Artigo

EstudandoInteraesFrmacoReceptorcomoProteinDataBank(PDB)e ProgramasGratuitos
Brito,M.A.*
Rev.VirtualQuim.,2011,3(6),467483.DatadepublicaonaWeb:5dejaneirode2012 http://www.uff.br/rvq

StudyingDrugReceptorInteractionsWiththeProteinDataBank(PDB)andFreeware
Abstract: Computational tools are important to help students to understand the concepts of drugreceptor interactions and to visualize 3D structures of ligandmacromolecule complexes in the Medicinal Chemistry course. In this work some computational practices are performed using drugreceptor structures available in PDB, the largest database of proteins, andafreewareviewerprogramfor3Dstructures,forabetterunderstandingofstudents'conceptsofintermoleculardrug receptorinteractions.Thecomplexesselectedwerechoseninlinewiththecomplexescoveredinclassroomlectures.Thus, the course fundamentals were contextualized and the new approach proved to be an important tool in the teaching learningprocess. Keywords:Education;MedicinalChemistry;Drugreceptorinteractions;ProteinDataBank.

Resumo
As ferramentas computacionais constituem importante meio para auxiliar o entendimento de conceitos de interaes frmacoreceptorevisualizaodeestruturas3DdecomplexosligantemacromolculanadisciplinadeQumicaMedicinal. NestetrabalhoforamrealizadasaulasprticascomputacionaisutilizandoasestruturasdecomplexosdisponveisnoPDB,o maior banco de dados de protenas, e um programa de visualizao das estruturas 3D gratuito, objetivando melhor entendimento por parte dos alunos dos conceitos de interaes intermoleculares frmacoreceptor. Os complexos selecionados foram escolhidos em consonncia com os complexos abordados em sala nas aulas tericas. Assim, os fundamentosdamatriaforamcontextualizadoseanovaabordagemmostrouseumaferramentaimportantenoprocesso ensinoaprendizagem. Palavraschave:Ensino;QumicaMedicinal;InteraesIntermolecularesFrmacoReceptor;ProteinDataBank.

* Universidade Federal Fluminense, Laboratrio de Qumica Medicinal Computacional, Faculdade de Farmcia, RuaDr.MrioViana,523,SantaRosa,Niteri,RJ.CEP24241000. moniquebrito@id.uff.br Rev.VirtualQuim.|Vol3||No.6||467483| 467

Volume 3, Nmero 6 Revista Virtual de Qumica ISSN 1984-6835

Dezembro 2011

Estudando Interaes Frmaco-Receptor com o Protein Data Bank (PDB) e Programas Gratuitos
Monique Arajo de Brito*
Universidade Federal Fluminense, Laboratrio de Qumica Medicinal Computacional, Faculdade de Farmcia, Rua Dr. Mrio Viana, 523, Santa Rosa, Niteri, RJ. CEP 24241-000. * moniquebrito@id.uff.br Recebido em 9 de junho de 2011. Aceito para publicao em 5 de janeiro de 2012

1. Introduo 2. Materiais e mtodos 3. Resultados e discusso 3.1. Estudo das interaes do complexo F-R 3.2. Estudo da albumina e da glicoprotena cida alfa-1 4. Concluses

1. Introduo
Visando a melhoria no processo de ensinoaprendizagem de Qumica Medicinal, novas estratgias vm sendo incorporadas s aulas prticas desta disciplina to importante do currculo farmacutico em diversas Universidades.1-4 Posto que inmeras transformaes e melhorias vem marcando a rea de Qumica Medicinal nos ltimos anos, importante que os alunos de Graduao sejam inseridos nessas novas abordagens da rea, com o uso de recursos tecnolgicos necessrios e fundamentais. O uso de mtodos e metodologias de modelagem molecular um exemplo de inovao incorporada s aulas prticas da disciplina, como descrito por alguns autores. 3,4 Nas aulas de Qumica Medicinal so abordados diversos contedos que envolvem o estudo de protenas e enzimas (macromolculas) receptoras de frmacos. Nesse sentido, as aulas tornam-se mais atrativas e os contedos so mais facilmente absorvidos pelos alunos quando eles podem pesquisar e observar as estruturas desses receptores, uma vez que muitos destes tiveram suas estruturas 468

