Universidade Federal do ABC

Pesquisando Desde o Primeiro Dia (PDPD)

Reviso Bibliogrfica Clulas tronco obtidas a partir de dentes decduos: da prtica laboratorial a aplicao clnica

Aluno: Vanderley Espirandelli (RA. 21003811) Orientador (a): Prof Dra. Christiane Bertachini Lombello

Maro 2012

Vanderley Espirandelli

Clulas-tronco obtidas a partir de dentes decduos: da prtica laboratorial a aplicao clinica

Relatrio Final Programa de Iniciao Cientfica Pesquisando Desde o Primeiro Dia PDPD/UFABC, Edital n 01/2011, correspondendo s atividades desenvolvidas no perodo de agosto de 2011 a setembro de 2012.

Orientador (a): Prof Dr . Christiane Bertachini Lombello

Santo Andr SP 2012

AVALIAO DO ORIENTADOR

Projeto: Clulas-tronco obtidas a partir de dentes decduos: da prtica laboratorial a aplicao clinica Categoria: Edital n 01/2011 (PDPD/UFABC) Aluno: Vanderley Espirandelli (RA. 21003811) Orientadora: Profa. Dra. Christiane Bertachini Lombello Data: 28 de setembro de 2012.

O aluno Vanderley Espirandelli desempenhou as atividades propostas para o Programa Pesquisando Desde o Primeiro Dia (PDPD) com iniciativa, dedicao e interesse. Esteve presente nas reunies programadas com a orientadora, mostrando-se solcito. Foi possvel cumprir o objetivo de ter o contato com o projeto de pesquisa, desenvolver um bom levantamento bibliogrfico e efetuar a anlise crtica das informaes. Paralelamente o aluno mantm um bom Coeficiente de Rendimento em seu curso.

Sendo assim avalio como muito boa a participao do aluno neste projeto.

Profa. Dra. Christiane Bertachini Lombello Centro de Engenharia, Modelagem e Cincias Sociais Aplicadas (CECS) Universidade Federal do ABC

RESUMO

A polpa dentria tem sido estudada como fonte para clulas tronco, pela facilidade de obteno e pelas caractersticas que estas clulas apresentam. Diversos estudos demonstram que as clulas tronco isoladas a partir da polpa de dentes decduos, apresentam grande capacidade de diferenciao em clulas neurais, osteoblsticas, condroblsticas, adipcitos e micitos. A obteno e o processamento dos tecidos dentrios para o isolamento das clulas tronco so fundamentais para o cultivo destas e a proposio de aplicao clnica. Neste estudo foram analisados criticamente artigos cientficos a respeito da obteno, isolamento e caracterizao de clulas tronco obtidas a partir de dentes de leite, dentes decduos. Dentre as principais aplicaes clnicas citadas na literatura constam: reconstruo de defeitos craniofaciais, reconstruo do epitlio corneano, hepatcitos diferenciados a partir das clulas tronco do dente de leite, leso da coluna vertebral, modelos para o tratamento de epilepsia, e diferenciao em clulas neuroprogenitoras.

Palavras-chave: Clulas Tronco; Dente Decduo; Regenerao; Tcnicas de Cultura de Clulas.

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SUMRIO

I.

INTRODUO...........................................................................pg. 01 I.1. Clulas tronco....................................................................pg. 02 I.2. Plasticidade das clulas tronco.......................................pg. 06 I.3. Clulas tronco mesenquimais.........................................pg. 08 I.4. Clulas tronco obtidas de polpa de dente decduo.......pg. 12

II. OBJETIVOS E METAS..............................................................pg. 13 III. METODOLOGIA........................................................................pg. 13 IV. RESULTADOS E DISCUSSO.................................................pg. 14 IV.1. Obteno e processamento das clulas tronco...........pg. 14 IV.2. Aplicao clnica..............................................................pg. 19 V. CONCLUSES..........................................................................pg. 23 VI. BIBLIOGRAFIA..........................................................................pg. 24

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I. INTRODUO As clulas tronco tm sido motivo de intensa explorao cientfica e miditica nos ltimos anos. O motivo de tanto interesse o grande potencial de diferenciao destas clulas, ou seja, sua plasticidade. A terapia com clulas tronco passou a despertar grande interesse na comunidade cientfica uma vez constatada a capacidade que essas clulas indiferenciadas tm de preservar sua prpria populao e se diferenciar em clulas dos diversos tecidos. Encontrar a fonte de clulas tronco apropriada para uso teraputico depende de fatores como a sua capacidade de proliferao e estabilidade citogentica, e tambm de suas caractersticas fenotpicas e potencial de diferenciao. Os tecidos perdem progressivamente sua capacidade de funcionamento, causado por doenas ou pela senescncia celular. Outro fator que influncia a qualidade de vida so os traumas, decorrentes de acidentes, existindo assim uma grande demanda por procedimentos que eliminem ou diminuam as limitaes causadas por doenas, envelhecimento ou trauma. A soluo para este tipo de problema passa pelo transplante de rgos, que atende apenas a uma frao muito pequena da necessidade atual, por escassez de doadores, levando a incapacidade de certos rgos, ou tecidos, de serem transplantados. Tambm devem ser considerados os tratamentos com drogas

