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Educao Mdica Continuada

Biologia molecular aplicada s dermatoses tropicais * Molecular biology in tropical dermatoses *

Ana Maria Roselino 1

Resumo: So apresentados conceitos bsicos sobre clula, cdigo gentico e sntese protica, e sobre algumas tcnicas de biologia molecular, tais como PCR, PCR-RFLP seqenciamento de DNA, RT-PCR e , immunoblotting. So fornecidos protocolos de extrao de nucleotdeos e de protenas, como salting out no sangue perifrico e mtodos do fenol-clorofrmio e do trizol em tecidos. Seguem-se exemplos comentados da aplicao de tcnicas de biologia molecular para o diagnstico etiolgico e pesquisa em dermatoses tropicais, com nfase na leishmaniose tegumentar americana e hansenase. Palavras-chave: Biologia molecular; Biologia molecular/mtodos; Hansenase; Hansenase/diagnstico; Leishmaniose; Leishmaniose mucocutnea/diagnstico; Reao em cadeia da polimerase; Polimorfismo gentico Abstract: Initially, basic concepts are presented concerning the cell, genetic code and protein synthesis, and some techniques of molecular biology, such as PCR, PCR-RFLP, DNA sequencing, RT-PCR and immunoblotting. Protocols of nucleotides and of proteins extraction are supplied, such as salting out in peripheral blood allied to phenol-chloroform and trizol methods in skin samples. To proceed, commented examples of application of those techniques of molecular biology for the etiologic diagnosis and for research in tropical dermatoses, with emphasis to American tegumentary leishmaniasis and leprosy are presented. Keywords: Leishmaniasis; Leishmaniasis, mucocutaneous/diagnose; Leprosy; Leprosy/diagnose; Molecular biology; Molecular biology/methods; Polymerase chain reaction; Polymorphism, genetic;

INTRODUO As doenas tropicais no Brasil, citadas tambm como doenas exticas, procedem da contaminao dos ndios por ocasio da colonizao, permitida pelas temperaturas elevadas e pelo excesso de umidade nos trpicos, condies ideais para essas doenas. O desmatamento sem critrio, resultando em intensa alterao ambiental local e global, somado s condies climticas e baixa qualidade de vida caracterstica da quase-totalidade dos pases situados em regies tropicais , vem estimulando a ocorrncia de epidemias.1 Vrias tm sido as discusses em relao ao impacto do aquecimento global sobre epidemias

decorrentes de transmisso do agente etiolgico pelo ar e doenas relacionadas aos artrpodes, apontando que medidas ambientais, econmicas, regulatrias legais, como tambm medidas de sade pblica, se tornam necessrias.2 Entre as doenas tropicais situam-se as doenas negligenciadas, que ocorrem em regies pobres e que, por sua vez, agravam a pobreza.3,4 Quando associadas Aids, a situao torna-se pior.5-8 Mais recentemente, as doenas tropicais se transformaram em problema de mbito mundial, devido migrao populacional e ao turismo internacional, refletido tambm

Aprovado pelo Conselho Editorial e aceito para publicao em 05.06.2008. * Trabalho realizado no no Laboratrio de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo So Paulo (SP), Brasil. Conflito de interesse: Nenhum / Conflict of interest: None Suporte financeiro / Financial funding:: FAEPA-HCFMRP-USP (Fundao de Auxlio ao Ensino, Pesquisa e Assistncia); APH (Associao Paulista contra a Hansenase - processos nos 092/2005; 112/2007); CNPq (proc. no 400930/05-6); Fapesp (proc. no 2007/54416-2).
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MD, PhD. Professora-associada, Laboratrio de Biologia Molecular, Diviso de Dermatologia, Departamento de Clnica Mdica, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo So Paulo (SP), Brasil.

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em sua transmisso durante transplantes de rgos slidos.9,10 Em relao, mais especificamente, s dermatoses tropicais, todos os dermatologistas no s latinos, mas de todo o mundo necessitam ter familiaridade com as doenas tropicais que cursam com leses cutneas, justamente devido ao aumento de viagens para pases tropicais e subtropicais.11 As dermatoses tropicais podem ser classificadas segundo o agente etiolgico envolvido como virais;12,13 bacterianas, em especial, as micobacterianas;14,15 fngicas e parasitrias.16-18 Em inqurito de consultas dermatolgicas em consultrios e em servios credenciados, realizado no Brasil, a hansenase aparece em 20o lugar no pas e em quarto lugar na Regio Centro-Oeste.19 Entre as mais comumente relatadas nas reas rurais do Panam, citam-se micetomas, paracoccidiodomicose, lobomicose, cromomicose, histoplasmose, rinosporidiose, esporotricose, hansenase, rinoscleroma e leishmaniose cutnea e mucocutnea.20 Biologia molecular e dermatoses tropicais Para o diagnstico das dermatoses tropicais, vrios so os mtodos subsidirios que, quando aliados ao exame clnico, permitem o diagnstico etiolgico de cada uma delas. Para cada dermatose, existem excelentes revises na literatura.12-18, 21-29 Entre as dermatoses bacterianas, fngicas e parasitrias, com exceo do bacilo Mycobacterium leprae, todos os organismos infectoparasitrios so cultivveis, permitindo o diagnstico etiolgico da doena em investigao. Porm, cada doena, por sua vez, manifesta-se de forma distinta no homem, quer pela virulncia do agente etiolgico, quer pela susceptibilidade gentica e resposta imune do hospedeiro.30,31 Por isso, algumas manifestaes clnicas, por exemplo, de doenas bacterianas, fngicas ou parasitrias no hospedeiro com imunidade celular exacerbada, podem fugir do usual, pois o antgeno pode encontrar-se escasso na bipsia da leso, e o emprego de mtodos diagnsticos clssicos, em busca da definio do agente infeccioso, pode retardar o diagnstico etiolgico final.32,33 Tambm vale a pena ressaltar que o emprego da biologia molecular pode auxiliar no diagnstico etiolgico diferencial entre as leses sarcodicas e da prpria sarcoidose.34,35 Com a descoberta da molcula do cido desoxirribonuclico (DNA), por Watson e Crick em 1953, o estudo dos tecidos e das clulas passa da observao morfolgica, macroscpica ou microscpica, para a molecular. A biologia molecular, alm de sua relevncia clnica e epidemiolgica, representa um campo em potencial para a pesquisa na rea mdica.36 Alm desses aspectos, o estudo per se das doenAn Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

as parasitrias, que envolvem vetores e hospedeiros intermedirios, muito tem contribudo para o desenvolvimento da biologia celular e molecular, assim como para a imunologia.37 Por outro lado, a aquisio de conhecimentos na rea de biologia molecular gerou, em 1973, por Herbert Boyer e Stanley Cohen, novas possibilidades para a construo do DNA recombinante, que, teoricamente, leva probabilidade de criao de novas formas de vida.38 A seguir, faz-se breve reviso dos conceitos bsicos e das aplicaes das tcnicas de biologia molecular, com exemplos prticos laboratoriais envolvendo resultados parciais de projetos das linhas de pesquisa Sero apresentadas as tcnicas de biologia molecular rotineiramente usadas para o diagnstico do agente etiolgico presente no tecido do hospedeiro e tambm aquelas que buscam identificao de protenas e de polimorfismos genticos do microorganismo ou do hospedeiro, que podem ou no estar relacionados susceptibilidade ou resistncia do hospedeiro frente ao parasito. Para que sejam sedimentados os conceitos aqui descritos, sugere-se consultar o livro DNA Segredos e Mistrios38 e, para mais detalhes, o livro Molecular biology of the cell.39 Conceitos bsicos sobre a clula As clulas so compostas por ncleo e citoplasma. No ncleo, est contido o material gentico das clulas; no citoplasma, as organelas responsveis por suas funes e pela sntese de protenas, que ocorre nos ribossomos. Os organismos unicelulares, chamados de procariotos, como as bactrias, vrus e algumas algas, no apresentam membrana nuclear separando o contedo nuclear do citoplasma. As plantas e animais possuem um ncleo verdadeiro, organismos eucariotos, onde se situa o cdigo gentico, ou DNA. As regras gerais que regem a informao gentica se aplicam a todos os organismos vivos, quer procariotos, quer eucariotos. As bactrias representam as clulas mais simples, posto que os vrus, que so ainda mais simples do que as bactrias, no podem sobreviver de forma independente. Os vrus so formados basicamente pelas molculas de DNA ou de cido ribonuclico (RNA), empacotadas em uma cpsula de protena. Os vrus mais estudados so os bacterifagos, ou fagos, que se perpetuam ao infectar uma bactria. Vrus, bactrias e qualquer outra forma de vida utilizam o cdigo gentico para a expresso protica. Da mesma forma que uma bactria aceita a infeco de um vrus, permitindo a duplicao do DNA viral e a sntese das protenas codificadas, um gene humano pode tambm ser introduzido em uma bactria, resultando a produo de protena em gran-