tridimensionais (3D) elucidadas experimentalmente. Aliado a isso, eles podem visualizar possveis interaes frmaco-receptor (F-R) de complexos estudados em sala de aula. Neste trabalho mostra-se a utilizao do uso de ferramentas e aplicativos do maior banco de dados on line de protenas, o Protein Data Bank, PDB.5 O PDB mantido no Laboratrio Nacional Brookhaven, em Upton, New York, e contm estruturas obtidas atravs de experimentos de difrao de raios-X e de nutrons em cristais e de Ressonncia Magntica Nuclear (RMN) de milhares de protenas. Quando comeou, em 1971, havia apenas 12 estruturas. A partir de 1980 esse nmero aumentou muito devido tanto melhoria de tecnologias de obteno das estruturas quanto viso da comunidade cientfica no sentido de compartilh-las. Hoje, h mais de 65 mil estruturas de protenas de interesse biolgico e de complexos F-R depositados no PDB (www.pdb.org). As aulas prticas de Qumica Medicinal tm sido ministradas aos alunos do sexto perodo do curso de Farmcia da Universidade Federal Fluminense (UFF), paralelamente s aulas tericas, no laboratrio de informtica da faculdade (InfoLab). Analisando as diferentes abordagens que poderiam ter sido Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 6| |467-483|

Brito, M. A. utilizadas, as atividades prticas no computador foram direcionadas ao estudo de complexos F-R, explorando as bases qumicas das interaes intermoleculares com o auxilio de programas e tcnicas computacionais. Os objetivos especficos foram: (a) Apresentar aos alunos este importante banco de dados de protenas; (b) Permitir que eles aprendam a acess-lo e a procurar as estruturas de protenas; (c) Visualizar as estruturas 3D de frmacos e complexos F-R e analisar possveis interaes qumicas no prprio site do PDB atravs do aplicativo PDB Ligand Explorer v. 3.8; (d) Aprender a obter as estruturas para o computador e visualiz-las com um programa de visualizao grfica 3D, para analisar possveis interaes qumicas F-R. As aulas prticas foram ministradas em consonncia com os contedos especficos das aulas tericas. importante ressaltar que alm do site do PDB, as prticas foram realizadas utilizando programa gratuito de fcil acesso pelos alunos, a fim de facilitar sua aplicao por outras Instituies de ensino do pas. grfico 3D Molegro Molecular Viewer (MMV) (Molegro Aps, Aarhus, Denmark),6 gratuito e de rpido aprendizado, que pode ser baixado do site aps prvia identificao do usurio (http://www.molegro.com). H verses disponveis para Windows, Linux e Mac. Alm disso, eles deveriam executar rotaes e translaes do complexo F-R, observar o local de ligao do frmaco na macromolcula e inferir possveis interaes qumicas atravs da anlise visual e das distncias entre os tomos do frmaco e resduos de aminocidos da macromolcula. Estas interaes poderiam ser ligaes de hidrognio, interaes inicas, interaes de van der Waals e hidrofbicas, assuntos discutidos nas aulas tericas de Qumica Medicinal quando se fala sobre frmacos estruturalmente especficos e a fase 7 farmacodinmica. Alm das interaes supracitadas, e uma vez que a PDE5 possui como co-fatores em seu stio ativo dois tomos de metal, o zinco (Zn2+) e o magnsio (Mg2+), possveis interaes com os metais poderiam ser exploradas. Na segunda aula, os alunos tiveram a chance de estudar complexos novos e aprofundar o que viram na primeira, pesquisando as estruturas das protenas plasmticas de transporte albumina e glicoprotena cida alfa-1. O principal objetivo desta segunda prtica foi mostrar os vrios stios de ligao a frmacos que a albumina possui e expor a diversidade de estruturas complexadas com essa protena existentes no PDB, alm de comparar essa diversidade com a escassez de estruturas da outra protena de transporte relatada nos livros, a glicoprotena cida alfa-1.

2. Materiais e Mtodos
Na primeira aula foi estudado o complexo do frmaco sildenafila (do medicamento Viagra) com o seu receptor, a enzima fosfodiesterase 5 (PDE5). No primeiro contato dos alunos com o site do PDB foi chamada ateno para alguns tpicos relevantes, como: O cdigo usado pelo PDB; A citao primria do trabalho, onde constam o ttulo, os nomes dos autores e um pequeno resumo da citao no PubMed; A descrio bioqumica da macromolcula; Os compostos qumicos (ligantes, ons e pequenas molculas) presentes no cristal juntamente com a macromolcula; Os arquivos FASTA e PDB; A estrutura 2D e 3D da macromolcula; O aplicativo Ligand Explorer do PDB.

