leo essencial de citronela no controle da bactria fitopatognica Erwinia carotovora

Ciely Melo Guedes Rodrigues Costa1, Michele da Silva Santos2, Helder Morais Mendes Barros2 Pollyanna Freire Montenegro Agra1 e Maria Arlene de Arajo Farias1
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Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal da Paraba, Areia, PB. Universidade Federal de Campina Grande, UAEAG/CTRN/UFCG, Campina Grande, PB. E-mail: micheleagricola@yahoo.com.br, hmmbbr@yahoo.com.br

Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da atividade antibacteriana do leo de citronela no controle da bactria Erwinia carotovora, agente causador da podrido mole e responsvel por diversas doenas bacterianas no Nordeste do Brasil. O experimento foi realizado no Laboratrio de Microbiologia do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal da Paraba, em Areia, PB, Brasil. Os isolados de bactria foram obtidos de plantas de alface (Lactuca sativa L.) e repolho (Brassica oleraceae var. capitata) infectadas com sintomas de podrido mole. O leo essencial foi preparado nas concentraes de 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 e 8,0%. O controle da atividade antimicrobiana dos leos essenciais foi testado com tetraciclina, na concentrao de 30 L/mL. O leo de citronela utilizado puro foi eficiente contra todos os isolados de E. carotovora, com halos de inibio variando entre 25 e 35 mm, superando o tratamento com tetraciclina (controle), com halos entre 18 e 25 mm. A concentrao inibitria mnima (CIM) do leo a 1% apresentou alta eficincia sobre a bactria Erwinia carotovora. Palavras-chave: Cymbopogon winterianus, alface, repolho, podrido mole, bactericida natural, halos de inibio

Essential oil of citronella in the control of the phytopathogenic bacterium Erwinia carotovora
Abstract The objective of this work was to evaluate the antibacterial activity of the citronella (Cymbopogon winterianus Jowitt) oil in the control of the bacterium Erwinia carotovora, agent causer of the soft rottenness and responsible for several bacterial diseases in the Northeast of Brazil. The experiment was carried out at the Laboratory of Microbiology of the Center of Agrarian Sciences of the Federal University of Paraiba, in Areia, PB, Brazil. The isolated of bacterium were obtained of plants of lettuce (Lactuca sativa L.) and cabbage (Brassica oleraceae var. capitata) infected with symptoms of soft rottenness. The essential oil was prepared in concentrations of 0.25; 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 and 8.0%. The control of the antimicrobial activity of the essential oils was tested with tetracycline, in the concentration of 30 L/mL. The citronella oil used pure was efficient against all the isolated ones of E. carotovora, with inhibition halos varying between 25 and 35 mm, overcoming the treatment with tetracycline (control), with halos between 18 and 25 mm. The minimum inhibition concentration (MIC) of the oil to 1% presented high efficiency on the bacterium Erwinia carotovora. Keywords: Cymbopogon winterianus, lettuce, cabbage, soft rottenness, bactericide natural, inhibition halos

INTRODUO A bactria Erwinia carotovora ou pectinoltica ocorre com freqncia em condi es a mb ientais de alta t empe r at u r a e u mi da de, se nd o responsvel por uma srie de doenas bacterianas na Regio Nordeste do Brasil, onde as condies para seu desenvolvimento so muito favorveis (Lopes & Querazo-Soares, 1997). Geralmente, a penetrao da bactria se d por meio de ferimentos, aberturas naturais, ou provocadas por insetos, ventos e equipamentos agrcolas. Tecidos debilitados fisiologicamente

devido ao desbalano nutricional ou fitotoxidez por agrotxicos so mais propensos ao ataque dessa bactria. Os sintomas so, inicialmente, a murcha da planta e, posteriormente, a podrido mole em sua base, quando os tecidos tomam uma colorao verde escura a negra (Zanbolim et al., 1997). Para reduzir os prejuzos que ocorrem pelo aparecimento das podrides moles, nas hortalias, normalmente oriundas do campo recomendado o emprego de bactericidas naturais por no deixarem resduos txicos a essas hortalias (Wilson et al.,1997).

