizado.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI O tamanho dos poros diminui com o aumento da relao
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molar
bisacrilamida/acrilamida.
Faixa efetiva de separao de protenas no sistema SDS-PAGE Concentrao do Gel de Poliacrilamida* (%) 15 10 7,5 5,0 Faixa Linear de Separao de Protenas (kDa) 12-43 16-68 36-94 57-212
* A relao molar acrilamida/bisacrilamida de 29;1.adaptado de sambrook&Russel,2001.
Para visualizao das bandas de protenas mergulha-se o gel, aps a migrao, em corante comassie-blue ou sais de prata.
DNA
Em uma amostra normal de DNA espera-se encontrar: Quantidade de (T +C) sempre igual de (A+G).
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A quantidade de T sempre igual de A e C sempre igual de G, mas (A+T) no precisa ser igual de G+C). Essa proporo varia em indivduos de espcies diferentes, mas a mesma em tecidos diferentes do mesmo organismo. G-C tem 3 pontes de H e A-T tem 2 pontes de H. Portanto DNA com muito G-C mais estvel que DNA com muito A-T. H um padro na configurao do DNA: Adenina e Guanina so molculas maiores ligadas ao acar. Timina e Citosina so molculas menores ligadas ao acar.
Cada molcula de acar liga-se a um fosfato que se liga a outra molcula de acar. O tamanho da ligao entre acar fosfato acar de 3.4 A. O tamanho da ligao entre aprox. 10 grupos de ligaes de pares de bases de 34 A. Isso muda para aprox. 11 pares de bases em alta concentrao de sal ou desidratando o DNA. In vivo ou in vitro essa situao pode ocorrer se houver formao de heterodplices como DNA-RNAc ou dplices RNA-RNA. O giro da fita pela direita, mas certas seqncias giram para esquerda (zDNA- DNA zigue-zague). Segmentos especficos no DNA podem sofrer mudanas de sentido.
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Uma mesma molcula de DNA pode se apresentar sob trs formas ou topoismeros distintos. A forma do DNA pode ser circular superenovelada (I), circular relaxada (II) e linear (III). Uma bactria como a E.coli contm aproximadamente 4 milhes de pares de bases em seu genoma. O genoma humano composto por aproximadamente 3 bilhes de pares de bases. A salamandra africana contm cerca de 50 bilhes de pares de bases e o lrio tem cerca de 250 bilhes de pares de bases. Em procariotos a maior parte do DNA parece ser codificante, j em eucariotos, grande parte so seqncias repetidas ao longo de todo o genoma (DNA - no codificante).
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Sentido 5- 3
O fsforo dister liga o carbono 5 ao carbono 3 do outro acar na fita. Quem se liga T, G, A ou C o acar, sempre pelo carbono 1. A ligao do fsforo dister e o acar se d no sentido 5-3, o que faz com que a toro da fita fique para a direita.
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PROTENAS
As protenas so sintetizadas a partir do cdigo gentico. In vivo, a ao da sntese de protenas ocorre nos ribossomos. A primeira etapa para sntese de protenas retransmitir a informao do DNA para os ribossomos. Para isso, as enzimas celulares sintetizam uma cpia funcional de um gene para levar seu cdigo gentico at os ribossomos. Essa
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cpia funcional chamada RNA mensageiro, que uma molcula muito parecida com o DNA. Em uma segunda etapa os cdons do RNAm associado aos aminocidos corretos pelo RNT transportador. Na terceira etapa, os aminocidos so ligados para formar uma cadeia protica. O ribossomo que formado de protenas e RNA executa essa funo. Quando a cadeia protica termina um sinal de terminao adicionado cadeia fazendo com que o ribossomo no tenha mais como ligar aminocidos e libere a cadeia formada. Existem 20 aminocidos que se combinam para formar milhares de protenas. Uma protena de tamanho mdio requer cerca de 1200 bases de seqncias codificante. Alm da combinao entre aminocidos, as protenas podem se enovelar tendo uma caracterstica tridimensional, expondo ligaes onde se encaixaro aos receptores com estrutura qumica compatvel.
RNA
O RNA formado por nucleotdeos compostos por acar, fosfatos e uma das quatro diferentes bases orgnicas. O RNA difere qumica e estruturalmente do DNA. Diferena qumica: no lugar do acar desoxirribose, o RNA contm ribose e no lugar da Timina, o RNA contm Uracila. Diferena estrutural: apesar das bases do RNA tambm poderem formar pares complementares, o RNA geralmente formado por apenas uma nica fita de esqueleto acarfosfato e bases. Embora seja capaz de parear com fitas simples no forma dupla hlice. Sntese do RNAm Assemelha-se replicao do DNA.
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A dupla hlice de DNA desenrolada e as bases so expostas. Nucleotdeos que esto no meio separados se pareiam com os nucleotdeos complementares da fita. A Uracila se pareia com a Adenina. Ligaes fosfodisteres so formadas entre os nucleotdeos e o RNAm recm sintetizado possui uma seqncia de bases que exatamente completar fita molde de DNA. O processo de usar uma fita molde de DNA para criar uma molcula de RNAm complementar transcrio. Os RNA transportadores e ribossomais no so traduzidos em protenas. Diferenas entre transcrio e replicao Na replicao do DNA ambas as fitas so usadas como molde para gerao de duas novas fitas para duas novas hlices. Na transcrio, apenas uma fita simples de RNA produzida e a nova molcula de RNAm liberada do molde conforme sintetizada e a dupla hlice de DNA volta que solta a fita de RNAm Essa sntese s possvel polimerase. Ao da RNA polimerase A hlice do DNA contm milhes de pares de bases. A RNA polimerase reconhece o incio e o trmino dos pares de bases que so os constituintes de um gene, e a partir da liga os cdons complementares e para de lig-los quando h uma sequencia no DNA que indica o trmino do gene. Essa sequencia de pares de bases no DNA que indica o comeo de genes chamada de promotor e a que indica o trmino de genes o terminador. a enrolar-se medida sintetizada. atravs das RNA chamado de
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI RNAt
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O ribossomo reconhece o RNAm e o prende na posio adequada para que seus cdons sejam lidos corretamente. A tarefa traduzir o cdigo que o RNAm trs do DNA em aminocidos e estes sero agrupados e determinaro a protena formada. No RNAt h um anticdon que o complementar do RNAm que s se liga a uma sequencia especfica de trs bases. Na outra extremidade do RNAt est um aminocido que ligado a esse RNAt atravs de uma enzima, a aminoacil sintetase. Assim o aminocido correto correspondente ao cdon do RNAm trazido ao ribossomo e pode ser ligado cadeia de aminocidos em uma sequencia especfica que determinar a protena. Esse processo a traduo.
Traduo em bactrias No RNAm h sinais, seqncias especficas de bases que tm complemento no ribossomo de bactrias que fica a 8 e 13 nucleotdeos antes do cdon de iniciao (geralmente esse cdon de iniciao em bactrias o AUG). Essas seqncias so formadas por 5GAGG-3 ou 5-AGGA-3. No RNAm tambm h uma sequencia de terminao. No existe um RNAt que se pareie com uma sequencia de terminao. Uma protena a responsvel pela terminao da traduo. Como os sinais de comeo e trmino de uma protena esto no RNAm, esto tambm no DNA. Por isso importante saber reconhecer os sinais de comando das bactrias que so os vetores de estudo em Biotecnologia.
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ENZIMAS MODIFICADORAS DE CIDOS NUCLICOS
Enzimas purificadas a partir dos organismos nos quais foram inicialmente identificadas. A nomenclatura feita pelas iniciais desse organismo, incluindo a sua linhagem, e por algarismos romanos que indicam a ordem em que foi encontrada a cepa. Exemplo: EcoR I, primeira enzima isolada de Escherichia coli, cepa R. Para evitar a desnaturao das enzimas numa reao, a concentrao de protena nunca deve ser inferior a 0,1 mg/mL. A frao V da albumina bovina (BSA) uma fonte de protena neutra para estabilizar a enzima. Geralmente so classificadas de acordo com os tipos de reaes que elas catalisam. As mais utilizadas so: Nucleases e Ribonucleases, DNA polimerases, RNA polimerases, Ligases, Fosfatases e quinases.
NUCLEASES E RIBONUCLEAES
Nucleases so responsveis pela quebra enzimtica da ligao fosfodister do DNA e s vezes do RNA tambm e as ribonucleases so responsveis pela quebra enzimtica da ligao fosfodister do RNA. As nucleases tm atividade exonuclesicas ou endonuclesica, as ribonucleases tm atividade endorribonuclesica.
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Alm de reconhecer diferentes stios-alvo, as diferentes endonucleases tambm clivam em diferentes posies dentro desses stios. Assim, so produzidas molculas com extremidades cegas ou com extremidades 5 ou 3coesivas.
EcoRI cliva as duas fitas do seu stio de reconhecimento, originando extremidades 5 coesivas. Essas so chamadas de extremidades coesivas uma vez que aderem rapidamente a outras molculas clivadas com a mesma fita, que apresentam extremidades de fita simples complementares, unindo-se por pareamento de bases.
NUCLEASES
Dentre outras, esto includas as endonucleases de restrio ou enzimas de restrio. Reconhecem pequenas regies de 4 a 8 pb especficas do DNA, chamadas de stio de restrio, e clivam estas regies em ambas as fitas de DNA. Levam o termo restrio porque algumas enzimas especficas clivam o DNA exgeno que o bacterifago implanta na clula bacteriana. Para que essa enzima no clive o prprio DNA, existem enzimas modificadoras que metilam o DNA endgeno, modificando o stio de restrio, impedindo ligao de enzimas clivadoras. H enzimas de restrio que clivam o mesmo stio no DNA, mas que foram isoladas de microrganismos diferentes, estas so chamadas de isosquizmeros. As endonucleases de restrio I e III clivam o DNA fora do stio de especificidade, enquanto as do tipo II clivam dentro do prprio stio.
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Enzimas de restrio tipo II
Nuclease Bal 31, Nuclease S1, Desoxirribonuclease I (DNAse I), Nuclease Microccica, Exonuclease III. As enzimas de restrio tipo II tm um padro de clivagem previsvel se for conhecida a seqncia de DNA analisada. Funcionam reconhecendo uma seqncia palindrmica, isto , que possui um duplo eixo rotacional, tendo a mesma seqncia quando lida no sentido 5- 3 em ambas as fitas. Por exemplo: 5- GAATTCC-3, que o stio de restrio da EcoR I. Atua melhor em fita dupla de DNA do que em fita simples. So aplicadas em digesto total ou parcial de DNA para serem clonadas ou em anlise de restrio.
Nuclease Bal 31
So exonucleases 3- 5 que remove progressivamente nucleotdeos da extremidade 3OH de DNA fita simples ou DNA fita dupla, mas tm alta especificidade para DNA fita simples. So aplicadas na deleo controlada a partir das extremidades de DNA fita dupla e geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento.
Nuclease S1
So endonucleases de fita simples que atuam melhor em DNA de fita simples do que em RNA de fita simples. So aplicadas para anlise de hbridos de DNA-RNA para identificao de ntrons, ma identificao da seqncia terminal dos transcritos (S1 Nuclease Mapping) e na
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remoo de bases salientes para produo de bases abruptas (a diferena est na forma como as extremidades foram clivadas). A ao dessa nuclease interrompida com a adio de EDTA.
Desoxirribonuclease I (DNAse I)
So endonucleases que degradam DNA fita simples ou dupla. So aplicadas para cortar molculas de DNA antes de fazer marcao isotpica; identificam regies do DNA onde se ligam protenas; removem DNA em preparaes de RNA; removem moldes de DNA aps transcrio in vitro; detecta regies transcricionalmente ativas na cromatina.
Nuclease Microccica
Tm atividade nuclesica no especfica sobre DNA e RNA fita simples ou dupla. So aplicadas para remoo de cidos nuclicos de extratos celulares e para estudos em cromatina.
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Exonuclease III
So especficas para DNA fita dupla com terminal 3-OH, atuando como exonuclease 3- 5; removem grupos fosfatos da regio 3 terminal de DNA fita simples e DNA fita dupla atravs da ao da parte 3 fosfatase que apresenta e funciona como endonuclease atuando assim especificamente para RNA e hbridos DNA-RNA. So aplicadas como End-labelling de DNA fita dupla que tm extremidades abruptas; geram subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento; fazem deleo controlada de seqncias a partir de extremidades de DNA fita simples ( em conjunto com uma endonuclease especfica para fita simples, como a Nuclease S1) e em tcnicas de mutagnese.
RIBONUCLEASES
Ribonuclease A (RNAse A), Ribonuclease H (RNAse H), Ribonuclease T1. So usadas para eliminar RNA, ou quando se mapeia, quantifica ou sequencia um RNA. Para o sequenciamento de RNA preciso usar uma combinao de RNAses que clivam em seqncias especficas, como as RNAses T1, U2 e CL3.
Ribonuclease A (RNAse A)
So endorribonucleases que clivam ligaes fosfodisteres na posio 3 de uma pirimidina. So aplicadas na remoo de preparaes de DNA. Antes de usar essa enzima pela primeira vez, deve-se ferver a soluo a 100C por quinze minutos a fim de inativar eventuais contaminaes com DNAse.
Ribonuclease H (RNAse H)
So endorribonucleases que clivam ligaes fosfodisteres de RNA em hbridos DNARNA. Ateno: estas no degradam RNA fita simples, RNA fita dupla, DNA fita simples nem DNA fita dupla.
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So aplicadas para eliminar de fita de RNAm aps a sntese da primeira fita do DNAc ( a fita de DNA sintetizada a partir de um molde de RNA DNA complementar), para facilitar a sntese da segunda fita de DNAc.
Ribonuclease T1
So endorribonucleases que clivam ligaes fosfodisteres de RNA aps um resduo G. So usadas para sequenciamento de RNA, mapeamento e quantificao de molculas de RNA por proteo pela nuclease em conjunto com a RNAse A e quantificao de transcritos feitos por transcrio in vitro a partir de um molde de DNA sem G. Dependendo da concentrao de NaCl ela atua diferente. Em concentraes de NaCl entre 0 e 100mM, a ribonuclease T1 cliva RNA de fita dupla, fita simples e a fita de RNA em heteroduplexes DNA:RNA. Na concentrao de NaCl 0,3M ou acima, atua somente sobre RNA fita simples.
DNA POLIMERASES
Fazem a duplicao e reparo do DNA nas clulas vivas. So agrupadas em trs grupos de acordo com o molde (template) que utilizam: DNA polimerase DNA dependentes; DNA polimerases RNA dependentes; DNA polimerases independentes de molde.
DNA Polimerases DNA Dependentes