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de quantidade, configurando a engenharia gentica. Assim, a estrutura da molcula DNA semelhante nos vrus, bactrias, plantas e seres humanos. Um gene representa a unidade codificadora de uma protena. O DNA, molcula composta por vrios genes, empacotado por protenas histonas , formando os nucleossomos. Cada cromossomo formado por nica molcula de DNA de dupla hlice supercondensada com protenas. Nas clulas humanas existem 44 cromossomos autossmicos (22 pares) e dois cromossomos sexuais (XX na mulher e XY no homem). Os cromossomos humanos arranjados aos pares constituem o caritipo humano. Os organismos multicelulares se desenvolvem a partir de uma nica clula, o zigoto. Como as clulas se multiplicam por mitose, todas as clulas tm o mesmo nmero de cromossomos e de genes, e a mesma informao gentica da clula inicial, salvo as mutaes que podem ocorrer no decorrer do processo. Assim, quando se pretende examinar um gene, isso pode ser feito em amostra de qualquer tecido. O que diferencia um tecido do outro a expresso de determinados genes. Portanto, quando se quer verificar a expresso de um determinado gene, busca-se o RNA no tecido que alvo de estudo. Conceitos bsicos sobre cdigo gentico e sntese de protenas O DNA molcula de carga negativa, composta por nucleotdeos. Cada nucleotdeo formado por um grupo fosfato, um acar (desoxirribose) e uma base nitrogenada. O grupo fosfato, de carga negativa, liga-se ao tomo carbono de nmero 5 do acar. As bases nitrogenadas so formadas de anis de carbono e nitrognio. As bases citosina (C) e timina (T) so formadas por um anel, enquanto as bases adenina (A) e guanina (G), por dois anis de carbono e nitrognio. A ligao de uma base ao carbono 1 do acar forma o nucleotdeo completo (Figura 1). O acar e o fosfato so invariveis nos nucleotdeos, representando a estrutura do DNA. A informao para a sntese das protenas est contida na seqncia das bases nitrogenadas. Por meio de uma ligao fosfodister os nucleotdeos formam a cadeia do DNA. A molcula do DNA composta por duas cadeias de nucleotdeos, que se ligam fracamente por pontes de hidrognio entre as bases nitrogenadas, constituindo a dupla hlice do DNA. Uma base A sempre se liga a uma T, enquanto uma C sempre se liga a uma G (Figura 1). Em situaes experimentais, aumentando-se a temperatura, as pontes de hidrognio se rompem facilmente, constituindo o processo de desnaturao. Quando a temperatura esfria, ocorre a hibridizao, e uma

FIGURA 1: Molcula de DNA. O grupo fosfato liga o carbono 3 do acar de um nucleotdeo ao carbono 5do acar do nucleotdeo seguinte. Portanto, haver sempre uma das pontas da cadeia com um grupo fosfato livre no carbono 5da desoxirribose (terminal 5) e outra ponta constituda por um grupo OH livre ligado ao carbono 3 (terminal 3). A ligao de duas cadeias de nucleotdeos feita por pontes de hidrognio formando a dupla hlice do DNA. A ligao entre os nucleotdeos adenina e timina se faz por duas pontes de hidrognio, enquanto a ligao entre citosina e guanina, por trs pontes de hidrognio
Fonte: http://images.google.com.br/

hlice volta a complementar a outra pelo pareamento das bases nitrogenadas. O DNA composto por seqncias de bases nitrogenadas que so transcritas ao RNA (xons) e por seqncias no transcritas (ntrons). O RNA assemelha-se ao DNA, com a diferena de que o acar ribose, que apresenta um grupo OH ligado ao carbono 2 em vez de um tomo de hidrognio, como na desoxirribose. Outra diferena, que formado por nica hlice, embora possa dobrar-se e formar cadeia dupla entre as bases complementares. Em relao s bases, a uracila (U) no RNA substitui a timina do DNA. Existem trs tipos de RNA: o RNA mensageiro (mRNA), que carrega a informao do cdigo gentico do DNA nuclear ao citoplasma; o RNA ribossmico (rRNA), que se liga s protenas para compor os ribossomos; e o RNA transportador (tRNA), que carrega os aminocidos no citoplasma para formar a cadeia poliAn Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

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peptdica protica. Quando ocorre a informao para a expresso gentica, a sntese de protenas se faz em trs etapas: 1- Transcrio: Inicialmente, h formao de uma molcula de RNA nuclear (hnRNA), cuja fita complementar corresponde exatamente fita do DNA, respeitando a ligao A-U e C-G. Ocorre na regio promotora do DNA, onde a enzima RNA polimerase d incio a seu processo. 2- Processamento do RNA (ou splicing): Ainda dentro do ncleo, as seqncias correspondentes aos ntrons so removidas, sendo adicionadas a molcula CAP (7-metil-guanosina) no terminal 5 e a cauda poliA no terminal 3, constituindo-se o mRNA. 3- Traduo: Uma vez no citoplasma, o mRNA servir de molde para o tRNA, quando no ribossomo. Para cada cdon (trs bases), um aminocido acrescentado cadeia polipeptdica. As protenas so formadas pela ligao dos aminocidos, que podem ser de 20 tipos. Todo aminocido composto por uma estrutura bsica: um tomo de carbono central ligado a um grupo amino, a um grupo carboxila e a um tomo de hidrognio. O que diferencia um aminocido do outro o quarto grupo lateral ligado ao carbono. O grupo amino tem carga positiva. e o grupo carboxila tem carga negativa. Portanto, a carga final do aminocido depender da carga do grupamento lateral. Para a sntese de uma protena, o grupo carboxila de um aminocido reage com o grupo amino do outro, com a eliminao de uma molcula de gua, formando a cadeia polipeptdica. Uma protena pode ter uma ou mais cadeias polipeptdicas. Depois que os aminocidos so ligados de forma linear (estrutura primria), a cadeia peptdica dobra-se sobre si mesma, formando a estrutura espacial ou terciria da protena. A interao dos diferentes grupamentos laterais de cada aminocido que determina a estrutura espacial de uma protena e, portanto, sua funo. Se ocorrer uma mutao pontual na seqncia de bases do DNA, o cdon gerado pode determinar a insero de um aminocido trocado na cadeia polipeptdica. Esse aminocido distinto pode resultar ou no numa protena no funcional. As protenas podem ser classificadas em: estruturais, quando so responsveis pela estrutura celular, como as protenas que compem a membrana celular, e pela manuteno das funes celulares; anticorpos, responsveis pela defesa do organismo contra elementos estranhos; de transporte celular, protenas responsveis pelo transporte de molculas, como as protenas de membrana com a funo de troca de ons
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para o meio intra ou extracelular; e enzimas, responsveis por todas as reaes qumicas da clula. A caracterstica mais importante das enzimas sua especificidade cada enzima s catalisa um tipo de reao qumica, atuando apenas sobre determinado substrato. Porm, como no participa intrinsecamente da reao, uma mesma molcula pode atuar inmeras vezes. As enzimas que muito interessam biologia molecular so denominadas enzimas de restrio ou endonucleases e foram descobertas em 1970. So produzidas naturalmente em bactrias para proteglas contra a introduo do material gentico viral. A bactria reconhece o DNA viral como estranho e destri a molcula utilizando as enzimas de restrio, que a cortam em vrios fragmentos, restringindo a replicao viral. Essas enzimas so especficas para determinados stios de restrio, por isso no digerem o DNA da prpria bactria. Por outro lado, quando presentes no DNA da bactria, esses stios de restrio so protegidos por um grupamento metil (CH3), que adicionado molcula do DNA pela ao da enzima metilase. Muitas vezes, os genes que codificam a enzima de restrio e a metilase encontram-se em posio adjacente no genoma. So conhecidas aproximadamente 900 enzimas de restrio, isoladas de mais de 230 espcies. Essas enzimas so designadas de acordo com o microorganismo do qual foram extradas. As trs primeiras letras se referem ao nome cientfico do microorganismo, portanto devem ser escritas em itlico. A letra seguinte se refere linhagem da bactria, e o nmero romano designa a ordem da descoberta da enzima. Por exemplo, EcoRI a enzima extrada de Escherichia coli, linhagem R, sendo a primeira enzima de restrio identificada nessa bactria. Com a possibilidade de serem cortados fragmentos de DNA de uma mesma espcie ou de espcies diferentes e de serem ligados numa segunda etapa, surge o DNA recombinante. TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 1. PCR, PCR-RFLP e seqenciamento do DNA Para as trs tcnicas PCR, PCR-RFLP e seqenciamento utiliza-se DNA extrado da amostra a ser analisada, quer seja sangue, clulas ou tecido. A extrao e a purificao do DNA de uma dada amostra podem ser feitas por mtodos laboratoriais caseiros ou por kits comerciais. Sugere-se consultar o livro Practical skills in biomolecular sciences.40 Extrao e purificao do DNA

