a.

Crinipellis perniciosa Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer considerado um organismo hemibiotrfico, devido a que uma parte do seu ciclo de vida se realiza sobre o tecido morto do seu hospedeiro, constando de uma fase biotrfica (n) ou parastica e uma saproftica (n + n) (SUREZ & DELGADO, 1993). O fungo em sua fase biotrfica infecta unicamente tecido meristemtico em crescimento ativo (brotos, botes florais, frutos), os basidiocarpos (estrutura sexual) liberam durante a noite os basidisporos, os quais se dispersam atravs do vento e da chuva. Os basidisporos germinam sobre a cutcula e base dos tricomas, emitindo tubos germinativos longos e vigorosos, no havendo formao de apressrios. Os tubos germinativos monocariticos penetram nos tecidos meristemticos de folhas e do tronco, atuando intercelularmente e causando inicialmente reaes em forma de clorose, entumecimento a partir do ponto inoculado e, posteriormente, inchaos, provocando superbrotaes e anomalias nos frutos e almofadas florais, processo que varia de 4 a 15 horas dependendo da temperatura e umidade relativa (PURDY & SCHMIDT, 1996). O miclio biotrfico do patgeno coloniza todo o tecido e cresce intercelularmente por aproximadamente trs semanas. No broto atacado h tambm contnuo crescimento com aparncia sadia; ento o patgeno penetra o lmen celular e, a partir da terceira at a dcima quarta semanas, os sintomas so bem visveis em forma de inchaes, deformaes e ramificaes, que por sua aparncia se denominam vassouras-de-bruxa (SUREZ, 1993; SUREZ & DELGADO, 1993). Posteriormente os tecidos atacados se necrosam; no caso das vassouras vegetativas, as necroses avanam progressivamente desde as folhas e talos, sendo este o incio da fase saproftica, aps trs a nove semanas inicia-se a dicariotizao, surgindo hifas com grampos de conexo. Durante a transio de vassouras verdes a secas, est presente10 tanto o miclio biotrfico como o saproftico dentro do tecido atacado (PURDY & SCHMIDT, 1996). O tecido morto permanece na rvore de maneira indefinida, enquanto o fungo vive sua fase saproftica (SUREZ, 1993). O miclio do fungo no interior da vassoura seca, forma massas sob condies de alta umidade relativa (menor que 80%), precipitao de 1000 a 2000 mm e temperaturas entre 22 a 28 0 C desenvolvendo, desta maneira, os basidiocarpos

(PURDY & SCHMIDT, 1996). Este o estgio meiosprico do fungo. Os basidiocarpos so de cor prpura intenso, cujo pleo apresenta um dimetro de 5 a 30 mm com sucos radiais convexos e deprimidos no centro, a lamela esbranquiada com mais de 15 lamnulas correspondentes aos sucos do pleo, o estipe oco de cor branco cremoso e mede de 5 a 10 mm, sua base engrossada de colorao parda. As basdias produzem quatro basidisporos uninucleados e o resto do himnio similar aos outros basidiomicetos (SINGER, 1942; BAKER & HOLLIDAY, 1957; HOLLIDAY, 1970). Desta maneira, os basidiocarpos provm de esporos para o incio de novas infeces sobre a gerao de brotos e gemas florais durante o ciclo de vida da planta. A liberao dos basidisporos, processo reprodutivo do C. perniciosa, ocorre preferencialmente noite, estando associada queda de temperatura e ao aumento da umidade relativa do ar, sendo disseminados pela corrente dos ventos. Os basidisporos so liberados atravs de um mecanismo explosivo. Os mesmos tm vida curta, de sensibilidade luz e em condies naturais no sobrevivem mais que uma hora. A disseminao tambm pode ocorrer atravs da gua e do transporte de material biolgico contaminado (GARCES, 1947). b. Moniliophthora roreri Moniliophthora roreri (Ciferri) Evans et al. tem dois ciclos de vida, o ciclo primrio e o secundrio. Os esporos so os nicos propgulos infectivos do M. roreri, e os frutos dos hospedeiros suscetveis so as nicas partes que o mesmo infecta (EVANS, 1981). Aps um perodo de aproximadamente trs meses, os frutos doentes tornam-se secos e mumificados e permanecem fixos ao tronco do hospedeiro por um longo perodo, sendo11 a maior fonte de inculo (AMPUERO, 1967; CASTAO, 1952). Os esporos so produzidos em grande quantidade nos frutos doentes, podendo alcanar uma densidade de 44 milhes de esporos por cm 2 (CAMPUZANO, 1981). RAM (1989) determinou que 20 perodos de esporulao sucessiva ocorrem em quatro ciclos durante 80 dias. At mesmo frutos velhos mumificados nas rvores ou cados no cho foram capazes de terem perodos de 13 a 16 esporulaes, produzindo inculo de M. roreri at os mesmos se decomporem. De acordo com WOOD & LASS (1985), os esporos so produzidos em grande nmero em poucas semanas, diminuindo gradativamente a quantidade em cerca de 10 semanas da infeco, aps o qual o