imunossupressoras diminuindo ainda a qualidade de vida do indivduo. Neste contexto, a terapia com clulas tronco se apresenta como uma fonte potencial para a regenerao de tecidos.
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Dentre as pesquisas que mais se desenvolveram nos ltimos anos, relacionadas terapia celular, as clulas tronco se destacam como as mais promissoras no tratamento e remisso de vrias patologias. Atualmente, diversas linhagens de clulas tronco, tm sido estudadas devido sua capacidade de diferenciao em clulas de vrios tecidos do organismo (fgado, pncreas, sistema nervoso central, rins, pulmes, pele, msculo esqueltico), e sua atuao como precursoras de recuperao tissular. I.1. Clulas tronco Por definio, as clulas tronco so clulas indiferenciadas capazes de se proliferar indefinidamente, gerando clulas filhas idnticas clula me. Mas ao mesmo tempo estas clulas podem ser induzidas a diferenciao e, neste caso, so responsveis por originar clulas especializadas como osteoblastos, condrcitos, clulas musculares, epidermais, neurais, entre outras (WATT e HOGAN, 2000; MOTA et al., 2005). As demais clulas presentes no organismo em geral sofrem processos proliferativos limitados, estando previamente comprometidas e um determinado ramo de diferenciao celular, tecido-especfica (MORRISON et al., 1997; WEISSMAN, 2000). No final do sculo XIX os primeiros experimentos com a finalidade de fertilizao in vitro podem ser considerados precursores dos estudos envolvendo clulas tronco humanas. Na tabela 1 so listados alguns dos principais avanos desta rea de pesquisa (LITTLE e STORB, 2002; SOLTER, 2006; FAIS et al., 2010).

Tabela 1: Eventos histricos relacionados a pesquisa de clulas tronco humanas (NCBI, 2006). Sculo Descrio dos estgios embrionrios pr-implantacionais e primeiras tentativas para fertilizar XIX vulos fora do corpo de mamferos (SCHENK, 1878). Primeiro animal, um coelho, gerado por fertilizao in vitro (CHANG, 1959). 1959 1964 Experimentos, com teatocarcinomas e sensibilidade a radiao da medula ssea, verificaram a existncia de clulas na medula ssea identificadas como clulas tronco (KLEINSMITH e PIERCE, 1964; TILL et al., 1964). Primeiro vulo humano fertilizado in vitro (EDWARDS et al., 1969). 1968 1980 Clulas tronco embrionrias cultivadas so exploradas como modelos de desenvolvimento embrionrio em camundongos, incluindo quimeras, apesar de anormalidades cromossnicas terem sido constatadas (MARTIN, 1980). 1978 Primeiro beb de proveta nasce na Inglaterra, Louise Brown (STEPTOE e EDWARDS,1978). 1981 Isolamento de clulas tronco a partir de blastocistos de camundongos (EVANS e KAUFMAN,1981) 1984 Identificadas a capacidade de diferenciao de clulas pluripotentes, previamente clonadas a partir de teratocarcinoma testicular humano, em neurnios e outros tipos celulares (THOMPSON et al., 1984; ANDREWS, 1988). 1989 Linhagem de clulas de carcinoma embrionrio humano, com capacidade de diferenciar em clulas dos 3 folhetos germinativos, so clulas aneuplides e com potencial de diferenciao in vitro limitado ( PERA et al., 1989). Blastocistos humanos so obtidos a partir da massa celular interna de embries fertilizados in vitro 1994 e mantidos em cultura por duas passagens, com caritipo normal (BONGSO et al., 1994a; 1994b). Clulas tronco embrionrias de primatas so mantidas in vitro, com caritipo normal e semelhana 1995 com clulas tronco embrionrias humanas (THOMSON et al., 1995; 1996). Clulas de blastocistos humanos so cultivadas in vitro por at 20 passagens, com caritipo 1998 normal, pluripotentes (SHAMBLOTT et al., 1998; THOMSON et al., 1998). 2000 Cientistas utilizam clulas tronco embrionrias humanas a partir da massa celular interna de blastocistos em estudos de proliferao e diferenciao celular (BONGSO, 1999; TROUNSON e GARDNER, 1999; PERA, et al., 2000). 2001 criado o INCA. O primeiro banco pblico de CT de cordo umbilical no Brasil. 2005 aprovada no Brasil a Lei de Biossegurana 11.105/2005 que permite o inicio da pesquisa utilizando CT do embrio humano. 2006 Clulas tronco adultas pluirpotentes induzidas (IPSCs) so descritas (TAKAHASHI e YAMANAKA, 2006). 2007 2012 Clulas somticas so reprogramadas para o estado de clulas tronco embrionrias pluripotentes, as clulas tronco pluripotentes induzidas (IPSC) (TAKAHASHI e YAMANAKA, 2006). Cientistas brasileiros conseguem alta taxa de proliferao de clulas tronco do deite de leite (LIZIER et al., 2012).