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FIGURA 2: Extrao de DNA de sangue perifrico pelo mtodo Salting out

A extrao do DNA genmico do sangue total perifrico, conhecida como salting-out, tcnica simples, cujo esquema pode ser visto na figura 2. Se existe a inteno de se extrair DNA de clulas mononucleares perifricas, pode ser utilizado o reagente Ficoll-Hypaque, que tem o inconveniente de no ser barato. Esse mtodo muito utilizado em experimentos que visam ao estudo da resposta imunecelular in vitro; por exemplo, desafiando-se as clulas mononucleares, mantidas em meios de cultura, contra determinado antgeno, pode-se estudar a blastognese, assim como a expresso de citocinas no sobrenadante por Elisa, ou por mRNA extrado das clulas. Alm do sangue perifrico, outras amostras podem ser utilizadas, como vrus, bactria, fungos,41 clulas vegetais ou animais. Para estudar as clulas mantidas em meio de cultura, torna-se necessrio separ-las por centrifugao. Mais comumente, a inteno a de extrair DNA de fragmentos ou bipsias do tecido, que podem ser mecanicamente homogeneizados previamente. As amostras de tecido podem ser oriundas de animais,42 de insetos,43 etc. A purificao e, por conseguinte, a quantificao do DNA de amostra congelada mais vantajosa em comparao com a amostra fixada em formol e conservada em blocos de parafina. Porm, existem

protocolos eficientes para a obteno de DNA dessas amostras44 e at de amostras citolgicas coradas em lminas.45 Mais recentemente, tem-se utilizado amostra de tecido coletada na forma de imprint em papel de filtro e no momento da feitura da bipsia para exame anatomopatolgico. Tambm se tm utilizado amostras de linfa coletadas na forma de imprint em papel de filtro no momento em que se coleta amostra para baciloscopia, das regies dos lbulos de orelhas, cotovelos, joelhos e de leso cutnea, em paciente com suspeita clnica de hansenase. O papel de filtro inserido em envelope contendo os dados do paciente, podendo ser estocado em temperatura ambiente, se a inteno extrair somente DNA. A grande vantagem reside no envio dessas amostras pelo correio para laboratrios de biologia molecular. PCR (polymerase chain reaction) Trata-se de tcnica descrita por Kary Mullis nos anos 80, que lhe rendeu o prmio Nobel de Qumica em 1993, e cujo princpio se baseia na sntese de milhares de cpias de DNA in vitro catalisada pela Taq polimerase. Essa enzima isolada da bactria Thermus aquaticus que, por viver na natureza em
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fontes de gua quente, evoluiu para sobreviver em altas temperaturas mantm-se estvel depois de repetidas exposies a 94oC. A PCR compreende trs passos: 1- Desnaturao do DNA: a ruptura das pontes de hidrognio, que ligam a dupla hlice do DNA, feita em altas temperaturas, de 94oC a 98oC, por 5min. 2- Anelamento dos primers: esse passo ocorre quando a temperatura reduzida entre 37oC e 65oC, por 30seg. 3- Extenso ou sntese do DNA: esse passo se d em intervalo de tempo que varia de dois a 5min, a 72oC, temperatura ideal para que a Taq polimerase atue, havendo incorporao das bases nitrogenadas s fitas copiadas. Esse ciclo repetido de 25 a 35 vezes, sendo que a partir do segundo ciclo, o tempo de desnaturao pode ser reduzido a 30seg. Uma vez obtido o produto de DNA amplificado, ele pode ser observado em gel de agarose ou de poliacrilamida, atravs da eletroforese, verificando-se o tamanho da banda esperada. Como o DNA tem carga negativa, devido ao cido fosfrico, as amostras iro migrar do plo negativo (ctodo) para o plo positivo (nodo). A agarose permite a separao de fragmentos de 200pb a 50kb. Quanto menor a concentrao de agarose (0,3%), menor a resistncia migrao da molcula de DNA, facilitando, portanto, a migrao de

fragmentos maiores. Por outro lado, para fragmentos pequenos de DNA, torna-se necessrio aumentar a concentrao de agarose (2% ou mais). Para fragmentos menores, at 1000pb, o gel de acrilamida melhor, sendo ideal para produtos de seqenciamento, permitindo a distino de fragmentos que diferem em um par de bases. Para o DNA ser visualizado no gel de agarose, torna-se necessria a incubao do gel com um corante fluorescente, o brometo de etdeo, cujas molculas se intercalam entre os nucleotdeos da dupla hlice, tornando-se fluorescente radiao ultravioleta. Existem outros corantes, que no so txicos como o brometo de etdeo, mas so mais dispendiosos. O gel de poliacrilamida fixado e corado pela prata. Para se observar o tamanho do fragmento amplificado no gel de agarose ou de acrilamida, usase um marcador de DNA com peso molecular conhecido. Um comumente utilizado o DNA do fago lambda digerido com a enzima de restrio HindIII. Os fragmentos digeridos possuem peso molecular predeterminado, podendo ser vistos no gel como bandas. Para se comprovar se a banda correta, isto , se o produto amplificado o esperado, pode ser feita confirmao: a) transferindo-se o DNA do gel para uma membrana de nitrocelulose pelo mtodo de Southern, com posterior hibridizao com sonda complementar; b) digerindo-se o produto da PCR com enzima de restrio; ou c) seqenciando-se o produto da PCR. PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length

FIGURA 3: Extrao de RNA pelo mtodo do trizol An Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