DNA polimerases I, fragmentos Klenow, T4 DNA polimerase, T7 DNA polimerase, Taq DNA polimerase. Adicionam desoxirribonucleotdeos (dNTP) a uma extremidade 3OH de um fragmento de DNA (ou RNA) que esteja pareado com uma molcula complementar de DNA que serve como molde. A direo de sntese sempre no sentido 5- 3, a partir da extremidade 3-OH do DNA iniciador (primer).
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI Os fragmentos Klenow
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Algumas DNA polimerases tiram nucleotdeos da extremidade 5 (exonuclease) ou 3(exonuclease tambm). Quando ela corta a partir da extremidade 5, pode ser aproveitada junto com a DNAse I que corta o DNA de fita dupla para marcar a molcula pela tcnica de nick translation. Quando a atividade de retirar nucleotdeos a partir da extremidade 5 indesejada, tratase a DNA polimerase I com uma protease que elimina a poro N- terminal da molcula que tem atividade de retirada de nucleotdeos. Por engenharia gentica possvel obter o gene de DNA polimerase I truncada (quebrada) na poro N-terminal. Quando o gene transcrito, resulta uma polimerase sem a poro N-terminal que recebe o nome de fragmento grande da DNA polimerase de E. coli (por ser obtido atravs deste vetor) ou fragmento Klenow. Quando a polimerase no se dissocia do DNA molde e adiciona nucleotdeos continuamente a partir de um primer, diz-se que esse processo a processividade da polimerase. A maioria das polimerases tem baixa processividade, sendo uma das excees a T7 DNA polimerase que usada para incorporar milhares de nucleotdeos em reaes de sequenciamento de DNA.
DNA Polimerase I
Geralmente age adicionando acar ponta 3 de uma cadeia de nucleotdeos. Tendo formas de trifosfato de desoxirribonucleotdeos como substrato e energia. A energia para a ligao vem da prpria quebra da ligao do trifosfato, sobrando bifosfato e sendo adicionado um fosfato. Pode agir no sentido 5-3(DNA polimerase), para isso, requer molde de DNA fita simples iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3-OH. Pode agir retirando nucleotdeos no sentido 5-3(ao exonuclesica), degradando DNA
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fita dupla ou hbridos DNA-RNA a partir da extremidade 5-PO4, liberando nucleotdeos 5 fosfatos ou pequenos oligonucleotdeos de at 10 nucleotdeos de tamanho. Pode agir retirando nucleotdeos no sentido 3-5 (ao exonuclesica) degradando a fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3-OH, o que remove os pareamentos errados de bases. aplicada na marcao de DNA por nick translation e na sntese da segunda fita de cDNA (em combinao com a RNAse H). In vivo a reao para replicao do DNA pela polimerase I muito lenta( aprox. 20 nucleotdeos/ seg.) e muito abundante( aprox. 400 molculas/ clula) e a polimerase I se dissocia do DNA aps a incorporao de 20 a 50 nucleotdeos. Por isso os pesquisadores desconfiaram que a polimerase I no poderia ser a nica responsvel pela maioria das snteses de DNA. Foi descoberto mais tarde que a polimerase III catalisa a sntese de DNA na forquilha da replicao.
Fragmento Klenow
Age no sentido 5-3(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples, iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3-OH livre Pode agir retirando nucleotdeos (ao exonuclesica) no sentido 3-5, degradando o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3-OH. aplicado em end-filling e marcao de DNA fita dupla com extremidade 5 saliente; na marcao de DNA por random priming; no sequenciamento de DNA pelo mtodo de terminao de cadeia; na sntese de segunda fita de cDNA; na mutao stio-dirigida, n sntese da segunda fita e na produo de sondas de DNA fita simples por primer extension.
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T4 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5-3(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples e iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3-OH. Pode agir retirando nucleotdeos no sentido 3-5 (ao exonuclesica), degradando ativamente o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3-OH. No age retirando nucleotdeos no sentido 5-3. aplicado em end-filling e marcao de DNA fita dupla com extremidade 5 saliente; na marcao de DNA fita dupla pela tcnica de replacement synthesis; na gerao de subclones de DNA sobrepostos para sequenciamento e em gap-filling na manuteno stio-dirigida.
T7 DNA Polimerase
Pode agir no sentido 5-3(DNA polimerase) requerendo molde de DNA fita simples iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3-OH. Pode agir retirando nucleotdeos no sentido 3-5(ao exonuclesica) degradando o DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 3-OH. No retira nucleotdeos no sentido 5-3. aplicado no sequenciamento de DNA pelo mtodo da terminao em cadeia e na sntese da segunda fita de DNA. Esta enzima substitui a Polimerase Klenow quando se deseja mais rapidez e afinidade pelo molde de DNA. H um averso dessa enzima (Sequenase) que no possui a capacidade de retirada de nucleotdeos da extremidade 3-5, sendo ideal pra o sequenciamento de DNA, pois altamente processiva.
Taq DNA Polimerase

Foi isolada de bactria termfilas. Pode agir no sentido 5-3(DNA polimerase) requerendo um molde de DNA fita simples iniciador de DNA ou RNA cm extremidade 3-OH.
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Pode agir retirando nucleotdeos na extremidade 3-5(ao exonuclesica) degradando DNA fita simples ou DNA fita dupla a partir da extremidade 5-PO4. aplicado em PCR; sequenciamento da DNA a altas temperaturas e em DNA footprinting. Existem outras polimerases termoestveis no mercado: Bst Polimerase, rTth Polimerase, Vente Polimerase, Pirostase, Hot Tub.
DNA Polimerases RNA Dependentes

AMV Transcriptase reversa Duplicam genomas baseados em RNA, como o dos retrovrus. Essas enzimas so empregadas por esses organismos para sintetizar uma cpia de DNA a partir de seus genomas de RNA. Esta a chamada transcrio reversa, as enzimas que as promovem so as Transcriptases Reversas. Essas enzimas so multifuncionais, mas mais empregada na sntese de DNA a partir de um molde de RNAm, tendo como iniciador um oligo (dT). A fita de DNA que sintetizada a partir do RNA chamada cDNA (DNA complementar). Tambm podem polimerizar uma molcula de DNA a partir de um molde de DNA.
AMV Transcriptase Reversa

Age como DNA polimerase 5-3requerendo molde de RNA fita simples ou fita dupla e um iniciador de DNA ou RNA com extremidade 3-OH. No possui atividade exonuclesica. Pode agir no sentido 5-3 e 3-5 como exorribonuclease degradando especificamente o componente de RNA dos hbridos DNA-RNA. Essa atividade denominada atividade tipo RNAse H
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aplicada para sntese da primeira fita de cDNA; no sequenciamento de DNA pelo mtodo da terminao de cadeia (sobretudo em moldes ricos em G e C), pois no possui atividade exonuclesica 3-5; identificao de estruturas secundrias do RNA e marcao da extremidade 3 do DNA.
DNA Polimerase - Independente de Molde

Terminal Transferase Enzima isolada de timo de novilho que catalisa a incorporao de dNTP (ribonucleotdeo) a uma extremidade 3-OH de DNA sem necessidade de molde. Essa capacidade foi utilizada para tornar compatveis as extremidades de insertos e vetores de clonagem atravs da construo de extremidades homopolimricas complementares. Terminal Deoxinucleotidil Transferase (Terminal Transferase) Adiciona dNTP(ribonucleotdeo) extremidade 3-OH de DNA fita simples ou DNA fita dupla, mas a reao ocorre com mais eficincia em fita simples. Para aumentar a eficincia em fita dupla tem que adicionar Co++. aplicada na adio de cauda homopolimrica e na marcao de extremidade 3-OH como 3- dNTP(ribonucleotdeo), 3NTP ou ddNTP marcados radioativamente.
RNA POLIMERASES
So as principais enzimas responsveis pela transcrio do DNA em RNA. Catalisam a adio de ribonucleotdeos a uma extremidade 3-OH sem a necessidade de um iniciador anelado. As RNA polimerases so divididas em trs classes: DNA dependentes; DNA independentes e RNA dependentes RNA dependentes(Replicases).
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI Responsveis pela duplicao de certos genomas virais de RNA. DNA dependentes Podem ter origem bacteriana ou viral. Bacteriana: RNA polimerase DNA - dependentes RNA polimerase de E. coli responsvel pelo reconhecimento das regies RNA polimerases dos vrus SP6, T7 e T3. RNA polimerases DNA independentes
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-10 e -35 do
promotor bacteriano. Tm baixa processividade in vitro, portanto so preferveis as
Poli (A) polimerase isolada de E. coli que no requer molde de DNA e que adiciona resduos de AMP a uma extremidade 3-OH de RNA a partir de ATP. Polinucleotdeo fosforilase foi a enzima chave para a sntese das molculas de RNA que permitiu a elucidao do cdigo gentico. Age como a Poli (A) polimerase, mas a partir de precursores de NDP.
RNA Polimerases DNA Dependentes