3. Resultados e Discusso
3.1. Estudo das interaes do complexo F-R

3.1.1. Escolha do complexo sildenafila-PDE5 e busca no PDB

Os alunos foram orientados a abrir o complexo F-R no aplicativo PDB Ligand Explorer e no programa Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 6| |467-483|

O complexo sildenafila-PDE5 foi escolhido porque o frmaco sildenafila foi abordado como exemplo na aula terica de Qumica Medicinal como um frmaco estruturalmente especfico, que necessita interagir com receptor para elicitar uma atividade biolgica. O sildenafila foi originalmente desenvolvido por cientistas britnicos e lanado no mercado pela indstria farmacutica Pfizer, em 1988, para o 469

Brito, M. A. tratamento da disfuno ertil.8 Pesquisando no PDB os complexos atravs da palavra-chave sildenafil (Figura 1), foram obtidos como resultado 24 complexos, entre eles o sildenafila com as PDEs 4, 5 e 6. A Figura 1 mostra a pgina de entrada do PDB com o resultado da busca pelo sildenafila.

Figura 1. Resultados obtidos no site do PDB com a palavra-chave sildenafil

O PDB organiza as estruturas com um cdigo de 4 dgitos, entre letras e nmeros, como pode ser observado na Figura 1 (3JWQ, circulado em vermelho). No site h uma ferramenta de busca mais avanada em que se especificam vrios parmetros, como, por exemplo, o tipo de macromolcula que se deseja (protena, DNA, RNA), o peso molecular, o tipo de estrutura secundria, o limite de afinidade de ligao (Ki) de determinado ligante por sua macromolcula, o mtodo experimental de obteno da estrutura, entre outros.

3.1.3. Descrio da macromolcula

A PDE5 uma hidrolase com especificidade para o substrato GMPc (guanosina monofosfato cclica) (Figura 2), com peso molecular de c.a. 38 kDa e uma cadeia polipeptdica composta por 324 aminocidos.

O N N O N OH NH NH2

3.1.2. Caractersticas gerais do trabalho publicado

O O P O O

O complexo escolhido para anlise foi o de cdigo PDB:1UDT, pois continha apenas o sildenafila e a enzima PDE5. O trabalho foi intitulado Crystal structure of Human Phosphodiesterase 5 complexed with Sildenafila (Viagra) e a descrio da estrutura do complexo foi publicada na revista Nature em 2003.9

Figura 2. Estrutura qumica do GMPc, substrato da PDE5

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Brito, M. A. 3.1.4. Descrio do complexo PDB:1UDT coordenadas da protena e dos ligantes, e pode ser visualizado tanto em editores de texto, quanto em programas grficos, gerando a imagem 3D. Nas primeiras linhas vem a descrio da macromolcula: a classificao bioqumica, o cdigo utilizado no PDB, o ttulo do trabalho publicado. Abaixo comea a descrio da protena e dos ligantes que foram cristalografados com ela: ATOM a designao dada para todos os tomos da protena e HETATM a descrio conferida para os tomos dos ligantes, inclusive os metais, e do solvente, que frequentemente a gua.

O complexo escolhido para observao contm, alm do frmaco sildenafila (Figura 3), os ons Zn2+ e Mg2+, co-fatores da PDE5. Ao passar o mouse em cima dos ligantes na pgina do complexo no PDB, aparecem suas respectivas estruturas qumicas em 2D na tela.
O NH N H3C O S O CH3 O N N CH3

H3C N N

3.1.6. A estrutura 3D do complexo F-R

Figura 3. Estrutura qumica do frmaco sildenafila

A estrutura tridimensional em formato pdb do complexo sildenafila-PDE5 pode ser visualizada tanto no prprio site do PDB, atravs do aplicativo Ligand Explorer, quanto com auxlio de algum programa grfico.

3.1.5. Os arquivos FASTA e PDB 3.1.7. Usando o aplicativo do PDB Ligand Explorer No arquivo FASTA encontra-se a sequncia primria de aminocidos de um polipeptdeo ou protena, representada pelo cdigo de uma letra, onde K representa uma lisina, W um triptofano, etc (Figura 4). O FASTA um arquivo texto, que pode ser visualizado em qualquer editor de texto. O PDB (Figura 5) um arquivo que contm as

Ao clicar no link Ligand Explorer ao lado da sigla do sildenafila (Sigla VIA na Figura 6) na pgina do complexo do PDB, o aluno direcionado para o aplicativo de visualizao 3D.