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FIGURA 4: Extrao de DNA pelo mtodo trizol

polymorphism) Esse mtodo bastante til quando se pretende confirmar determinado fragmento amplificado por PCR. Conhecendo-se a seqncia amplificada, existem sites que fornecem os stios de restrio daquele fragmento com as enzimas correspondentes (http://www.neb.com/nebecomm/default.asp). O ideal que se tenha um nico stio de restrio para determinada enzima. Se as enzimas apresentarem mais que um stio de restrio, deve-se optar por aquela que corte o fragmento em outros fragmentos com pesos moleculares distintos, e tambm que no sejam fragmentos to pequenos. Seqenciamento de DNA O seqenciamento de DNA foi descrito em 1977 por Walter Gilbert e Fred Sanger, que dividiram o prmio Nobel de qumica em 1980. O seqenciamento do produto da PCR, ou da banda de DNA eluda do gel de agarose, empregandose kits comerciais, utilizado para a confirmao da PCR ou quando se est diante de um fragmento amplificado ainda desconhecido. O seqenciamento compreende nova PCR com o primer sense ou anti-sense; portanto, haver amplificao de uma cadeia simples de DNA. Os nucleotdeos incorporados so dideoxinucleotdeos (ddNTPs) fluorescentes, cada um com uma cor diferente, anlogos aos nucleotdeos usuais, mas que impedem a pro-

gresso da sntese, pois na posio 3 do carbono do acar aparece um hidrognio no lugar do grupo OH. Assim, cada vez que um dideoxi incorporado, a reao interrompida, e o seqenciador automtico faz a leitura daquela base marcada. Uma vez obtida, a seqncia do DNA comparada com seqncias j depositadas no GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e, caso no seja encontrada, pode ser depositada com sua autoria. 2. RT-PCR (reverse transcription-PCR) A RT-PCR utilizada quando se quer verificar a expresso de determinado gene, por exemplo, a expresso de genes de citocinas em amostras de tecidos.46 Para tal, torna-se necessria a extrao de RNA. Cada clula contm cerca de 10pg de RNA, sendo 80-85% de rRNA, 10-15% de tRNA e 1-5% de mRNA. Enquanto rRNA e tRNA so de pequeno tamanho, o mRNA heterogneo e apresenta em sua cadeia centenas a milhares de nucleotdeos. O RNA mais difcil de ser purificado, comparado ao DNA, devido fcil degradao durante o processo de extrao atribuda a ribonucleases contaminantes, e tambm porque o tratamento rigoroso para separ-lo das protenas resulta na fragmentao de sua cadeia. Quando se quer extrair RNA de determinada amostra, pode ser usado o mtodo fenol-clorofrmio ou o mtodo do trizol. Este ltimo reagente permite a extrao inicial do RNA, seguida pela extrao de DNA
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e de protenas de uma mesma amostra (Figuras 3-5). Mais recentemente, tem sido extrado RNA de apenas uma clula, empregando-se a tcnica de microdisseco a laser.47 O mtodo da RT-PCR consiste na combinao da tcnica de transcriptase reversa com a PCR, envolvendo trs etapas: 1- extrao do mRNA; 2- sntese do cDNA, fita complementar do mRNA, pela enzima transcriptase reversa; 3- amplificao do DNA pela Tac polimerase. Algumas DNAs polimerases estveis, por exemplo a enzima rTth, podem utilizar mRNA como fita molde para a sntese de cDNA, permitindo que o mtodo completo seja feito em tubo nico. 3. Eletroforese de protenas Immunoblotting A eletroforese baseia-se na separao de molculas com cargas eltricas distintas em um campo eltrico. A corrida eletrofortica depender do tamanho da molcula, da carga eltrica dos aminocidos e do pH do buffer. A eletroforese de protenas em gel de poliacrilamida (Page) a mais utilizada na anlise de protenas. O gel de poliacrilamida formado por monmeros de acrilamida, cujas cadeias se interligam com N,N-metileno bisacrilamida (bis), com formao de polmeros de acrilamida. Aps a corrida eletrofortica com amostras de protenas em estudo, o gel deve ser fixado com cido tricloroactico e corado com prata

ou Coumassie Blue, sendo que o mtodo pela prata mostra sensibilidade de cinco a 200 vezes maior. O termo blotting refere-se transferncia das fraes proticas contidas no gel de poliacrilamida para uma membrana de nitrocelulose (Western blotting). A utilizao de anticorpos marcados contra determinada protena recebe o nome de immunoblotting. Para esse processo, inicialmente tem-se que obter a protena em estudo (ver extrao de protenas pelo mtodo trizol), o gel de poliacrilamida, buffer apropriado e o aparelho de eletroforese vertical. Fazse o gel em duplicata. Um deles corado para visualizao das bandas proticas, e o outro transferido para membrana de nitrocelulose, utilizando-se um aparelho de transferncia de protenas. BIOLOGIA CELULAR APLICADA AO ESTUDO DE DERMATOSES TROPICAIS Leishmaniose tegumentar americana Justifica-se a utilizao da PCR para o diagnstico etiolgico da LTA pela baixa porcentagem de achado do parasito na bipsia de pele, em especial na forma mucosa. Levantamento realizado na regio nordeste do Estado de So Paulo demonstrou aproximadamente 55% de identificao do parasito na bipsia, comparada a 85-90% na PCR.48,49 Quando se trata da forma mucosa, a porcentagem do encontro do parasito na bipsia ainda menor, reforando o emprego da PCR para seu diag-

Figura 5: Extrao de protenas pelo mtodo trizol An Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

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nstico.48-51 H vrios pares de primers descritos na literatura para o diagnstico molecular das leishmanioses.48-51 Tem-se a alternativa de uso de primers que amplificam seqncias especficas de espcies de leishmnias48 ou primers que amplificam seqncias comuns a todas as espcies. Neste ltimo caso, existe a opo do uso de primers que amplificam seqncia do DNA do minicrculo do cinetoplasto (kDNA), comum a todas espcies de leishmnia.49-51 A utilizao de enzimas de restrio para determinar a espcie da leishmnia tem sido muito descrita na literatura, sendo mtodo mais barato e mais rpido do que o seqenciamento do produto da PCR.49,52 Com a utilizao da PCR-RFLP identificou-se a espcie , L. (L.) amazonensis na forma mucosa da LTA na regio de Ribeiro Preto (SP).53 Em relao amostra a ser estudada para o diagnstico da LTA, tem-se dado preferncia a mtodos de coleta no invasivos, como a escarificao da borda da leso54 ou coleta de amostra em papel de filtro, seguida pela extrao do DNA.55 Ultimamente, tem-se utilizado o eludo da amostra, coletada em papel de filtro na forma de imprint, diretamente na PCR, seguida da confirmao por restrio enzimtica, com resultados comparveis extrao do DNA da bipsia de pele ou de mucosa de paciente com LTA.56 A PCR para pesquisa do parasito tambm pode ser aplicada ao flebtomo,43 assim como a espcie identificada em amostras humanas pode estar relacionada resposta teraputica da LTA.57 A manifestao clnica das leishmanioses depende da trade: espcie do parasito-vetor-hospedeiro. Entre os fatores genticos descritos no hospedeiro, relacionados susceptibilidade e resistncia a parasitos, tem-se o gene NRAMP1, que expressa uma protena de transporte de membrana. A protena Nramp1 (natural resistance-associated macrophage protein) localiza-se na membrana de lisossomos de macrfagos e tem como funo a troca de ons dos meios intracelular e extracelular, estando relacionada resposta imune do hospedeiro.58 Assim, procuraram-se polimorfismos do gene que expressa a protena Nramp1 pelo mtodo PCR-RFLP em amostra populacional da regio nordeste do Estado de So Paulo. Os resultados mostraram que o alelo C do polimorfismo 274C/T est relacionado proteo para o desenvolvimento da LTA, enquanto o gentipo TT do polimorfismo 823C/T mostrou-se associado forma mucosa da LTA.59 Em relao ao parasito, desde a descrio de seu genoma, as espcies vm sendo comparadas para se encontrar DNA-alvo que tenha potencial para uso teraputico ou em vacinas.60 O DNA responsvel pela expresso da enzima topoisomerase I tem sido considerado molcula promissora no tratamento do parasi-

to procarioto.61 Alguns resultados de PCR e de PCR-RFLP para identificao de DNA de leishmnias em amostras de pele ou de mucosa so mostrados nas figuras 6-8.48,52,55 Hansenase A despeito da diminuio de casos de hansenase registrados, o nmero de casos novos diagnosticados ainda permanece inalterado, e o diagnstico con-

FIGURA 6: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com amostras mantidas em cultura, utilizando-se par de primers especfico para kDNA, que amplifica fragmento de 120pb, comum a todas as leishmnias
Colunas: 1. L. (V.) braziliensis (Lbb. 2903); 2. L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8); 3. L. (L.) chagasi (LV 9.3); 4. amostra de DNA extrado de sangue de co com calazar; 5: Trypanosoma cruzi; 6. PM 100pb. Observar amplicon de 120pb para todas as amostras, com exceo da cultura de T. cruzi, confirmando a especificidade dos primers para Leishmania spp.. Observe neste gel que est havendo consumo quase completo da concentrao de primers utilizada nas reaes (setas).

