Isolamento e Seleo de Microrganismos Produtores de Lipases a partir do Soro de Queijo

Dayane Fortes Dartora1; Diogo Henrique Hendges1; Naiane Sanagaletti1; Tatiane L. Cadorin1; Severino Matias de Alencar2 e Sideney Becker Onofre2
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Laboratrio de Qualidade Agroindustrial - Bolsistas PIBIC/CNPq - CEFET-PR Unidade de Pato Branco. Laboratrio de Qualidade Agroindustrial - CEFET-PR Unidade de Pato Branco 85503-390 Pato Branco PR E-mail: becker@pb.cefetpr.com.br.

RESUMO A presena de cidos graxos livres podem estar associados ao sabor amargo em leos vegetais, cereais, leite, nata e ovos e se deve a ao freqente das lpases. A atividade das lpases podem ter uma grande importncia quando utilizados na produo de queijos tipo azul e italiano, para torn-los mais picantes. Visando selecionar microrganismos produtores de enzimas extracelulares do tipo lipases que este trabalho foi desenvolvido. Para o isolamento dos microrganismos utilizou-se meio de cultura lquido a base de soro de queijo. Aps incubao a 30oC por 48 horas os microrganismos foram isolados. Foi avaliado a atividade lipoltica em 7 linhagens de leveduras, 2 fungos filamentosos e 3 bactrias e determinado os ndices enzimticos (IE). Os resultados obtidos evidenciaram que 3 linhagens de leveduras, 2 cepas de bactria e 2 fungos filamentosos so produtores de lpases. INTRODUO A utilizao de microrganismos para a gerao de produtos de interesse comercial tem recebido crescente ateno por parte da indstria de alimentos. Produtos qumicos, agrcolas e alimentos produzidos por biossntese, devem movimentar um mercado de cerca de US$ 17 bilhes na prxima dcada (Toledo & Batalha 1994). Existe ainda um aumento do consumo de produtos produzidos pr bioengenharia, somado alterao das preferncias dos consumidores relacionadas a preo, nutrio, convenincia, e inovao tecnolgica de produtos alimentcios. Dentro desse quadro a produo de extratos de leveduras para uso como realador de sabor em alimentos uma possibilidade extremamente recente no Brasil, o produto vem sendo fabricado por algumas indstrias a nvel experimental ou industrial, revelando um grande potencial econmico (Agronegcio Brasileiro 1998). A utilizao de soro de queijo produzido pela indstria de laticnios representa uma importante fonte de matria-prima barata para a produo de enzimas, j que este produto muitas vezes descartado, gerando um efluente de grande potencial poluente (Ben-Hassan & Ghaly 1994). Dentre as enzimas com potencial de produo utilizando-se do soro do queijo como substrato, podemos destacar as lipases. Em leite a lipase nativa uma lipoproteina (EC 3.1.1.34) absorvida pelas micelas da casena, que se ativa por esfriamento ou no processo de homogeneizao. Esta liplise induzida pode provocar a perda de grandes quantidades de leite de vaca e alteraes no paladar humano, tendo em vista a nossa sensibilidade aos cidos graxos volteis de cadeia curta e mdia, provocando sabor amargo. A atividade das lipases podem ter uma grande importncia quando utilizados na produo de queijos tipo azul e italiano, para torn-los mais picantes (Adda et al. 1982).

