UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA CENTRO DE CINCIAS EXATAS E TECNOLGICAS DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

RELATRIO DE AULA PRTICA MICROBIOLOGIA DO LEITE E DERIVADOS TAL 414 COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES

Professor: Alunos:

Antnio Fernandes de Carvalho Daniel de Oliveira - 70371 Gabriela Moreira Sales - 74293

Viosa Minas Gerais 2013

1. Introduo

O leite definido como o produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condies de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas (BRASIL, 2002). Do ponto de vista nutricional, o leite considerado um dos alimentos mais completos, por apresentar em sua composio alto teor de protenas, vitaminas, sais minerais, alm de ser importante fonte de clcio, sendo amplamente comercializado e consumido pela populao, e recomendado especialmente para crianas e idosos. Devido a sua composio, constitui um excelente meio de cultura para multiplicao de microrganismos (FRANCO; LANGRAF, 1996), podendo ter importante participao na veiculao das DTA (Doenas Transmitidas por Alimentos), quando consumido sem tratamento trmico adequado (BOOR, 1997). Diversos microrganismos patognicos podem ser veiculados pelo leite, destacando-se Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., Listeria

monocytogenes, Campylobacter spp., Salmonella spp., Staphylococcus aureus e Escherichia coli (RIEDEL, 1992; ROBINSON, 1990). Alm dos patognicos, os microrganismos deteriorantes presentes no leite podem causar alteraes qumicas, tais como a degradao de gorduras, de protenas e de carboidratos, tornando-o imprprio para o consumo e industrializao (COUSIN, 1982). O controle microbiolgico em amostras de leite realizado,

principalmente, atravs da pesquisa de microrganismos indicadores que, quando presentes, podem fornecer informaes sobre as condies sanitrias da produo, do processamento, ou armazenamento, assim como a possvel presena de patgenos e estimativa da vida de prateleira do produto. Os principais grupos de microrganismos indicadores de qualidade do leite so os aerbios mesfilos (AM) e os coliformes (FRANCO; LANGRAF, 1996). O grupo dos coliformes composto por bactrias dos gneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella e pertencem famlia das Enterobacteriaceae. So bastonetes curtos, gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no esporulados, que apresentam como caracterstica marcante a capacidade de fermentar a lactose com produo de cido e gs quando incubados entre 32 e 35 C em 48 horas. Esses micro-organismos tm 1

como habitat o trato intestinal do homem e de outros animais de sangue quente. A Federao Internacional de Laticnios (FIL, 1998) define as bactrias do grupo coliforme como formadoras de colnias vermelho escuras, com aproximadamente 0,5 mm de dimetro, se incubadas em gar VRBL (violet red bile lactose) a 30C. Dentre o grupo dos coliformes (totais), h um subgrupo denominado coliformes termotolerantes que restrito aos membros capazes de fermentar a lactose em 24 horas a 44,5 + 0,2 C com produo de cido e gs. Este subgrupo apresenta a particularidade de estar frequentemente associado a contaminao recente de origem fecal. As bactrias pertencentes esse grupo podem multiplicar-se rapidamente em leite, especialmente acima de 20 C, degradando protenas e lactose. Consequentemente observa-se formao de gs (CO2 e H2) que alteram o sabor e odor do leite e diminuem sua estabilidade trmica. Na indstria de laticnios esses micro-organismos esto associados a um defeito relativamente comum no processamento de queijos que conhecido como estufamento precoce. Nesse caso, se a contaminao do leite no tanque de fabricao de queijos estiver entre 25 e 50 coliformes por mL, com apenas 24 horas esse nmero pode chegar a 5 x 105 UFC/g de queijo. Dessa forma j possvel observar a formao de sabores estranhos devidos produo de compostos como cido frmico e actico assim como a formao de pequenas olhaduras ou orifcios distribudos pelo interior do queijo. Quando a contaminao por coliformes atinge cerca de 106 UFC/g de queijo, seu volume visivelmente aumentado e o estufamento torna-se evidente. Em funo de ser impraticvel, sob o ponto de vista tecnolgico, pesquisar rotineiramente todos os patgenos que podem estar associados aos alimentos ou gua, utiliza-se a pesquisa de um grupo de micro-organismos que normalmente esto associados contaminao por dejetos humanos. Os indicadores com maior aceitao cientfica so representados pelo grupo dos coliformes. Como as bactrias pertencentes esse grupo so sensveis ao tratamento trmico da pasteurizao, sua presena nos alimentos ou gua tratada indica falhas durante as etapas de processamento. Para evitar sua presena na indstria de laticnios importante que sejam tomadas algumas medidas. Dentre elas convm citar a pasteurizao 2

eficiente do leite, respeitando-se o binmio tempo/temperatura escolhido; adoo de procedimentos de higiene e sanitizao bem elaborados e controlados; o controle e orientao permanente quanto higiene pessoal dos funcionrios; a eliminao da presena de leite ou creme cru dentro das indstrias; a checagem peridica das placas do pasteurizador para avaliar a presena de microfuros. Existem dois mtodos de anlise para a enumerao de coliformes. A contagem em placas utilizando gar VRBL e a tcnica do NMP (Nmero Mais Provvel). A FIL recomenda o mtodo em placa quando esperada uma alta contagem de coliformes (> 100 UFC/g ou 10 UFC/ mL de produto).