FIGURA 7: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com amostras de DNA de pacientes com suspeita clnica de LTA: 541 e 712 (i: imprint; b: bipsia; s: sangue). Utilizou-se par de primers especfico para kDNA de leishmnias, cujo amplicon de 120pb. (-): controle negativo, sem adio de DNA. Comparar os resultados com as amostras de leishmnias mantidas em cultura. A PCR da amostra 541i positiva. Observe o resto de primers (setas). A PCR da amostra 712i duvidosa, pois o resto de primers maior do que a banda de 120pb An Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

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do de um gene MntH do bacilo M. leprae em amostras de pacientes com hansenase. As figuras 9 e 10 mostram resultados de PCR com primers especficos para M. leprae em amostras de tecido,66 assim como a amplificao do gene MntH do bacilo M. leprae em DNA extrado de bipsias de pacientes com hansenase. Em relao ao hospedeiro, buscam-se polimor-

FIGURA 8: Amostras na forma de imprint de pacientes com suspeita clnica de LTA. A. Gel de agarose 1,5%. Colunas 7 e 8 representam os controles positivos para LTA (PCR com amostras de culturas de L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis). Colunas 1, 4, 5: amostras positivas; 3, 6: negativas; 2: PCR duvidosa, com amplificao inespecfica, entre 200 e 300pb; 8: PM 100pb. B. Gel de acrilamida 10%. Padro enzimtico dos produtos das PCRs mostrados no gel de agarose digeridos com a enzima BsrI esquerda do PM 100pb, e com a HaeIII, direita. Houve confirmao da negatividade das PCRs para LTA nas amostras 2, 3, 6. Observar os padres de restrio, comparando os resultados das amostras 4 e 5 com as amostras de leishmnias mantidas em cultura (setas). C. seqenciamento do produto da PCR da amostra 4, com primers sense e antisense, confirmando tratar-se de LTA por L. (V.) braziliensis, quando acessado o GeneBank

tinua sendo essencialmente clnico em vrias regies do pas. Em centros maiores, tm-se mtodos subsidirios auxiliares ao diagnstico, como a baciloscopia, a pesquisa do bacilo na bipsia e o mtodo sorolgico que pesquisa anticorpos antiPGL1.25,62 O impasse reside nos doentes paucibacilares, quando no se encontra o bacilo nas amostras pesquisadas, assim como a pesquisa de antiPGL1 torna-se ineficaz nessa forma da hansenase. Assim, ainda se buscam antgenos especficos para o imunodiagnstico da hansenase.63 A biologia molecular tem-se mostrado til para o diagnstico etiolgico nas formas paucibacilares, nos contactantes, e quando h suspeita de recidiva. Vrios so os pares de primers utilizados no diagnstico por PCR, e mtodos moleculares tm sido comparados.64,65 Quando h suspeita de recidiva, tem-se que saber se o bacilo vivel, e, para tal, no basta o achado de DNA nas amostras, sendo necessrio o reconhecimento da expresso gnica, sendo a RT-PCR o mtodo ideal.66 Como o bacilo no cultivvel, a descrio do genoma de M. leprae67 vem permitindo o estudo molecular do bacilo em busca de genes-alvo para a teraputica. Assim, encontra-se em andamento o estuAn Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

FIGURA 9: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com primers P2/P366 e DNA extrado de amostras de pele de pacientes com hansenase forma multibacilar (204, 220, 226, 544, 438) e com diagnstico a esclarecer (541, 771). As PCRs das amostras 541 e 771 so negativas, assim como a amostra de M. tuberculosis (M. Tb) mantida em cultura, confirmando a especificidade dos primers para M. leprae. Observar as PCRs positivas para as amostras 544 e 438, alm do uso completo de primers na reao (setas). As PCRs das amostras 204, 220 e 226 resultaram banda fraca, provavelmente devido ao baixo nmero de cpias, que precisam ser confirmadas. Para tal, pode ser realizada nova PCR com o produto da PCR, ou real time PCR, ou tentar o seqenciamento dessas amostras. C (-): controle negativo, sem adio de DNA

FIGURA 10: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com DNA extrado de amostras de pele (ver Figura 9). As PCRs foram realizadas com dois pares de primers especficos para o gene MntH do bacilo M. leprae, que amplificam seqncias de 336 e de 1.136pb

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fismos genticos que possam estar implicados na apresentao clnica da hansenase. Nesse sentido, tem a autora estudado o gene que expressa a 2GP1 (-2-glicoprotena 1) ou apoliprotena H em amostra populacional com hansenase. CONSIDERAES FINAIS O arsenal de tcnicas de biologia molecular tem crescido consideravelmente, assim como os aparelhos desenhados para sua aplicao. Para acompanhar o desenvolvimento da cincia molecular, os conceitos bsicos devem ser aprofundados no dia-a-dia. Os dermatologistas com atividades essencialmente clnicas devem tambm inteirar-se do assunto, haja vista que muitos laboratrios de anlises clnicas j empregam em sua rotina tcnicas de biologia molecular para diagnstico. Em relao pesquisa em dermatoses tropicais, muito se tem adquirido com a utilizao da biologia molecular, sendo que o objetivo mais atual se encontra dirigido para o desenvolvimento de frmacos e de vacinas para seu controle.

REFERNCIAS
1. 2. Barros M. Clima e endemias tropicais. Estudos Avanados. 2006;20:297-306. Diaz JH. The influence of global warming on natural disasters and their public health outcomes. Am J Disaster Med. 2007;2:33-42. Hotez PJ, Molyneux DH, Fenwick A, Kumaresan J, Sachs SE, Sachs JD, et al. Control of neglected tropical diseases. N Engl J Med. 2007;357:1018-27. Reddy M, Gill SS, Kalkar SR, Wu W Anderson PJ, , Rochon PA. Oral drug therapy for multiple neglected tropical diseases: a systematic review. JAMA. 2007;298:1911-24. Rosatelli JB, Machado AA, Roselino AM. Dermatoses among Brazilian HIV-positive patients: correlation with the evolutionary phases of AIDS. Int J Dermatol. 1997;36:729-34. Machado AA, Coelho IC, Roselino AM, Trad ES, Figueiredo JF, Martinez R, et al. Histoplasmosis in individuals with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS): report of six cases with cutaneousmucosal involvement. Mycopathologia. 1991;115:13-8. de Almeida AM, Roselino AM, Foss NT. Leprosy and HIV infection. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1994;62:133-5. Rosatelli JB, Souza CS, Soares FA, Foss NT, Roselino AM. Generalized cutaneous leishmaniasis in acquired immunodeficiency syndrome. J Eur Acad Dermatol Venereol. 1998;10:229-32. Martn-Dvila P Fortn J, Lpez-Vlez R, Norman F, , Montes de Oca M, Zamarrn P et al. Transmission of , tropical and geographically restricted infections during solid-organ transplantation. Clin Microbiol Rev. 2008;21:60-96. Roselino AM, de Almeida AM, Foss NT, Lima VJ, Raspanti EO, Ferraz AS. Renal transplantation in leprosy patients. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1993;61:102-5. High WA, Bravo FG. Emerging diseases in tropical dermatology. Adv Dermatol. 2007;23:335-50. Lupi O, Tyring SK. Tropical dermatology: viral tropical diseases. J Am Acad Dermatol. 2004;51:1038-9. Carneiro SC, Cestari T, Allen SH, Ramos-e-Silva M. Viral exanthems in the tropics. Clin Dermatol. 2007;25:212-20. Lupi O, Madkan V Tyring SK. Tropical dermatology: , bacterial tropical diseases. J Am Acad Dermatol. 2006;54:559-78. Hussain T. Leprosy and tuberculosis: an insightreview. Crit Rev Microbiol. 2007;33:15-66. Lupi O, Tyring SK, McGinnis MR. Tropical dermatology: fungal tropical diseases. J Am Acad Dermatol. 2006;55:723-4. Jacobson CC, Abel EA. Parasitic infestations. J Am Acad Dermatol. 2007;56:1026-43. Ahmed AA, van de Sande WW Fahal A, Bakker, Woudenberg I, Verbrugh H, van Belkum A. Management of mycetoma: major challenge in tropical mycosis limited international recognition. Curr Opin Infect Dis. 2007;20:146-51.
An Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

3.