As clulas tronco esto presentes tanto no embrio quanto em adultos. So encontradas na massa celular interna do blastocisto, os blastocistos, em alguns tecidos do feto, como o cordo umbilical e placenta, e em tecidos jovens, como no dente decduo, alm de vrios outros tecidos do organismo
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adulto (LEMISCHKA, 2005). As clulas tronco seguem dois modelos bsicos de diviso: o determinstico, pelo qual a diviso celular de uma clula tronco gera uma nova clula tronco e tambm uma clula diferenciada; e o aleatrio ou estocstico, pelo qual as clulas tronco podem gerar apenas novas clulas tronco e ou tambm clulas com potencial para sofrer diferenciao (SANTOS et al., 2004). Dependendo de onde se originam estas apresentam propriedades distintas. Podem ser identificados trs tipos de clulas tronco, dependendo de sua origem: embrionrias, germinativas embrionrias e adultas (WAGERS e WEISSMAN, 2004). As clulas tronco embrionrias so obtidas no estgio inicial do embrio, O vulo fecundado por um espermatozoide (zigoto), a primeira fase embrionria. O zigoto comea a se dividir cerca de 30 horas aps a fecundao, e por volta do terceiro dia o embrio uma massa compacta de 12 ou mais clulas, caracterizando o estgio de mrula (Figura 1a). Cinco a seis dias aps fertilizao, e depois de vrios ciclos de diviso celular, formada o blastocisto. A camada externa do blastocisto chamada de trofoblasto, e internamente encontrado um aglomerado celular, a massa celular interna, formada por blastocistos (Figura 1b). Nesta fase, h cerca de 70 clulas trofoblsticas e cerca de 30 clulas na massa celular interna. As clulas da massa celular interna so as clulas tronco (THOMSON et al. 1998), capazes de originar clulas dos trs folhetos embrionrios (ectoderme, mesoderme e endoderme), e anexos embrionrios, sendo denominadas clulas pluripotentes (ODORICO, 2001; SMITH, 2001) (Figura 1c).

Figura 1: Etapas do desenvolvimento embrionrio. a.mrula; b.blastocisto; c.trs folhetos embionrios (adaptado de: www.lance-ufrj.org/ceacutelulastronco.html).

No final do desenvolvimento embrionrio fetal a regio conhecida como crista gonadal, que acabaria por se tornar os rgos sexuais, fonte de um tipo particular de clulas embrionrias, as clulas germinativas embrionrias. Estas clulas compartilham algumas caractersticas das clulas tronco embrionrias, e podem originar clulas dos trs folhetos embrionrios, mas so consideradas como multipotentes uma vez que no originam anexos embrionrios (WAGERS e WEISSMAN, 2004). No organismo jovem e adulto tambm podem ser identificadas clulas tronco. Em geral esto presentes em tecidos com alta taxa de renovao, como por exemplo a medula ssea, responsvel pela reposio das clulas do sistema hematopoitico, como as hemceas, cuja vida mdia de aproximadamente 120 dias (VERFAILLIE, 2002; KRAUSE, 2002). Atualmente so bem caracterizadas as clulas tronco obtidas a partir de medula ssea, tecido adiposo, tecido muscular, tecido neural, crnea, retina, fgado, pncreas,
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entre outros. A plasticidade destas clulas em geral limitada, se comparada s clulas tronco embrionrias, tm a capacidade de se diferenciar em clulas do tecido no qual se localizam ou mesmo tecidos da mesma origem embrionria (algumas poucas clulas tronco apresentam esta caracterstica). Estas clulas so consideradas multipotentes ou at mesmo unipotentes, dependendo do tipo de clula tronco (GAMRADT e LIEBERMAN, 2004). As clulas tronco pluripotentes induzidas (iPSC) constituem a mais recente descoberta na rea de clulas tronco. Estas clulas so clulas somticas, induzidas a se comportarem como clulas tronco, pela

reprogramao gnica, ativando genes como Oct-4, Sox2, c-Myc e Klf4 (TAKAHASHI e YAMANAKA, 2006). So consideradas importantes fontes de clulas tronco autlogas para tratamentos clnicos e apresentam alta capacidade proliferativa, plasticidade, morfologia, alm de estados genmico e epigenmico, condizentes com as clulas tronco embrionrias (AMABILE e MEISSNER, 2009).

I.2. Plasticidade das clulas tronco As clulas tronco podem tambm ser classificadas de acordo com seu grau de plasticidade, ou versatilidade para diferenciao, conforme citado anteriormente (LOEFFLER e ROEDER, 2002). Podem ser classificadas como totipotentes, pluripotentes, multipotentes e unipotentes (VERFAILLIE, 2002).