Estudando a composio bruta e mineral, assim como o processo de degradao durante a maturao de queijos, Law & Sharpe (1977) avaliaram que houve uma profunda protelise durante esta etapa e conseqentemente altos nveis de aminocidos livres foram observados, sendo que no final desta, principalmente valina, leucina, lisina, fenilalanina e cido glutmico foram detectados. Os queijos tambm apresentaram liplise intensa durante o amadurecimento, sendo a cido olico o cido graxo livre mais abundante, seguido pelos cidos palmtico e mirstico. 2cetobutrico (a-ceto cido) e aldedos de cadeia ramificada de aminocidos. A obteno do metanetiol, assim como de compostos volteis sulfurosos de extrema importncia para o desenvolvimento do aroma natural de queijo. Identificando os compostos volteis caractersticos do queijo denominado Roncal, em diferentes perodos de lactao, Rank et al. (1985) encontraram hidrocarbonos, cidos graxos, steres, compostos sulfurosos e carbonlicos e especialmente lcoois. Os compostos extrados foram semelhantes em todas as estaes, mas foram identificados em concentraes diferentes, o que permite a partir deste estudo, que os queijos possam ser classificados tomandose como base s estaes em que foram produzidos. Os autores ainda acrescentam que cidos graxos livres formados durante a etapa de maturao so os precursores de metilcetonas, cetonas, steres aromticos e alifticos, os quais fornecem o aroma caracterstico aos diversos tipos de queijos, como j mencionado anteriormente por outros autores. A biotecnologia moderna representa uma possibilidade de produo de enzimas especficas para certas reas de aplicao. Muitos outros problemas tambm devem ser resolvidos antes que se penetre no mercado potencial de enzimas. Neste contexto que o objetivo deste trabalho foi selecionar microrganismos produtores de enzimas extracelulares do tipo lipase com potencial de utilizao na produo de queijos com caractersticas especiais, favorecendo assim o mercado deste produto, bem como minimizando o impacto ambiental gerado por esse subproduto que o soro de queijo. MATERIAL E MTODOS Local de realizao: o isolamento foi realizado no Laboratrio de Qualidade Agroindustrial do Curso de Agronomia do Centro Federal de Educao Tecnolgica do Paran Unidade de Pato Branco. Isolamento a partir do soro de queijo: para o isolamento utilizou-se soro do queijo fornecido pela CAPEG Cooperativa Agropecuria Guarani Lacticnio Central. Erlenmeyers contendo 10ml de soro de leite acrescido de extrato levedura na concentrao de 2%, em pH que variou de 3,0 a 6,0; foram incubados em agitador por 24 horas a uma temperatura de 30C. Meios de cultura para isolamento: as culturas desenvolvidas em Erlenmeyers a partir do soro de queijo, foram inoculadas por esgotamento em placas de Petri contendo meio de cultura YEPL [Extrato de levedura (1%); peptona (2%); lactose (2%) e gar (1,5%)]. Aps a incubao a 30C, as colnias individuais foram isoladas, purificadas e transferidas para tubos de ensaios contendo meio YEPL para posterior identificao e avaliao da atividade lipoltica. Avaliao da atividade lipoltica: a atividade lipoltica foi realizada segundo a metodologia descrita por Hankin & Anagnostakis (1975), utilizando meio de cultura composto de peptona (1%); cloreto de sdio (0,5%) e gar (2%). A este meio foi adicionado 1% de Tween-20 (sorbitano monolaurato) para observao da produo de lipase. As linhagens das leveduras e bactrias isoladas e purificadas foram inoculadas no centro das placas de Petri com o auxlio de uma ala de platina esterilizada. As placas foram mantidas em estufa de crescimento a 28C por 12 dias, quando se procedeu as avaliaes da atividade lipoltica

pela metodologia descrita por Hankin & Anagnostakis (1975), determinando-se o ndice enzimtico (IE), pela relao: dimetro da colnia pelo dimetro da colnia mais o halo dos cristais de sais de clcio do cido lurico, multiplicado por 100. A atividade lipoltica foi evidenciada pela presena de cristais de sais de clcio do cido lurico, liberados ao redor das colnias formando um halo. Delineamento experimental: todas as avaliaes foram realizadas em oito repeties por microrganismos e os resultados foram comparados estatisticamente atravs de testes t e Tukey, segundo os delineamentos experimentais dos ensaios. RESULTADOS E DISCUSSO Aps o isolamento, a purificao e a identificao dos microrganismos (Tabela 1), foi realizado a avaliao da atividade lipoltica, conforme metodologia. Tabela 1 Microrganismos isolados do soro do queijo. Microrganismos Cndida utilis Saccharomyces cerevisiae Rodotorula rubra Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Aspergillus sp Penicilium sp Nomenclatura LSoA02 LSoE02 LSoD02 BSoA02 BSoB02 FSoA02 FSoB02

Os microrganismos identificados aps o isolamento, foram agrupados trs grupos distintos: bactrias, fungos filamentosos e leveduras. Nesses trs grupos, verificamos a presena de microrganismos nos diferentes substratos utilizados, bem como nos diferentes pH. Aps a identificao utilizando provas bioqumicas e com o auxlio de microscopia, verificamos que o principal grupo isolado e identificado foi o das leveduras, destacando os gneros Saccharomyces cerevisiae, Cndida utilis e Rodotorula rubra. J com relao s bactrias foram identificadas Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. Dentre os fungos filamentosos isolados e caracterizados destacamos os gneros Aspergillus e Penicilium. No intuito de avaliar a capacidade de produzir lpases esses microrganismos foram ensaiados em meio especfico para produo desta enzima. A atividade lipoltica foi observada em todos os microrganismos testados, sendo os valores do dimetro das colnias, o dimetro das colnias mais o halo da atividade enzimtica (Figura 1) e a partir desses dados foram calculados os ndices enzimticos, os quais esto apresentados na Tabela 2. Os resultados dos testes de Tukey demonstraram uma variabilidade na produo de lpases no grupo das leveduras, tendo uma variao no ndice enzimtico de 29,140 a 16,650, sendo a Candida utilis a que menos produziu e a Saccharomyces cerevisiae a que mais produziu. Sendo que a Cndida utilis apresentou ndice que diferiu significativamente dos demais microrganismos avaliados.

