Noes de Cultivo de Tecidos Vegetais 1.

Introduo A biotecnologia vem sendo utilizada pela humanidade h milnios e foi aplicada sem o conhecimento das tcnicas biolgicas, ressaltando-se que, desde que existe a civilizao, h, tambm, a biotecnologia. Define-se biotecnologia como a interveno do homem para desenvolver mtodos e criar, assim, novas formas de vida que, mediante a natureza, seriam impossveis de surgir, Gyves (1994). Na agricultura, a seleo de novas cultivares para adaptao de plantas silvestres ao cultivo exemplo de biotecnologia, mas tambm o so a fabricao de pes, queijos, bebidas fermentadas, como vinhos e cervejas, e muitos outros produtos que o homem vem utilizando ao longo dos anos, em seu prprio benefcio. A biotecnologia moderna inclui metodologias avanadas de gentica, biologia molecular e cultura de clulas e tecidos para seleo, engenharia gentica e clonagem de espcies e variedades biolgicas, alm de processo fermentativo para fins produtivos. A engenharia gentica permite que seja realizada a introgresso de qualquer gene caracterizado, alterando importantes rotas metablicas promovendo, com isso, a alterao no tipo e na composio de amido, leos, protenas, vitaminas etc., sem levar em considerao as usuais barreiras biolgicas (BINSFELD, 2000). Com essas modificaes objetiva-se: 1) elevar o valor nutricional dos alimentos; 2) melhorar o processamento industrial e a comercializao dos produtos; 3) desenvolver plantas transgnicas que funcionem como biorreatores, onde seja possvel produzir polipeptdios de valor farmacutico como, por exemplo, vacinas na forma de antgenos de vrus ou anticorpos, e 4) produzir inmeras enzimas protenas para fins industriais, alm dos benefcios ambientais que a engenharia gentica pode trazer, pois a idia dos produtos transgnicos , em ltima anlise, tornar a agricultura menos dependente de agrotxicos e inseticidas (MONTEIRO, 2000). As tcnicas da engenharia gentica esto amplamente baseadas no cultivo de tecidos, pois a transformao gentica requer o cultivo, in vitro, de protoplastos, clulas e tecidos da planta que se deseja transformar como tambm das clulas e tecidos transformados, seja possvel obter plantas regeneradas (GYVES, 1994). 2. Cultivo de Tecidos Vegetais A cultura de tecidos vegetais uma tcnica recente visto que os primeiros passos foram dados no incio do sculo XX e os maiores avanos foram notados a partir da segunda metade do sculo. No anexo 1 tem-se um breve histrico da cultura de tecidos vegetais. A tecnologia da cultura de clulas, protoplastos e tecidos de plantas, constitui uma das reas de maior sucesso, como parte do complexo da biotecnologia e vem sendo ampliada dia-a-dia. Aps quase meio sculo de progresso, esta tecnologia conquistou destacada posio na propagao comercial e industrial de plantas, no melhoramento gentico, no manejo, no intercmbio e na conservao de germoplasma e em outras aplicaes, como as pesquisas em fisiologia vegetal e produo industrial in vitro de compostos secundrios. Tambm, por meio do cultivo de tecidos se pode regenerar plantas a partir de meristemas para obter material livre de vrus, clulas isoladas ou massa de tecidos desdiferenciados (calo) para obteno e seleo de plantas resistentes s condies adversas.

Por cultivo de tecido, ao qual tambm se faz referncia como cultivo in vitro, entende-se o conjunto de metodologias que permitem o crescimento e a multiplicao de clulas, tecidos, rgos ou partes de rgos de uma planta (explante) sobre um meio nutritivo e em condies asspticas. Utilizam-se recipientes semi-hermticos e o cultivo se realiza sob condies ambientais de iluminao e temperatura controladas. Esta tcnica se baseia, principalmente no aproveitamento da totipotncia das clulas vegetais, ou seja, na capacidade de produzir rgos, como brotos e/ou razes (organognese) ou embries somticos que regeneram uma planta completa (embriognese somtica) num meio de cultivo favorvel. No anexo 2 so apresentados alguns conceitos bsicos em cultura de tecidos vegetais. A tcnica de cultivo in vitro apresenta, portanto, grande potencialidade, favorecendo a obteno de novos gentipos, de linhas celulares e de hbridos que, de outra maneira, no poderiam ser obtidos na natureza, por causa das barreiras reprodutivas na hibridao sexual. Os cultivos de tecidos vegetais podem ser iniciados com qualquer parte da planta: gemas, razes, folhas, clulas isoladas, protoplastos (clula sem parede celular), semente, embries zigticos, antera etc. A escolha de um ou de outro explante depender dos objetivos desejados e da disponibilidade e capacidade de resposta do material vegetal. Qualquer tcnica de cultivo in vitro tem, como fim primrio, dirigir o crescimento e o desenvolvimento do explante manipulado em um meio de cultivo. Este controle exercido, basicamente, pela adio de substncias de diversas naturezas ao meio de cultivo. Dentre essas substncias encontram-se os reguladores de crescimento e alguns nutrientes. Outro ponto de controle leva em conta as condies fsicas (iluminao, temperatura, umidade etc) e qumicas (pH etc). Uma planta cultivada in vitro tem seu metabolismo heterotrfico e por isso necessita de: gua, macro e micronutrientes e carboidrato, como fonte de carbono (PIERIK, 1988). No cultivo de tecidos so fundamentais, para todas as suas tcnicas, a assepsia, o explante, o meio nutritivo e os fatores ambientais: luz, temperatura, dixido de carbono (CO2) e oxignio (O2), segundo CID, 2001. Para evitar a contaminao dos meios por impurezas minerais, todos os sais utilizados na sua preparao devem ser de qualidade analtica (p.a.) 2.1. Aplicaes do Cultivo de Tecidos Vrias so as aplicaes das tcnicas do cultivo de tecidos, a comear pela clonagem, seu lado mais visvel, seguida pela cultura de clula (suspenses celulares em meio lquido), tecidos e rgos para fins prticos, obteno de plantas haplides a partir da cultura de anteras, produo de metablitos secundrios em biorreatores, gerao de variantes somaclonais, microenxertia, tecnologia dos protoplastos etc. Um dos esteios bsicos da chamada biologia molecular de plantas (engenharia gentica) depende, em grande extenso, de estratgias e tcnicas utilizadas em biologia celular. 2.1.1. Micropropagao A micropropagao ou clonagem a propagao vegetativa in vitro, utilizada principalmente naquelas plantas de difcil multiplicao pelos mtodos convencionais, permitindo a obteno de grande nmero de plantas sadias e geneticamente uniformes, em curto perodo de tempo. Atualmente, a maior concentrao da atividade de