>1UDT:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE

TRELQSLAAAVVPSAQTLKITDFSFSDFELSDLETALCTIRMFTDLNLVQNFQMKHEVLCRWILSVKKNYRKNVAYHNWRHAFNT AQCMFAALKAGKIQNKLTDLEILALLIAALSHDLDHRGVNNSYIQRSEHPLAQLYCHSIMEHHHFDQCLMILNSPGNQILSGLSIEE YKTTLKIIKQAILATDLALYIKRRGEFFELIRKNQFNLEDPHQKELFLAMLMTACDLSAITKPWPIQQRIAELVATEFFDQGDRERKE LNIEPTDLMNREKKNKIPSMQVGFIDAICLQLYEALTHVSEDCFPLLDGCRKNRQKWQALAEQQ

Figura 4. Arquivo FASTA do complexo PDB:1UDT

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Brito, M. A. HEADER HYDROLASE 06-MAY-03 1UDT TITLE CRYSTAL STRUCTURE OF HUMAN PHOSPHODIESTERASE 5 COMPLEXED TITLE 2 WITH SILDENAFIL(VIAGRA) COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: CGMP-SPECIFIC 3',5'-CYCLIC PHOSPHODIESTERASE; COMPND 3 CHAIN: A; ... ATOM 1 N THR A 537 -3.982 28.215 83.642 ATOM 2 CA THR A 537 -2.685 28.492 84.329 ATOM 3 C THR A 537 -2.853 28.484 85.842 ATOM 4 O THR A 537 -3.963 28.599 86.365 ATOM 5 CB THR A 537 -2.104 29.875 83.957 ATOM 6 OG1 THR A 537 -2.892 30.899 84.577 ATOM 7 CG2 THR A 537 -2.100 30.080 82.451 ATOM 8 N ARG A 538 -1.731 28.366 86.536 ATOM 9 CA ARG A 538 -1.722 28.343 87.987 ATOM 10 C ARG A 538 -2.256 29.661 88.522 ATOM 11 O ARG A 538 -3.086 29.680 89.429 ATOM 12 CB ARG A 538 -0.298 28.122 88.487 ATOM 13 CG ARG A 538 -0.201 27.865 89.964 ATOM 14 CD ARG A 538 1.239 27.622 90.373 ATOM 15 NE ARG A 538 1.299 26.928 91.652 ATOM 16 CZ ARG A 538 2.415 26.694 92.323 ATOM 17 NH1 ARG A 538 3.577 27.101 91.835 ATOM 18 NH2 ARG A 538 2.367 26.062 93.484 ... HETATM 2544 ZN ZN A1001 -4.452 56.769 81.496 HETATM 2545 MG MG A1002 -3.709 57.206 77.758 HETATM 2546 C34 VIA A1000 -0.132 61.467 80.120 HETATM 2547 C33 VIA A1000 -0.169 61.792 81.589 HETATM 2548 C32 VIA A1000 -1.261 62.864 81.927 HETATM 2549 C30 VIA A1000 -1.114 63.031 83.405 HETATM 2550 N29 VIA A1000 -1.798 62.280 84.370 HETATM 2551 N28 VIA A1000 -1.414 62.696 85.612 HETATM 2552 C31 VIA A1000 -1.948 62.111 86.845 HETATM 2553 C24 VIA A1000 -0.495 63.700 85.440 HETATM 2554 C23 VIA A1000 0.260 64.519 86.346 HETATM 2555 O27 VIA A1000 0.180 64.422 87.549 ...

1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

43.46 42.15 42.35 40.95 39.76 34.38 30.89 43.46 44.97 43.58 46.01 40.05 41.34 43.47 50.75 46.85 63.89 49.99 33.15 27.93 52.65 38.29 38.55 36.46 36.25 32.60 26.92 33.71 30.27 37.49

Figura 5. Parte do arquivo pdb do complexo PDB:1UDT. Nas primeiras linhas vem a descrio da macromolcula. A descrio ATOM para todos os tomos da protena e a descrio HETATM conferida para os tomos dos ligantes, inclusive metais, e do solvente

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Figura 6. Parte do site do PDB onde se chega funo de visualizao das interaes F-R (Ligand Explorer)

Na parte superior da tela do Ligand Explorer aparece o cdigo PDB da estrutura (seta amarela, Figura 7) e a sequncia primria de aminocidos da protena (seta rosa, Figura 7), onde o aluno clica e o aminocido ressaltado na estrutura do complexo. interessante observar que a forma prevalente de organizao da estrutura secundria da PDE5 so as hlices alfa, em diferentes cores na Figura 7. O aplicativo s permite a visualizao da protena em

modelo fita. O sildenafila aparece em modelo bola e basto com os tomos de carbono em verde, tomos de nitrognio em azul, tomos de oxignio em vermelho e tomo de enxofre em amarelo. Os metais aparecem um pouco afastados do sildenafila, o tomo de Zn2+ em cinza e o de Mg2+ em verde. Os tomos de hidrognio do ligante foram omitidos para melhor visualizao.