RNA polimerase de E. coli Transcreve a partir de promotores que possuem a seqncia consenso de promotores de E. coli. aplicada em transcrio in vitro e na sntese de RNA marcado radiotivamente. RNA polimerase de fagos (SP6, T3 e T7) Tm transcrio altamente especfica a partir de promotores dos fagos SP6, T3, T7. aplicada em produo de RNA anti-sense; na sntese de RNA marcado radioativamente; na sntese de RNAm para traduo in vitro e no sequenciamento de RNA.
RNA Polimerases DNA Independentes

Poli (A) polimerase
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI Adicionam cauda poli (A) extremidade 3-OH de RNA fita simples.
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aplicada na marcao radioativa de RNA e na adio de cauda poli (A) para servir de molde para oligo (dT) durante sntese de cDNA.
Polinucleotdeo Fosforilase
Adiciona ribonucleotdeo a uma extremidade 3-OH de um RNA aceptor. aplicada na sntese artificial de molculas de RNA.
LIGASES
As ligases catalisam a formao de uma ligao fosfodister entre grupos justapostos 3-OH e 5-PO4. A reao ocorre entre molculas de DNA fita dupla com extremidades abruptas ou coesivas. Podem ser de origem bacteriana ou viral. A DNA ligase de E. coli de origem bacteriana usa como fonte de energia o NADH. A T4 DNA ligase de origem viral usa como fonte de energia o ATP, por isso so preferenciais em clonagens moleculares para ligar extremidades abruptas. A RNA ligase une molculas de RNA ou DNA fita simples na presena de ATP. H evidncias de que a T4 RNA ligase estimula a atividade da T4 DNA ligase na ligao de extremidades abruptas.
T4 DNA Ligase
Catalisa a formao da ligao fosfodister entre extremidades adjacentes 3-OH e 5PO4 intramolecularmente em regies de corte (nicks) ou entre extremidades coesivas ou abruptas. aplicada entre molculas de DNA para clonagem de fragmentos.
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T4 RNA Ligase
Catalisa a formao da ligao fosfodister entre extremidades 3-OH e 5-PO4 de DNA fita simples e RNA fita simples. aplicada na unio de molculas de DNA fita simples ou RNA fita simples; no aumento de eficincia da T4 DNA ligase em ligaes de extremidades abruptas e na marcao da extremidade 3-OH de RNA.
FOSFATASES E QUINASES
Fosfatases so empregadas para desfosforilar extremidades 5-PO4 de vetores de clonagem para evitar o religamento dos mesmos aps a adio da DNA ligase na presena de insertos, assim aumenta o nmero de clones transformantes contendo insertos clonados no vetor. Podem agir em associao com as Quinases, pois a Polinucleotdeo Quinase transfere um grupo fosfato terminal do ATP (y fosfato) extremidade 5-OH das extremidades defosforiladas. Esse grupo terminal pode ser marcado radiotivamente. As quinases tambm podem trocar o grupo 5-PO4 do DNA para o ADP, mas essa reao menos eficiente que a atividade de transferncia do grupo fosfato do ATP ao 5-OH.
Fosfatases
Fosfatase alcalina bacteriana (Bacterial Alkaline Phosphatase BAP); Fosfatase alcalina de intestino de novilho (Calf Intestinal Phosphatase CIP); Fosfatase alcalina de camaro (Shrimp Alkaline Phosphatase SAP). Removem grupos fosfato de extremidade 5de rNA fita simples, DNA fita simples, RNA fita dupla, DNA fita dupla, dNTP e NTP So aplicadas em defosforilao de DNA fita dupla para evitar autoligao de vetores de clonagem; na defosforilao de DNA e RNA para posterior marcao da extremidade 5 com Polinucleotdeo Quinase e como componente de conjugado de anticorpo para imunodeco.
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Quinases
T4 Polinucleotdeo Quinase 5quinase: transfere y- fosfato de ATP para uma extremidade 5-OH de DNA fita simples, DNA fita dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla. 3fosfatase: remove grupos fosfato da extremidade 3 de DNA fita simples, DNA fita dupla, RNA fita simples ou RNA fita dupla. So usadas na marcao de extremidade 5 de DNA ou RNA para sequenciamento de DNA pela tcnica de Maxam-Gilbert; no sequenciamento de RNA e na remoo de 3PO4.
Cuidados quanto ao uso de enzimas de restrio: Contaminantes (polifenis, polissacardeos etc.) interferem na atividade das enzimas, reduzindo a eficincia. A contaminao por polissacardeos consiste na principal contaminao afetando a pureza do DNA extrado de plantas. Esses carboidratos podem inibir a atividade de vrias enzimas usadas em manipulaes biolgicas de DNA, tais como ligases, polimerases, e enzimas de restrio. A contaminao por fenis, e a conseqente oxidao do DNA, pode ser evitada agregando PVP, -mercaptoetanol ao tampo de extrao. Em casos extremos, o composto dietilditiocarbamato (0,1 M) pode ser adicionado.
SOLUO TAMPO
Solues capazes de manter o pH constante mesmo que pequena quantidade de cido ou base seja a ela adicionada. Para a escolha do tampo: a) escolher um sistema c/bas conjugado com pKa (da base ou do cido ) mais prximo possvel do pH desejado. pKa: ponto de inflexo da curva de neutralizao de um grupamento cido ou bsico.
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A capacidade tamponante ser maior em um pH prximo ao pKa, pois nessa faixa mais fcil absorver radicais OH- e H+ gerados nessa soluo. b) permitir o preparo de soluo tampo de menor concentrao depende da capacidade tamponante do par cido /base. c) no alterar outras variveis como a fora inica. Deve-se evitar a ao de DNAses (nucleases), que podem degradar o DNA. Por esse motivo os tampes de extrao de DNA possuem pH por volta de 8,0 (enquanto o pH timo para ao de DNAses endgenas fica por volta de 7,0) :
TAMPO DE CORRIDA
A composio e a fora inica do tampo de corrida influenciam na migrao e na qualidade do resultado de uma eletroforese. Em baixa fora inica, a migrao muito lenta, e em extrema fora inica provoca uma alta condutividade eltrica, que gera calor e pode levar desnaturao das partculas analisadas. Os tampes mais utilizados so: TAE e TBE
TAE (TRIS-ACETATO-EDTA)
Tem baixo custo, mas capacidade tamponante menor que o TBE. No deve ser utilizado em corridas longas nem em altas voltagens. Caso seja necessrio seu uso nesses casos, deve-se trocar o tampo no meio da corrida. O TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rpida quando o DNA apresenta-se sob a forma linear ou supernoveladas.
CTAB 2%
As membranas celulares devem ser rompidas para liberao do DNA: detergente catinico CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide - Brometo de etiltrimetilamnio).
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Os cidos nuclicos devem ser separados de polissacardeos, porque inibem a ao de enzimas de restrio e torna a amostra de DNA excessivamente viscosa, interferindo na migrao do DNA em corridas eletroforticas. Polissacardeos e cidos nuclicos possuem solubilidade diferenciada na presena desse detergente.
Os cidos nuclicos so polinions solveis em gua.
Os sais de sdio e
potssio de cidos nuclicos so insolveis na maioria dos solventes orgnicos, incluindo numa mistura de etanol e gua, mas eles no so desnaturados por solventes orgnicos. O detergente catinico CTAB solubiliza membranas celulares, e dependendo da concentrao de NaCl no tampo, CTAB forma um complexo com o DNA, e utilizado para precipitar DNA seletivamente.
NaCl 5M
Precipitao do DNA Neutralizante
EDTA (CIDO ETILENO DIAMONO TETRACTICO) 0,5 M PH 8,0

Tambm para evitar ao de DNAses. Este agente quelante imobiliza cations de Mg, que so cofatores para vrias endonucleases.
CLOROFRMIO (LCOOL ISOAMLICO) (E/OU FENOL)

Os cidos nuclicos devem ser separados das protenas. Desnaturam as protenas tornando-as insolveis fase aquosa. A utilizao de soluo fenol/clorofrmio seguida de clorofrmio /lcool isoamlico usada para remover qualquer trao de fenol remanescente. Nesse processo as protenas desnaturadas ficam na interface das fases fenlica e aquosa.
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INCUBAO EM BANHO-MARIA
Hidrlise do RNA
-Mercaptoetanol 0,2%
Antioxidante: O DNA deve ser protegido da ao de compostos fenlicos, como peroxidades e polifenoloxidades que oxidam o DNA (a contaminao por compostos fenlicos pode ser evidenciada pela colorao do DNA marrom). Ao: quebra parte do dissulfeto para a molcula ficar linear, eliminando a contaminao por fenis.
PVP (POLIVINILPIRROLIDONA)
Tambm antioxidante, evita a oxidao de polifenis, eliminando a contaminao por fenis.
BROMETO DE ETDEO
um anlogo de base que se intercala na molcula de DNA e emite fluorescncia violeta quando exposto aos raios UV. Na sua presena ocorre reduo de velocidade de migrao, pois o DNA aumenta o seu tamanho e muda de forma.
BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)

Tambm antioxidante, evita a oxidao de polifenis. Protena neutra que estabiliza enzimas de restrio.
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DPEC
Inibidor de RNA. Para extrao de RNA, comum tratar as solues com dietil pirocarbonato (DEPC) de forma a desnaturar RNAses. Entretanto, em certos casos e situaes, apenas a esterilizao em autoclave j suficiente para inativar ribonucleases. No necessrio tratar o tampo de extrao. Todos os tubos de centrfugas, cadinhos, almofariz, pipetas (plsticas ou de vidro) devem ser autoclavadas e secadas antes do uso, ou tratados com DEPC. No misturar DEPC e TRIS. Caso o protocolo necessite de TRIS livre de RNAse, usar gua livre de RNAse.
TRIS- HCl; pH 7,4

Soluo neutralizante.
PROTENA K
Alguns protocolos incorporam proteases (proteinase K) para facilitar a separao do DNA das protenas da cromatina.
ETANOL OU ISOPROPANOL
Recuperao dos cidos nuclicos totais por precipitao em lcool (etanol ou isopropanol).
ACETATO DE SDIO (SAIS)

Eliminao do RNA por digesto com RNAse, ou separao de RNA e DNA por solubilidade diferencial em sais. Sob condies de alta concentrao de sais (Ex. 7,5 M de Acetato de Sdio), DNA e os RNA pequenos (principalmente tRNA) permanecem em soluo, enquanto que RNA (> que 60 bases) precipita.
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TCNICAS MAIS UTILIZADAS
INOCULAO DE VIROSE EM CURCUBINCEAS