As clulas tronco totipotentes apresentam a maior plasticidade. O zigoto totipotente, ou seja, capaz de diferenciar nos tres folhetos que formam o corpo humano, incluindo placenta e anexos embrionrios. As clulas totipotentes so encontradas nos embries nas primeiras fases de diviso, isto , quando o embrio tem entre 16 e 32 clulas, que corresponde a 3 ou 5 dias de vida (GAGE, 2000; ROBEY, 2000). As clulas obtidas da massa interna do blastocisto, formado no 5 dia do desenvolvimento embrionrio, so consideradas pluripotentes, pois podem dar origem a todos os tipos de tecidos humanos, excluindo a placenta e anexos embrionrios (ROBEY, 2000). A plasticidade ainda suficiente para a obteno de qualquer tipo celular presente no organismo, e devido disponibilidade de blastocistos resultantes de tcnicas de fertilizao in vitro e diagnstico primplantacional, a utilizao destas clulas em protocolos experimentais e clnicos uma realidade (ODORICO et al., 2001; SOLTER, 2006). As clulas multipotentes e unipotentes apresentam plasticidade mais limitada, originam clulas em um determinado tipo de tecido, e no caso das unipotentes apenas um tipo celular. As clulas tronco hematopoiticas multipotentes da medula ssea, presentes em organismos adultos, podem se desenvolver em hemceas, glbulos brancos ou plaquetas (KRAUSE, 2002). Estas clulas tronco hematopoiticas adultas tem como funo a renovao celular e tecidual, para a reposio de clulas que morreram ou perderam a funo. , portanto, uma clula indiferenciada presente no tecido adulto diferenciado (CLARKE et al., 2000).
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As clulas tronco adultas, multi e unipotentes, j foram identificadas nos tecidos neural, muscular, endotelial, mesenquimal, gastrointestinal e clulas da epiderme. Na medula ssea, alm das clulas tronco hematopoiticas citadas, so encontradas clulas tronco mesenquimais, correspondendo a 0,01% a 0,0001% das clulas nucleadas. Estas clulas tem potencialidade para formar clulas sseas, cartilaginosas, musculares de tendo, ligamentos, adipcitos entre outros (PITTENGER et al., 1999; MINGUELL et al., 2000; MEIRELLES et al., 2006; CAPLAN, 2009; BYDLOWSKI et al., 2009). Apesar dos avanos nas pesquisas com clulas tronco nas ltimas dcadas, podem ser citados dois fatores fundamentais a serem elucidados para a utilizao clnica de clulas tronco adultas: quais as fontes ideais para obteno das clulas; e como ocorre a induo e o controle da diferenciao.

I.3. Clulas tronco mesenquimais O interesse pelo uso clnico das clulas tronco mesenquimais, em virtude de seu potencial teraputico, e tomando por base a quantidade de equipes de pesquisa que estudam estas clulas nos ltimos anos, gerou muitas dvidas quanto sua nomenclatura e identificao (HORWITZ et al., 2005). A Sociedade Internacional de Terapia Celular (ISCT), em relatrio de 2005, atravs do Comit de Clulas Tronco do Tecido Mesenquimal, props um conjunto de normas para definir clulas tronco mesenquimais humanas (HORWITZ et al., 2005). Estas normas tem o objetivo de proporcionar
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comunidade cientfica um padro de critrios, com base nos melhores dados disponveis atualmente, e reconhece que as investigaes futuras

provavelmente vo proporcionar uma reviso destes, a medida que novos dados surgirem. Portanto, os trs critrios para definir as clulas tronco mesenquimais so: a. Aderncia ao plstico. As clulas tronco mesenquimais, isoladas de uma populao de clulas mononucleares, apresenta aderncia seletiva em cultura, superfcie do plstico (poliestireno). Uma desvantagem deste mtodo a possvel contaminao por clulas hematopoiticas. Aderncia ao plstico propriedade bem descrita de clulas tronco

mesenquimais. b. Caracterizao das clulas tronco mesenquimais. H um consenso geral que clulas tronco mesenquimais humanas de medula ssea no expressam os marcadores hematopoiticos como CD45 (marcador de todas as clulas hematopoiticas), CD34 (um marcador de clula tronco hematopoitica primitiva, raramente expressa em clulas tronco mesenquimais humanas, apesar de ser positiva em camundongos), e CD14 (marcador de moncito). Tambm no devem ser expressos o CD11b (um marcador de clula imune) e glicoforina-A (marcador de linhagem eritride). O CD117 (clula tronco progenitora hematopoitica) est quase sempre
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ausente de clulas tronco mesenquimais humanas. No expressam as molculas co-estimulatrias, tais como CD80, CD86, e CD40, ou as molculas de adeso CD31 (PECAM-1, expresso em clulas endoteliais e hematopoiticas), CD18 (LCAMB), CD58 (NCAM-1). Expressam nveis variveis de CD105 (endoglina), CD73 (ecto-5nucleotidase), CD44, CD90 (Thy-1), CD71 (receptor de transferrina), gangliosdeo GD2, e CD271 (receptor do fator de crescimento nervoso de baixa afinidade), que so reconhecidos pelo anticorpo monoclonal Stro-1, assim como as molculas de adeso CD106 (VCAM-1), ALCAM, ICAM-1 E CD29. c. Plasticidade. As clulas tronco mesenquimais so caracterizadas por serem clulas tronco multipotentes, que tem duas propriedades nicas. A primeira sua capacidade de auto-renovao para alm do limite de Hayflick (as clulas se dividem por apenas 50 ou 60 geraes antes de seus telmeros fiquem muito curtos para dar a proteo aos cromossomos, chegando a um limite mnimo de tamanho, a partir da as divises celulares param e tem inicio o envelhecimento), uma propriedade compartilhada por clulas tronco embrionrias (YOUNG et al.,2001). A segunda a capacidade de se diferenciar em clulas mesenquimais e no mesenquimais, tais como osso, gordura, cartilagem (PEREIRA et al., 1995) e em clulas neurais