micropropagao reside na limpeza clonal e na produo de mudas de espcies ornamentais herbceas e arbustivas (BAJAJ, 1993). A primeira aplicao comercial da micropropagao foi realizada por Morel(1960), ao multiplicar orqudeas atravs da cultura de pices caulinares e regenerao de protocormos (diminutas estruturas que se diferenciavam e davam origem a embries). A sucessiva diviso desses protocormos possibilitou acelerar o processo de propagao de orqudeas. Mais tarde, Smith e Murashige (1970) conseguiram desenvolver plantas inteiras a partir de meristemas apicais (sem qualquer primrdio foliar) em meio contendo sais minerais e vitaminas, enriquecido com reguladores de crescimento. Murashige (1974) apresentou o seguinte esquema padro para sistemas de micropropagao: Estdio I - seleo de explantes, desinfestao e cultivo em meio nutritivo, sob condies asspticas Estdio II - multiplicao dos propgulos atravs de sucessivas subculturas, em meio prprio para multiplicao Estdio III - transferncia das partes areas produzidas para meio de enraizamento e subseqente transplantio das plantas, obtidas para substrato do solo. Este esquema pode variar conforme as peculiaridades de cada espcie, podendo ser necessria uma fase adicional de alongamento das partes areas antes do enraizamento, ou o esquema pode ser simplificado, eliminando-se a etapa de enraizamento in vitro, manipulando-se as partes areas como microestacas, as quais enraizam diretamente no substrato de transplantio. Um estgio zero , s vezes, citado, o qual corresponde ao tratamento dado planta-matriz de onde so retirados os explantes (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1990). Para se fazer a micropropagao, utilizam-se os seguintes mtodos: 2.1.1.1. Proliferao de Gemas Axilares Gemas axilares so estimuladas a crescer (Figura 1) formando brotos simples ou tufos de brotos que so divididos, dando origem a novos explantes. Segmentos apicais ou nodais so adequados como fonte de explantes para o processo de preservao de germoplasma in vitro. Tal material apresenta as seguintes vantagens: adaptao s condies in vitro; alto grau de valor gentico da planta matriz; maior garantia de regenerao, que meristemas ou calos, e economia de espao para armazenamento.

Fig. 1. Gemas axilares oriundas de algodo G. hirsutum cultivadas in vitro.

2.1.1.2. Induo de Gemas Adventcias Por Organognese Direta Ou Indireta Formao de gemas em locais no convencionais (Figura 2) tanto diretamente de tecidos com potencial morfogentico quanto indiretamente, atravs da formao de calos. Entende-se por calo (Figura 3) um aglomerado de clulas desorganizadas, formadas por clulas diferenciadas e no diferenciadas, que se dividem ativamente e que, em geral, se originam em zonas com injrias qumicas ou fsicas (BAJAJ, 1989). A definio de protocolo de induo de organognese a partir de meristema apical, isto ,

induo de uma multibrotao das culturas a serem transformadas, aumentaria significativamente a freqncia de plantas transformadas (ARAGO et al., 1998).

Fig. 2. Organognese direta a partir de fragmentos de folha de Violeta africana Saintpaulia ionantha

Fig. 3. Calo frivel oriundo de hipoctilo de plntulas de algodo G. hirsutum in vitro

2.1.1.3. Embriognese Somtica Consiste na formao de embries somticos (embriides) a partir de tecidos somticos, com constituio idntica da planta-me, a no ser nos casos em que ocorre a embriognese por via indireta, passando pela formao de calos, quando poder ocorrer variabilidade gentica. Para que ocorra embriognese somtica, as clulas diferenciadas devem ser primeiro desdiferenciadas (desprogramao gnica) para serem consideradas como clulas embriognicas aps a diviso celular (PASQUAL et al., 1997). A induo de embriognese no muito fcil, seno impossvel, no caso de muitas espcies vegetais. Entretanto, quando possvel, apresenta vrias vantagens sobre as tcnicas de micropropagao, dentre elas se destacam: 1) a capacidade de produzir grande nmero de embries num espao limitado; 2) os embries so individualizados e se desenvolvem diretamente em plantas (LAWRENCE, 1981). Os embriides podem ser utilizados tanto na continuao da propagao in vitro quanto na produo de sementes sintticas. As principais limitaes da embriognese somtica em plantas perenes, especialmente frutferas tropicais, so: 1) o baixo nmero de plantas desenvolvidas em condies de campo, apesar de ser possvel o processo de embriognese, e conseqentemente, a obteno de embries somticos, em diversas espcies; 2) as dificuldades de obtenes de embries a partir de partes maduras/adultas das plantas, com a maioria dos sucessos obtidos com tecidos de sementes ou de plntulas (BARROS, 1999). Entretanto, os embries zigticos so a fonte para a obteno das cpias, o que quase sempre no desejvel, por ser desconhecido o valor gentico desses indivduos. 2.1.1.3.1. Embriognese Direta Os embries somticos so originados diretamente do explante. A ocorrncia de embriognese direta tem sido registrada em tecidos gametofticos, esporofticos e em tecidos que se originaram em funo da fertilizao dos gametas. Este fenmeno ocorre com maior probabilidade em micrsporos dentro da antera e tecidos de partes do ovrio, incluindo as paredes do ovrio ou carpelos, vulo, embrio zigtico ou plntulas jovens (BAJAJ, 1992a).

2.1.1.3.2. Embriognese Indireta Os embries somticos so produzidos a partir de calo. A verdadeira embriognese indireta (Figura 4) requer que as clulas diferenciadas de um explante sejam induzidas a formar calos no-diferenciados e, ento, algumas clulas se tornam comprometidas ou predeterminadas em uma rota embriognica (BAJAJ, 1992b).

Fig. 4. Embries somticos de algodo G. hirsutum, obtidos a partir de explante de hipoctilo.

Os embries somticos podem ser distinguidos de brotos adventcios por serem bipolares, possuindo primrdios radiculares e foliares, xis e cotildones e no terem conexo vascular com o tecido paternal. Por outro lado, gemas axilares ou adventcias podem induzir a formao de condutos procambiais no tecido maternal. Esses condutos na planta intacta estabelecem uma conexo entre broto novo e o sistema vascular da planta-me. Diferentes dos meristemas, que originam brotos e razes separadamente, esses embries quase sempre se originam superficialmente sobre calos e se desprendem facilmente (Figura 5).

Fig. 5. Diagrama mostrando diferena entre propagao a partir de gema e embrio somtico.

Os embries somticos so formados a partir de clulas caracteristicamente meristemticas e, portanto, diferentes das usuais clulas vacuoladas parenquimatosas Figura 6 b) encontradas em calos e em culturas em suspenso; elas possuem citoplasma denso, ncleo grande e muitos gros de amido (Figura 6a) (BAJAJ, 1991).

