Norma Tcnica SABESP NTS 014

Coliformes Totais e Termotolerantes - Mtodo de membrana filtrante

Procedimento

So Paulo Dezembro - 2005

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SUMRIO
1 2 3 4 5 5.1 5.2 OBJETIVO...............................................................................................................1 PRINCPIO DO MTODO .......................................................................................1 DEFINIES ...........................................................................................................1 MATERIAIS UTILIZADOS E EQUIPAMENTOS .....................................................2 REAGENTES...........................................................................................................2 Reagentes primrios .............................................................................................2 Reagentes elaborados...........................................................................................3

6 LIMPEZA, PREPARO E ESTERILIZAO DE MATERIAIS USADOS EM BACTERIOLOGIA ..............................................................................................................5 6.1 Procedimento...............................................................................................................5 6.2 Teste de eficincia de esterilizao dos frascos de coleta .....................................8 7 AMOSTRAGEM ...............................................................................................................8 7.1 Embalagem para amostragem ...................................................................................8 7.2 Tcnica de coleta.........................................................................................................9 7.3 Preservao da amostra .............................................................................................9 8 9 INTERFERENTES ...................................................................................................9 PROCEDIMENTO ANALTICO ...............................................................................9

9.1 Diluio ou diviso de amostras................................................................................9 9.2 Preparao da sala de filtrao................................................................................10 9.3 Procedimento bsico ................................................................................................10 9.4 Confirmao de colnias tpicas e atpicas de coliformes totais e termotolerantes ...............................................................................................................11 10 RESULTADOS.............................................................................................................12 10.1 Ensaio presuntivo ...................................................................................................12 10.2 Ensaio confirmativo para coliforme total PRESENA/AUSNCIA ..................12 10.3 Ensaio confirmativo para coliforme total QUANTIFICAO............................12 10.4 Ensaio confirmativo para coliforme termotolerante PRESENA/AUSNCIA.13 11 BIBLIOGRAFIA .....................................................................................................13

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Coliformes Totais e Termotolerantes - Mtodo de membrana filtrante