(PITTENGER et al., 1999; SANCHEZ-RAMOS et al., 2000;

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MEIRELLES et al, 2006; MONTEIRO, 2009). Estas caractersticas sugerem que, a utilizao das clulas tronco mesenquimais em terapias celulares seja das mais promissoras, ampliando as possibilidades de utilizao clinica e tratamento (CANO, 2006; BYDLOWSKI et al., 2009; LIU e VELAZQUEZ, 2009). Permanece um mistrio para a comunidade cientfica o mecanismo de regulao gnica que determina no embrio que uma clula tronco pluripotente se diferencie em determinado tecido especfico, como heptico, sseo, hematolgico, etc. Porm, sob condies controladas artificialmente (em laboratrio), existem suplementos que atuam como fatores de diferenciao e, quando colocados em cultura de clulas tronco, determinam sua diferenciao em diversos tecidos. Estudos ainda em andamento averiguam as

conseqncias do contato direto das clulas tronco com um tecido j diferenciado, trabalhando com a hiptese do desenvolvimento da mesma expresso gnica do tecido onde foram alocadas (GBT, 2000; IOMSA, 2002). A fonte mais estudada de clulas tronco mesenquimais a medula ssea, onde esto localizadas tanto as clulas tronco mesenquimais quanto as hematopoiticas. Desde 1950, o uso clnico da medula ssea com finalidade de recuperao do sistema hematolgico e imunolgico vem demonstrando que a ocorrncia de regenerao de tecidos no hematolgicos ocorre devido presena da linhagem mesenquimal. Uma analise dos resultados obtidos pelo uso clinico da medula ssea trat base terica do potencial dessa clula vindo de outras fontes (PEREIRA, 2008). Obviamente possvel que algumas
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peculiaridades biolgicas possam existir no potencial clnico vindo de diferentes fontes, mas isso somente ser respondido no transcorrer das pesquisas futuras.

I.4. Clulas tronco obtidas de polpa de dente decduo A polpa dentria tem sido estudada como fonte para clulas tronco. So derivadas de um tecido muito acessvel e tambm so capazes de fornecer clulas suficientes para uma potencial aplicao clnica (MIURA et al., 2003). Os dentes permanentes, removidos por razes especficas, tambm so fontes de clulas tronco (GRONTHOS et al., 2000; GRONTHOS et al., 2002). Uma das aparentes vantagens das clulas obtidas a partir de polpa de dentes decduos, em relao aos dentes permanentes, a maior capacidade de proliferao celular, e provavelmente constitui uma populao celular mais imatura, mesmo se tratando de clulas tronco, permitindo um maior potencial de diferenciao. Alguns autores citam a capacidade de diferenciao de clulas tronco obtidas a partir de polpa de dentes decduos em clulas neurais, osteoblsticas, condroblsticas, adipcitos e micitos (MIURA et al., 2003; WANG et al., 2010; ESTRELA et al., 2011; RODRGUEZ-LOZANO et al., 2011; SUCHNEK et al., 2011). Este trabalho prope a analise das publicaes cientficas sobre o isolamento, cultivo, caracterizao e aplicao clnica das clulas tronco obtidas a partir de polpa de dentes decduos.
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II. OBJETIVOS e METAS O objetivo do presente estudo o levantamento sistemtico de informaes sobre clulas tronco isoladas a partir de dentes decduos, bem como o uso experimental e/ou clnico destas clulas para terapia celular e engenharia de tecidos. Com os dados obtidos ser possvel avaliar o potencial de uso das clulas tronco isoladas de dentes decduos e delinear um protocolo para isolamento, caracterizao e diferenciao celular, a ser desenvolvido em continuidade ao presente projeto.

III. METODOLOGIA A reviso sistemtica de literatura deve ser realizada em sete etapas distintas (ATALLAH e CASTRO, 1998; CASTRO, 2001). A primeira etapa corresponde formulao do questionamento para definir o tema da reviso bibliogrfica. As demais etapas referem-se a: localizao e seleo de artigos publicados; avaliao crtica das publicaes; coleta de dados; apresentao dos dados; interpretao dos resultados; aprimoramento da reviso.

III.1. Localizao e seleo de artigos publicados Foram identificados artigos cientficos publicados nas bases de dados Pubmed e Scielo, relevantes para o isolamento e a caracterizao de clulas tronco a partir de dentes decduos, neste primeiro momento da pesquisa. Como

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palavras-chave para a busca em questo foram utilizadas: dentes decduos (ingls: deciduous teeth) e clulas tronco (ingls: stem cells).

III.2. Avaliao crtica das publicaes e coleta de dados Os artigos cientficos obtidos com o levantamento bibliogrfico foram analisados criticamente para sua incluso ou no nesta reviso sistemtica, sendo excludos apenas os artigos que no fazem referncia ao tema.