4.

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AGRADECIMENTOS tcnica do Laboratrio de Biologia Molecular, FMRP-USP Sandra Silva Rodrigues dos , Santos e aos alunos de ps-graduao Andrezza Furquim da Cruz, Maria Jos Brochado e Olvia Kim, pelo apoio tcnico e reviso do manuscrito.

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29.

30. 31. 32.

33.

34.

35.

36. 37.

38. 39.

Sociedade Brasileira de Dermatologia. Perfil nosolgico das consultas dermatolgicas no Brasil. An Bras Dermatol. 2006;81:549-58. Tapia Collantes A. Dermatologia en el tropico. Rev Med Panama. 1995;20:65-71. Medeiros ACR, Roselino AMF. Leishmaniose tegumentar americana: do histrico aos dias de hoje. An Bras Dermatol. 1999;74:329-36. Gontijo B, Carvalho MLR. American cutenous leishmaniasis. Rev Soc Bras Med Trop. 2003;36:71-80. Vale ECS, Furtado T. Leishmaniose tegumentar no Brasil: reviso histrica da origem, expanso e etiologia. An Bras Dermatol. 2005;80:421-8. Nagar R, Pande S, Khopkar U. Intradermal tests in dermatology-I: Tests for infectious diseases. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 2006;72:461-5. Walker SL, Lockwood DNJ. The clinical and immunological features of leprosy. Br Med Bulletin. 2006;77-78:103-21. Ameen M. Cutaneous leishmaniasis: therapeutic strategies and future directions. Expert Opin Pharmacother. 2007;8:2689-99. Reithinger R, Dujardin JC, Louzir H, Pirmez C, Alexandre B, Brooker S. Cutaneous leishmaniasis. Lancet Infect Dis. 2007;7:581-96. Shaw J. The leishmaniasis survival and expansion in a changing world. A mini-review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2007;102:541-7. Marques SA, Cortez DB, Lastria JC, Camargo RSMP , Marques MEA. Paracoccidioidomicose: freqncia, morfologia e patognese de leses tegumentares. An Bras Dermatol. 2007;82:411-7. Hill AVS. The immunogenetics of human infectious diseases. Annu Rev Immunol. 1998;16:593-617. Hill AVS. Aspects of genetic susceptibility to human infectious diseases. Annu Rev Genet. 2006;40:469-86. Ghosn S, Dahdah MJ, Kibbi AG. Mutilating lupoid leishmaniasis: Twelve years to make the diagnosis! Dermatology. 2008;216:187-9. Marques SA, Lastria JC, Putinatti MSMA, Camargo RMP Marques MEA. Paraccocidioidomycosis: infiltrated, , sarcoid-lyke cutaneous lesions misinterpreted as tuberculoid leprosy. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2008;50:47-50. Fidler HM, Rook GA, Johnson NM, McFadden J. Mycobacterirum tuberculosis DNA in tissue affected by sarcoidosis. BMJ. 1993;306:546-9. Daldon PEC, Arruda LHF. Granulomas noinfecciosos: sarcoidose. An Bras Dermatol. 2007;82:559-71. Pinho MSL. Pesquisa em biologia molecular: como fazer? Rev Bras Coloproct. 2006;26:331-6. Colley DG. Parasitic diseases: opportunities and challenges in the 21st century. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000;95(Suppl 1):79-87. Farah SB. DNA segredos e mistrios. 2 ed. So Paulo: Sarvier; 2007. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P Molecular biology of the cell. New York: Garland . Science; 2002.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

Reed R, Holmes D, Weyers J, Jones A. Practical skills in biomolecular sciences. 2nd ed. UK: Addison Wesley Longman Ltda; 1998. Sandhu GS, Kline BC, Stockman L, Roberts GD. Molecular probes for diagnosis of fungal infections. J Clin Microbiol. 1995;33:2913-9. Soares MJV Moraes JRE, Roselino AMF. Polymerase , chain reaction in detecting Leishmania sp in symptomatic and asymptomatic seropositive dogs. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis. 2005;11:532-9. Oliveira-Pereira YN, Rebelo JMM, Moraes JLP Pereira , SRF. Diagnstico molecular da taxa de infeco natural de flebotomneos (Psychodidae, Lutzomyia) por Leishmania sp na Amaznia maranhense. Rev Soc Bras Med Trop. 2006;39:540-3. Tordini G, Giaccherini R, Pacenti L, Miracco C, Zazzi M, Zanelli G. Cutaneous leishmaniasis: usefulness of PCR on paraffin-embedded skin biopsies as part of routine investigation. Ann Trop Med Parasitol. 2007;101:745-9. Volpini AC, Marques MJ, Lopes dos Santos S, Machado-Coelho GL, Mayrink W, Romanha AJ. Leishmania identification by PCR of Giemsastained lesion imprint slides stored up to 36 years. Clin Microbiol Infect. 2006;12:815-8. Maffei CML, Mirels LF, Sobel RA, Clemons KV Stevens , DA. Cytokine and inducible nitric oxide synthase mRNA expression during experimental murine Cryptococcal meningoencephalitis. Infect Immun. 2004;72:2338-49. Saal I, Gustin A, Rombaut K, Pelaez P Rorive S, , Remmelink M, et al. Laser-assisted microdissection applied to frozen surgical pathologic specimens methodological aspects on RT-PCR. J Exp Thar Oncol 2003;3:325-35. Medeiros ACR, Rodrigues SS, Roselino AMF. Comparison of the specificity of PCR and the histopathological detection of leishmania for the diagnosis of American cutaneous leishmaniasis. Braz J Med Biol Res. 2002;35:421-4. Garcia FCB, Santos SSR, Chociay MF, Medeiros ACR, Roselino AMF. Mtodos subsidirios para o diagnstico da leishmaniose tegumentar americana (LTA): comparao dos resultados do sequenciamento de DNA e da PCR-RFLP para determinao da espcie de leishmania em amostras cutneo-mucosas. An Bras Dermatol. 2005;80(Supl3):340-5. Oliveira JGS, Novais FO, Oliveira CI, Cruz Junior AC, Campos LF, Rocha AV et al. Polymerase chain reaction , (PCR) is highly sensitive for diagnosis of mucosal leishmaniasis. Acta Trop. 2005;94:55-9. Disch J, Pedras MJ, Orsini M, Pirmez C, Oliveira MC, Castro M, et al. Leishmania (Viannia) subgenus kDNA amplification for the diagnosis of mucosal leishmaniasis. Diagn Microbiol Infect Dis. 2005;51:185-90. Rotureau B, Ravel C, Couppi P Pratlong F, Nacher M, , Dedet JP et al. Use of PCR-Restriction fragment length , polymorphism analysis to identify the main new world Leishmania species and analyze their taxonomic properties and polymorphism by application of the

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53.

54.

55.

56.

57.

58.

59.

60.