1 OBJETIVO Prescrever o mtodo para determinao de coliformes totais e termotolerantes em guas naturais e tratadas pela tcnica de filtrao seguida de inoculao e incubao. 2 PRINCPIO DO MTODO Este mtodo baseado na inoculao da amostra, em meios de cultura especficos para o desenvolvimento de bactrias do grupo coliformes. Uma vez que haja o desenvolvimento de colnias, confirma-se a presena dos coliformes, a qual dependendo do procedimento adotado, o resultado pode ser expresso como: presena/ausncia por 100 mL ou a quantificao dos mesmos em coliformes/100 mL. Em todas as etapas que se seguem quando o resultado for negativo, considerar como ausncia de coliformes na amostra. A metodologia possui trs etapas distintas: 1) Filtrao: A primeira uma reteno dos possveis microorganismos presentes na amostra, atravs da filtrao de 100 mL de amostra ou uma poro diluda da mesma atravs de uma membrana filtrante especfica de 0,45m de porosidade. A membrana colocada em uma placa de Petri contendo meio de cultura m-endo agar les e segue para incubao em estufa de cultura a 350,5C por 22 a 24h. Resultado positivo: colnias vermelhas com brilho verde metlico superficial. 2) Ensaio presuntivo: Os resultados positivos suspeitos para coliformes totais na etapa anterior so repicados para o meio de cultura caldo lactosado (ou lauril triptose) com prpura de bromocresol e submetidos incubao em estufa de cultura a 350,5C por 24/48h. O resultado positivo nesta etapa a alterao de cor do meio de cultura de prpura para amarelo em funo da alterao de pH pelo desenvolvimento bacteriano fermentador de lactose ou presena de gs no tubo de Durhan. 3) Ensaio confirmativo: Coliformes totais: Os resultados positivos no ensaio presuntivo so repicados para o meio de cultura caldo lactosado verde brilhante bile 2% e submetidos incubao em estufa de cultura a 350,5C por 24/48h. O resultado positivo nesta etapa a presena de CO2 e H2 (gases) no tubo de Durhan. Coliformes termotolerantes: Os resultados positivos no ensaio presuntivo so tambm repicados para o meio de cultura caldo EC (EC broth) e submetidos incubao em banho trmico a 44,50,2C por 242h. O resultado positivo nesta etapa a presena de CO2 e H2 (gases) no tubo de Durhan. 3 DEFINIES Coliformes totais so bactrias capazes de crescer na presena de sais biliares ou agentes tensoativos (como lauril sulfato de sdio) e de fermentar a lactose a 35-37C, com produo de cido, gs e aldedo, em 24/48 horas. Coliformes termotolerantes um subgrupo de coliformes totais que tem a propriedade de se desenvolver a 44,50,2C em meio de cultura EC em 24 horas. Exemplos: Escherichia coli, Klebsiella. Colnias tpicas Colnias vermelhas com brilho verde metlico superficial total ou parcial. Colnias atpicas Colnias vermelhas sem brilho.
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C.L. - Caldo Lactosado. C.L.V.B.B. - Caldo Lactosado verde brilhante e bile a 2% (meio de cultura para coliformes totais). EC - Meio de cultura para coliformes termotolerantes. Crescimento confluente - Todo crescimento excessivo sem colnias bem definidas na superfcie da membrana, tanto para colnias tpicas como atpicas. 4 MATERIAIS UTILIZADOS E EQUIPAMENTOS Ala para repique, Banho trmico com agitador, Estufa de cultura, Frasco de diluio para leite, com ou sem graduao, Membranas filtrantes de ster de celulose com 47 mm de dimetro e 0,45 m de porosidade, quadriculada, na cor branca, Microscpio estereoscpico, com aumento de 10 a 15 vezes e fonte de luz fluorescente, Pinas sem ponta, Pissete autoclavvel, Placas de Petri de plstico atxico, estril, de aproximadamente 49 mm de dimetro e 9 mm de altura, Sistema de filtrao, Tubo de Durhan, Tubo de ensaio de vidro neutro ou de borossilicato com dimenses de aproximadamente 12x120 mm com ou sem tampa de rosca, Tubo de ensaio de vidro neutro ou de borossilicato com dimenses mnimas de 16x150 mm com ou sem tampa de rosca. 5 5.1 REAGENTES Reagentes primrios

cido Clordrico p.a. - HCl lcool Etlico comercial (96GL) - C2H5OH lcool Etlico p.a. C2H5OH Cloreto de Magnsio hexahidratado p.a. - MgCl2.6H2O EDTA (cido etileno diamino tetractico sal dissdico) - C10H14N2O8Na2.2H2O Fosfato de Potssio monobsico p.a. - KH2PO4 Hidrxido de Sdio p.a. - NaOH Meio de cultura Caldo Lactosado desidratado ou Caldo Lauril Triptose desidratado Meio de cultura Caldo Lactosado verde brilhante e Bile 2% desidratado Meio de cultura caldo EC desidratado Meio de cultura M-Endo Agar Les (Bacto) desidratado Prpura de Bromocresol p.a. Tiossulfato de Sdio pentahidratado p.a. - Na2S2O3.5H2O