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Figura 7. Estrutura do complexo sildenafila-PDE5 visualizado no aplicativo Ligand Explorer do PDB. O sildenafila est em modelo bola e basto colorido por elemento

Na parte inferior esquerda da Figura 7 (seta verde) o aluno pode marcar as interaes que deseja visualizar e especificar as distncias para cada uma; entre elas esto as ligaes de hidrognio, hidrofbicas, interaes mediadas pela gua e interaes com metais. Para melhor visualizar as interaes ele pode ainda restringir um raio em torno do ligante para que somente aqueles resduos que esto dentro do raio especificado apaream na tela. Ao clicar na sigla VIA que representa a estrutura do sildenafila (Figura 7, seta marrom) e na interao por ligao de hidrognio com distncia de 3,3 (esta

distncia pode ser modificada) pode-se observar duas interaes (Figura 8), uma entre o tomo de hidrognio do nitrognio polar do sistema pirazolopirimidinona do sildenafila e o tomo de oxignio da carbonila da cadeia lateral do resduo Gln817 a 2,76 , o que caracteriza uma ligao hidrognio de intensidade forte; e outra interao com distncia de 3,21 entre o tomo de oxignio da carbonila do sistema pirazolo-pirimidinona do sildenafila e o tomo de nitrognio do grupo amida da cadeia lateral do mesmo resduo, Gln817.

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Figura 8. Interaes por ligao de hidrognio entre tomos do sistema pirazolo-pirimidinona do sildenafila (em modelo bola e basto mais grosso) e do resduo de Gln817 (em modelo bola e basto mais fino) da enzima PDE5 visualizadas atravs do aplicativo Ligand Explorer do PDB

Estas ligaes de hidrognio do frmaco com o resduo Gln817 da PDE5 mostram a importncia do anel heteroaromtico que existe no substrato (GMPc, Figura 2) da PDE5 e que aparece na estrutura do frmaco sildenafila. Outros frmacos da mesma classe, como o vardenafila, o tadalafila e o lodenafila este um frmaco desenvolvido no Brasil pelo laboratrio Cristlia possuem anis

heteroaromticos bioissteros ao do substrato (embora o tadalafila no apresente hidrognio polar capaz de fazer ligao de hidrognio) (Figura 9). O objetivo foi preservar as ligaes de hidrognio com o resduo Gln817, uma vez que as ligaes de hidrognio so muito importantes nos sistemas biolgicos e nessa enzima mostra uma justificativa importante.

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H3C N N N H3C O NH O S O CH3 O N N CH3

H3C H3C N O NH N N O S O CH3 O N

Brito,M.A.

CH3

(a)

(b)
O N N H N O CH3

O O

(c)
H3C N N N H3C H3C O O NH O S O N N O N O N S O CH3 O HN N CH3 O CH3 N N

(d)

Figura9.EstruturasqumicasdosfrmacosinibidoresseletivosdePDE5.(a)sildenafila,(b)vardenafila,(c) tadalafila,e(d)lodenafila.Emdestaquesosgruposbioissterosdoanelpirimidinonadofrmacoprottipoda classe,sildenafila As interaes hidrofbicas e de van der Waals identificadas pelo programa com at 3,6 compreenderam: (i) o anel pirimidinona do sildenafila e o anel fenila de Phe820, em uma interao hidrofbica do tipo empilhamento ( stacking) (Figura 10); (ii) o anel fenila do sildenafila e o grupo propil da cadeia lateral de Leu804, em uma interaodevanderWaals(Figura9). AlmdasinteraesFRpodeseobservartambm as interaes entre os tomos de metais (Zn2+ e Mg2+) e resduos da protena. Analisando as interaes do tomo de Zn2+ (em cinza) com a protena com distncia de at 3,6 , observamos interaes com os grupos polares imidazola (His617 e His653) e carboxilato(Asp704eAsp654)dascadeiaslateraisdos aminocidos(Figura11). importante enfatizar que o complexo FR escolhido no possui gua estrutural mediando interaes entre o ligante e a macromolcula, mas paraalgunscomplexosestasguassoimportantes.

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Brito, M. A.