Tampo USO: 7,0 ml tampo fosfato monobsico 12,0 ml tampo fosfato dibsico 181 ml gua destilada Por ltimo: 12 g bissulfito Macerar alquota de aprox.20g de folha positiva para vrus em 20 ml de tampo uso. Usar Carburundum 400 mesh para esfoliar a folha de mudas novas em estgio de at 3 folhas (folhas cotiledonares expandidas) e esfregar o macerado nas folhas. Transplantar as mudas aps 3 dias de inoculao.
EXTRAO DE DNA VEGETAL PELO MTODO CTAB
Tampo CTAB para extrao de DNA vegetal de folhas cotiledonares expandidas

Estoque Concentrao Final Volume Final 15 mL
CTAB 5% NaCl 5M EDTA 0,5 M Tris-HCl (pH8)1,0M PVP* slido -Mercaptoetanol** H2O completar o volume para
2% 1,4 M 20 mM 100 mM 2% 0,2%
6 mL 4,2 mL 0,6 mL 1,5 mL 0,3 g 30 L 15 mL
PVP - polivinilpirrolidona; **Colocar imediatamente antes do uso e sob capela.
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Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampo CTAB pr aquecido a 65C. Incubar a 65C e agitar a cada 10 min por 30 min suavemente. Adicionar 1 volume de clorofrmio( lcool isoamlico) ou trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min. Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm) Transferir o sobrenadante para outro tubo. Repetir a extrao com clorofrmio ou trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min Centrifugar por 10 min a 5000g (8000rpm) Opcionalmente, adicionar RNAse a uma concentrao final de 100mg/ml e incubar a 37C por 30 min. Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. Misturar suavemente por inverso do tubo. Se o complexo DNA-CTAB formar uma rede filamentosa visvel, recuperar esse DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o DNA no aparecer ou ficar floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 min e descartar o sobrenadante.
A agitao suave emulsifica as fases formadas preservando o DNA.
Quanto mais repetio, mais pura a amostra, mas com menos DNA.
Sempre que possvel, evitar a centrifugao por levar a uma co-precipitao de DNA e polissacardeos. Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o precipitado se soltar do fundo, centrifugar por 3 min a 10000g (12.000 rpm) para grudar o precipitado no fundo do tubo. Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em cmera de fluxo laminar. O precipitado no deve conter resduos de isopropanol ou secar demais, por que pode dificultar a ressuspenso do DNA.
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Dissolver o precipitado em 200 a 500 mL de TE e incubar a 4C por uma hora ou mais. Para uma purificao posterior, seguir para a etapa de acetato de amnio ou fazer purificao por gradiente de CsCl.
Macerao
15 ml de tampo CTAB
+ um volume de
Clorofrmio
Centrifugado
Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugao com clorofrmio
Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugao com clorofrmio: Transferir fase superior para novo tubo com etanol ou isopropanol 0,6 volumes e RNAse:
Misturar por inverso de tubo suavemente:
Filamento de DNA
lavar precipitado de DNA com etanol 70%
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Inverter tubo para secar
Dissolver o precipitado em 200 a 500 L de TE
Sem RNAse, nem centrifugao:
desproteinizao, os compostos
celulares apresentam-se assim, aps
1Protena, 2DNA, 3R :
EXTRAO DE DNA VEGETAL PELO MTODO DE DOYLE E DOYLE
O DNA de plantas ser extrado de acordo com protocolo modificado de Doyle e Doyle (l990). Esse mtodo foi adaptado de um mtodo proposto por Saghai-Maroof et al. (1984). Ler consideraes em Ferreira e Grattapaglia (1995) (pg 121 a 139).
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1. Coletar as amostras de folhas jovens e saudveis das plantas, evitando reas atacadas por pragas e doenas. De modo geral devem-se lavar as folhas em gua corrente, usando, sempre que necessria gua sanitria e/ou sabo. Enxaguar, e em seguida rinsar em gua destilada, e secar com papel toalha. Esse material pode ser congelado, liofilizado, seco em estufa a aproximadamente 4oC, ou usado diretamente. 2. Utilizar cerca de 150 mg de lminas de folha frescas ou 50 mg de folhas liofilizadas ou secas. As amostras sero trituradas em almofariz na presena de nitrognio lquido. Uma possibilidade utilizar discos foliares cortados com a tampa dos microtubos Eppendorf de 1,5 ml. O material pode ser triturado em cadinho e transferido para o tubo, ou diretamente no tubo usando um micro-pistilo. 3. O material ser transferido para um tubo de centrfuga, e 650 1 do tampo de extrao ser adicionado: 10 ml 2% CTAB 1.4 M NaCl 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) 20 mM EDTA, pH 8,0 0,2 g do produto 2,8 ml do estoque 5 M NaCl 1 ml estoque 1 M Tris Cl pH 8,0 400 l do estoque 0,5 M EDTA, pH 8,0
1% polivinilpirrolidona MW10,000 0,1 g do produto
4. Adicionar a uma alquota do tampo a ser usado, pouco antes do uso: 0,2 % -mercaptoethanol 50 g ml-l de proteinase K 5. Misturar os tubos em vrtex, e coloc-los em banho-maria a 55oC por 60 minutos. 6. Adicionar 650 l de clorofrmio: lcool isoamil (24:1) e misturar at formar uma emulso. 7. Microcentrifugar a soluo por 5 minutos a 12000 rpm.
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8. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para no pipetar a interfase. Caso o volume da fase superior no for superior fase intermediria com fragmentos de tecido, adicionar mais tampo e misturar vigorosamente e re-centrifugue. 9. Adicionar 200 l.tubo-1 do tampo de extrao sem proteinase K e mercaptoetanol, e adicionar 650 l de clorofrmio: lcool isoamil (24:1), misturando at formar uma emulso. 10. Microcentrifugar a soluo por 5 minutos a 12000 rpm. 11. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, com cuidado para no pipetar a interfase. 12. Repetir esses trs passos anteriores mais uma vez. 13. Coletar a fase aquosa superior e transferir para um novo tubo, e adicionar um volume igual de isopropanol. 14. Centrifugar o DNA por 5 minutos a 12000 rpm. 15. Lavar o pellet com 1 ml de Etanol 70% para remover sais por duas vezes, e secar ao ar ou sob vcuo num dessecador. 16. Ressuspender o DNA em 20 l de tampo TE contendo ribonuclease [RNAse] (10 g.ml-l). A RNAse deve ser fervida dependendo da origem comercial. Vrias preparaes so contaminadas por DNAses, que so inativadas pela fervura, enquanto que as RNAses no so (demonstrando a resistncia dessas enzimas). Em geral prepara-se estoque dissolvendo 100 mg de RNAse em 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 15 mM NaCl; aquecer em gua fervente por 15 minutos e resfriar lentamente a temperatura ambiente. Fazer alquotas de 1 ml e armazenar a 20oC.
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MTODO
PARA
EXTRAO
DE
DNA
DE
CLULAS
EUCARITICAS
Preparao de DNA de clulas eucariticas (Sambrook&Russel, 2001). Mtodo adequado para Southern Blot e para construo de banco genmico por obter um DNA genmico de alta qualidade de elevada massa molecular. Solues e material TBS Tris-HCl 20mM; pH7.4 NaCl 150mM
Proteinase K Tampo de extrao Tris HCl 10 mM ; pH 8.0 EDTA 0,1M SDS 0,5%
RNAse a 20 g/mL Dissolvida em tampo acetato de sdio 50 mM; pH 4.8 e fervida em banho-maria por vinte minutos para eliminar qualquer DNAse contaminante. Conservar em eppendorf de 1,5 mL a -20C. Fenol equilibrado 1 volume de fenol 1 volume de Tris 1M B-Hidroxiquinolina 0,1% (p/v) B-Meracaptoetanol 0,2% (p/v)
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Soluo equilibrada com Tris-HCl 100mM; pH8.0; EDTA 1mM; NaCl 200mM
Etanol absoluto Etanol 70% (v/v) TE Tris-HCl 10mM; pH8.0 EDTA 1mM; pH 8.0
Soluo de cido ctrico / glicose cido ctrico Citrato de sdio Glicose gua destilada 0,48 g 1,32 g 1,47 g q.s.p. 100 mL
Materiais: Incubadora com agitao, tubos de vidro e plstico, centrfuga, basto de vidro em forma de gancho. Mtodo 1. Usar 0,5 mL de TBS para raspar as clulas da placa de cultura 2. Transferir a suspenso de clulas para um tubo de centrfuga e colocar no gelo 3. Lavar a placa 1x com 1 mL de TBS e juntar a primeira suspenso (pode ser utilizado 0,5 g de tecido mole) 4. Centrifugar a 1500xg/10 min a 4C. Ressuspender as clulas em 5 a 10 volumes de TBS gelado e repetir a centrifugao. 5. Transferir a soluo para um enlermeyer (para uma suspenso de 1 mL de clulas, usar frasco de 50 mL) e adicionar 10 mL de tampo de extrao para cada 1 mL de suspenso de clulas 6. Incubar a 37C por 1 hora
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7. Adicionar proteinase K para uma concentrao final de 100 g/mL.Misturar lentamente com um basto de vidro 8. Incubar a 50C por 3 horas 9. Resfriar a temperatura ambiente 10. Transferir as clulas para um tubo de centrfuga e adicionar igual volume de fenol equilibrado. Misturar lentamente. 11. Centrifugar a 5000xg/15 min temperatura ambiente 12. Transferir a fase aquosa para um tubo limpo e repetir a extrao mais duas vezes. 13. Para se obter DNA de alta massa molecular (= 200Kb), depois da 3 extrao com fenol, dialisar a fase aquosa a 4C contra 4 litros de uma soluo de Tris-HCl 50mM; pH8.0; EDTA 10mM at que a A270 do dialisado esteja menor que 0,05. 14. Para isolar DNA com tamanho entre 100 e 150 Kb, transferir a fase aquosa final para um tubo de centrfuga novo e adicionar 0,2 volumes de etanol e, usando um basto de vidro, enrolar o DNA. Se o DNA precipitado tornar-se fragmentado, coletar por centrifugao a 5000 xg/5min temperatura ambiente. Lavar o DNA com etanol 70%. 15. Secar e ressuspender o DNA em 1 mL de TE para cada 5x106 clulas. Deixar o DNA dissolvendo na geladeira (4C) durante a noite. 16. Estimar a concentrao por espectrofotometria a 260nm ou usar 1/10 do volume final para anlise em gel de agarose. 17. Preparao de DNA de tecidos Mesmo protocolo a partir do item 7 . Congelar o tecido em nitrognio lquido e pulverizar usando cadinho. Deixar o nitrognio evaporar e adicionar ao tecido aproximadamente 10 volumes de tampo de extrao e transferir a suspenso para um tubo de centrfuga. Em seguida iniciar passo 7. Obs: Ao trabalhar com DNA cromossomal usar pipetas de grosso calibre ou cortar as pontas das pequenas, pois o pequeno dimetro pode causar quebra mecnica do DNA.
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Estimativa de Concentrao de DNA, Aps Sua Extrao Quantificao de DNA (e RNA) Atravs de Espectrofotometria
O DNA de fita simples absorve mais que o DNA de fita dupla helicoidal por que as bases esto encontradas no interior das hlices. Essa informao permite monitorar por espectrofotometria o momento da desnaturao da fita dupla, que de rpida transio, que caracterizada por aumento da absorbncia da mistura analisada (efeito hipercrmico). Ao contrrio dos peptdeos, as bases aminadas nos cidos nuclicos so cromforos fortes. As 5 bases encontradas no DNA ou RNA absorvem entre 250 e 280nm. O padro de absoro tpico de protenas a 280nm. O padro de absoro tpico de DNA a 260nm. *Razo tima entre A260/ A280 DNA 1,8 - 1,9 RNA 1,9 2,0 Quando h protenas, esses valores so diminudos. Campos aromticos (fenis) tambm interferem e eles so usados na purificao de DNA e RNA. Espectrofotometria para avaliao de pureza, e quantificar a partir do passo 8. 1. Diluir a amostra de DNA 1:500 em 1mM Tris-HCL; pH 7.5 2. Preparar o TE: (10mM tris-HCL; pH 8.0; 1mM EDTA) 3. Adicionar 1mL de TE cubeta de quartzo e zerar a 260 nm com o branco (branco=TE) No usar cubeta de vidro que opaca radiao ultravioleta. 4. Adicionar 1mL da diluio na cubeta (sem o TE) 5. Ler a 260nm 6. Repetir as leituras em 230, 280 e 320 nm
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Se o aparelho no for de feixe duplo, zerar com o branco em cada comprimento de onda. 7. *Avaliar a pureza: A260 /A280 >ou igual 1,8 A320< 0,1 . A260 8. Calcular a [DNA] ou [RNA] conforme a frmula mais conveniente
A estimativa da concentrao de DNA depende do tipo e quantidade de amostra disponvel. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo nvel de contaminao por protenas, fenis, polissacardeos, lcool, ou outros cidos nuclicos, a estimativa por espectrofotmetro, medida pela absorbncia das bases a 260 nm consiste num mtodo simples, rpido e com certa preciso. Para quantificao de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 nm at 320 nm. A leitura a A260nm permite o clculo da concentrao de cidos nuclicos na amostra. Uma DO (Densidade ptica) de l corresponde aproximadamente a 50 g ml-1 para DNA dupla fita, 40 g ml-1 para DNA e RNA fita simples, e cerca de 20 g ml-1 para oligonucleotdeos. *A relao entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma estimativa da pureza dos cidos nuclicos. Solues puras de DNA e RNA possuem valores de DO260/DO280 entre 1,8 e 2, respectivamente. Se existe contaminao com fenol ou protenas, a relao DO260/DO280 ser muito menor, e a preciso nas quantidades de cidos nuclicos ser baixa.
Espectrofotometria Para Quantificao de DNA