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5.2 Reagentes elaborados 5.2.1 Soluo alcolica 70% Medir 700 mL de lcool etlico comercial 96% (alterar quantidades de lcool e gua deionizada se utilizar lcool com outra concentrao); Adicionar 260 mL de gua deionizada; Homogeneizar. 5.2.2 Solues para preparao do tampo Soluo estoque A: Dissolver 34 g de Fosfato de Potssio monobsico em 500 mL de gua deionizada e ajustar o pH para 7,20,5 com Hidrxido de Sdio 1 mol/L. Completar para 1000 mL com gua deionizada; Soluo estoque B: Dissolver 81,1 g de Cloreto de Magnsio hexahidratado em 1000 mL de gua deionizada; Autoclavar as solues a 121C por 15 minutos antes de us-las. Armazenar em frasco com tampa protegido da luz e guardar em geladeira. 5.2.3 Soluo de EDTA 15% 5.2.4 gua de diluio (Tampo) Soluo de uso 1 Juntar 1,25 mL de soluo estoque A com 5 mL de soluo estoque B, completar o volume para 1000 mL com gua deionizada; Colocar cerca de 92 mL dessa soluo em um frasco de diluio de leite; Autoclavar a 121C por 15 minutos; O volume do lquido no frasco deve ser de 902mL. Soluo de uso 2 Juntar 1,25 mL de soluo estoque A, com 5 mL de soluo estoque B, em um erlenmeyer e completar para 1000 mL com gua deionizada; Tampar com algodo; Autoclavar a 121C por 15 minutos. 5.2.5 Preparao do meio de cultura M-Endo Agar Les Fazer assepsia da bancada com lcool Etlico 70%, aguardando a secagem da mesma; Acender o bico de Bnsen; Em um bquer estril pesar 51 g do meio M-Endo Agar Les (ou valor indicado pelo fabricante); Adicionar no bquer com o meio, com auxlio de uma pipeta estril, 20 mL de lcool Etlico p.a. Misturar com um basto de vidro estril at que todo meio fique umedecido; Retirar uma alquota do balo volumtrico contendo 1000 mL de gua deionizada estril e acrescentar no bquer com o meio; Homogeneizar com auxlio do basto esterilizado; Colocar a mistura no balo com o restante da gua, tampar e homogeneizar; Deixar em repouso protegido da luz por 15 minutos, temperatura ambiente, homogeneizando algumas vezes; Aquecer em banho de gua fervente, agitando freqentemente at completa dissoluo do meio, tomando o cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio; Acender os outros bicos de Bnsen; Fazer a assepsia do local de trabalho;
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Aps a dissoluo do meio, separar em um tubo de ensaio uma pequena amostra do meio, aguardar at que fique temperatura ambiente e medir o pH, que deve estar na faixa de 7,20,2; Nota 1: Caso o pH no esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Colocar as bases das placas de Petri previamente esterilizadas sobre a bancada e distribuir com auxlio de uma pipeta esterilizada, cerca de 3 a 4 mL do meio em cada uma; Aguardar alguns minutos e tamp-las; Aguardar esfriar completamente at solidificar; Acondicion-las em uma caixa plstica com as placas na posio invertida; Refrigerar (2 a 10C) por at duas semanas. 5.2.6 Preparao do meio de cultura caldo EC Em um bquer com capacidade de 250 mL, pesar 3,7 g do meio de cultura EC; Acrescentar 100 mL de gua deionizada e homogeneizar com um basto de vidro at dissolver completamente; Ajustar o pH, se necessrio, com NaOH 1 mol/L ou HCl 1 mol/L; Distribuir cerca de 5 mL do meio em tubos de ensaio de 12x120 mm tendo em seu interior tubos de Durhan invertidos; Tampar os tubos e autoclavar por 15 minutos a 121C; Aps autoclavao e temperatura ambiente, medir o pH final que deve ser de 6,90,2; Nota 2: Caso o pH no esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6C por at duas semanas ou manter em temperatura menor que 30C por at uma semana. 