Estudos sobre o potencial das espcies vegetais, visando obter leos essenciais para uso na agricultura, como inseticidas botnicos, vm despertando o interesse dos pesquisadores e agricultores. Esses leos devem ser utilizados como um mtodo de controle eficaz, com reduo dos custos, preservao do ambiente e dos alimentos da contaminao qumica, tornando-se prtica adequada agricultura sustentvel (Ketoh et al., 2002). Assim, mtodos de controle vm sendo pesquisados, dentre os quais pode ser destacado o uso de produtos

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alternativos, como: ps, extratos botnicos e leos essenciais de origem vegetal. A citronela uma planta aromtica parecida com a capim-cidreira, sendo conhecida por ser retirado de suas folhas um leo com propriedades repelentes, tendo como constituintes principais mais de 80 componentes, entre eles: citronelal, geraniol, limonemo. Os teores de leo essencial na matria seca e na matria fresca so 1,4% e 0,84%, respectivamente. Segundo Ketoh et al. (2002), o leo essencial de C. martinii contm 70 a 90% de geraniol. Levando-se em conta as poucas informaes existentes sobre a ao do leo essencial de citronela como agente bactericida fitopatognico e considerando a importncia da bactria Erwinia carotovora, agente causador da podrido mole, o presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos inibitrios do leo essencial de Cymbopogon winterianus Jowitt (citronela) comparado com antibitico Tetraciclina sobre o desenvolvimento dessa bactria in vitro, isolada a partir de plantas infectadas de Lactuca sativa L. (alface) e de Brassica oleraceae var. capitata (repolho). MATERIAL E MTODOS A pesquisa foi conduzida no Laboratrio de Microbiologia do Departamento de Fitotecnia, Setor de Fitossanidade, do Centro de Cincias Agrrias da Universidade Federal da Paraba, em Areia, PB, Brasil. Os isolados da bactria utilizados nos ensaios foram obtidos a partir de plantas infectadas com sintomas de podrido mole de Brassica oleraceae var. capitata (repolho) e de Lactuca sativa (alface), em propriedades agrcolas dos municpios de Areia, Bananeiras e Lagoa Seca, PB. O patgeno foi a bactria fitopatognica Erwinia carotovora, que se encontra associada freqentemente s hortalias. O material infectado chegado ao laboratrio com sinais da doena podrido mole foi processado

imediatamente com a finalidade de cultivo e isolamento. Para se proceder aos isolamentos dessa bactria a partir do material doente, seguiram-se tcnicas rotineiras de laboratrio. O ensaio foi incubado a 28 C ,durante 48 horas, para o crescimento do microorganismo. As colnias crescidas e com caractersticas de bactrias foram isoladas e mantidas a 4 C para posterior identificao. Para o reconhecimento de cada isolado, usou-se uma codificao com letras e algarismos, indicando o patgeno, o hospedeiro e a localidade (Tabela 1). Para cada isolado foram realizadas quatro repeties. Os caracteres morfofisiolgicos, culturais e tintoriais foram observados a partir de isolados crescidos no meio

de c ult ur a BDA, permi t i ndo a apreciao do formato das clulas bacterianas e sua motilidade. As reaes tintoriais foram determinadas pelo mtodo de gram. As caractersticas bioqumicas foram verificadas por meio da assimilao dos carboidratos como a celulose e maltose, a liquefao da gelatina, produo de indol e a produo de gs a partir de glucose. Os componentes utilizados no meio de cultura foram dissolvidos em banho Maria, agitando-s e a mistura vagarosamente com basto de vidro. O pH foi ajustado para 7, o meio foi distribudo em tubos de ensaios utilizando-se um volume de 5 mL que, em seguida, foram autoclavados a 120 C, durante 20 minutos.