Figura 10. Interaes hidrofbica e de van der Waals entre grupos do sildenafila (em modelo bola e basto mais grosso) e os resduos Phe820 e Leu804 (em modelo bola e basto mais fino) da enzima PDE5 visualizadas atravs do aplicativo Ligand Explorer do PDB

Figura 11. Interaes entre o tomo de zinco (em cinza) e os resduos Asp704, His653, Asp654 e His617 (coloridos por elemento) da enzima PDE5, visualizadas atravs do aplicativo Ligand Explorer do PDB Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 6| |467-483| 477

Brito, M. A. 3.1.8. Usando o programa Molegro Molecular Viewer (MMV) hidrognios da protena e do ligante e os oxignios da gua da estrutura cristalografada. A Figura 12 mostra a janela inicial do programa MMV, onde se observa a protena colorida de acordo com os tomos e o sildenafila colorido em amarelo (destaque da autora). Na parte inferior da tela observa-se a sequncia primria da protena, em diferentes cores.

Ao fazer o download do arquivo pdb do complexo F-R o aluno pode observ-lo tambm pelo programa MMV. A visualizao inicial do complexo pelo MMV diferente do Ligand Explorer, pois aparecem todos os

Figura 12. Tela inicial do programa MMV com o complexo PDB:1UDT (sildenafila em amarelo)

No MMV pode-se, tambm, estipular um corte para os resduos ao redor do ligante. Na Figura 13 foi feito um corte de 4,0 em torno do inibidor e os aminocidos foram identificados pela sigla de 3 letras e a numerao correspondente a cada um na protena. Nessa Figura pode-se observar o predomnio de resduos com cadeia lateral apolar/hidrofbica, prximos ao sildenafila, como fenilalanina (Phe), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile) e alanina (Ala), o que refora a importncia dessas interaes entre o frmaco e a macromolcula. O MMV tem recursos diferentes em relao ao aplicativo Ligand Explorer, como, por exemplo, as diversas formas de visualizao da estrutura secundria da protena, a possibilidade de mudar as cores tanto do ligante quanto da protena e a

possibilidade de gerar superfcie eletrosttica de ambos (Figura 14). Nessa superfcie observam-se as regies da protena carregadas positivamente (em azul), as regies carregadas negativamente (em vermelho) e as regies apolares, no-carregadas (em branco). Ela uma ferramenta importante quando se quer estudar a distribuio superficial de cargas na protena. H outros programas gratuitos e de fcil acesso em que se pode visualizar estruturas 3D de protenas, de complexos F-R e visualizar interaes, entre eles esto PyMOL Molecular Viewer (http://www.pymol.org/), Visual Molecular Dynamics (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/) e SwissPDB Viewer (http://spdbv.vital-it.ch/).

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Brito, M. A.

Figura 13. Sildenafila (em modelo basto) e resduos a 4,0 de distncia (em modelo arame)

Figura 14. Superfcie eletrosttica da enzima PDE5

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Brito, M. A. 3.2. Estudo da albumina e da glicoprotena cida alfa-1 Os alunos ao procederam a busca no PDB com as palavras-chaves serum albumin, encontraram 99 estruturas. Eles puderam ver a diversidade de frmacos complexados com esta protena, como o anestsico local lidocana (PDB:3JQZ), o AZT, inibidor nucleosdeo da transcriptase reversa do HIV-1 (PDB:3B9L), os anti-inflamatrios no-esteroidais cido saliclico (PDB:2I30), cido acetil saliclico (PDB:2I2Z), diflunisal (PDB:2BXE), ibuprofeno (PDB:2BXG) e indometacina (PDB:2BXK), o anticoagulante oral varfarina (PDB:2BXD), o hipnticosedativo diazepam (PDB:2BXF), os anestsicos gerais propofol (PDB:1E7A) e halotano (PDB:1E7B), entre outros.

A segunda prtica computacional envolveu a pesquisa e a observao de complexos com a albumina e a glicoprotena cida alfa-1. A albumina a protena presente em maior concentrao no plasma sanguneo e em espaos extravasculares, desempenhando papel na ligao e transporte de frmacos e uma variedade de outros compostos orgnicos endgenos e xenobiticos.10 Por esse motivo ela exerce forte influncia na fase farmacocintica de muitos frmacos (na etapa de distribuio), contribuindo para uma maior ou menor biodisponibilidade, e sua importncia ressaltada nas aulas de Qumica Medicinal. A flexibilidade estrutural da albumina permite que ela se adapte a uma variedade de ligantes.11 O principal objetivo desta prtica foi mostrar aos alunos os vrios stios de ligao a frmacos que a albumina possui e a diversidade de estruturas complexadas com essa protena existentes no PDB, e comparar essa diversidade com a escassez de estruturas da outra protena de transporte, a glicoprotena cida alfa-1.12

3.2.2. Escolha dos complexos e visualizao dos stios de ligao dos frmacos na albumina

3.2.1. Busca no PDB

O H3C CH3 H N O CH3 Lidocana N CH3 CH3 HO O N

Foram escolhidos seis complexos para observar e analisar, com o requerimento de que pertencessem a diferentes classes teraputicas para que os alunos acumulassem maior nmero de informaes sobre os frmacos. Os complexos escolhidos foram da albumina com lidocana (PDB:3JQZ),10 AZT (PDB:3B9L),13 ibuprofeno (PDB:2BXG),14 varfarina (PDB:2BXD),14 diazepam (PDB:2BXF),14 e propofol (PDB:1E7A).15 As estruturas qumicas dos frmacos esto mostradas na Figura 15.