5.2.7 Preparao do meio de cultura caldo lactosado (CL) com prpura de bromocresol Pesar 13,0 g do meio de cultura caldo lactosado e 0,01 g de prpura de bromocresol; Transferir o meio e a prpura de bromocresol para um balo de fundo chato de 2000 mL contendo aproximadamente 500 mL de gua deionizada; Homogeneizar e completar o volume para 1000 mL com gua deionizada e homogeneizar novamente; Aquecer, se necessrio, agitando freqentemente, at completa dissoluo do meio, tomando o cuidado para no atingir a temperatura de ebulio; Ajustar o pH, se necessrio, com NaOH 1 mol/L ou HCl 1 mol/L que deve estar em 6,90,2; Aps completa dissoluo do meio, colocar cerca de 10 mL em tubos de ensaio de 16mmx150mm com tampa de rosca, contendo em seu interior tubos de Durhan invertidos; Fechar os tubos; Autoclavar por 15 minutos a 121C; Aps autoclavao e temperatura ambiente, medir o pH final que deve ser de 6,90,1; Nota 3: Caso o pH no esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6C por at duas semanas ou manter em temperatura menor que 30C por at uma semana. 5.2.8 Preparao do meio de cultura caldo lauril triptose com prpura de bromocresol Pesar 35,6 g do meio de cultura caldo lauril triptose e 0,01 g de prpura de bromocresol;
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Transferir o meio e a prpura de bromocresol para um balo de fundo chato de 1000 mL contendo aproximadamente 500 mL de gua deionizada; Homogeneizar e completar o volume para 1000 mL com gua deionizada e homogeneizar novamente; Aquecer, se necessrio, agitando freqentemente, at completa dissoluo do meio, tomando o cuidado para no atingir a temperatura de ebulio; Ajustar o pH, se necessrio, com NaOH 1 mol/L ou HCl 1 mol/L que deve estar em 6,80,2; Aps completa dissoluo do meio, colocar cerca de 10 mL em tubos de ensaio de 16mmx150mm com tampa de rosca, contendo em seu interior tubo de Durhan invertido; Fechar os tubos; Autoclavar por 15 minutos a 121C; Aps autoclavao e temperatura ambiente, medir o pH final que deve ser de 6,80,2; Nota 4: Caso o pH no esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6C por at duas semanas ou manter em temperatura menor que 30C por at uma semana. 5.2.9 Preparao do meio de cultura caldo lactosado verde brilhante e bile 2% Pesar 40,0 g do meio caldo lactosado verde brilhante desidratado; Transferir o meio para um balo de fundo chato de 2000 mL contendo aproximadamente 500 mL de gua deionizada; Homogeneizar e completar o volume para 1000 mL com gua deionizada e homogeneizar novamente; Aquecer, se necessrio, agitando freqentemente, at completa dissoluo do meio, tomando o cuidado para que no seja atingida a temperatura de ebulio; Ajustar o pH, se necessrio, com NaOH 1 mol/L ou HCl 1 mol/L; Aps a dissoluo do meio, colocar cerca de 10 mL em tubos de ensaio de 16 mm x 150mm com tampa de rosca, contendo em seu interior tubos de Durhan invertidos; Fechar os tubos; Autoclavar por 15 minutos a 121C; Aps autoclavao e temperatura ambiente, medir o pH final que deve ser de 7,20,2; Nota 5: Caso o pH no esteja na faixa desejada, desprezar o lote e preparar novo lote. Armazenar em temperatura de 2 a 6C por at duas semanas ou manter em temperatura menor que 30C por at uma semana. 5.2.10 Soluo de Tiossulfato de Sdio pentahidratado 3% m/v 5.2.11 cido Clordrico 1 mol/L 5.2.12 Hidrxido de Sdio 1 mol/L 6 LIMPEZA, PREPARO BACTERIOLOGIA E ESTERILIZAO DE MATERIAIS USADOS EM