nmero torna-se insignificante. EVANS (1981) reportou que esporos tm sido coletados na superfcie de frutos doentes durante mais de um ano aps a infeco inicial. Aps a liberao, considervel nmero de esporos infectivos se distribuem sobre os troncos das rvores e almofadas florais (RAM, 1989). Variaes no nmero de esporos tm sido identificadas em funo do tempo, em dias, e das estaes do ano (EVANS, 1981). Vrios aspectos da disperso da doena ainda no esto bem entendidos (WOOD & LASS, 1985). Os propgulos infectivos (esporos) de M. roreri so transportados pelo ar e principalmente tm grande facilidade de se dispersarem pelo vento (EVANS, 1981), embora a disperso possa ocorrer tambm atravs da gua, insetos e outros animais (NAUNDORF, 1954). Alm do mais, estes so mais resistentes a luz e dissecao (EVANS, 1981) do que os de C. perniciosa (PURDY & SCHIMIDT, 1996). 2.1.2.2a. Crinipellis perniciosa A sintomatologia da vassoura-de-bruxa bastante variada e foi descrita detalhadamente por HOLLIDAY (1952), BAKER & HOLLIDAY (1957), THOROLD (1975), EVANS (1981b), RUDGARD (1989) e TOVAR (1991). Recentemente foi feita redescrio dos sintomas, principalmente em plntulas inoculadas em diferentes estdios de desenvolvimento e a comparao com mudas infectadas naturalmente, alm de alguns sintomas em plntulas e plantas adultas com resistncia a C. perniciosa (SILVA et al., 2002). Quando o fungo infecta ramos ou brotos vegetativos provoca inchao da parte afetada, acompanhada da proliferao de pequenos brotamentos prximos um dos outros, onde se prendem as folhas grandes curvadas e retorcidas, que parecem vassoura-de-bruxa, advindo o nome da doena. Nas almofadas florais infectadas formam-se cachos de flores anormais, hipertrofiadas, com pedicelo grande e inchado, que podem no produzir frutos, ou que daro origem a frutos que morrem prematuramente, ou cujo crescimento so anormais. Nos frutos os sintomas variam em funo da idade e o tamanho dos mesmos quando infectados e tambm quanto ao modo de infeco (SILVA et al., 2002). Quando a infeco se d atravs do ponto de insero da flor ou por infeco basidiosprica na inflorescncia, surgem frutos partenocrpicos, deformados, de formato similar do morango e que morrem prematuramente, tornando-se negros, petrificados, com menos de 6 cm de dimetro. Se a infeco ocorre em flores j polinizadas, resultam em frutos anormais, com aspecto