Tabela 1. Isolados de bactria Erwinia carotovora utilizados nos ensaios. Codificao do isolado de bactria EAAR1 EALS2 EABN3 ERAR1 ERLS2 ERBN3

Hospedeiro Lactuca sativa (Alface) Lactuca sativa (Alface) Lactuca sativa (Alface) Brassica oleraceae (Repolho) Brassica oleraceae (Repolho) Brassica oleraceae (Repolho)

Localidade Areia Lagoa Seca Bananeiras Areia Lagoa Seca Bananeiras

Foi semeada a amostra do microrganismo alvo e incubado temperatura de 36 a 37 C, utilizando um tubo controle, sem inoculao (testemunha). Aps o crescimento do microrganismo, foram colocados todos os cultivos em refrigerao at a solidificao: teste positivo (presena da bactria): meio liquefeito, teste negativo (ausncia da bactria): meio no liquefeito. Foi selecionado o leo essencial oriundo da espcie Cymbopogon winterianus Jowitt (citronela), o qual foi adquirido em casa especializada de venda de produtos naturais, na cidade de Recife, PE. O leo essencial foi preparado nas concentraes 0,25; 0,50; 1,00; 2,00; 4,00 e 8,00%, de acordo com a tcnica

de Allegrini et al. (1973). Em tubos de ensaios estreis de 70 x 10 mm foi repassado 0,4 mL do leo, uma gota de Tween 80 e quantidade suficiente de gua destilada estril (ADE) para um volume final de 5 mL, tudo homogeneizado por cinco minutos e, em seguida, as diluies foram feitas seriadas razo 2. Do primeiro tubo foram repassados 2,5 mL para o segundo, o qual j continha 2,5 mL de gua destilada estril, sempre acompanhando a agitao e homogeneizao e, assim, sucessivamente, at a obteno da ltima diluio. O controle da avaliao das atividades antimicrobianas dos leos essenciais foi testado com tetraciclina (Sensidisco. CECON/SP), na concentrao de 30 L/mL.

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RESULTADOS E DISCUSSO As caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e tintoriais dos isolados bacterianos de Lactuca sativa (alface) e Brassica oleraceae var. capitata (repolho) esto relatadas na Tabela 2 comparativamente com os caracteres expressos para Erwinia carotovora registrados no Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Krieg & Holt, 1984). Todas as caractersticas que foram apresentadas nesta Tabela, como: exigncias a fatores de crescimento, podrido mole, colorao de gram (-) negativa, liquefao da gelatina (+) positiva, a produo de gs a partir da glucose, a produo de indol, utilizao de celobiose e a utilizao da maltose coincidiram com as referncias do Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, segundo Krieg & Holt (1984), com exceo da caracterstica crescimento a 36-37 C que apresentou sinal negativo. Quanto morfologia, verificou-se que Erwinia carotovora caracteriza-se como sendo bastonetes retos, medindo de 0,5-1,0 x 1,0-3,0 micra; so mveis por meio de flagelos peritriquios e por apresentarem-se como anaerbios facultativos. Estas ve rificaes coincidem com os referenciais da 8 edio do Manual de Bergey (Krieg & Holt, 1984), que descreve espcies do gnero Erwinia como sendo bastonetes retos, medindo 0,5-1,0 x 1,0-3,0 micra, mveis por meio de flagelos peritriquios, gram-negativas, anaerbias facultativas, catalase positiva, geralmente associados como patgenos de plantas. Na Tabela 3, verifica-se que o leo de Cymbopogon winterianus (citronela) quando utilizado puro mostrou-se eficiente contra todos os isolados de E. carotovora testados (EAAR1, EALS2, EABN3, ERAR1, ERLS2, ERBN3), com halos de inibio variando entre 25 e 35 mm, suplantando o tratamento controle com a Tetraciclina, cujos halos foram entre 18 e 25 mm. Resultados concordantes com os do presente estudo foram obtidos por diversos pesquisadores.