Nessa prtica utilizaremos o espectrofotmetro, gel de agarose, fluormetro e placa de Petri com padro. Para leitura a 320nm: Ligar o espectrofotmetro 15 minutos antes. 1 . Colocar o comprimento de onda para 320 nm.
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Fazer uma soluo diluda em gua da amostra de DNA (1:100, 1: 500, ou at 1: 1000). Zerar o instrumento com gua em Abs320nm. Fazer leituras de Abs230nm, AbS260nm, Abs280nm e Abs320nm Estimar a concentrao de DNA pela frmula (Abs260nm Abs320nm) x 50 x fator de diluio = [DNA] em g ml-1
Obs. Existe um superestimativa da concentrao por espectrofotmetro devido a impurezas na soluo. 6. Fazer um estoque de trabalho com a concentrao de 5 ng l-1
Para leitura a 260nm: Para quantificao: Diluir a 1:1000 ou 1:500 em gua ou soluo tamponada com Tris 1 mM, pH 8.0. ler a 260 nm da amostra e do branco Fita dupla [ds DNA ( /mL)] = Fita simples [ss DNA ( /mL)] = RNA [RNA ( g/mL)] = 50 . A260 . diluio 33 . A260 . diluio 40 . A260 . diluio
Oligonuc. sintticos [DNA (pmol/ L)] =_ 100 . A260 . diluio___________ 1,5 Na + 0,71 Nc + 0,2 Ng + 0,84 Nt Porque a diferena dos sintticos: como a estrutura molecular modifica a absoro, tem que adaptar a frmula, pois os sintticos de DNA s so obtidos na forma Cis e os normais so Trans. O uso de protocolos de extrao de DNA simplificados, que utilizam pouco material de origem, ou possuem poucos passos de purificao, tendem a produzir cidos nuclicos com maior contaminao.
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Em plantas tropicais, existe um grande problema de contaminao com polifenis e polissacardeos. Nesses casos, a estimativa por espectrofotometria no permitem uma determinao acurada da concentrao de DNA. Nesse caso, o mtodo de escolha consiste na fluorometria. A amostra de DNA a ser estimada tratada com um corante especfico para DNA dupla fita (ex. Hoechst 33258), e esse corante excitado a um comprimento de onda (365 nm) e com emisso a 460 nm proporcional a concentrao de DNA. RNA, protenas e nucleotdeos no afetam as leituras. (ver descrio na pgina 124-125 de Ferreira e Grattapaglia, 1995). Outros mtodos empregados utilizam a caracterstica da fluorescncia em ultravioleta induzida pela intercalao de brometo de etdeo na dupla fita de DNA. A fluorescncia proporcional concentrao de DNA, e pode-se determinar a quantidade de DNA numa amostra por comparao com padres conhecidos. A comparao de fluorescncia pode ser feita num mini-gel, que permite tambm a separao de DNA do RNA. Uma outra possibilidade aplicar a amostra numa placa de petri com 1% agarose contendo brometo de etdeo (0,5 mg ml-1), e comparar com padres. Manter a placa a 37'C por cerca de 30 minutos e observar no transiluminador. (usar 0,5 g de agarose 1% em 50 ml de tampo TAE, adicionar 5 l de brometo de etdeo 10 mg/ml e analisar alquotas de 2 L).
ISOLAMENTO DE DNA PELO MTODO TRIZOL

Depois de completada a remoo da fase aquosa, como descrito no protocolo de isolamento de RNA, o DNA pode ser isolado na interfase e fase fenlica a partir do homogeneizado inicial. Seguindo precipitao e uma srie de banhos, o DNA solubilizado em 8mM NaOH. O DNA recuperado a partir de tecidos e culturas celulares permite o uso de reagente Trizol para a determinao do DNA contido na anlise de amostras. Simultneas extraes de DNA genmico permitem normalizao de resultados de Northern Blot por DNA genmico em vez de maior variao de peso de RNA total ou tecido. (Dependendo da fonte, o pellet de DNA obtido pode requerer purificao - ex. extrao por fenol - primeiramente para outras aplicaes).
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Reagentes requeridos: Etanol Citrato de sdio 0,1 M em 10% de etanol Etanol 75% NaOH 8 mM Exceto sob outros aspectos, o experimento transcorrido entre 15 a 30C. 1. PRECIPITAO DE DNA Remover a fase aquosa remanescente demasiadamente a interfase e precipitar o DNA da fase orgnica e da interfase com etanol. Adicionar 0,3 mL de 100% de etanol por 1 mL de reagente Trizol. Reagente usado pela homogeneizao inicial, e misturar amostras por inverso. Depois estocar as amostras entre 15 a 30C por 2 a 3 minutos e sedimentar o DNA por centrifugao por no mais de 2.000 xg por 5 min entre 2 e 8C. Remover cuidadosamente a fase aquosa crtico para a qualidade do isolado de DNA. 2. LAVAGEM DO DNA Remover o sobrenadante etano-fenol e se desejar, salvar este para precipitao de protenas. Lavar o pellet de DNA duas vezes numa soluo contendo 0,1 M de citrato de sdio em 10% de etanol. Usar 1 mL da soluo por 1 mL de reagente Trizol usado na homogeneizao inicial. Para cada lavagem, estocar o pellet de DNA em soluo de lavagem por 30 minutos entre 15 a 30C (com mistura peridica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 e 8C.
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Seguindo estas duas lavagens, suspender o pellet de DNA em 75% de etanol (1,5-2 mL de etanol 75% por 1 mL de reagente Trizol), estocar por 10-20 minutos entre 15 e 30C (com agitao peridica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 a 8C. Uma lavagem adicional em soluo de citrato de sdio a 0,1 M (em etanol 10%) requerida para grandes pellets contendo 200 g de DNA ou grandes quantidades de material que no DNA. 3. REDISSOLVENDO O DNA Secar o DNA ao ar de 5 a 15 minutos em tubo aberto. (No secar em centrfuga; isso far ficar mais difcil para dissolver). Dissolver o DNA em NaOH 8 mM de modo que esta concentrao de DNA seja 0,20,3 g/ L. Tipicamente, adicionar 300-600 L de NaOH 8 mM para DNA isolado de 107 clulas ou 50-70 mg de tecido. Ressuspendendo em base fraca ALTAMENTE recomendvel desde que o isolado de DNA no ressuspenda bem em gua ou em Tris. O pH de NaOH 8 mM apenas 9 e deveria ser facilmente ajustado com TE ou HEPES uma vez que o DNA est na soluo. Para este estgio, a preparao de DNA (especialmente de tecidos) pode conter material gel insolvel (fragmentos de membranas, etc.). Remover o material insolvel por centrifugao de >12.000 xg por 10 minutos. Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo. O DNA solubilizado em NaOH 8 mM pode ser estocado toda noite a 4C; para perodos prolongados, amostras podem ser ajustadas com HEPES para pH 7-8 e suplementados com 1 mM de EDTA. Uma vez que o DNA ajustado, pode ser estocado a 4 C ou -20C.
Quantificao e Expectativa de Rendimento de DNA
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Pegar uma alquota da preparao de DNA solubilizada em NaOH 8 mM, misturar com gua e a soluo final medir a A260. Calcular o teor de DNA usando o valor A260 por duplo traado de DNA. Uma unidade A260 equivale a 50 g de duplo traado de DNA/mL. Para calcular o nmero de clulas em amostras analisadas, admitir que uma poro de DNA por 1 x 106 clulas humanas diplides (e de ratos e camundongos) originais equivalem a 7,1 g, 6,5 g e 5,8 g respectivamente. Aplicaes: Amplificao de DNA por PCR Depois de redissolvido o DNA em NaOH 8 mM, ajustar o pH para 8.4 com HEPES 0,1 M. Adicionar entre 0,1 e 1,0 g de amostra de DNA para sua reao de PCR , misturar e aplicar o protocolo de PCR padro.
Reao de Restrio de Endonuclease

Ajustar o pH do DNA para um valor requerido usando HEPES. Alternativamente, amostras podem ser dualizadas em preparao para 1 mM de EDTA; pH 8.0. Usar 3-5 unidades de enzimas por micrograma de DNA. Usar as condies recomendadas pela fbrica das enzimas em particular, e permitir fazer o processo da reao entre 3 a 24 horas. Num ensaio tpico, 80-90% do DNA digerido. Ajustamento de pH de amostra de DNA em NaOH 8 mM:
pH Final 8.4 8.2 8.0 7.8
HEPES 0,1 M 86 93 101 117
pH Final 7.2 7.0
HEPES 1 M ( L) 23 32
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Notas para isolamento de DNA: 1. A fase fenlica e interfase podem ser estocadas entre 2 e 8C durante a noite. 2. Amostras suspensas em etanol 75% podem ser estocadas entre 2 e 8C por meses. 3. Amostras dissolvidas em NaOH 8 mM podem ser estocadas toda a noite entre 2 e 8C. Para estocagem de longos perodos ajustar o pH para 7-8 e ajustar a concentrao de EDTA para 1 mM.
Guia de Soluo de Problemas