de cenoura, os quais se tornam pretos e petrificados, com 15 cm de comprimento.14 Nos frutos jovens, com 8 semanas, com 2 a 5 cm de comprimento, resultam rgos com maturidade precoce, sobre os quais aparece uma mancha negra, dura e irregular, que corresponde, internamente, a tecidos e amndoas afetados ficando as sementes ligadas entre si e inaproveitveis. Frutos infectados por basidisporos, com idade de aproximadamente 11 semanas, apresentam podrido setorial externa e internamente (ORCHARD et al., 1994). As sementes quando infectadas podem ser aproveitadas de acordo com o estdio de desenvolvimento em que o fruto foi infectado (SILVA et al., 2002). O fungo coloniza primeiramente os tecidos internos dos frutos e quando surgem os sintomas externos, as sementes j esto imprestveis para o consumo.

Moniliophtora perniciosa um fungo pertencentente ordem Agaricales, conhecido anteriormente por Crinipellis perniciosa. o causador da vassoura-de-bruxa, doena que afecta os tecidos jovens dos cacaueiros, levando sua perda de produtividade e dando origem a elevados prejuzos econmicos. Uma plantao infectada pode perder cerca de 90% da sua produo [carece de fontes]. Surge em duas fases distintas: biotrfica (expanso e infeco) e saprotrfica (quando morre e produz esporos). A fase biotrfica e o que despoleta a mudana para a fase saprotrfica, ainda no so totalmente conhecidas. Os esporos so dipersados pelo vento, mas necessitam de atingir a gua de forma agerminar. Devido a isto, espalha-se essencialmente durante a poca das chuvas. O seu controlo muito difcil, requerendo trabalho rduo para o remover. A parte mais crtica do tratamento, a poda de material infectado, s pode ser efectuada durante os perodos secos, devido ao risco de propagao da doena. Devido a motivos econmicos, a maior parte dos galhos cortados so mantidos no solo, o que leva a um risco de re-infeco das rvores no ano seguinte. No entanto, pulverizando o cho com uma camada fina depetrleo pode prevenir a passagem de esporos para a atmosfera outra vez[carece de fontes].

2.1.2.2. Taxonomia a. Crinipellis perniciosa O agente causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro foi classificado inicialmente por Stahel em 1915 como Marasmius perniciosus. Em 1942, foi transferido para o gnero Crinipellis por Singer e, na reviso da sistemtica do fungo, foi mantido o12 binmio Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer (SINGER, 1942). Este fungo pertence

diviso Eumycota, subdiviso Basidiomycotina, classe Basidiomycetes, subclasse Homobasidiomycetidae, ordem Agaricales e a famlia Tricholomataceae. As espcies pertencentes a esta famlia caracterizam-se por possurem basidiomas pileados, estipitados, ligncolas, basidisporos de cor branca e so capazes de revivescerem aps o secamento quando so umedecidos (ALEXOPOULOS et al., 1996; EVANS, 1980). Reconhece-se trs variedades do fitopatgeno com base na morfologia do basidioma: (i) C. perniciosa var. perniciosa, apresentando o pleo esbranquiado nas margens e rseo-avermelhado no centro; (ii) var. citriniceps, com pleos amarelo-citrinos e (iii) var. ecuadoriensis possuindo pleos uniformemente vermelhos (PEGLER, 1978). a. Crinipellis perniciosa Como parte do seu controle recomenda-se eliminar as vassouras secas a fim de reduzir a fonte produtiva de inculo, combinada com uma poda anual de manuteno durante a estao seca (SUREZ, 1979). O controle biolgico oferece alternativa atravs do fungo Trichoderma stromaticum que a base do biofungicida Tricovab,16 utilizado no controle de C. perniciosa, cuja conseqncia a reduo da esporulao do fungo (SAMUELS et al., 2000; GRIFFITH et al., 2003). A aplicao de fungicidas protetores e sistmicos na lavoura feita como um complemento a poda fitossanitria e a utilizao de variedade resistentes, pois o uso dos mesmos isoladamente no mostra bom controle da vassoura-de-bruxa. Alm disso, o patgeno ataca tecidos em crescimento, portanto, seu controle com fungicidas se torna difcil; situao que se complica devido a que o perodo de maior infeco coincide com a estao chuvosa (DESROSIERS et al., 1955) que podem facilmente lavar os fungicidas protetores e devido baixa translocao dos produtos sistmicos em um planta lenhosa (RESENDE et al., 2000). Em 1990, o Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC), em Ilhus, Bahia, iniciou um programa de melhoramento gentico para resistncia a vassoura-de-bruxa, dos quais dentre vrios materiais genticos, com excelente potencial de resistncia (LUZ et al., 2003; SILVA et al., 2003). Para tal, desenvolveu-se um sistema semi-automatizado de inoculao artificial com apoio do American Cocoa Research Institute (ACRI), o qual vem permitindo a avaliao de um grande nmero de prognies de cacau sob condies controladas. Com a utilizao deste sistema, um total de 341 prognies de cacau j foram avaliadas quanto resistncia VB. Paralelamente, a CEPLAC lanou