Fig. 6. Diferena entre clulas meristemticas (A) e clulas parenquimatosas (B).

As formas dos embries somticos correspondentes s distintas fases de desenvolvimento, so: pr-embriide, cordiforme, torpedo e cotiledonar (Figura 7).

Fig. 7. Estdio de desenvolvimento de embrio somtico: A- pr-embriide; Bcorao; C- torpedo; D- cotiledonar.

2.1.2. Cultivo de Meristemas Os meristemas (Figura 8) so tecidos vegetais formados por grupos de clulas no diferenciadas (clulas com algumas caractersticas e funes no especficas) que se caracterizam por sua alta atividade de diviso e so responsveis pelo crescimento dos distintos rgos da planta (DEBERGE e ZIMMERMAN, 1991).
Fig. 8. Gema formada de domo meristemtico, primrdio foliar e poro inferior ao promrdio foliar.

O cultivo de meristemas utilizado para limpeza de viroses, baseando-se no princpio de que esta parte da planta a nica no infectada por vrus, devido velocidade de multiplicao celular e ausncia de um sistema vascular por onde os vrus pudessem ser disseminados. Nos ltimos anos, o cultivo de meristemas tem ganhado, em algumas culturas, certa importncia, por ser utilizado para a obteno de tecidos para a transformao gentica por agentes biolgicos, como Agrobacterium (GOULD et al., 1991). 2.1.3. Cultivo de Protoplastos Protoplasto uma clula cuja parede foi removida por ao enzimtica. O cultivo de protoplastos vm sendo utilizado no melhoramento de espcies de interesse agronmico, para obteno de plantas transgnicas, de hbridos somticos e de mutantes ou variantes somaclonais. Alm disso, protoplastos constituem um sistema vegetal para estudo da expresso de genes isolados e sua regulao. A tcnica de isolamento de protoplasto em fumo, foi estabelecida por Nagata e Takebe (1970), a partir de clulas de mesfilo de folha, a qual vem sendo empregada como metodologia bsica em diferentes espcies. Vrios parmetros so importantes para a obteno de protoplastos viveis, entre os quais se destacam: a espcie, as condies de desenvolvimento da planta, tipo e idade do explante e as condies de isolamento dos protoplastos. Teoricamente, utilizando-se uma mistura adequada de enzimas pectocelulolticas, protoplastos podem ser isolados a partir de qualquer tipo de tecido vegetal. Essas enzimas pectocelulolticas foram usadas, a princpio, na indstria para produo de sucos de frutas. Elas so isoladas de microrganismos simbiticos, parasitas ou saprofticos, que degradam naturalmente as paredes celulares (CARNEIRO et al.,1998). As tcnicas de obteno e cultivo de protoplastos so fceis de manipular e no requerem equipamentos sofisticados, porm a metodologia no pode ser generalizada, pois cada gentipo um caso particular, necessitando de alguns ajustes especficos na cultura. A etapa limitante na generalizao dessa metodologia a regenerao de plantas. Apesar de ser possvel o isolamento de protoplastos de vrios tecidos, as suspenses celulares so ultimamente mais utilizadas, pela facilidade de manipulao e alta eficincia no isolamento. Com o objetivo de regenerar plantas a partir dos protoplastos, clulas embriognicas so sempre recomendadas, sobretudo em plantas monocotiledneas (HORN et al., 1988; MEGIA et al., 1993). A fuso de protoplastos de cultivares, espcies ou gneros diferentes, induzida por vrios produtos e mtodos. O polietileno-glicol (PEG) o produto mais usado para induo da fuso obtendo-se, desta forma, o hbrido somtico (PASQUAL et al.,1997). As solues salinas neutralizam as cargas negativas das membranas, e o PEG pode formar pontes moleculares entre certas protenas da membrana, o que facilita as agregaes dos protoplastos (ALDWINCKLE et al., 1982). A hibridao somtica de plantas envolve quatro estgios distintos (PASQUAL et al.,1997): 1) isolamento de protoplasto; 2) fuso de protoplastos; 3) regenerao de plantas a partir de tecidos selecionados e, 4) anlise das plantas regeneradas. 2.1.4. Cultivo de Clula Isolada ou Massa de Tecido Desorganizado O cultivo de clula isolada ou massa de tecido desorganizado (calo) uma alternativa para a obteno e seleo de plantas resistentes a condies adversas (fungo,

bactria, herbicidas etc.) e distintos tipos de explantes para produzir compostos de interesse (AMMIRATO et. al., 1984). A seleo in vitro tem, como vantagens: 1) as unidades experimentais so mantidas em meio definido e condies controladas, permitindo a seleo de pequenos incrementos em resistncia; 2) clulas cultivadas podem ser expostas ao agente seletivo de maneira uniforme, reduzindo a possibilidade de escapes; 3) sistemas de cultivo mantidos em pequenos espaos podem, potencialmente, substituir onerosas casas-de-vegetao ou campos de teste, e 4) o agente causador da doena ou outro fator permanece confinado no laboratrio. 2.1.5 Cultivo de Embries Zigticos ou Embries Imaturos O cultivo de embries zigticos ou embries imaturos (Figura 9) usado para obteno de hbridos entre diferentes espcies, tornando possvel, a certas cultivares, a transferncia de genes desejveis. Trabalho pioneiro de cultivo de embries maduros foi realizado por Hanning (1904), cultivando embries maduros de Raphanus sativus, R. landra, R. caudatus e Cochlearia danica, cuja exigncia nutricional consistia de sais minerais, acares e aminocidos. Desde ento, a tcnica de cultura de embries tem-se expandido e ensejado importantes contribuies em estudos bsicos da fisiologia do desenvolvimento do embrio, em programas de melhoramento gentico, pela recuperao de hbridos de interesse de cruzamentos incompatveis, bem como para a quebra de dormncia de sementes, observada em algumas Fig. 9. Cultivo de embrio zigtico a partir de sementes secas de espcies (FERREIRA et al., mamona (R. communis). 1990). A medida em que o embrio zigtico se desenvolve, ocorrem mudanas progressivas na sua exigncia nutricional, passando de heterotrfico a autotrfico. A distino entre essas duas fases baseia-se na dependncia do embrio pelas substncias nutritivas armazenadas no endosperma. Inicialmente, o zigoto e o embrio tm, nas fases subseqentes fecundao, pouca capacidade de sntese e se utilizam das reservas nutricionais, reguladores de crescimento e outros metablitos essenciais presentes no endosperma e clulas acessrias do saco embrionrio. Ainda no estgio globular, o embrio continua sendo heterotrfico. Somente a partir do estgio cordiforme final, com incio do desenvolvimento dos cotildones, que o embrio comea a se tornar independente e autotrfico (RAGHAVAN, 1976). Hanning (1904) observou que incluso de sacarose era necessria para a germinao e demonstrou a influncia de diferentes fontes de nitrognio sobre a morfologia do embrio (RAGHAVAN,1976). Diversos fatores podem afetar a eficincia e o sucesso da cultura de embries, porm as condies gerais foram testadas e determinadas por vrios pesquisadores, em trabalhos clssicos, desde o incio do sculo. Para obteno de hbridos interespecficos por meio do melhoramento convencional, h necessidade da conduo de sucessivas geraes de retrocruzamento com parental recorrente, no sentido de introgredir a caracterstica selvagem no mesmo e