61.

assay to clinical samples. J Clin Microbiol. 2006;44:459-67. Motta AC, Lopes MA, Ito FA, Carlos-Bregni R, de Almeida OP Roselino AM. Oral leishmaniasis: a clinico, pathological study of 11 cases. Oral Dis. 2007;13:335-40. Garcia AL, Parrado R, De Doncker S, Bermudez H, Dujardin JC. American tegumentary leishmaniasis: direct species identification of Leishmania in noninvasive clinical samples. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2007;101:368-71. Bensoussan E, Nasereddin A, Jonas F, Schur LF, Jaffe CL. Comparison of PCR assays for diagnosis of cutaneous leishmaniasis. J Clin Microbiol. 2006;44:1435-9. Freitas SF. Padronizao e formulao do custo da PCR-RFLP para o diagnstico de leishmaniose tegumentar Americana em papel de filtro [Dissertao]. Ribeiro Preto: Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo; 2007. 112 p. Arevalo J, Ramirez L, Adaui V Zimic M, Tulliano G, , Miranda-Verstegui C, et al. Influence of Leishmania (Viannia) species on the response to antimonial treatment in patients with American tegumentary leishmaniasis. J Infect Dis. 2007;195:1846-51. Skamene E, Schurr E, Gros P Infection genomics: . Nramp1 as a major determinant of natural resistance to intracellular infections. Annu Rev Med. 1998;49:275-87. Chociay-Gatti MF. Polimorfismos do gene SLC11AI (NRAMP1) na leishmaniose tegumentar Americana em populao de uma regio do sudeste do Brasil [Tese]. Ribeiro Preto: Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto, Universidade de So Paulo; 2007. 122 p. Smith DF, Peacock CS, Cruz AK. Comparative genomics: from genotype to disease phenotype in the leishmaniases. Int J Parasitol. 2007;37:1173-86. Reguera RM, Redondo CM, Gutierrez de Prado R, Prez-Pertejo Y, Balaa-Fouce R. DNA topoisomerase I from parasitic protozoa: a potential target for

62.

63.

64.

65.

66.

67.

chemotherapy. Biochim Biophys Acta. 2006;1759:117-31. Scollard DM, Adams LB, Gillis TP Krahenbuhl JL, , Trumman RW Williams DL. The continuing challenges , of leprosy. Clin Microbiol Rev. 2006;19:338-81. Aroz R, Honor N, Banu S, Demangel C, Cissoko Y, Arama C, et al. Towards an immunodiagnostic test for leprosy. Microbes Infect. 2006;8:2270-6. Almeida EC, Martinez NA, Maniero VC, Sales AM, Duppre NC, Sarno EM, et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction in the blood and nasal secretion of Brazilian household contacts. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2004;99:509-12. Martinez NA, Britto CFPC, Nery JA, Sampaio EP Jardim , MR, Sarno EN, et al. Evaluation of real-time and conventional PCR targeting complex 85 genes for detection of Mycobacterium leprae DNA in skin biopsy samples from patients diagnosed with leprosy. Clin Microbiol. 2006;44:3154-9. Phetsuksiri B, Rudeeaneksin J, Supapkul P Wachapong , S, Mahotarn K, Brennan P. A simplified reverse transcriptase PCR for rapid detection of Mycobacterium leprae in skin. FEMS Immunol Med Microbiol. 2006;48:319-28. Monot M, Honor N, Garnier T, Araoz R, Coppe JY, Lacroix C, et al. On the origin of leprosy. Science. 2005;308:1040-2.

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Questes e resultados das questes

1. Em relao s doenas tropicais, assinale a resposta INCORRETA: a) Elas recebem esse nome porque incidem em pases tropicais e subtropicais, e esto relacionadas pobreza. b) As doenas negligenciadas, includas nas doenas tropicais, agravam a pobreza. c) A temperatura elevada e a umidade nos trpicos contribuem para o controle das epidemias. d) As doenas tropicais podem ser relatadas, segundo o agente etiolgico, como virais, bacterianas e fngicas. 2. Em relao ao diagnstico das doenas tropicais, assinale a resposta CORRETA: a) As doenas tropicais, quer bacterianas, quer fngicas, so confirmadas pelo cultivo do agente etiolgico, incluindo as micobacterioses. b) Quando o hospedeiro apresenta resposta imunecelular exacerbada a determinada doena tropical, seu agente etiolgico facilmente encontrado ao exame histopatolgico. c) Em algumas doenas tropicais, como nas leishmanioses, o emprego de tcnicas de biologia molecular facilita o diagnstico etiolgico. d) Nas doenas tropicais, a virulncia do agente etiolgico e a resposta imunolgica do hospedeiro no influenciam a apresentao da forma clnica da doena 3. Em relao clula, assinale a resposta CORRETA: a) Eucarioto definido como organismo unicelular que no apresenta membrana nuclear separando o ncleo do citoplasma. b) A sntese protica realizada no citoplasma, em organelas chamadas ribossomos. c) No organismo procarioto, o DNA se situa no ncleo, responsvel pelo cdigo gentico. d) A definio de um organismo procarioto ou eucarioto reside na presena da membrana citoplasmtica, que separa as organelas citoplasmticas do ncleo.

cao viral e sua perpetuao. d) Um gene humano pode ser introduzido no ncleo de um vrus por meio da engenharia gentica. 5. Nucleossomos representam genes empacotados por protenas em uma molcula de DNA. De acordo com o enunciado, assinale a resposta INCORRETA: a) As protenas responsveis pelo empacotamento dos genes so denominadas histonas. b) A molcula de DNA composta por vrios genes. c) O cromossomo composto por vrios genes e, por conseguinte, por vrias molculas de DNA empacotadas por protenas. d) Uma molcula de DNA supercondensada por protenas, compondo um cromossomo. 6. Em relao a DNA, RNA e protenas, assinale a resposta CORRETA: a) A molcula de DNA formada por uma fita simples constituda por nucleotdeos, grupamento fosfato e um acar, a desoxirribose. b) Enquanto o DNA se situa no ncleo, o RNA se situa nas organelas citoplasmticas, em especial no retculo endoplasmtico. c) O cdigo gentico, ou cdon, formado por trs bases nitrogenadas, e cada cdon incorpora um dipeptdeo molcula da protena. d) Um gene representa a unidade codificadora de uma protena. 7. Quanto a DNA, RNA e protenas, assinale a resposta INCORRETA: a) O DNA molcula cujas seqncias de bases nitrogenadas originaro o cdigo gentico para a sntese protica. b) O RNA, molcula de fita simples, responsvel pelo encaminhamento da informao gentica do ncleo ao citoplasma. c) A molcula de DNA composta por xons e ntrons, sendo as seqncias dos ntrons transcritas para o mRNA. d) A molcula de RNA menor do que a do DNA, pois s so transcritas seqncias especficas. 8. As protenas so formadas por aminocidos. Assinale a resposta INCORRETA: a) Quando duas molculas de aminocidos se unem, o grupo carboxila de um deles se liga ao grupo amina do outro, com eliminao de uma molcula de gua, formando um dipeptdeo.

4. Em relao aos organismos procariotos, assinale a resposta CORRETA: a) Os vrus representam os organismos unicelulares mais simples, possuindo DNA ou RNA nuclear, envolto em cpsula protica. b) As bactrias permitem que os vrus introduzam seu material gentico em seu interior e, assim, a sntese de protenas virais. c) Os fagos so bactrias que permitem a repliAn Bras Dermatol. 2008;83(3):187-203.