6.1 Procedimento 6.1.1 Vidrarias em geral Fazer a descontaminao prvia de toda a vidraria utilizada nos ensaios microbiolgicos, onde houver gua de diluio ou meios de cultura, em autoclave a 121C por 30 minutos. - Desprezar o contedo das vidrarias; - Colocar de molho em gua contendo detergente neutro, por no mnimo 2 horas;
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- Lavar a parte externa com uma esponja e a parte interna com escovas (tipo gaspilho) embebidas em gua e detergente neutro 2 a 5%; - Enxaguar em gua corrente vrias vezes; - Enxaguar em gua deionizada ou destilada; - Secar em estufa de secagem; - Quando utilizar vidraria aberta, fechar com papel alumnio, cobrindo inclusive as bordas externas. 6.1.2 Materiais especiais Tubos de Durhan Fazer a descontaminao prvia esterilizando em autoclave a 121C por 30 minutos; Aps descontaminao, coloc-los em um bquer com gua e detergente neutro e ferver por 15 minutos, para remoo dos resduos internos. Pipetas - Colocar as pipetas de molho em gua e detergente neutro num recipiente por no mnimo uma hora; - Enxaguar com gua pelo menos 10 vezes; - Enxaguar com gua deionizada; - Deixar escorrer; - Colocar as pipetas dentro do porta-pipetas de ao inoxidvel ou embalar em papel kraft; - Esterilizar em estufa de secagem a 170C por duas horas. Sistema de filtrao - Lavar as duas partes do sistema com uma esponja embebida em gua e detergente neutro; - Enxaguar em gua corrente por vrias vezes; - Enxaguar em gua deionizada; - Secar temperatura ambiente ou estufa de secagem em temperatura inferior a 50C; Para esterilizao em autoclave, embrulhar o conjunto em papel kraft ou similar, e autoclavar por 15 minutos a 121C. Para esterilizao em forno de microondas, colocar em uma caixa plstica, tamp-la, colocar no forno de microondas e ligar por 1 minuto em potncia mxima (100%) e por 2 minutos em potncia fraca (30%), repetindo a operao por duas vezes e deixando um pequeno intervalo entre cada operao. Nota 6: No utilizar forno de microondas para sistemas que contenham m. Placas de Petri plsticas - Destampar a placa; - Retirar o meio e a membrana da base da placa com auxlio de uma esptula; - Embalar o meio com a membrana em papel alumnio e colocar dentro de um saco plstico autoclavvel; - Descontaminar o material esterilizando em autoclave a 121C por 30 minutos; - Desprezar material descontaminado no lixo; - Colocar, separadamente, as tampas e os fundos de molho em lcool etlico comercial a 70% por no mnimo 12 horas, enxaguar com gua corrente e deixar de molho em detergente neutro a 2% cerca de 12 horas; - Enxaguar em gua corrente 10 vezes; - Enxaguar em gua deionizada;
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- Imergir em soluo de lcool Etlico a 70% por no mnimo 2 horas; - Secar em estufa com temperatura inferior a 50C; - Colocar em caixas plsticas, desinfetar em luz ultravioleta por cinco minutos ou esterilizar no forno de microondas, ligando por um minuto na potncia mxima (100%) e por dois minutos na potncia mdia baixa (30%), repetindo a operao por duas vezes e deixando um pequeno intervalo entre cada operao; - Tampar a caixa e guardar. Frascos de coleta - Retirar o papel alumnio que protege a tampa e a boca do frasco; - Desprezar o restante da amostra; - Retirar as etiquetas e caso haja algum cdigo marcado no frasco, retirar com lcool Etlico comercial e algodo; - Colocar os frascos e as tampas em soluo de detergente neutro de 2 a 5 % por um mnimo de duas horas; - Lavar a parte externa dos frascos e as tampas com esponja e sabo neutro e as partes internas com escovas (tipo gaspilho); - Enxaguar em gua corrente vrias vezes; - Enxaguar em gua deionizada ou destilada; - Secar os frascos; - Colocar 3 gotas de Tiossulfato de Sdio pentahidratado a 3% em cada frasco; Nota 7: Esta quantidade de Tiossulfato de Sdio neutraliza at 5 mg/L de cloro residual livre em 100mL de amostra. - Tampar o frasco sem rosquear completamente a tampa para permitir a entrada e sada do vapor; - Envolver as tampas dos frascos de coleta com papel alumnio; - Autoclavar por 15 minutos a 121C; - Aps esfriar, retirar da autoclave e fech-los por completo; - Fixar o papel alumnio com elstico em volta do frasco. 