ISOLAMENTO DE DNA * Expectativas de rendimento de DNA por mg de tecido ou 1 x 106 cultura celular Fgado e rim, 3-4 g Msculo esqueltico e crebro e placenta, 2-3 g Clulas humanas, ratos e camundongos (1 x 106 cultura celular), 5-7 g Fibroblastos, (1 x 106 cultura celular) 5-7 g * Baixo rendimento Homogeneizao incompleta ou lise de amostra. Pellet de DNA final no dissolvido completamente. * Razo A260/280 < 1.70 Amostra de DNA foi diluda em gua ao invs de TE primariamente para analise espectrofotmetra. O fenol no foi suficientemente removido da preparao de DNA. Lavar o pellet de DNA uma vez adicional com citrato de sdio 0,1 M em 10% de etanol.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI * Degradao do DNA
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Tecidos no forma imediatamente processados ou refrigerados depois de remover do animal. Amostras usadas para isolamento ou a preparao isolada de RNA so estocadas entre -5 e -20C ao invs de entre -60 e -70C. Amostras foram homogeneizadas com uma Polytron ou outra homogeneizao de alta velocidade. * Contaminao por RNA Incompleta remoo de fase aquosa. Pellets de DNA insuficientemente lavados com citrato de sdio 0,1 M em 10% de etanol. * Outras aplicaes: Primariamente usar para amplificao em PCR, ajustando o pH para 8.4. Para digesto do DNA com restrio de endonucleases, ajustar o pH para o valor desejado, usar 3-5 unidades de enzima por micrograma de DNA e permitir que a reao seja feita at 3-24 horas dentro das condies timas da enzima em particular. Tipicamente 80-90% do DNA digerido.
VISUALIZAO DO DNA, APS SUA EXTRAO Gel de Eletroforese

A eletroforese em gel permite o fracionamento eficiente de cidos nuclicos, e possui um importante papel analtico, e s vezes um papel preparativo. A matriz de separao usada normalmente agarose e seus derivativos. Outra possibilidade empregada o gel de poliacrilamida, usada normalmente para o fracionamento de molculas de baixo peso molecular (i.e. < 1 kilopares de base). O poder de resoluo da poliacrilamida permite a deteco de diferenas de tamanho de at um par de bases, comumente usada em gis de sequenciarnento e microssatlites. Os gis podem ser nativos (sem tratamento) ou
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desnaturantes (com a adio de uria, formamida etc.) para evitar a formao de estruturas secundrias, evitando a interferncia na mobilidade atravs do gel. Os cidos nuclicos migram com base nas diferenas de peso molecular. De modo geral, todos cidos nuclicos possuem aproximadamente uma densidade de carga por base, e a conformao da molcula em geral semelhante. Portanto, a dificuldade de penetrao no gel proporcional ao peso molecular. A mobilidade aproximadamente inversamente proporcional ao logaritmo do peso molecular. Parmetros que afetam a mobilidade do DNA em gel eletroforese: 1. Concentrao de agarose: com a maior concentrao de agarose, a separao de fragmentos maiores reduzida. Menores concentraes facilitam a separao de fragmentos de maior peso molecular. A faixa de trabalho encontra-se entre 0,5% at 2% de agarose. 2. Gradiente de voltagem: expressa em V/cm. Consiste no ponto crtico na separao de fragmentos de DNA. Correndo um gel sob alto gradiente, reduz tremendamente a separao de fragmentos de alto peso molecular, apesar de ser aceitvel us-lo para checar a qualidade de digesto (teste mais rpido). Entretanto, a separao tpica de digestes usando enzimas de restrio mais bem conduzida a baixos gradientes (l a 2 V/cm) por toda a noite. O problema consiste na difuso dos fragmentos de baixo peso molecular (<1 kpb) e resultam em bandas menos distintas. Esses fatores devem ser considerados dependendo do uso e anlise. Como aproximao, a distncia de migrao de um fragmento de DNA proporcional ao log do seu tamanho. Ao plotar migrao por peso num papel semi-log (antigamente!), obtinha-se uma curva padro com o peso dos fragmentos e peso desconhecido. sempre recomendvel incluir padres de peso molecular em todos os gis.
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Preparao de Gel de Agarose: Preparar gel de 0,7 a l % para analisar qualidade e quantidade do DNA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Pesar l g de agarose por 100 ml de tampo de corrida l x TAE (estoque 50x) num erlenmeyer e cobrir com vidro ou plstico e nunca papel alumnio. Aquecer por cerca de 2 minutos em forno de microondas at ferver. Misturar com cuidado, pois a soluo ferve para fora do frasco. Esperar a soluo esfriar at cerca de 50oC (ponto que tolere encostar na sua pele), para evitar danos forma do gel. Verter o gel na forma fechada nas extremidades e com o pente em posio. Esperar esfriar e remover bolhas com ponteiras. Remover o pente com cuidado (levantar um lado primeiro com cuidado!) Colocar o gel na cuba e completar o volume do tampo at cobrir o gel Enquanto isso, preparar as amostras a serem carregadas no gel Adicionar o volume necessrio de amostra num tubo (1 a 5 l), e acrescentar o tampo de amostra (1 l) contendo azul de bromofenol. A funo do tampo da amostra aumentar a densidade (com glicerol ou sucrose), e o azul de bromo fenol corre no gel com tamanho equivalente a 300 pares de base. 11. 12. Transferir as amostras para os poos do gel Conectar os eletrodos fonte e ligar. Os cidos nuclicos encontram-se no pH do tampo TAE carregados negativamente e migram para o positivo - correm para o vermelho!
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Aps a corrida, transferir o gel para uma bandeja contendo brometo de etdeo em gua (10 l de uma soluo 10 mg/ml de brometo de etdeo em 500 ml de gua) e agitar com cuidado por 20 minutos - BROMETO DE ETDEO CARCINOGNICO E MUTAGNICO - USE LUVAS SEMPRE QUANDO MANIPUL-LO.
14.
Observar sob luz ultravioleta no transiluminador. Observar a presena de rastros indicadores de RNA; formao de banda simples de DNA; comparar a intensidade das bandas das amostras; detectar a presena de degradao e/ou contaminao nas amostras.
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MULTIPLICAO DO DNA, APS SUA EXTRAO
Princpios do Mtodo Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

Copia e amplifica as seqncias especficas de DNA de at 1 KB de comprimento. A enzima DNA polimerase I foi isolada de bactrias termoestveis (Termus aquaticus por isso o nome Taq. Polimerase), portanto, no sofre desnaturao pelo calor alcanado com o termociclador. So comumente empregados 20 ciclos para amplificao de DNA, o que d mais ou menos 1 milho de cpias do DNA original. O primer pode ser especfico para uma parte do DNA, excluindo assim os exons, ou para a fita completa. Para utilizar o PCR preciso conhecer a seqncia de uma regio curta do DNA em cada extremidade da seqncia maior que se deseja copiar. Essas seqncias curtas so usadas para especificar os primers de oligonucleotdeos. O mtodo consiste em ciclos repetidos de desnaturao, anelamento e sntese de DNA. O DNA de dupla hlice com a seqncia a ser copiada e amplificada misturada com excesso de molar de dois oligonucleotdeos de DNA de hlice nica (os primers). O primeiro primer idntico extremidade 5 da fita de DNA a ser copiada e o segundo primer idntico fita de DNA de sentido inverso na extremidade 3. * Como o DNA de dupla hlice antiparalelo, o segundo primer tambm o complemento invertido da hlice de sentido normal.
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Incio: Desnaturao do DNA de dupla hlice em altas temperaturas e resfriamento para se reanelar.
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No reanelamento o primeiro primer (em excesso molar) ir hibridizar com a extremidade 3 da hlice de sentido inverso e o segundo primer (tambm em excesso molar) ir hibridizar com a extremidade 3 do sentido certo. A mistura reanelada incubada com DNA polimerase I e com todos os quatro trifosfatos de desoxinucleotdeos (A, T, G, C) (a-substratos) para permitir que novo DNA seja sintetizado.
A DNA polimerase I ir estender a extremidade 3 de cada primer ligado para sintetizar o complemento dos moldes de DNA de hlice nica (a). O segundo ciclo idntico ao primeiro. O produto do PCR pode ser lido em gel de agarose (b), por exemplo.
Variao do PCR
PCR-Transcriptase reversa ou RT-PCR Usa o RNA extrado da amostra e dele se faz cpia do DNA. O DNA replicado como no PCR normal. O RT-PCR usado para anlises de translocaes cromossmicas.
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EXTRAO DE RNA VEGETAL PELO MTODO CTAB

PROCEDIMENTO: Macerar em nitrognio lquido 3g de tecido vegetal. Transferir para tubo de polipropileno com 15 mL de tampo CTAB pr aquecido a 65C. Incubar a 65C e agitar a cada 10 min por 30 min suavemente. Adicionar 1 volume de trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min. Centrifugar por 10 min a 5000g (8000 rpm) Transferir o sobrenadante para outro tubo. Repetir a extrao com trisol e agitar o tubo manualmente ou com agitador por 10 min Centrifugar por 10 min a 5000g (8000rpm) Adicionar 0,6 volume de isopropanol gelado ou 2,5 volumes de etanol absoluto gelado. Misturar suavemente por inverso do tubo. Se o complexo RNA-CTAB formar uma rede filamentosa visvel, recuperar esse DNA com um gancho feito de pipeta de Pasteur. Caso o RNA no aparecer ou ficar floculento, centrifugar a 10000 g (12.000 rpm) por 20 min e descartar o sobrenadante. Sempre que possvel, evitar a centrifugao por levar a uma co-precipitao de RNA e polissacardeos. Lavar o precipitado com aproximadamente 5 mL de etanol 70%. Se o precipitado se soltar do fundo, centrifugar por 3 min a 10000g (12.000 rpm) para grudar o precipitado no fundo do tubo. Secar invertendo o tubo em papel toalha ou em cmera de fluxo laminar. O precipitado no deve conter resduos de isopropanol ou secar demais, por que pode dificultar a ressuspenso do RNA. Quanto mais repetio, mais pura a amostra, mas com menos DNA. A agitao suave emulsifica as fases formadas preservando o RNA.
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Dissolver o precipitado em 200 a 500 mL de TE e incubar a 4C por uma hora ou mais.
Macerao
15 ml de tampo CTAB
+ um volume de
Trisol
Centrifugado
Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugao com Trisol
Centrifugado Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugao com Trisol: Transferir fase superior para novo tubo com etanol ou isopropanol 0,6 volumes
Misturar por inverso de tubo suavemente:
Filamento de RNA
lavar precipitado de RNA com etanol 70%
Inverter tubo para secar TE
Dissolver o precipitado em 200 a 500 L de
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ISOLAMENTO DE RNA PELO MTODO TRIZOL