IV. RESULTADOS e DISCUSSO IV.1. Obteno e processamento das clulas tronco O levantamento bibliogrfico na base de dados pubmed utilizando as palavras-chave deciduous teeth e stem cells, como constantes dos ttulos ou resumos de artigos publicados em ingls, at o ms de maro de 2012. Foi possvel obter 55 referncias bibliogrficas, entre artigos inditos e revises bibliogrficas, estas ltimas correspondem a 10 artigos. A mesma busca realizada no banco de dados scielo (com os termos em ingls) resultou em 3 artigos publicados at o presente momento. A partir deste levantamento foram selecionados primeiramente artigos que abordam especificamente a obteno e caracterizao das clulas tronco a partir de dentes decduos. As informaes relativas obteno, isolamento e caracterizao de clulas tronco de dentes decduos, ou seja, de dentes de leite, objeto principal deste estudo, esto transcritas a seguir. Os dentes decduos devem ser coletados a partir de um centro odontolgico, onde cirurgies dentistas se responsabilizam pela remoo deste
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dente preservando o tecido mole. Todo o procedimento de coleta do dente decduo deve estar de acordo com a legislao vigente de Pesquisa Clnica (Resoluo MS 196/1996). A presena de polpa vermelha, indicando fluxo sanguneo at o momento da remoo, favorece a viabilidade das clulas presentes. A presena de polpa acinzentada nos dentes decduos indicativa que o fluxo sanguneo para a polpa possa ter sido comprometido, provocando morte celular e, portanto, inviabilidade do tecido para a obteno de clulas tronco. Dentes com grande mobilidade e propenso a cair tem grande probabilidade de apresentar comprometimento do fluxo sanguneo da polpa, e correspondente probabilidade de comprometimento da viabilidade celular. Devem ser excludos dentes que apresentam abscessos apicais, tumores ou cistos tambm, evitando o comprometimento das linhagens celulares presentes (ARORA et al., 2009). A coleta deve envolver condies de assepsia adequadas para minimizar a contaminao do tecido obtido. O transporte do dente deve ser realizado em frascos estreis, de preferncia em ambientes refrigerados at o momento do processamento. Como meio de coleta e armazenamento podem ser utilizadas solues que visem preservao do tecido da polpa dentria, tais como: HypoThermosol (HTS; BioLife Solutions, Bothell, WA), MesenCult meio basal (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canad), meio salino tamponado com fosfato (PBS; Sigma Chemical, St. Louis, MO), soluo salina balanceada de Hank (HBSS, invitrogen, USA) (KERKIS et al., 2006; PERRY et al., 2008; SEO et al., 2008; SUCHNEK et al., 2010). Pode ainda ser
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adicionada soluo antibitica, por exemplo, 100U/ml penicilina e 100 g/ml de estreptomicina, para minimizar o risco de contaminao do tecido coletado (KERKIS et al., 2008; SUCHNEK et al., 2010). As etapas de processamento descritas a seguir forma baseadas principalmente em 5 referencias bibliogrficas, sendo elas: Miura et al. (2003), Kerkis et al. (2006), Seo et al. (2008), Arora et al. (2009), Suchnek et al. (2010). Algumas informaes relativas ao uso de dentes, mesmo que no decduos, foram adaptadas da publicao de Perry et al (2008). Os dentes de leite podem ser submetidos a processo de desinfeco com lavagem em soluo fosfato tamponada, essencialmente a soluo de transporte e armazenamento do tecido recm-coletado, contendo soluo antibitica. A lavagem deve ser realizada algumas vezes, podendo ser substituda por uma ltima lavagem em meio sem antibitico (KERKIS et al., 2009). A lavagem do tecido tambm pode ser realizada em 1% de povidoneiodine (PVP-I) durante 2 minutos e imerso em tiossulfato de sdio a 0,1% em PBS durante 1 minuto, lavagem final em PBS estril (PERRY et al., 2008). As razes dos dentes devem ser separadas a partir da coroa para revelar a polpa dentria, sendo utilizado forceps ou escavador dental. A polpa dentria deve ser colocada em placa de petri estril. Existe a opo de obter clulas da polpa dentria por digesto enzimtica (MIURA et al., 2003; SEO et al., 2008; ARORA et al., 2009; SUCHNEK et al., 2010), ou por explante (KERKIS et al. 2006). Neste trabalho citaremos a obteno de clulas por digesto enzimtica.