Tabela 2. Caractersticas morfolgicas, fisiolgicas e tintoriais de isolados de Erwinia carotovora patognica Lactuca sativa (alface) e Barssica oleraceae var. capitata (repolho), comparativamente aos referenciais registrados no Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Krieg & Holt, 1984). Caractersticas dos isolados
Exigncias a fatores de crescimento ...... + Podrido mole ...................................... + Colorao de gram ................................. Liquefao da gelatina ........................ + Produo de gs a partir de glucose ...... Produo de indol ................................ Crescimento a 36-37 C ......................... Utilizao de celobiose ......................... + Utilizao de maltose .............................. -

Referencial de E. carotovora
Exigncias a fatores de crescimento ...... + Podrido mole ...................................... + Colorao de gram .................................. Liquefao da gelatina ........................ + Produo de gs a partir de glucose ...... Produo de indol ................................ Crescimento a 36-37 C ......................... + Utilizao de celobiose .......................... + Utilizao de maltose .............................. -

Tabela 3. Dimetros mdios dos halos de inibio (mm) do leo essencial de citronela utilizado puro e da Tetraciclina sobre E. Carotovora. Isolados de E. carotovora
EAAR1 EALS2 EABN3 ERAR1 ERLS2 ERBN3

Tratamentos Cymbopogon winterianus Tetraciclina (Testemunha) 35 18

28 20

29 25

33 24

27 22

25 20

Pattnaik et al. (1996) trabalhando com leos essenciais de C. winterianus, C. flexuosus e C. martini e mais outros sete leos contra 22 espcies de bactrias e 12 espcies de fungos verificaram que C. winterianus mostrou-se eficiente contra quinze espcies bacterianas e dentre os fungos citam-se alguns fitopatognicos. Dikshit & Husain (1984) pesquisaram o leo essencial de C. winterianus extrado das folhas, onde foi verificado sua eficcia na concentrao de 400 ppm sobre fungos patognicos ao homem e aos animais. Esse mesmo leo obtido de folhas numa concentrao de 0,25 L microlitro apresentou atividade sobre Entamoeba histolitica, conforme De-blasi et al. (1990). Begum et al. (1993) tambm verificaram que leo de C. winterianus inibe o crescimento de vrios fungos fitopatognicos, concordando com os resultados deste estudo. Scortichini & Rossi (1991) comprovaram que o leo de C. winterianus possui um

f itoconstit uinte denomi nado de terpineno que responsvel pelo antagonismo de Erwinia amylovora, uma bact ria no pectinolt ica fitopatognica. O leo essencial foi analisado puro para avaliar suas atividades antimicrobianas sobre os isolados de Erwinia carotovora. Pelos dados da Tabela 4, constata-se que o leo de C. winterianus (citronela) na concentrao de 1% foi ativo sobre todos os isolados de E. carotovora, com valores mdios dos halos de inibio entre 10 e 12 mm de dimetro. A concentrao inibitria mnima (CIM) desse leo essencial, tambm se mostrou eficiente contra todos os isolados em nveis de 1%. Deste modo, fica evidenciado a importncia do leo de C. winterianus no controle de Erwinia carotovora em Brassica oleraceae var. capitata (repolho) e em Lactuca sativa (alface), bem como de outros agentes fitopatognicos.

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Tabela 4. Dimetros mdios dos halos de inibio da CIM (Concentrao Inibitria Mnima) do leo essencial de C. winterianus (citronela) sobre E. carotovora. leo essencial 8,0 4,0 2,0 1,0 0,5 0,25 CONCLUSES Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram concluir que: O leo essencial de citronela proporciona maior efeito no controle de Erwinia carotovora, com halos de inibio maiores do que a Tetraciclina. A concentrao inibitria mnima do leo essencial de citronela a 1% apresenta alta eficincia sobre essa bactria. REFERNCIAS
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Isolados de E. carotovora 22 16 14 12 0 0 18 16 12 12 0 0 20 14 14 10 0 0 22 16 14 12 0 0 20 16 14 12 0 0 22 14 14 10 0 0

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Recebido em fevereiro de 2008 e aprovado em maio de 2008

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