vinte clones e trs variedades hbridas (Theobahia, Theobahia I, e Theobahia II) resistentes, os quais vm sendo distribudos e plantados em diferentes agrossistemas da regio cacaueira da Bahia. Infelizmente, a maioria destes clones descendente de SCA-6, cuja resistncia, segundo BARTLEY (1986), tem sido considerada monognica dominante. No entanto, para a situao emergencial da Bahia, face ao desespero dos produtores, estes gentipos desempenharam o seu papel, baixando o potencial de inculo na regi 2.1.2.5. Hospedeiros a. Crinipellis perniciosa Crinipellis perniciosa parasita do cacau como tambm de outras espcies do gnero Theobroma, como grandiflorum (Spr.) K. Scum (cupuau), bicolor Humb & Bompl., calodesmis, glauca, obovatum Klotz ex Bern (cacau cabea-de-urubu), microcarpa Mart, subincanum Mart. (cupu), speciosum Willd. (cacau) e do gnero Herrania, como albiflora Gudot, ntida (Poepp) Shultes, purprea (Pitter) e os gneros Sterculia speciosa Schum e Entada gigas (L) Falc & Rendle (HOLLIDAY, 1980; TOVAR, 1991; SUREZ & DELGADO, 1993). A espcie subdividida em quatro bitipos de acordo com o hospedeiro que ataca: 1) bitipo-C que infecta predominantemente Theobroma spp., mais especificamente o cacaueiro e Herrania spp. (EVANS, 1978; BASTOS et al., 1988); 2) bitipo-S que infecta as espcies da famlia Solanaceae (BASTOS & EVANS, 1985; BASTOS et al., 1988); 3) bitipo-L que predominantemente saproftico e coloniza diversos substratos (EVANS, 1978; HEDGER et al., 1987) e 4) bitipo-B que infecta Bixa orellana (BASTOS & ANDERBRHAN, 1986). Tambm se tem reportado atacando espcies pertencentes s famlias Solanecea (jil, jurubeba, berinjela, caiara), Bixaceae (urucum), Bignoniaceae (alguns cips) e Malpighiaceae (cip silvestre) (BASTOS & EVANS, 1985; BASTOS & ANDEBRHAN, 1986; GRIFITH & HEDGER, 1994; RESENDE et al., 2000; GRIFITTH et al., 2003). ESTRUTURA GENTICA DE POPULAES DE Crinipellis perniciosa E Moniliophthora roreri UTILIZANDO MARCADORES RAPD E SSR Ricardo Franco Cunha Moreira

Orientador: Prof. Dr. Carlos Ruggiero Co-orientadora: Dr a . Karina Peres Gramacho Tese apresentada Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias Unesp, Cmpus de Jaboticabal, como parte das exigncias para a obteno do ttulo de Doutor em Agronomia (Gentica e Melhoramento de Plantas). JABOTICABAL SO PAULO BRASIL