2. Mtodo

2.1 NMERO MAIS PROVVEL

2.2.1 Objetivos Estabelecer procedimento para a determinao do Nmero Mais

Provvel de coliformes e termotolerantes em alimentos.

2.2.2 Materiais Meio de cultura e reagentes: Caldo lauril sulfato de sdio (LST) concentrao simples, caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla, caldo verde brilhante bile 2 % lactose, caldo EC, soluo salina peptonada 0,1 %. Utenslios e equipamentos: bico de Bunsen, pipetas, tubos de vidro, tubos de Durhan, banho-maria com movimentao de gua.

3. Principais aplicaes Aplica-se a todos os produtos lcteos, devendo ser utilizada quando o limite mximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.

4. Procedimento 4.1. Metodologia segundo BRASIL, 2003 Pesagem e preparo da amostra

Foi analisada uma amostra de Leite Pasteurizado Integral Vitaminado Tipo B, Lote 01, embalado dia 16/02/2013, Laticnios Funarbe. Foi transferido 1 mL da amostra para o tubo contendo soluo salina peptonada 0,1 % de forma a obter a diluio 10-1. Prova presuntiva Diretamente da amostra (100),foram inoculados volumes de 1 mL em uma srie de 3 tubos contendo caldo verde brilhante em concentrao simples. A partir da diluio 10-1, foram efetuadas as demais diluies desejadas em soluo salina peptonada 0,1 %. A seguir, inoculados volumes de 1mL da diluio 10-1 na segunda srie de 3 tubos contendo caldo verde brilhante em concentrao simples. Foram inoculados 1 mL da diluio 10-2 na terceira srie de 3 tubos. Incubados os tubos a 44,5 + 1 C por 48 horas. 4

5. Resultados Leitura: a suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs nos tubos de Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia quando agitado levemente.

Tabela de determinao do Nmero Mais Provvel (NMP) por 100 mL da amostra nos limites de confiana de 95 %, quando so utilizados trs tubos para cada volume de 10, 1,0 e 0,1 mL.

10 ml Diluio 100 - 3 tubos positivos 1,0 ml Diluio 10-1 1 tubo positivo 0,1 ml Diluio 10 -2 0 Nmero mais provvel/g ou ml: 4,3 Intervalo de Confiana: 9 180

5. Concluso Os resultados mostram que h presena de coliformes termotolerantes, o que pode indicar m qualidade de higienizao do leite e processo ineficiente de pasteurizao, visto que coliformes no resistem ao mesmo. Como a anlise foi realizada com Leite Pasteurizado submetido a eficiente processo de pasteurizao e boa qualidade de higiene, acreditamos ter havido contaminao durante a manipulao da amostra analisada, interferindo no resultado. 6. Referncias BRASIL, 2003. Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Instruo Normativa n 62, de 26 de agosto de 2003. Mtodos Analticos Oficiais Microbiolgicos para Anlises Microbiolgicas para Controle de Produtos de origem Animal e gua. DOU 18 de setembro de 2003.

BOOR, K. J. Pathogenic microorganisms of concern to the dairy industry. Dairy, Food and Environmental Sanitation, Ames, v.17, n.11, p.714-717, 1997. COUSIN, M. A. Presence and activity psychotrophic microorganisms in milk and dairy products. Journal of Food Protection, Des Moines, v.45, p.172-207, 1982. FRANCO, B. D. G. M.; LANGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. So Paulo: Atheneu, 1996.

International Dairy Federation. IDF/FIL. Norma 41:1966.

MARTH, E., STEELE, J. L. Applied Dairy Microbiology. 2 1d., 2001.

RIEDEL,G. Controle sanitrio de alimentos. 2.ed. So Paulo: Atheneu, 1992.

ROBINSON, R. Q. Dairy microbiology: the microbiology of milk. New York: Elsevier Applied Science, 1990. v.1.

SILVA, N., JUNQUEIRA, V. C. A., SILVEIRA, N. F. A., TANIWAKI, M. H., SANTOS, R. F. S., GOMES, R. A. R. Manual de Mtodos de Anlise Microbiolgica de Alimentos. 3 ed., 2007.

WALSTRA, P., WOUTERS, J. T. M., GEURTS, T. J. Dairy Science and Technology, 2 ed., 2006.

WEHR, H. M., FRANK, J. F. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 17 ed., 2004.