recuperar a sua performance; entretanto, este mtodo limitado em certas espcies, por barreiras de origem bitica: os cruzamentos so incompatveis ou ocorre a formao do zigoto no vivel. Uma alternativa usada para contornar o problema implica na exciso do embrio imaturo e no seu posterior desenvolvimento in vitro. Vrios so os fatores que afetam a cultura de embries in vitro, tais como a escolha do meio nutritivo adequado, os reguladores de crescimento utilizados, as substncias fenlicas liberadas e a prpria remoo inadequada do embrio. 2.1.6. Cultivo de Anteras Atravs do cultivo de anteras pode-se conseguir plantas clones de clulas que possuem uma s cpia da dotao cromossmica (AMMIRATO et al., 1990). As plantas haplides, assim obtidas, so estreis e no formam sementes; entretanto, podese conseguir plantas diplides homozigticas, pela duplicao dos cromossomos das clulas, mediante tratamento com agentes duplicadores como, por exemplo, colchicina, nica etapa substituindo as muitas geraes de autofecundao necessrias no processo usual de obteno de linhagens. A cultura de anteras considerada uma ferramenta importante em programa de melhoramento, pois possibilita a obteno de linhas 100% homozigotas. A obteno de plantas puras em geraes segregantes acelera o processo de obteno de novas cultivares em vrios anos (FERNANDES, 1990). As plantas haplides podem ser obtidas tanto diretamente por embriognese, quanto indiretamente, via formao de calos. Na andrognese direta o micrsporo se comporta como um zigoto, passando por vrios estdios de embriogenia, semelhante ao que ocorre ex vitro. Na andrognese indireta se dividem e formam calo. As plantas derivadas de calos podem apresentar variaes genticas. Segundo Nitsch (1983), alguns fatores influenciam a obteno de plantas haplides viveis atravs da cultura de anteras ou plens, como: a viabilidade do plen, vigor que a planta apresenta no estdio homozigoto, e a reao das plantas haplides em relao aos agentes duplicadores dos cromossomos. 2.2. Fatores que Influem no xito do Cultivo De Tecidos 2.2.1. Origem e Tipo do Material Vegetal So, talvez, o fator mais importante. Cada espcie ou variedade se comporta de maneira diferente, e tm grande influncia a idade da planta e suas condies prvias no campo, a poca da coleta, o tipo de explante, a posio que este ocupa na planta e uma larga lista de aspectos, prprios do material vegetal, que dificilmente podem ser controlados em sua totalidade. O material cultivado in vitro tem que estar livre de microrganismos que possam interferir durante o processo (PIEREK, 1988). 2.2.2. Composio do meio de cultivo O meio de cultivo desempenha vrias funes pois, ao mesmo tempo em que serve de suporte fsico para o explante, proporciona-lhe os nutrientes necessrios sua sobrevivncia; alm disso, tal como se indicou anteriormente, os componentes do meio podem ser utilizados para dirigir o crescimento e o desenvolvimento do material vegetal (GEORGE, 1996). O meio de cultivo pode ser lquido ou solidificado com gar ou outro tipo de agente gelificante (CARVALHO, 1996). Existem vrios meios de cultivo,

entretanto, o mais amplamente utilizado o formulado por Murashige e Skoog (1962), de denominao MS. Os componentes deste meio e suas concentraes, so listados na Tabela 1 2.2.2.1. Reguladores de Crescimento a) Auxinas um grupo de reguladores de crescimento utilizados para induzir o desenvolvimento de ns, formao de calo e desenvolvimento de razes adventcias. As auxinas utilizadas com maior freqncia em cultivo in vitro, so: cido indol-3-actico (AIA), cido indol3-butrico (AIB), cido -naftalenoactico (ANA) e cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4D). O AIA uma auxina que, comumente, adicionada a concentraes relativamente elevadas (1-30 mg/l) devido ao fato de se decompor na presena de luz, mediante oxidao enzimtica. As outras auxinas mencionadas so sintticas e mais ativas utilizando-se, portanto, em concentraes inferiores.
Tabela 1. Composio das solues concentradas utilizadas para a preparao do meio de cultivo MS.

b) Citocininas Trata-se de um grupo de reguladores de crescimento que estimulam a diviso celular, sobretudo junto de uma auxina. As citocininas mais utilizadas em cultivo in vitro, so: kinetina (KIN), zeatina (citocinina natural), 6-benzilaminopurina (BAP ou BA) e 6-(g,g-

dimetilalimino) purina (2iP). Em concentraes elevadas induzem formao de brotos adventcios e inibem a formao de razes; so, assim, responsveis pela eliminao da dormncia apical, promovendo o desenvolvimento das gemas axilares. c) Giberelinas So reguladores de crescimento que induzem o desenvolvimento dos ns e o crescimento dos meristemas, ou gemas in vitro; podem, tambm, romper a dormncia de embries isolados ou gemas e inibir a formao de razes e brotos adventcios, e so utilizados com menor freqncia que as auxinas e as citocininas. Dentro das giberelinas, o cido giberlico (GA3) o mais empregado. Deve-se ter em conta que o GA3 perde 90% de sua atividade ao se esterilizar junto ao meio no autoclave (PIERIK, 1988). 2.2.3. Condies de Incubao No comum que as condies de incubaes variarem muito de um cultivo a outro ainda que sua importncia seja equiparvel dos demais fatores de cultivo. Embora cada planta, explante e perodo de cultivo, possa ter seus requerimentos especficos, comum utilizar-se a qualidade e a intensidade de luz, fotoperodos e termoperodos, mais ou menos padronizados. Por exemplo, para culturas tropicais uma intensidade luminosa de 2.500 lux com um fotoperodo de 16 horas de luz e 8 horas no escuro e uma temperatura de 25 C a 30C (MONTOYA HENAO, 1991) . Combinando-se adequadamente esses trs fatores (material vegetal, meio de cultivo e condies de incubao) conseguir-se- obter, no material vegetal, alguns dos seguintes processos morfogenticos: desenvolvimento dos meristemas j existentes no explante; organognese, isto , formao de multibrotao e/ou razes adventcias; embriognese assexual, ou seja, formao de embries somticos (embriides) a partir de clulas que no so produto de fuso gamtica e, desdiferenciao (converso de clulas diferenciadas em clulas no diferenciadas, ou seja, meristemticas) de tecidos e proliferao de massa de calo.