Tabela 2 Teste de Tukey para mdias do ndice enzimtico, dos microrganismos, no meio para atividade lipoltica. Microrganismos LSoA02 LSoE02 LSoD02 BSoA02 BSoB02 FSoA02 FSoB02 Dimetro da colnia (mm) 15,625 5,425 5,850 4,645 5,312 4,350 4,911 Dimetro de colnia + halo (mm) 53,625 32,088 35,137 32,688 38,875 32,062 27,750 ndice enzimtico* 29,140 a 16,900 b 16,650 b 14,150 b 13,660 b 13,570 b 12,610 b

* ndice enzimtico obtido da relao: dimetro da colnia/dimetro da colnia + halo x 100. Mdia de 8 repeties. ndices seguidos da mesma letra no diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5%.

Figura 1 - Colnia de microrganismo evidenciando a atividade lipoltica, com a presena de halo de precipitao de sais de laurato de clcio. Para a classificao das linhagens quanto atividade enzimtica utilizou-se a metodologia descrita por Digby & Kempton (1991), procedendo-se a elaborao da matriz de distncia de Bray Curtis, que obedece ao modelo ([x ij Xkj] ) / (Xij + Xkj) (Figura 2). Essa medida de distncia foi o que apresentou o maior coeficiente de correlao cofentico (r = 0,9634) e o teste de Mantel no demonstrou diferena significativa ao nvel de 5%.

1,00

0,75

0,50

0,25

0,00 LSoE02 LSoD02 BSoA02 BSoB02 FSoA02 FSoB02 LSoA02

|--------------------|--------------------|------------------|---------------------|

Figura 2 Fenograma dos microrganismos com base na atividade enzimtica extracelular. Aps anlise do comportamento desses microrganismos verificamos que alguns, mesmo que pertencentes a gneros e espcies diferentes, possuem um comportamento similar, dentre eles podendo destacar a bactria da espcie Klebsiella pneumoniae que teve um halo de colnia de 5,312 mm e um halo de colnia, mais o halo enzimtico de 38,875mm, obtendo-se um ndice enzimtico igual a 13,660 isso indica uma alta sntese dessa enzima, pois o halo enzimtico foi 7,5 vezes superior o halo da colnia. Com relao ao comportamento da Cndida utilis, o nico microrganismo que diferiu significativamente dos demais, formou um dimetro de colnia de 15,625 mm e um dimetro da colnia + o halo de 53,625 mm e um ndice enzimtico de 29,140. Comparando os dados podemos verificar que o halo enzimtico foi 3,5 vezes maior que o halo da colnia, embora com um ndice enzimtico alto. Isso pode indicar uma adaptao ao meio de cultura e as demais condies de cultivo, cujos produtos resultantes podem ser inibidores da expresso gnica responsveis pela sntese enzimtica, bem como podendo ser uma caracterstica referente especificidade da enzima expressada, pois essa caracterstica se refere a diferentes taxas de atividades enzimticas apresentadas por uma mesma lipase sobre triglicerdeos, diglicerdeos e monoglicerdeos, contendo cido graxos de cadeia longa ou curta. A especificidade das enzimas lipolticas para cidos graxos, aliados dependncia da forma fsica do substrato, caracterstica de extrema importncia na escolha da enzima ou sistema enzimtico, para o desenvolvimento de produtos flavorizados por modificaes de gordura (Nelson 1972, Akesson et al. 1983, Kilara 1985). O potencial para o aumento ou formao de flavor, pela combinao de duas enzimas lipolticas, foi estudado por Richardson et al (1971). A combinao de esterase gstrica e esterase pregstrica resulta em maior produo de cidos graxos livres e aumento de flavor. Aparentemente, o aumento da liberao de cidos graxos livres se deve maior atividade da esterase gstrica sobre mono e diglicerdeos. CONCLUSO

Aps a realizao deste trabalho, utilizando-se da metodologia descrita, conclumos que todos os microrganismos avaliados so produtores de lpases, destacando-se o gnero Klebsiella pneumoniae, como um o maior produtor de lipases, j a levedura do gnero Cndida utilis foi a que menos produziu. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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