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O tecido ento digerido com colagenase tipo I (3mg/ml) e dispase (4mg/ml) por 30 minutos a 1 hora, a 37 C (SEO et al.,2008; MIURA et al., 2003). Tambm pode ser usado colagenases I e II, e termolisina como protease neutra, durante 40 minutos (PERRY et al, 2008). Uma vez que a digesto seja finalizada, adicionado um meio de cultura para neutralizar a ao enzimtica, como o Meio Mnimo de Eagle (MEM), com 15% de Soro Fetal Bovino (SFB) (KERKIS et al., 2006; SEO et al., 2008). Posteriormente a digesto enzimtica as clulas podem ser obtidas com centrifugao a 600 g (2.000 rpm, durante 5 minutos), e o pellet celular pode ser filtrado, em filtro de 70 m, para se obter suspenses de clulas isoladas (SUCHNEK et al., 2010). As clulas obtidas devem ser cultivadas em um Meio Mnimo de Eagle (MEM), suplementado com 15% de Soro Fetal Bovino (SFB), 0,1 M de cido ascrbico 2-fosfato, 100U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina, e incubadas a 37 C e 5% de CO2 (SEO et al., 2008). As clulas recm isoladas devem ser contadas em Cmara de Neubauer com soluo de 0,2% de Azul de Tripan, para a da viabilidade celular. As clulas devem ser observadas aderidas placa de cultura aps 24h, e o meio de cultura trocado para a eliminao das clulas no aderentes (SEO et al., 2008; ARORA et al., 2009). As culturas devem ser monitoradas diariamente, para verificar a presena de contaminao, e em caso de contaminao positiva as culturas devem ser imediatamente descartadas. As clulas no contaminadas, mas no aderentes placa de cultura devem ser removidas com o meio, sendo realizada a substituio do meio nos primeiros dias de cultura (PERRY et al.,
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2008; SUCHNEK et al., 2010). As clulas obtidas pelo este processo so dependentes de ancoragem e devem se apresentar como pequenas colnias inicialmente, chegando a colnias de 50 clulas entre 5 e 7 dias de cultura, quando deve ser feita a passagem, ou repique, das clulas, com 0.25% tripsina
/ 1mM EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), (PERRY et al., 2008; SUCHNEK et

al., 2010). A manuteno das culturas permite o monitoramento do crescimento celular. Deve ser efetuada a troca de meio de cultura (descrito acima) trs vezes por semana (PERRY et al., 2008). As passagens seguintes devem ser efetuadas com 70% da confluncia da monocamada, em mdia a cada 98,7 hs (SUCHNEK et al., 2010). Com a manuteno das clulas em cultura deve ser obtido o tempo de duplicao celular de aproximadamente 41,3 hs (21.397.3 hrs) (SUCHNEK et al., 2010). As clulas apresentam morfologia arredondada com processos celulares inicialmente, com as passagens subsequentes adquirem morfologia mais espalhada, como fibroblasto (SUCHNEK et al., 2010). Diferentes linhagens celulares podem ser obtidas atravs de mudanas no meio de cultivo celular. Se as culturas forem obtidas com preparao no selecionada, colnias de clulas com morfologia semelhante s clulas epiteliais ou endoteliais podem se estabelecer. Geralmente estas clulas desaparecem durante o curso de sucessivas passagens celulares. Se a contaminao com estas clulas for excessiva, a cultura pode ser submetida a tripsina por um curto perodo, para que somente as clulas de interesse sejam

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isoladas uma vez que as clulas endoteliais ou epiteliais aderem mais firmemente placa de cultura. A caracterizao das clulas cultivadas, como sendo clulas tronco, deve envolver marcadores moleculares especficos. Uma caracterizao bastante completa de marcadores foi realizada por SUCHNEK et al. (2010). Foi identificada a presena fortemente positiva de CD44 (91.7 %), CD73 (82.3 %), CD90 (96.5 %), CD117 (96.2 %), CD166 (74.3 %) e HLA I (88.3 %); a presena moderada de CD29 (67.0 %), CD105 (49.1 %) e a presena mesmo que fraca de CD45 (13.2 %), CD63 (35.1 %) e CD71 (36.6 %). As clulas foram negativas para CD18 (0.1 %), CD31 (0.0 %), CD34 (0.1 %), CD49d (0.5 %), CD49e (3.5 %), CD106 (0.0 %), CD133 (3.9 %), CD146 (1.7 %), CD184 (1.3 %), CD197 (0.2 %) e HLA II (0.4 %). Os resultados so condizentes com o trabalho de Perry et al. (2008) que ainda citou como negativos os marcadores CD11b e CD19.

IV.2. Aplicao clnica O levantamento bibliogrfico resultou em algumas poucas publicaes, apresentando principalmente a potencialidade de aplicao clnica ou o resultado de protocolos experimentais, envolvendo modelos animais. No foi observado um protocolo de aplicao clnica em humanos com dados conclusivos. Esta realidade condizente com os dados apresentados tambm para clulas tronco mesemquimais de forma geral (SUMMER e FINE, 2008).