Anexo 1: Histrico da Cultura de Tecidos Vegetais Apresenta-se, neste anexo, um histrico sucinto, visando oferecer uma idia das bases e da evoluo da cultura de tecidos vegetais. Em 1838, Schleiden e Schwann levantaram a hiptese de que toda clula tinha capacidade de gerar um indivduo. Em 1892, Sachs definiu que as plantas sintetizam substncias capazes de formar rgos e que apresentam distribuio de forma polar. Em 1902, Haberdandt tentou demonstrar a totipotencialidade das clulas das plantas, a partir de material maduro, e obteve pouca expanso, porm no conseguiu diviso celular. O desconhecimento dos reguladores de crescimento contribuiu para este insucesso. Em 1904, Hanning foi o primeiro a cultivar embries imaturos de crucferas in vitro com sucesso. Em 1922, Robbins e Kotte mantiveram, com sucesso, razes de gramneas em meio de cultura. Em 1925, Laibach aplicou o cultivo de embries a cruzamentos interespecficos de Linum. Os progressos na cultura de tecidos s foram possveis a partir da dcada de 30. Em 1934, White manteve o crescimento de pices de razes de tomate, em meio lquido, por um perodo ilimitado. Neste mesmo ano, Kogh et al. identificaram o primeiro fitohormnio, a auxina, cido indolilactico. Em 1939 Gautheret e Nocourt estabeleceram um protocolo para a manuteno de cultura de calo de cenoura. Neste mesmo ano, White conseguiu manter calo de fumo em meio contendo AIA. Outros mritos no avano das tcnicas de cultivo in vitro so devidos s observaes de Van Overbeek et al. (1941) que promoveram a diferenciao e o crescimento de calo a partir de embries de Datura stramonium, pela incluso de leite de coco no meio de cultivo. Em 1946, Ball regenerou plantas de Lupinus e Tropaelum, a partir de pices caulinares. Em 1948, Skoog e Tsui demonstraram a regulao qumica da formao da parte area e raiz, em calo de fumo. Em 1952, Sussex e Steve, trabalhando com primrdio foliar, observaram que este originava uma planta. Neste mesmo ano, a suplementao do meio de cultura com auxina e leite de coco permitiram que Steward e Caplin (1952) obtivessem formao de calo em diversas espcies de plantas. Tambm em 1952, Morel e Martin recuperaram plantas de dlia livres de Vrus do Mosaico pela cultura de pices caulinares Em 1953, Tulecke obteve calo haplide a partir do cultivo de plen de Gingko biloba. No perodo de 1953 a 1954, Muir observou que clulas colocadas em meio de cultura continuavam se multiplicando. Em 1954, Muir et al. obtiveram a primeira planta, a partir de uma clula isolada. Com a descoberta da cinetina (primeira citocinina) por Miller et al. (1955), foi possvel demonstrar-se que a diferenciao da parte area, raiz ou ambos, em calo de fumo, era regulada pelo balano hormonal auxina/citocinina. A partir desta descoberta houve grandes avanos no estudo da cultura de tecidos vegetais. Em 1958, Wickson e Thimann observaram que quando se aplicava cinetina a uma gema terminal ou lateral dormente, esta saa da dormncia. No mesmo ano, Reinert e Steward et al. (1958) obtiveram formao de embries somticos a partir de calo de

cenoura, e Maheswari e Rangaswamy estudaram a cultura de ncelos e a regenerao de embries somticos em Citrus. Em 1959, Melchers e Bergmann constataram uma variao na ploidia com o avano do tempo em que o explante permanecia no meio de cultura. Em 1960, Morel recuperou cultivares de orqudeas livres de vrus, mediante cultura de meristemas, trabalhando com pice caulinar (meristema + primrdio foliar + poro inferior ao primrdio foliar) demonstrando a pontencialidade das aplicaes comerciais da micropropagao. O mtodo de isolamento de protoplastos de plantas com enzima de degradao da parede celular, foi desenvolvido por Cocking (1960). Murashige e Skoog elaboraram, em 1962, o meio de cultura conhecido universalmente, denominado meio MS. Tambm em 1962 Kanta et al. Obtiveram sucesso na polinizao in vitro de Papaver somniferum. vulos isolados eram colocados em cultura e, em seguida, gros de plen eram depositados sobre os mesmos, ocorrendo o desenvolvimento do tubo polnico, a fecundao, a formao do embrio e, posteriormente, a obteno de sementes. J em 1965, Aghion-Prat induziu a florao in vitro em tecidos de fumo. Em 1966, Guha e Maheswari foram os pioneiros na induo de andrognese in vitro em Datura, a partir de gros de plen, mediante cultura de anteras. Smith e Murashige obtiveram, em 1970, a formao de plantas pela cultura de meristemas propriamente dito (poro distal ao mais novo primrdio foliar) O mtodo de excluso de viroses e virides em plantas de Citrus foi desenvolvido por Murashige et al. (1972) e consistia na garfagem de pices caulinares (meristemas com dois primrdios foliares) em porta-enxerto in vitro. Ainda neste mesmo ano, Carlson et al. (1972) comunicaram a primeira fuso de protoplastos, obtida em Nicotiana. Em 1974, Reinhard iniciou estudos sobre a biotransformao de tecidos vegetais e Zaenen et al. descobriram que o plasmdio Ti o princpio indutor de tumores de Agrobacterium, uma bactria de grande importncia na transformao gentica em protoplastos vegetais. Em 1978, Melchers et al. conseguiram hbridos somticos entre batata e tomate. Em 1982, Krens et al. alcanaram a incorporao de DNA isolado por protoplastos, tornando possvel a transformao de clulas vegetais a partir de um DNA isolado. Neste mesmo ano, Zimmermann obteve a fuso de protoplastos, atravs de estmulo eltrico. Em 1985, Horsch et al. obtiveram a infeco e a transformao gentica de disco foliares de tabaco com Agrobacterium, bem como a regenerao das plantas transformadas. No Brasil, os trabalhos pioneiros com cultura de tecidos foram desenvolvidos no Instituto Biolgico, na dcada de 1950. A primeira equipe de cultura de tecidos foi formada em 1971, na ESALQ, em Piracicaba, SP. Entre 1975 e 1980 foram criados os laboratrios da Universidade de Campinas, do Instituto Agronmico de Campinas e da EMBRAPA. Atualmente, a maioria das instituies tem laboratrio nesta rea, trabalhando com diferentes metodologias de manipulao de plantas in vitro.