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b) Todos os 20 aminocidos conhecidos tm carga eltrica negativa e, quando ligados de forma linear, constituem a estrutura primria de uma protena. c) A sntese de uma protena est diretamente relacionada ao cdigo gentico. Portanto, se houver alterao de uma base no cdon, esta pode resultar em uma protena alterada ou no. d) Se todas as clulas humanas possuem o mesmo cdigo gentico, todas as clulas expressam protenas semelhantes. 9. Enzima uma protena. Assinale a resposta INCORRETA: a) Enzimas so responsveis pelas reaes qumicas de uma clula; so especficas, atuando sobre determinado substrato. b) As endonucleases so enzimas de restrio que podem cortar uma molcula de DNA em vrios fragmentos. c) As enzimas de restrio, produzidas no citoplasma viral, auxiliam a introduo do material gentico viral em uma bactria. d) As endonucleases so denominadas de acordo com o microorganismo do qual foram extradas; algumas suportam altas temperaturas, como a Taq polimerase. 10. Assinale a frase INCORRETA: a) Todas as clulas humanas possuem o mesmo nmero de genes, portanto, a mesma informao gentica. b) Todas as clulas humanas expressam todos os genes, portanto, a expresso de uma protena pode ser estudada em qualquer clula. c) Se todas as clulas humanas possuem o mesmo cdigo gentico, um determinado gene poder ser estudado em qualquer clula. d) Todas as clulas humanas, com exceo das clulas sexuais, possuem 46 cromossomos, constituindo o caritipo. 11. A tcnica da PCR consiste na sntese in vitro de milhares de cpias de DNA, catalisada pela enzima termoestvel Taq polimerase. Assinale a resposta CORRETA: a) A PCR tcnica simples, que consiste na desnaturao das duas cadeias do DNA, seguida pelo anelamento dos primers, e sntese do DNA, catalisada por uma polimerase. b) Para a tcnica da PCR, extrai-se RNA de qualquer clula ou tecido com o intuito de se estudar a expresso protica. c) A dupla hlice do DNA formada por duas cadeias de polipeptdeos ligadas por pontes de hidrognio. d) A extrao de DNA para a PCR s alcanada de amostra congelada a -70oC.

12. Para se realizar uma PCR, prepara-se a soluo de reagentes, denominada mix, com o buffer, os oligonucleotdeos, os primers, a amostra de DNA e a Taq polimerase. Assinale a resposta INCORRETA: a) Um elemento muito importante no buffer o Mg2+, que atua como co-fator da polimerase. b) Os primers devem ser desenhados cuidadosamente, pois, quando inespecficos, se ligam a vrios fragmentos do DNA genmico. c) As bases A, U, C e G devem ser incorporadas ao mix, porque a sntese do DNA depender de sua concentrao no mix. d) A Taq polimerase enzima isolada da bactria Thermus aquaticos, que se mantm estvel a altas temperaturas. 13. Assinale a resposta CORRETA: a) Quando se quer estudar a expresso de determinado gene, faz-se a extrao do RNA total da amostra, a seguir, com a enzima transcriptase reversa, transforma-se o RNA em cDNA, e, finalmente, a PCR, constituindo a tcnica de RT-PCR. b) As tcnicas de PCR e PCR-RFLP (restrio enzimtica) muito se prestam investigao etiolgica do agente causal em uma amostra, quer humana, animal ou de inseto, cujos primers no necessitam ser to especficos. c) O seqenciamento do DNA tcnica mais dispendiosa, pois depende de um seqenciador automtico, e nada mais do que uma PCR da PCR, originando fita dupla a ser analisada. d) No existem tcnicas de extrao de DNA e de RNA de uma nica amostra, tendo-se que optar por uma das molculas a ser estudada. 14. Qual a melhor tcnica de biologia molecular para se estudar um polimorfismo de determinado gene? a) A PCR, sem dvida, podendo-se extrair RNA do sangue perifrico, constituindo o RNA genmico. b) Se o polimorfismo j descrito, pode-se verificar na seqncia do DNA qual a enzima que poder cortar a seqncia justamente no stio polimrfico. Portanto, pode-se usar a PCR-RFLP . c) Necessariamente, tem-se que proceder ao seqenciamento do DNA aps a PCR. d) Os polimorfismos genticos so estudados por RT-PCR. 15. Quais as tcnicas laboratoriais para se verificar a expresso de um gene? a) Faz-se inicialmente a extrao de RNA total da amostra e, a seguir, a RT-PCR com primers especficos para a seqncia do gene em estudo. Tambm pode ser realizada hibridizao in situ,
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com probes que se ligaro ao mRNA especfico. b) Pode-se buscar pela expresso protica no tecido, por exemplo, imuno-histoqumica com anticorpo especfico contra a protena. c) Pode-se realizar cultura das clulas que expressam o gene em estudo, e, por Elisa, quantificar a protena sintetizada no sobrenadante, ou proceder immunoblotting com anticorpo contra a protena. d) Todas as respostas esto corretas. 16. Para se visualizarem os produtos de DNA ou fraes proticas, utiliza-se a eletroforese. Assinale a alternativa INCORRETA: a) A eletroforese baseia-se na separao de molculas com cargas eltricas distintas ou de tamanhos diferentes. b) O DNA, por ser molcula de carga negativa, devido aos grupamentos fosfatos, migra do plo negativo (ctodo) para o plo positivo (nodo). c) A eletroforese com gel de acrilamida a mais utilizada para a anlise de protenas, que, em geral, realizada em sistema vertical. d) O DNA pode ser observado em gel de agarose ou de poliacrilamida, porm, para estudo de molculas maiores, d-se preferncia ao gel de acrilamida. 17. Consultando a Figura 8B do texto, qual a sua anlise do padro de restrio enzimtico para as amostras 4 e 5? Assinale a alternativa CORRETA: a) Ambas as amostras so de L. (V.) braziliensis, comparadas s amostras de leishmanias mantidas em cultura. b) Ambas as amostras so de L. (L.) amazonensis, comparadas s amostras de leishmanias mantidas em cultura. c) A utilizao das enzimas de restrio BsrI e HaeIII no se presta ao diagnstico diferencial entre as espcies de leishmanias. d) A enzima BsrI corta o fragmento de DNA somente de L. (V.) brazilinsis, enquanto a HaeIII corta somente de L. (L.) amazonensis.

18. Observe a figura abaixo e assinale a resposta INCORRETA:

Gel de acrilamida 10%. Produtos de digesto com as enzimas BsrI e HaeIII em amostras com suspeita clnica de LTA. As amostras dos pacientes a a d devem ser comparadas com as amostras de leishmanias mantidas em cultura a. A amostra 3 de L. (L.) amazonensis. b. A amostra 4 de L. (V.) braziliensis. c. As amostras 1 e 2 apresentam padro de restrio semelhante entre si e provavelmente so de L. (V.) braziliensis, porm o padro de restrio da BsrI no permite descartar L. (L.) amazonensis. d. Todas as amostras so de L. (V.) braziliensis. 19. Como voc interpreta os resultados das PCRs mostrados na figura abaixo? Assinale a resposta INCORRETA:

Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR de amostras de pacientes com suspeita clnica de LTA (colunas 1-10), coletadas na forma de imprint em papel de filtro, que devero ser comparadas ao amplicon de 120pb, obtido de amostra de L. (L.) amazonensis mantida em cultura

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a) As amostras 2, e 4 a 8 so positivas, mas seria importante confirmar com digesto enzimtica. b) A amostra 1 tambm positiva, sem dvida. c) A amostra 9 mostra rastro de DNA, mas parece haver uma banda fraca na altura de 120pb. d) Os restos de primers das amostras 2, e 4 a 8 se assemelham ao resto de primers da amostra controle, reforando o resultado positivo. 20. Ainda em relao figura acima, assinale a alternativa INCORRETA: a) Os rastros das amostras 9 e 10 provavelmente so devidos a excesso de DNA. b) A PCR da amostra 3 muito duvidosa, pois o resto de primers mais intenso do que a prpria banda de 120pb (setas). c) Seria interessante diminuir a concentrao de primers das reaes. d) A concentrao de DNA total extrado do tecido igual para todas as amostras, j que foram extradas usando-se o mesmo protocolo.

Gabarito Disidrose: aspectos clnicos, etiopatognicos e teraputicos. 2007;83(2):107-15. 1b 2a 3c 4a 5d 6b 7a 8c 9a 10 b 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 b c d d a b b d a c

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