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Como citado anteriormente, a facilidade de obteno de dentes decduos, e o isolamento e cultivo das clulas tronco obtidas a partir destes so fatores que favorecem a aplicao clnica deste tipo celular. Os primeiros estudos realizados com clulas tronco do dente decduo visavam a reconstruo de defeitos craniofaciais. Mendona Costa e colaboradores (2008), em estudo realizado com roedores, concluiram que as clulas tronco de dentes decduos constituem um modelo promissor para a reconstruo de defeitos cranianos em cirurgias craniofaciais, demonstrando ainda que elas podem se diferenciar eficientemente em adipcitos e clulas musculares esquelticas, o que, junto com a formao do osso, so elementos essenciais para a reconstruo de tecidos neste tipo de aplicao. Em estudo pr-clinico sobre a recuperao ssea de defeitos orofaciais foi comprovada a eficcia na utilizao de clulas tronco do dente decduo, indicando ainda que a passagem dos ensaios experimentais para ensaios com humanos seja rpida (BHATT e LE, 2009; ZHENG et al., 2009; HYNES et al., 2012; ZHU et al., 2012). Paralelamente diversos estudos prope a utilizao de clulas tronco mesenquimais em ortopedia, clulas obtidas de outras fontes, como a medula ssea. O tratamento de osteoporose e das leses decorrentes desta um importante potencial de aplicao clnica para as clulas obtidas para dente de leite, uma vez que se conhece o potencial de diferenciao osteogncia destas. (CANCEDDA et al., 2003; BYDLOWSKI et al., 2009). O transplante de tecidos produzidos a partir de clulas tronco da polpa do dente decduo para a reconstruo do epitlio corneano tambm se mostrou
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promissor, o que representa uma alternativa vlida para a reconstruo da superfcie ocular em casos de deficincia lmbica bilateral com importantes implicaes clnicas, na rea de oftalmologia (GOMES et al., 2010). Hepatcitos (clulas encontradas no fgado capazes de sintetizar protenas) foram induzidos a partir das clulas tronco do dente decduo, e foi verificada que alm destas produzirem uria, uma quantidade significativa de glicognio foi encontrado armazenado, indicando que estas clulas tronco adquiriram caractersticas morfolgicas e funcionais dos hepatcitos sob condies especficas de cultura. Este estudo prope a aplicao clnica de destas clulas para o reparo de leses hepticas (ISHKITIEV et al., 2010). Os dados obtidos no trabalho de Freitas (2011) demonstram que o transplante de clulas tronco da polpa de dente, apresentam potencial teraputico em modelo experimental de epilepsia uma vez que o transplante foi capaz de reduzir a manifestao das crises espontneas recorrentes em animais com epilepsia induzida. Ainda na rea de neurologia o potencial de reparo e regenerao do tecido nervoso para as clulas tronco do dente de leite apresentam dados interessantes em casos de isquemia cerebral. A migrao e diferenciao em clulas neuronais progenitoras, vasculognese induzida, e melhora em danos cerebrais isqumicos foram observados aps ocluso permanente da artria cerebral mdia, com transplante das clulas tronco de polpa de dente em estudo experimental em ratos (INOUE et al., 2011). Alm de patologias e doenas degenerativas, o uso de clulas tronco de dente decduo foi estudado em casos de traumas que resultam em leso aguda
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de medula espinhal. Foi identificada uma significativa recuperao funcional em ratos com esta leso, demonstrando que o transplante de clulas tronco do dente decduo pode ser um candidato adequado para o tratamento deste tipo de trauma, bem como doenas degenerativas neuronais (TAGHIPOUR et al., 2011). Outras reas em que se conhecem promissores resultados

experimentais com a utilizao de clulas tronco mesenquimais poderiam ter protocolos clnicos envolvendo clulas obtidas a partir de dentes decduos, uma vez que as caractersticas e a plasticidade destas duas populaes celulares em muito se assemelham (BYDLOWSKI et al., 2009). Estas reas incluem, entre outras: cardiologia, para diversas cardiopatias incluindo infarto do miocrdio, doena de Chagas, e outras miocardiopatias; endocrinologia, para o tratamento da diabetes, substituindo a funo das ilhotas pancreticas; em urologia e nefrologia, para a substituio de clulas epiteliais dos tbulos renais cuja disfuno resulta em insuficincia renal aguda; dermatologia, para o tratamento de queimaduras e feridas de difcil cicatrizao, como no p diabtico; oncologia, para o reparo de tecidos acometidos por cncer, principalmente de origem hematolgica (BARRY e MURPHY, 2004;

BYDLOWSKI et al., 2009; ESTRELA et al., 2011).

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V. CONCLUSES A presena sabida de clulas da linhagem mesenquimal na polpa do dente decduo, aliada a facilidade de sua obteno em comparao a outras fontes da linhagem mesenquimal, implica em que esta fonte de clulas mesenquimais seja uma estratgia interessante no tratamento de futuras doenas crnico-degenerativas. Alm disso, as pesquisas demonstram sua alta capacidade de proliferao e plasticidade como citado anteriormente. Alguns exemplos expressivos do uso teraputico que as clulas tronco mesenquimais de medula relatados recentemente abordam um amplo espectro de indicaes, incluindo a reparao cardiovascular, tratamento de fibrose pulmonar, leso da medula espinhal, osso e reparao da cartilagem. Apesar dos estudos j efetuados quanto utilizao, coleta,

identificao, cultura e criopreservao de clulas tronco do dente decduo, os aspectos prticos quanto obteno destes tecidos, tais como: o tempo limite decorrido a partir da extrao do dente para sua utilizao; as condies em que o dente deve ser armazenado antes do processamento; o melhor processo para a separao e cultura das clulas, so de fundamental importncia em virtude do potencial que estas clulas tm para aplicao em tratamentos. Descritas as tcnicas disponveis at a presente data, propor as bases para o desenvolvimento de uma nova metodologia que agregue os melhores mtodos at agora descritos, principalmente os limites entre a obteno do dente decduo e seu processamento, conseqncia lgica deste trabalho.

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Elegemos as metodologias propostas por Lizier e colaboradores (2012) como sendo a mais adequada para utilizao, visando primeiramente a proliferao de clulas tronco de dentes decduos, para a obteno de um banco celular, e posteriormente trabalhando com a diferenciao destas clulas armazenadas em banco.

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