ANEXO 2: Conceitos Bsicos em Cultura de Tecidos Vegetais Na cultura de tecidos, como qualquer outra rea do conhecimento, existem termos e conceitos bsicos, os quais devem ser conhecidos por quem trabalha ou quer trabalhar na rea. Neste anexo, so apresentados os conceitos de uso mais freqente na cultura de tecidos vegetais. Adulto: fase do ciclo vital, na qual uma planta tem alcanado o grau de maturidade suficiente para florescer ou reproduzir. Aclimatao: processo de adaptao da planta s condies ambientais, aps sua transferncia da condio in vitro, antes do transplante para o local definitivo. Adventcio: estruturas ou rgos desenvolvidos fora do seu lugar normal de desenvolvimento, a partir de tecido adulto, num ponto de iniciao no predeterminado, por exemplo, embries a partir de qualquer clula que no seja zigoto; folhas e ramos a partir de razes. gar: produto extrado de algas marinhas, utilizado para solidificar o meio de cultura. gua deionizada, desminerilizada ou destilada: gua livre de certas impurezas, particularmente sais e diversos ons. Andrognese: partenognese masculina ou o desenvolvimento haplide de uma plntula ou de suas partes, a partir de gameta masculino. Aneuplodia: perda ou ganho de cromossomos atravs de vrios processos que resultam em complementos cromossmicos anormais na metfase. Antioxidantes: produtos qumicos que evitam a oxidao. pice caulinar: estrutura formada pelo meristema apical acompanhado de primrdios foliares e tecidos adjacentes da haste. Apomixia: reproduo assexual que resulta na formao de um embrio sem prvia fertilizao, a partir de uma nica clula ou de um conjunto de clulas. Assepsia: no cultivo in vitro, significa ausncia de qualquer microrganismo. Assptico: substncia, local, equipamento livre de fungos, bactrias, vrus, micoplasmas e outras contaminaes orgnica. Autoclavagem: fornecimento de calor sob presso, com o objetivo de proceder esterilizao. Autotrfico: organismo que utiliza CO2 como nica fonte de carbono para sntese de suas biomolculas. Autotrficas: plantas ou outros organismos capazes de sintetizar suas prprias substncias orgnicas, a partir de componentes inorgnicos simples, mediante fotossntese ou quimiossntese. Auxinas: grupo de reguladores de crescimento vegetal, quimicamente ou funcionalmente relacionados ao hormnio natural AIA (cido indolactico) que causam alongamento celular, dominncia apical, enraizamento e outros fenmenos. Auxotrfica: clulas ou organismos cujos crescimento e desenvolvimento dependem da presena, no meio de cultura, de suplementos, porque no so capazes de sintetizar certos metablitos essenciais, necessitando da adio de nutrientes exgenos. Biotecnologia: conjunto de tcnicas especficas para modificao e melhoria dos sistemas biolgicos, ou seja plantas, animais, microrganismos, clulas em cultivo ou produtos derivados. Calo: aglomerado de clulas no organizadas, irregularmente diferenciadas, que se multiplicam desordenadamente e se desenvolvem a partir de tecidos vegetais, normalmente em resposta a injrias qumicas ou fsicas. Calognese: induo e desenvolvimento de calos. Clula diferenciada: qualquer clula no meristemtica.

 Clula no diferenciada: clula meristemtica. Cmara de crescimento ou de cultivo: cmara com controle de iluminao, fotoperodo e temperatura, na qual so mantidos os cultivos. Cmara de fluxo laminar: cmara para manipulao do material vegetal assptico, utilizada nas operaes de estabelecimento e transferncia dos cultivos, que mantm em seu interior um ambiente livre de agentes contaminantes por meio de um fluxo no turbulento e contnuo de ar estril. Citocininas: grupo de reguladores de crescimento vegetal, quimicamente ou funcionalmente relacionados ao hormnio natural zeatina, que causam diviso celular, diferenciao celular e de brotos, quebra de dormncia apical e outros fenmenos. Clonagem: tem pelo menos dois significados distintos: 1) ato de se obter novas culturas atravs de subcultivos mantendo a identidade gentica do material, e 2) isolar uma seqncia de DNA em uma molcula vetora (o que possibilita sua conservao e multiplicao). Clone: conjunto de clulas, tecidos, plantas ou animais, obtidos assexualmente ou por partenognese, a partir de um nico indivduo, o que possibilita a obteno de um novo indivduo com a mesma carga gentica do indivduo a partir do qual foi gerado. Criopreservao: conservao de material biolgico em nitrognio lquido a 196C, ou em sua fase de vapor, a 150C. Cultura em suspenso: cultura de clulas individuais, agregados ou tecidos em meio lquido, freqentemente sob agitao para fornecer aerao adequada. Densidade crtica de clulas: menor inculo a partir do qual se pode desenvolver um novo cultivo em suspenso. Nmero de clulas por unidade de volume. Desinfeco: eliminao de microrganismos localizados internamente nos tecidos. Desinfestao: eliminao de microorganismos localizados na superfcie do tecido ou rgo. Desdiferenciao: converso das clulas diferenciadas ao estado meristemtico e ocorre quando os tecidos so feridos. Diferenciao: srie de modificaes relativamente permanentes e irreversveis, que ocorrem em clulas meristemticas e resultam em distines entre os tipos de clulas de um organismo, desenvolvendo clulas ou tecidos com caractersticas e funo especficas. Diplide: clula ou planta com duas vezes o nmero bsico de cromossomos (2n). Dominncia apical: anulao do crescimento das gemas laterais pela gema apical. Embrio: estado precoce de desenvolvimento de uma planta, consistindo de primrdio de raiz, broto e folhas. Embriognese: processo de iniciao e desenvolvimento de embrio que pode ser sexual (embrio zigtico, embriognese propriamente dita) ou assexual (embrio somtico, embriognese somtica). Embriide: estrutura semelhante ao embrio, porm originria de uma clula somtica. Tambm chamado embrio somtico ou embrio adventcio. Epigentico: qualquer mudana no fentipo que no resultante de uma alterao na seqncia do DNA. Esterilizao: consiste na eliminao de todos os microrganismos; normalmente efetuado por autoclavagem. Ex vitro: desenvolvido fora do recipiente de cultivo. Explante: fragmento de tecido ou rgo de plantas utilizado para se iniciar uma cultura in vitro. Fitohormnios: compostos naturais que regulam o desenvolvimento das plantas. Os principais grupos incluem auxinas, citocininas, giberelinas, cido abscsico e etileno.