Reagente para isolamento de RNA de clulas e tecidos. composto por uma soluo mono fsica de fenol e guanidina isotiocianato. Foi desenvolvido por Chomezynski e Sacchi. Durante a homogeneizao da amostra ou lise, o reagente Trizol mantm a integridade do RNA durante a ruptura celular e dissolvimento dos componentes celulares. A adio de clorofrmio seguido de centrifugao separa a soluo em duas fases: aquosa e orgnica. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. Aps a transferncia da fase aquosa, o RNA recuperado por precipitao com lcool isoproplico. Depois de removida a fase aquosa, o DNA e protenas na amostra pode ser recuperada por precipitao seqencial. A precipitao com lcool etanol resulta DNA a partir da interfase, e uma precipitao adicional com lcool isoproplico resulta protenas a partir da fase orgnica. Co-purificao do DNA pode ser til na normalizao de RNAs produzidos de amostra para amostra. Essa tcnica bem executada com pequenas quantidades de tecido (50 - 100 mg) e clulas (5x106), e abundantes quantidades de tecido (> 1 g) e clula (> 107), de humanos, animais, plantas ou origem bacteriana. Todo processo pode ser completado em uma hora. O RNA total isolado por Trizol livre de contaminao protica e DNA. Isto pode ser til para ser usado em anlise por Northem blot, hibridizao Dot blot, seleo poli (A), translao in vitro, teste de proteo de RNAse e clone molecular. Para uso no PCR, o tratamento do isolado de RNA com amplificao gradual de DNAse I recomendado quando os dois primers posicionam-se dentro de um s exon.
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O reagente Trizol facilita isolamento de uma variedade de espcies de RNA de grande ou pequeno tamanho molecular. Por exemplo, o RNA isolado de fgado de rato, eletroforesado no gel de agarose, e corado com brometo de etdeo, mostra discreta banda de alto peso molecular de RNA entre 7 Kb e 15 Kb no tamanho, (composto de RNAm e RNAhn) duas bandas predominantes de RNA ribossomal de aproximadamente 5 Kb (28 S) e de aproximadamente 2 Kb (18 S), e RNA de baixo peso molecular entre 0,1 e 0,3 Kb (RNAt, 5 S). O isolado de RNA tinha na A 260/A280 razo de > 1.8 quando diludo em TE. PRECAUES PARA PREVENIR CONTAMINAO POR RNASE RNAses podem ser introduzidas acidentalmente dentro da preparao em qualquer ponto no processo de isolamento atravs de tcnica inadequada. Pela dificuldade para inibir a atividade da RNAse, essencial prevenir esta introduo. As seguintes pautas devem ser observadas quando se trabalha com RNA: Sempre usar luvas descartveis. A pele muitas vezes contm bactrias e fungos que podem contaminar uma preparao de RNA e ser uma fonte de RNAses. Usar esterilizao, plsticos descartveis e pipetas automticas reservadas pra trabalho com RNA para prevenir cross-contaminao com RNAses de equipamentos compartilhados. Por exemplo, um laboratrio que est usando investigao de RNA provavelmente estar usando RNAse A ou T1 para reduzir formao no fundo de filtro, e muitos itens no disponveis ( como uma pipeta automtica) podem ser ricas fontes de RNAses. Vidros devem ser esterilizados a 150C por 4 horas e plsticos devem ser embebidos em 0,5 M de NaOH por 10 min, lavado cuidadosamente com gua e autoclavado. Reagentes para a tcnica:
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI Clorofrmio lcool Isoproplico
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gua livre de RNAse ou soluo SDS 0,5% ( Para preparar gua livre de RNAse, extrair gua em garrafas de vidro livre de RNAse. Adicionar DEPC 0,01% (v/v). Deixar parado durante a noite e autoclavar. A soluo de SDS pode ser preparada usando DEPC tratado e gua autoclavada). 1. HOMOGENEIZAO a) Tecidos Homogeneizar amostras de tecido em 1 mL de reagente Trizol por 50-100 mg de tecido usando um vidro- Teflon ou forte homogeneizao (Polytron, ou Tissumizer ou equivalente). O volume da amostra no pode exceder 10% do volume de reagente Trizol usada para homogeneizao. b) Clulas de cultivo em meios de crescimento Lisar celular diretamente no disco de cultura adicionando 1 mL de reagente Trizol para 3,5 cm de dimetro do disco, passando as clulas lisadas diretamente para uma pipeta. A poro de reagente Trizol adicionado baseado na rea do disco de cultura (1 mL por 10 cm2) e no no nmero de clulas presentes. Uma poro insuficiente de reagente Trizol pode resultar em contaminao do isolado de RNA com DNA. c) Clulas de cultivo em suspenso Fazer um pellet celular por centrifugao. Lise celular no Trizol por repetidas pipetagens. Usar 1 mL do reagente por 5 10 x 106 clulas animais , vegetais ou leveduras, ou por 1 x 107 clulas bacterianas. Lavando as clulas antes de adicionar Trizol poderia ser evitado, todavia isto aumenta de possibilidade de degradao de RNAm. Ruptura de algumas clulas fngicas e bactrias podem requerer o uso de homogeneizador. Opcional: Um passo do isolamento adicional pode ser preciso para amostras com alto contedo de protenas, gordura, polissacardeos ou material extracelular tal como msculos, tecido gorduroso, e partes tuberosas de vegetais.
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Seguindo a homogeneizao, remover material insolvel do homogeneizado por centrifugao de 12.000xg por 10 min entre 2 a 8C. O resultado um pellet contendo membrana extracelular, polissacardeos, e grandes molculas de alto peso molecular de DNA, enquanto o sobrenadante contm RNA. Em amostras de tecidos gordurosos um excesso de gordura coletada assim como uma camada colocada que pode ser removida. Em cada caso, transferir a soluo homogeneizada limpa para um tubo novo e proceder com adio de clorofrmio e separao de fase descrita. 2. FASE DE SEPARAO Incubar a amostra homogeneizada por 5 min entre 15 a 30C para permitir completa dissociao do complexo ncleo-protico. Adicionar 0,2 mL de clorofrmio para 1 mL de reagente Trizol. Tampar os tubos de amostras com segurana. Misturar vigorosamente manualmente por 15 segundos e incub-los entre 15 a 30C entre 2 e 3 min. Centrifugar as amostras por no mais de 12.000 xg por 15 min entre 2 e 8C. Seguindo a centrifugao, a mistura isolada dentro do pouco vermelho, fase fenolclorofrmio, na interfase, e uma descolorida fase aquosa superior. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa. O volume de fase aquosa por volta de 60% do volume de reagente Trizol usado para homogeneizao. 3. PRECIPITAO DE RNA Transferir a fase aquosa para um tubo novo, e salvar a fase orgnica se desejar isolar DNA ou protena. Precipitar o RNA da fase aquosa por mistura com lcool isoproplico. Usar 0,5 mL de lcool isoproplico por 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a homogeneizao.
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Incubar amostras entre 15 a 30 C por 10 min e centrifugar por no mais de 12.000 xg por 10 min entre 2 e 8C. O precipitado de RNA muitas vezes invisvel antes da centrifugao forma um gel como um pellet no lado e no fundo do tubo.
4. LAVAGEM DE RNA Remover o sobrenadante. Lavar o pellet de RNA uma vez com 75% de etanol, adicionando o mnimo de 1 mL dos 75% de etanol por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneizao inicial. Misturar a amostra em vrtex e centrifugar por no mais que 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8C. 5. REDISSOLVENDO O RNA No final do procedimento, secar brevemente o pellet de RNA (ao ar ou em cmara de vcuo por 5-10 min). No secar o RNA por centrifugao a baixo vcuo. importante no permitir que o pellet de RNA seque completamente, visto que isto diminui grandemente sua solubilidade. Parcialmente dissolvida, a amostra de RNA tem uma razo A260/280 < 1.6. Dissolver RNA em gua livre de RNASe ou 0,5% de soluo SDS por passagem soluo uns pouco de tempo atravs de uma ponta de pipeta e incubando por 10 min entre 55 e 60C. (Evitar SDS quando o RNA for usado em reaes enzimticas subseqentes) O RNA pode tambm ser redissolvido em 100% de formamida (deionizada) e estocar a -70C. Notas para o isolamento de RNA:
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1. Isolamento de RNA de pequenas quantidades de tecido (1 a 10 mg) ou amostras celulares (102 a 104): Adicionar 800 L de reagente Trizol para o tecido ou clulas. Seguindo a lise da amostra, adicionar clorofrmio e proceder com a separao de fase como descrito no item 2. Prvia precipitao de RNA com lcool isoproplico, adicionar 5-10 g de glycogen livre de RNAse conduzindo assim para a fase aquosa. Para reduzir a viscosidade, cortar o DNA genmico com 2 passagens atravs de uma agulha de 26 calibre primariamente para posterior adio de clorofrmio. O glycogen sobra na fase aquosa e co-precipitado com o RNA. Isto no inibe a sntese first-strand para concentraes acima de 4 mg/mL e no inibe PCR. 2. Depois da homogeneizao e antes da adio de clorofrmio, amostras podem ser estocadas entre -60 e -70C por no mximo um ms. 3. Centrfugas de mesa que podem atingir um mximo de 2.600 xg so adequadas para uso nestes protocolos se o tempo de centrifugao for aumentado para 3060 minutos nos itens 2 e 3.

ISOLAMENTO DE RNA Expectativa de rendimento de RNA por mg de tecido ou 1 x 106 cultura de clulas Fgado e bao, 6-10 g Rim, 3-4 g Msculo esqueltico e crebro, 1-1,5 g Placenta, 1-4 g Clulas epiteliais (1 x 106 cultura celular), 8-15 g Fibroblastos, (1 x 106 cultura celular) 5-7 g
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI * Baixo rendimento Homogeneizao incompleta ou lise de amostra Pellet de RNA final no dissolvido completamente
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* Razo A260/A280 <1.65 Amostra de RNA foi diluda em gua em vez de TE primariamente para anlise espectrofotmetra. Baixa resistncia inica e baixa pH de solues aumenta absorbncia para 280 nm. Amostras homogeneizadas em pouco volume de reagente. Seguidamente a homogeneizao, amostras no so estocadas ao espao de temperatura por 5 min. A fase aquosa foi contaminada com a fase fenlica. Incompleta dissoluo final de pellet de RNA. * Degradao de RNA Tecidos no foram imediatamente processados ou refrigerados depois de removidos do animal. Amostras usadas para isolamento ou o preparado isolado de RNA estavam entre -5 e -20C, ao invs de entre -60 e -70C. Clulas forma desfeitas por digesto de tripsina. Solues aquosas ou tubos no estavam livres de RNAse. Formaldedo usado para eletroforese em gel de agarose estava com pH abaixo de 3.5. * Contaminao de DNA Amostras homogeneizadas em pequeno volume de reagente.
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Amostras usadas para o isolamento continham solventes orgnicos (ex: etanol, DMSO), fortes tampes ou soluo alcalina. *Contaminao de Proteoglicanos e Polissacardeos A conseguinte modificao da precipitao de RNA (item 3) remove estes compostos contaminantes do isolado de RNA Adicionar para a fase aquosa 0,25 mL de isopropanol seguido de 0,25 mL de um soluo com alta salinidade (Citrato de Sdio 0,8 M e NaCl 1,2 M) por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneizao. Misturar a soluo resultante, centrifugar e proceder com o isolamento descrito no protocolo. A precipitao alterada efetivamente precipita RNA enquanto conserva polissacardeos e proteoglicanos na forma solvel. Uma combinao do precipitado modificado com uma adicional centrifugao do homogeneizado inicial ( nota 2 do protocolo de isolamento de RNA) requerido para isolar RNA puro de material vegetal contendo um alto nvel de polissacardeos.
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ISOLAMENTO DE PROTENAS USANDO O MTODO TRIZOL