NH O H3C
+

CH3 CH3 O
_

OH

N=N=N

Ibuprofeno

Zidovudina (AZT) O OH CH3 Cl N O O Diazepam Propofol H3C CH3 O N CH3 OH CH3 CH3

Varfarina

Figura 15. Estruturas qumicas dos frmacos complexados com a albumina escolhidos para anlise

Os frmacos zidovudina, ibuprofeno e varfarina so quirais, portanto apresentam isomeria ptica. Embora no seja mencionado que enantimero 480

encontra-se complexado nem no PDB, nem nos artigos que reportam a obteno dos complexos F-R, sabe-se que a atividade do ibuprofeno deve-se quase Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 6| |467-483|

Brito, M. A. que inteiramente ao enantimero (S), embora ele seja comercializado na forma racmica.16 O eutmero da varfarina tambm o de configurao (S), quatro vezes mais potente do que o distmero (R), mas este frmaco tambm comercializado em sua forma racmica.17 Em relao ao AZT no h meno potncia dos enantimeros.18 Aps escolha e leitura cuidadosa dos ttulos dos trabalhos de cada complexo, os alunos fizeram o download dos mesmos e abriram cada estrutura no programa MMV, que mostra as estruturas secundrias da protena e permite a mudana de cor no ligante, o que seria importante na visualizao. A Figura 16 ilustra os complexos de cada frmaco escolhido com a albumina. Pela observao dessa Figura pode-se identificar as diferentes regies de ligao a frmacos na albumina, ao contrrio de outras protenas, principalmente as enzimas, que possuem stios determinados de ligao a frmacos, seja o stio cataltico ou o alostrico. Esta diversidade de stios de ligao (tambm denominada promiscuidade) o que faz a albumina ligar-se a tantos compostos orgnicos diferentes. Analisando a Figura 16 detecta-se pelos menos sete locais diferentes de ligao, considerando que uma molcula de ibufrofeno, o diazepam e uma molcula do propofol ligaram-se a regies visualmente muito prximas na protena (setas azuis), que podem ser consideradas como a mesma regio. Alm disso, os alunos puderam ver que mais de uma molcula do frmaco pode se ligar protena e que a nica forma de organizao secundria da albumina so as hlices alfa (Figura 16, em vermelho).

Figura 16. Estruturas da protena srica humana albumina (hlices alfa em vermelho) complexada com diferentes frmacos (em verde)

Aps a procura e visualizao das estruturas de frmacos complexados com a albumina, eles procederam busca de estruturas da glicoproteina cida alfa-1 com as palavras alpha1-acid glycoprotein, o que resultou em apenas uma

estrutura, de cdigo PDB:3KQ0. A estrutura no tem frmaco ligado e essa protena, tem outra forma de organizao secundria alm das hlices alfa, as folhas beta (Figura 17, em azul).

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Figura 17. Estrutura da glicoproteina cida alfa-1

4. Concluses
As aulas computacionais utilizando as ferramentas do PDB foram muito atraentes para os alunos, que desenvolveram as atividades com desenvoltura e consolidaram melhor o conhecimento adquirido nas aulas tericas da disciplina. No incio houve dificuldade de entender as interaes, mas a integrao com as aulas tericas proporcionou melhor entendimento. Os relatrios entregues mostraram boa sedimentao do conhecimento e amadurecimento sobre o tema das aulas. Na avaliao interna informal sobre as prticas, todos os alunos disseram que a utilizao dessas ferramentas contribuiu muito para seu entendimento acerca do assunto e que o uso de ferramentas computacionais deveria ser incorporado a outras disciplinas. Sobre as dificuldades encontradas, a mais citada foi conseguir ver as interaes. Certamente as aulas contriburam para uma melhor relao ensino-aprendizagem. Foi observado que ambos os programas tem vantagens e desvantagens. A vantagem do Ligand Explorer que o aluno pode alterar os valores de corte das distncias de interao. A vantagem do MMV se poder alterar as cores dos aminocidos e dos ligantes, ocultar trechos da protena mais distantes do inibidor e gerar o mapa de superfcie eletrosttica da protena, acessando as regies de cargas negativas ou positivas e as regies neutras. importante enfatizar para os alunos que as estruturas baixadas do PDB so estticas e que algumas vezes possuem contatos estricos ruins, que necessitam de refinamento (otimizao de geometria e minimizao de energia) para qualquer estudo mais 482

aprofundado com os complexos. Alm disso, em estudos de modelagem molecular com protenas devemos averiguar se a estrutura da protena est completa, se ela tem mutao, e os estados de protonao dos resduos cidos e bsicos da protena. O programa gratuito PROPKA (http://propka.ki.ku.dk/) uma ferramenta para prever o pKa dos resduos de aminocidos de um receptor.