 Gema axilar: refere-se gema localizada na axila das folhas. Gametoclone: propagao clonal de gametas (plen, vulos). Gametfito: clulas e tecidos da fase haplide do ciclo vital das plantas. Gametoplasma: conjunto de materiais hereditrios de uma espcie. Gene: unidade do material de herana; seqncia ordenada de nucleotdeos que compreende um segmento de DNA. Gene marcador de seleo: so aqueles que codificam para uma protena, geralmente com atividade enzimtica, ou para outro produto que ir conferir, s clulas transformadas da planta, resistncia a um determinado substrato, permitindo distinguir clulas transformadas de no transformadas. Gene reprter: so aqueles que codificam para uma protena, geralmente de atividade enzimtica, cujo produto facilmente detectado. Esses genes so marcadores que possibilitam identificar ou marcar clulas transformadas sem, contudo, eliminar as clulas no transformadas. Giberelinas: grupo de reguladores de crescimento que induzem o alongamento dos entrenos e o crescimento dos meristemas ou gemas in vitro. Tambm podem romper a dormncia dos embries isolados ou gemas e inibir a formao de razes e gemas adventcias. Habituao: capacidade necessria para as clulas crescerem e se dividirem independentemente de reguladores de crescimento. Geralmente, depois de um certo perodo das clulas ou tecidos em cultivo, este fenmeno reduz as concentraes de reguladores de crescimento necessrias para permanncia a uma terminada resposta. Haplide: condio correspondente a um conjunto nico de cromossomos no pareados em cada ncleo. caracterstica dos gametas. Heterotrfico: organismo que requer substncias orgnicas como fonte de carbono, para a sntese de biomolculas. Indexao: processo de deteco de patgenos em plantas ou culturas, visando identificao de plantas sadias. Induo: remoo do agente de represso, permitindo a iniciao de um processo. Inocular: em cultivo de tecidos, significa introduzir clulas, tecidos, rgos ou organismos em ou sobre um meio de cultivo. In vitro: cultivo de qualquer material vivo, em condies asspticas, sobre um meio sinttico determinado sob condies ambientais controladas. In vivo: referente a fenmenos que ocorrem nas clulas ou organismos vivos, normalmente fora do ambiente de cultivo de tecidos. Juvenilidade: fase do ciclo vital de uma planta determinado por caractersticas especficas e sua incapacidade de manifestar a reproduo sexual. Em condies de cultivo in vitro, este material se caracteriza por possuir elevada capacidade morfognica. Lux: unidade de medida da luz incidente que ilumina uma superfcie de 1m situada a 1m da fonte de irradiao. Macroelementos: grupo de elementos essenciais requeridos em concentraes relativamente elevadas na nutrio mineral das plantas. Meio lquido: meio nutritivo em estado lquido, sem agente solidificante. Meio slido ou semislido: meio nutritivo, solidificado por um agente como o gar, gelrite etc. Meristema: tecido vegetal formado por grupos de clulas no diferenciadas, que se caracterizam por sua alta atividade de diviso e so responsveis pelo crescimento dos distintos rgos da planta.

 Meristemide: uma clula com caractersticas que se assemelham quelas do embrio, ou meristema apical e capaz de manifestar sua totipotncia, originada por diferenciao de clulas do calo. Microelemento: grupo de elementos essenciais requeridos em concentraes relativamente pequenas na nutrio mineral das plantas. Micropropagao: tcnica de propagao assexual de plantas, mediante o cultivo in vitro. Micrsporo: esporo haplide, uninucleado, que se desenvolve no gro de plen. Morfognese: conjunto de fenmenos que do origem a um tecido, rgo ou organismo. Evoluo de uma estrutura desde um estado indiferenciado at um estado diferenciado. rgo: conjunto de tecidos que atuam como unidade estrutural ou funcional (raiz, gema, folha, flor, fruto). Organognese: processo de diferenciao no qual se formam rgos vegetais novos, a partir de estruturas preexistentes. Oxidao: escurecimento de tecidos cortados que resulta da reao de compostos fenlicos, liberados ao meio, com o oxignio. pH: logaritmo da concentrao de ons de hidrognio convertido em sinais; medida da acidez ou basicidade. P/V: peso/volume: indica a concentrao de um composto slido em gua. Exemplo: glicose a 2%, significa 20g/1000ml. Partenognese: desenvolvimento do embrio a partir de vulos no fertilizados. Primrdio: estdio rudimentar de um rgo que comea a se formar. Propgulo: qualquer parte vegetativa de uma planta, destinada propagao. Protoplasto: clula desprovida da parede celular. Regenerao: resposta morfognica a um estmulo, que resulta na produo de rgos, embries ou plantas completas. Regulador de crescimento: composto orgnico natural ou sinttico que, a baixas concentraes, promove, inibe ou modifica o crescimento e o desenvolvimento da planta. Repicar: subdividir uma cultura e transferi-la para um meio novo. Rizognese: induo e desenvolvimento de razes. Senescncia: degradao celular, culminando com a morte das clulas. Somaclone: propagao clonal de clulas somticas. Somtica: refere-se aos processos e estruturas que envolvem as clulas de um organismo, exceto das clulas reprodutivas. Subcultura (Repicagem): transferir para um meio novo pequenas pores do material cultivado. Tecido: grupo de clulas com caractersticas comuns. Tecido diferenciado: qualquer tecido no meristemtico, inclusive o calo. Tecido no diferenciado: tecido meristemtico ( um tecido organizado, mas no diferenciado). Tecido no organizado: calo. Tecido organizado: qualquer outro tecido, exceto o calo. Termolbil: substncia que se decompe com o calor. Termoterapia: tratamento com temperaturas elevadas, objetivando-se principalmente a desativao de vrus. Totipotncia: capacidade de clulas individuais expressarem o fentipo da planta completa da qual foram derivadas.

 Volume/Volume (V/V): indica a concentrao de um composto lquido, por exemplo: 3ml/1000ml de ANA. Variao somaclonal: variao observada em plantas obtidas por cultivo in vitro de tecidos somticos que pode ser transmitida sexualmente. Vitrificao: manifestao fisiolgica devido provavelmente, ao excesso de absoro de gua em cultura de tecidos, tornando os brotos quebradios (vitrificados). Zigoto: clulas diplides resultantes da fuso de gametas.