Protenas so isoladas a partir do sobrenadante fenol-etanol obtidos depois da precipitao de DNA com etanol (item 1, Precipitao de DNA). A preparao resultante pode ser analisada pela presena de protenas especficas por Western Blotting.
Reagentes para a tcnica: lcool isoproplico Cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol SDS 1% 1. PRECIPITAO DE PROTENA Precipitar protenas a partir do sobrenadante etanol-fenol (aproximadamente 0,8 mL por 1 mL de reagente Trizol) com lcool isoproplico. Adicionar 1,5 mL de isopropanol para 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a homogeneizao. Estocar amostras por 10 min entre 15 e 30C e sedimentar as protenas precipitadas a 12.000 xg por 10 min entre 2 e 8C.
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2. LAVAGEM DE PROTENAS Remover o sobrenadante e lavar o pellet de protena 3 vezes em soluo contendo 0,3 M de cloreto de Guanidina em 95% de etanol. Adicionar 2 mL de soluo de lavagem por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneizao inicial. Durante cada ciclo de lavagem estocar os pellets de protena na soluo de lavagem por 20 min entre 15 e 30C e centrifugar a 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8C. Depois da lavagem final, misturar 2 mL de etanol ao pellet de protena em vrtex. Estocar o pellet de protena em etanol por 20 min entre 15 e 30C e centrifugar a 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8C. 3. REDISSOLVENDO O PELLET DE PROTENA Secar o pellet de protena a vcuo por 5-10 min. Dissolver isto em SDS 1% com pipetagem. Completar a dissoluo do pellet de protena pode requerer incubao da amostra a 50c. Sedimentar qualquer material insolvel por centrifugao a 10.000 xg por 10 min entre 2 e 8C e transferir o sobrenadante para um tubo novo. A amostra lida usando Western Blotting ou pode ser estocada entre -5 e -20C para uso futuro. Notas para isolamento de protenas: 1. Os pellets de protena suspensos em cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol ou em etanol podem ser estocadas por no mximo um ms entre 2 e 8C ou por no mximo um ano entre -5 e -20C. 2. O seguinte protocolo uma alternativa aproximada que permite uma mais eficiente recuperao de protenas. Dialisar o sobrenadante fenol-etanol contra trs trocas de SDS1% entre 2 e 8C.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI Centrifugar o material dialisado a 10.000 xg por 10 min. Usar o sobrenadante limpo para Western Blotting.
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3. Protenas podem ser quantificadas pelo mtodo Bradford j que a concentrao de SDS o suficientemente baixa (<0,1%), ento isto no ir interferir. Mtodos que no tm problemas de detergente-interfase e que no so confiados em leituras a A260/A280 podem ser usados (traos de fenol podem causar superestimao na concentrao de protenas).

ISOLAMENTO DE PROTENA * Rendimento baixo Homogeneizao incompleta ou lise de amostra. Pellet de DNA final no dissolvido completamente. * Degradao de protena Tecidos no foram imediatamente processados ou refrigerados depois de removido do animal. * Deformao de banda em PAGE Pellet de protena insuficientemente lavada.
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GEL PARA ELETROFORESE DE PROTENAS

Gel separador 12% volume total de 10 mL Acrilamida/bis acrilamida 4,0 mL (2 ) Tris HCL 1,5 M pH 8.8 2, 5 mL (3) SDS 10% 100 L (4) Persulfato de amnio 10% 100 L (5) TEMED 4,0 L (6) gua destilada 3,3 mL (1) Gel Concentrador volume final de 10 mL Acrilamida/bis acrilamida 0,83 mL (2) Tris HCl 0,5 M pH 6,8 0,63 mL (3) SDS 10% 50 L (4) Persulfato de amnio 10% 50 L (5) TEMED 5 L (6) gua destilada 3,4 mL (1)
QUANTIFICAO DE PROTENAS
Ligaes peptdicas absorvem a A215.
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Resduos aromticos (Tyr, Phe, Trp) absorvem em torno de 280nm, portanto, na regio ultravioleta. A absortividade das protenas muito baixa. A absortividade da protena depende do contedo de resduos aromticos. Portanto, cada protena requer um clculo individual. Absorvidade a A280 para BSA - 0,7 (em sol. a 1 mg/mL) IgG - 1,35 (em sol. a 1 mg/mL) IgM - 1,2 (em sol. a 1 mg/mL) Prot. A estafilocccica - 0,14 (em sol. a 1 mg/mL) Extrato proteico - 1,0 (em sol. a 1 mg/mL) Como as ligaes peptdicas absorvem a 215nm, a concentrao de protenas pode ser monitorada nesse comprimento de onda. A absorvidade em 215nm quinze vezes maior que a 280 nm e no depende, contudo de aminocidos aromticos. 1mg/mL de protenas: A280 = 1 e A215 = 15. Mas a leitura a 215nm sofre influncia da interferncia de nucleotdeos livres ou cidos nuclicos presentes na amostra. Por isso, pode ser descontada essa presena possvel, considerando o componente de absoro a 260nm: Concentrao de protena (mg/mL) = 1,55 . A280 0,76 . A260.
MTODOS COLORIMTRICOS PARA PROTENAS
Solues diludas de protenas podem ser quantificadas por diversos mtodos colorimtricos eficientes e reprodutveis. A escolha do mtodo depende de possveis substncias interferentes na soluo testada. Mtodos mais comuns: Lowry, Bradford, BCA (otimizao do mtodo Lowry). Dependendo do mtodo, a sensibilidade de deteco de protenas aumenta. Ex: Biureto Absoro no U.V 1000 - 5000 g detectvel 200 - 2000 g detectvel
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MTODO COLORIMTRICO BRADFORD PARA DETERMINAO DE PROTENA
O corante Coomassie Blue reage com a cadeia polipeptdica. H poucos agentes interferentes. No funciona bem com protenas bsicas e sofre interferncia de detergentes como o Triton X-100, SDS e NP-40 quando estes esto em concentrao acima de 0,2%. Reagente de Bradford: 100 mg de Coomassie Blue G 250 Dissolver em 50 mL de etanol a 95%. Adicionar 100 mL de cido fosfrico (H3PO=17M) Completar com gua para volume final de 200 mL. Estvel a 4 por at 6 meses. Tampo PBS NaCl 150 mM NaHPO4 10mM pH 7,2 Soluo padro de: Albumina Bovina (BSA) 1mg/mL em tampo PBS Imunoglobulina G (IgG) 1mg/mL em tampo PBS Mtodo:
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1. Montar curva padro de diluio da soluo-padro de protena em um volume final de 100 L. Cobrir a faixa de 0 a 150 g de protena. Fazer cada tubo em triplicata. 2. Preparar as amostras em volume final de 100 L para teste diluindo as em PBS, de modo que a concentrao final caia na faixa at 150 g. Fazer dois ou trs pontos diferentes caso no tenha idia da concentrao da amostra. Testar diluies de 1: 100, 1; 500 e 1; 1000 um comeo. 3. Diluir a soluo de Bradford cinco vezes em gua destilada (ex; 10 mL de reagente de Bradford misturados a 40 mL de gua para cerca de 50 tubos).Se houver precipitado, filtrar em papel de filtro. 4. Misturar 900 L de soluo de Bradford diluda em cada um dos tubos da curva-padro e das amostras
TUBOS
REAGENTES SOL. PADRO DE PROTENA ( L) AMOSTRA ( L)
1 0 100 900
2 10 90 900
3 20 80 900
4 40 60 900
5 80 20 900
6 100 900
7 10 90 900
8 100 900
GUA ( L)
Reagente Bradford ( L)
5. Deixar a cor estabilizar por 5 no mais que 30. 6. Determinar a A595 para cada um dos pontos experimentais.
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7. Calcular a curva padro com papel grfico linear. Quotar cada ponto da curva de calibrao, determinar a melhor reta e calcular a concentrao protica da amostra. 8. Para uma maior preciso, calcular a melhor reta matematicamente por regresso linear.
Referncias bibliogrficas
Vanzela, L.L. A.; Souza, R. F. Avanos da Biologia Celular e da Gentica Molecular. So Paulo, ed. UNESP, 2009. Kreuzer, H.; Massey, A. Engenharia Gentica e Biotecnologia. Porto Alegre, ed. Artmed, 2002. Michel, A.; Cesaro, T. Contribuies da Biotecnologia para a Agricultura. Azevedo, O. M.; Felipe, S. M.; Brgido, M.M.; Maranho, Q. A.; Souza, T. M. Tcnicas Bsicas em Biologia Molecular. Braslia, ed. Braslia, 2003.
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PROCEDIMENTOS EM TCNICAS LABORATORIAIS VEGETAIS

Mauren C.A.Silveira Biomdica Graduanda Eng. Biotecnolgica

Frmulas e problemas mais comuns

Ou: C (g/L)1 x V (L)1 = C (g/L)2 x V (L)2 e

SOLUES PARA TCNICAS DE EXTRAO VEGETAL

CIDO CLORDRICO 2,5 N

Completar o volume at 500 mL com gua destilada em proveta

GUA DEPC 0,1%

GUA LIVRE DE RNASE

CLORETO DE LTIO (LICL) 5M

EDTA 0,5M PH 8.0

EDTA 500 MM; PH 8.0

FENOL:CLOROFRMIO:LCOOL ISOAMLICO (25:24:1)

GEL DE AGAROSE 1% (COM BROMETO DE ETDIO)

Fundir em microondas. Deixar esfriar at 70C aprox.

HIDRXIDO DE SDIO 10N - NAOH 10N

Tris HCl Livre de RNAse

Soluo Tampo (Wash Buffer)

Tampo Fosfato de Sdio 1M

Diluir nas seguintes propores de acordo com o pH desejado:

NaH2PO4.H2O 1M 53,7 mL 42,3 mL 22,6 mL 15,5 mL 10,4 mL

Na2HPO4 1M 46,3 mL 57,7 mL 77,4 mL 84,5 mL 89,6 mL

pH 6.8 7.0 7.4 7.6 7.8

Tampo de Amostra para Eletroforese

Tampo Fosfato Salina- PBS 10X

FUNES DOS MATERIAIS, SOLUES E PROCEDIMENTOS

Velocidades de separao de componentes

*Adaptado de Sambrook e Russel, 2001.

* A relao molar acrilamida/bisacrilamida de 29;1.adaptado de sambrook&Russel,2001.

ENZIMAS MODIFICADORAS DE CIDOS NUCLICOS

Enzimas de restrio tipo II

DNA Polimerases DNA Dependentes

Taq DNA Polimerase

DNA Polimerases RNA Dependentes

AMV Transcriptase Reversa

DNA Polimerase - Independente de Molde

promotor bacteriano. Tm baixa processividade in vitro, portanto so preferveis as

RNA Polimerases DNA Dependentes

RNA Polimerases DNA Independentes

Os cidos nuclicos so polinions solveis em gua.

EDTA (CIDO ETILENO DIAMONO TETRACTICO) 0,5 M PH 8,0

CLOROFRMIO (LCOOL ISOAMLICO) (E/OU FENOL)

BSA (ALBUMINA DE SORO BOVINO)

TRIS- HCl; pH 7,4

ACETATO DE SDIO (SAIS)

TCNICAS MAIS UTILIZADAS

INOCULAO DE VIROSE EM CURCUBINCEAS

EXTRAO DE DNA VEGETAL PELO MTODO CTAB

Tampo CTAB para extrao de DNA vegetal de folhas cotiledonares expandidas

2% 1,4 M 20 mM 100 mM 2% 0,2%

6 mL 4,2 mL 0,6 mL 1,5 mL 0,3 g 30 L 15 mL

PVP - polivinilpirrolidona; **Colocar imediatamente antes do uso e sob capela.

A agitao suave emulsifica as fases formadas preservando o DNA.

Sobrenadante em outro tubo, repetir centrifugao com clorofrmio

Misturar por inverso de tubo suavemente:

lavar precipitado de DNA com etanol 70%

Inverter tubo para secar

Dissolver o precipitado em 200 a 500 L de TE

Sem RNAse, nem centrifugao:

celulares apresentam-se assim, aps

EXTRAO DE DNA VEGETAL PELO MTODO DE DOYLE E DOYLE