Agradecimento
A Autora agradece Pr-Reitoria de Pesquisa, Ps Graduao e Inovao (PROPPi) da UFF.

Referncias Bibliogrficas
1 2 3

Brito, M. A. Rev. Eletr. Farm. 2011, 8, 88. [Link] Brito, M. A. Rev. Eletr. Farm. 2010, 7, 22. [Link]

Andrade, C. H.; Trossini, G. H. G.; Ferreira, E. I. Rev. Eletr. Farm. 2010, 1, 1. [Link]
4

Carvalho, I.; Pupo, M. T.; Borges, A. D. L.; Bernardes, L. S. C. Quim. Nova 2003, 26, 428. [CrossRef]
5

Berman, H. M.; Westbrook, J.; Feng, Z.; Gilliland, G.; Bhat, T. N.; Weissig, H.; Shindyalov, I. N.; Bourne, P. E. Nucleic Acids Res. 2000, 28, 235. [CrossRef] [PubMed]
6

Stio da empresa Molegro Bioinformatics Solutions. Disponvel em: < http://www.molegro.com>. Acesso em: 17 novembro 2011. Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 6| |467-483|

Brito, M. A.
7

Maher, T. J.; Johnson, D. A. Em Foyes principles of medicinal chemistry Lippincott Williams & Wilkins: New York, 2008, cap. 4.
8

S.; Parker, K. L., eds.; McGrawHill: New York, 2006, cap. 11.
13

Boolell, M.; Allen, M. J.; Ballard, S. A.; Gepi-Attee, S., Muirhead, G. J., Naylor, A. M., Osterloh, I. H., Gingell, C. Int. J. Impot. Res. 1996, 8, 47. [PubMed]
9

Zhu, L.; Yang, F.; Chen, L.; Meehan, E. J.; Huang, M. J. Struct. Biol. 2008, 162, 40. [CrossRef] [PubMed]
14

Sung, B. J.; Hwang, K. Y.; Jeon, Y. H.; Lee, J. I.; Heo, Y. S.; Kim, J. H.; Moon, J.; Yoon, J. M.; Hyun, Y. L.; Kim, E.; Eum, S. J.; Park, S. Y.; Lee, J. O.; Lee, T. G.; Ro, S.; Cho, J. M. Nature 2003, 425, 98. [CrossRef] [PubMed]
10

Ghuman, J.; Zunszain, P. A.; Petitpas, I.; Bhattacharya, A. A.; Otagiri, M.; Curry, S. J. Mol. Biol. 2005, 353, 38. [CrossRef] [PubMed]
15

Bhattacharya, A. A.; Curry, S.; Franks, N. P. J. Biol. Chem. 2000, 275, 38731. [CrossRef] [PubMed]
16

Hein, K. L.; Kragh-Hansen, U.; Morth, J. P.; Jeppesen, M. D.; Otzen, D.; Mller, J. V.; Nissen, P. J. Struct. Biol. 2010, 171, 353. [CrossRef] [PubMed]
11

Borne, R.; Levi, M.; Wilson, N. Em Foyes principles of medicinal chemistry; Lippincott Williams & Wilkins: New York, 2008, cap. 36.
17

Ascenzi, P.; Bocedi, A.; Notari, S.; Fanali, G.; Fesce, R.; Fasano, M. Mini Rev. Med. Chem. 2006, 6, 483. [CrossRef] [PubMed]
12

Lu, M. C.; Lemke, T. L. Em Foyes principles of medicinal chemistry; Lippincott Williams & Wilkins: New York, 2008, cap. 31.
18

Buxton, I. L. O. Em Goodman & Gilman As Bases Farmacolgicas da Teraputica; Brunton, L. L.; Lazo, J.

Woster, P. M. Em Foyes principles of medicinal chemistry; Lippincott Williams & Wilkins: New York, 2008, cap. 43.

Rev. Virtual Quim. |Vol 3| |No. 6| |467-483|

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