3. Referncias Bibliogrficas ALDWINCKLE, T.S.; AHKONG, Q.F.; BANGHAM, A.D.; FISCHER, D.; LUCY, J.A. Effects of polythylene glycol liposome and erythrocytes: permeability changes and membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta, v.689, p. 548- 560, 1982. ALTMAN, D.W. Introgresso de genes para melhoria do algodo: contraste com cruzamento tradicional com a biotecnologia. [S.l.]: Monsanto do Brasil, 1995. AMMIRATO, P.V.; EVANS, D.A; SHARP, W.R.; YAMADA, Y. Handbook of plant cell culture. New YorK: Macmillan,1984. v.3. AMMIRATO, P.V.; EVANS, D.A; SHARP, W.R.; BAJAJ, Y.P.S., Handbook of plant cell culture. New YorK: Macmillan,1990. v.5. ARAGO, F.J.L.; VIANNA, G.R.; RECH, E.L. Feijo transgnico. Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento, v.1, p.46-49,1998. BAJAJ, Y.P.S. Biotechnology in agriculture and forestry 7: Medicinal and Aromatic Plant II. Berlin: Springer-Verlag, 1989. BAJAJ, Y.P.S. Biotechnology in agriculture and forestry 15: Medicinal and Aromatic Plant III. Berlin: Springer-Verlag, 1991. BAJAJ, Y.P.S. Biotechnology in agriculture and forestry 19: High-tech and Micropropagation Plant III. Berlin: Springer-Verlag, 1992a. BINSFELD, P.C. Anlise diagnstica de um produto transgnico. BioTecnologia Cincia & Desenvolvimento, v. 12, p. 16-19, 2000. BAJAJ, Y.P.S. Biotechnology in agriculture and forestry 20: High-tech and Micropropagation Plant IV. Berlin: Springer-Verlag, 1992b. BAJAJ, Y.P.S. Biotechnology in agriculture and forestry 21: Medicinal and Aromatic Plants IV. Berlin: Springer-Verlag, 1993 CARNEIRO, V.T.C. de; CONROI, T.; BARROS, L.M.G.; MATSUMOTO, K. Protoplastos: Cultura e aplicaes. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformao gentica de plantas. Braslia: Embrapa- SPI/ Embrapa-CNPH,1998. p.413- 458. CARVALHO, J.M.F.C. Aplicacin de las tcnicas de cultivo in vitro en la multiplicacin y mejora del algodn. 1996. 174p. Tese doutorado.E.T.S.I.U.P.M., 1996. CID, L.P.B. A propagao in vitro de plantas. O que isso? Bio-tecnologia Cincia & Desenvolvimento, v.19, p. 16-21, 2001. CINCIA & natureza: Vida das plantas. Rio de Janeiro: Ed. Abril, 1997. 151 p. DEBERGH, P.C.; ZIMMERMAN. Micropropagao. [S.l.]: Academic Press, 1991. FERNANDES, M.I.B.M. de Obteno de plantas haplides atravs da cultura de anteras. In: TORRES, A C.; CALDAS, L.S. eds. Tcnicas e aplicao da cultura de tecidos de planta. Braslia: ABCTP/EMBRAPA/CNPH, 1990. p.311-332. FERREIRA, A.G.; HU, C.Y.; SANTAREM, E.R. Somatic embryogenesis of soybean (Glycine max (L.) Merril), Brazilian cultivars ivor and IAS-5. Phyton, v.51, p.139-144, 1990. GEORGE, E.F. Plant propagation by tissue culture. Basingstoke: Edington, 1996. GYVES, E.M. Agrobiotecnologia. Mxico: Iberoamrica, 1994. GOULD, J.M.; BANISTER; S.; HASEGAWA. ; FAHIMA, M.; SMITH, R.H. Regeneration of Gossypium hirsutum and G. barbadense shoot apex tissues for transformation. Plant Cell Reports, v.10, p.12-16, 1991.

GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagao. In: TORRES, A.C. ed. Tcnicas e aplicaes da cultura de tecidos de planta. Braslia: ABCTP/ EMBRAPA-CNPH, 1990. p.99-169. HANNIG, E. Zur physiologie pflanzlicher embryonen. 1.Ueber die cultur von cruciferen-embryonen ausserhalb des embryosack. Botanic Ztg., v.62, p.45-80, 1904. HORN, M.E.; CONGER, B.V.; HARMS, C.T. Plant regeneration from protoplasts of embryogenic suspension cultures of orchardgrass (Dactylis glomerata L.) Plant Cell Reports, v.7, p. 371-374, 1988. MEGIA, R.; HAICOUR, R.; TIZROUTINE, S.; BUI TRANG, V.; ROSSIGNOR, L.; SIHACHAKR, D.; SCHWENDIMAN, J. Plant regeneration from cultured protoplasts of the cooking banana cv. Bluggoe (Musa spp., group) Plant Cell Reports, v.13, p.41-44, 1993. MONTEIRO, A.J.L.C. A biotecnologia no Brasil. Bio-tecnologia Cincia & Desenvolvimento, v.3, p.26-27, 2000. MONTOYA HENAO, M.L. Cultivo de tejidos vegetales. Medelln: Universidad Nacional de Colombia, 1991. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, v.15, p.473-497, 1962. MURASHIGE, T. Plant propagation through tissue culture. Annual Review of Plant Physiology, v.25, p. 135-166, 1974. MOREL, G. Producing virus-free cymbidiums. American Orchid Society Bulletin, v. 29, p. 495-497, 1960. NAGATA, T.; TAKEBE, I. Cell wall regeneration and cell division in isolated tobacco mesophyll protoplasts. Planta, v. 92, p. 301-308, 1970. NITSCH, C. Progress in anther and pollen culture technique. In: BEIJING, B. ed. Cell and tissue culture techniques for cereal crop improvement. Beijing, Science Press, 1983. p.1-10. PASQUAL, M.; CARVALHO, G.R.; HOFFMANN, A.; RAMOS, J.D. Cultura de tecidos: tecnologia e aplicaes: aplicaes no melhoramento gentico de plantas. Lavras: [s.n.], 1997. PIERIK, R.L.M. Cultivo In vitro de las plantas superiores. Madrid: Mundiprensa, 1988. RAGHAVAN, V.; TORREY, J.G. Effects of certain growth substances on the growth and morphogenesis of immatrure embryos of capsella in culture. Plant Physiology, v.39, p. 691- 699, 1976. ROCA, W.M.; ARIAS, D.I.; CHVES, R. Mtodos de conservacin in vitro del germoplasma. In: ROCA,W.M.; MROGINSKI, L.A. ed. Cultivo de tejidos en la agricultura. Cali: [s.n.], 1991. p.696-713. SMITH, S.M.; MURASHIGE, T. In vitro development of the isolated shoot apicalmeristem of angiosperms. American Journal Botany, v.57, p. 562-568, 1970