6.1.3 Materiais novos PROCEDIMENTOS COMPLEMENTARES PR-TRATAMENT0 PARA ELIMINAO DE FENOL E SUBSTNCIAS TXICAS EM TAMPAS PLSTICAS E VEDAES DE BORRACHA NOVAS Vedaes de borracha e tampas plsticas novas podem conter resduos txicos que se no forem removidos podem alterar a composio de solues e meios de cultura. Eliminao de fenol 1) processo simplificado: - Imergir tampas ou vedaes em gua destilada em um recipiente adequado; - Autoclavar a 121C, durante 30 minutos; - Repetir esta operao 6 vezes consecutivas (ou mais), efetuando a troca de gua destilada a cada autoclavao. Para comprovar a eliminao dos resduos txicos, realizar a prova de adequabilidade biolgica e determinao de fenol da gua destilada proveniente da ltima autoclavao. As tampas e vedaes s estaro em condies de uso quando a prova de adequabilidade apresentar resultados da razo B/A compreendidos num intervalo de 0,8 a 3,0 e a anlise de fenol apresentar resultado negativo.
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2) processo alternativo: - Imergir tampas e vedaes de borracha em solues de Hidrxido de Sdio 3N contida em recipiente adequado e deixar em contato durante 24 horas; - Remover a soluo de Hidrxido de Sdio aps 24 horas; - Neutralizar com soluo de cido Clordrico 1N; - Colocar os materiais em local adequado e proceder como o descrito no processo simplificado. Eliminao de gordura e outros resduos - Imergir a vidraria em soluo de cido Clordrico a 1%, em recipiente adequado deixando em repouso durante 12 horas; - Retirar a vidraria desta soluo e enxaguar cuidadosamente em gua corrente; - Imergir a vidraria em soluo de detergente em concentrao adequada e proceder a sua lavagem normal. 6.2 Teste de eficincia de esterilizao dos frascos de coleta - Preparao do meio: Pesar 4,5 g de meio TSB (Tryptic Soy Broth) e dissolver em 150mL de gua deionizada. Nota 8: Preparar sempre momentos antes do uso; - Aps a dissoluo do meio, separar uma pequena quantidade de amostra e medir o pH que deve estar na faixa de 7,30,2C, caso necessrio ajustar com NaOH 1 mol/L ou HCl 1 mol/L; - Adicionar 20 mL do meio de cultura em cinco frascos de coleta recm preparados para esterilizao e fech-los; - Esterilizar 4 frascos em autoclave, mantendo um frasco (n 5) fora da mesma como controle positivo; - Aps a autoclavao, em temperatura ambiente, medir o pH final que deve ser de 7,30,2C; - Apertar a tampa dos frascos (rosquear) e lev-los para estufa, inclusive n 5, por 72 horas a 350,5C; - Retirar da estufa e observar se houve alterao de cor. Resultados Caso a esterilizao seja eficiente no haver alterao de cor; Caso a esterilizao no seja eficiente, o meio passa de amarelo para branco leitoso. Neste caso deve ser repetido o teste aps confirmao da ineficincia da esterilizao. 7 AMOSTRAGEM 7.1 Embalagem para amostragem Coletar as amostras em frascos de volume mnimo de 100 mL, limpos, esterilizados em autoclave a 121C durante 15 minutos, contendo 3 gotas de soluo de Tiossulfato de Sdio 3% (para eliminar a possvel presena de cloro residual livre da amostra). Deve existir uma proteo de papel alumnio na tampa do frasco, que deve ser mantida desde o final da esterilizao do frasco at o instante do ensaio. O frasco deve ter uma vedao perfeita, para no permitir qualquer vazamento durante o transporte da amostra. Nota 9: Para gua bruta contendo metais pesados adicionar 0,3 mL de EDTA a 15% para cada 100 mL da amostra, antes da autoclavao do frasco.

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7.2 Tcnica de coleta Coletar a amostra sem enxaguar o frasco, tomando cuidado para no encostar qualquer objeto na boca do mesmo. Evitar conversar ou respirar diretamente no ato de enchimento do frasco. No ench-lo at a boca visando a homogeneizao da amostra. Amostras coletadas em torneiras: Abrir a torneira, aguardar aproximadamente um minuto e coletar a amostra. Amostras coletadas em superfcies: Amostras em canais, crregos ou corredeiras devem ser coletadas colocando a boca do frasco no sentido contrrio da correnteza; Amostras de superfcie ou reservatrios, quando no for possvel amostragem diretamente com o frasco de amostra, podem ser coletadas com auxlio de um frasco auxiliar amarrado em um cordo previamente higienizado ou esterilizado. Amostras coletadas em bicas ou ausncia de torneiras: Limpar a rea onde ser feita a coleta. Coletar a amostra. 7.3 Preservao da amostra As amostras devem ser preservadas a uma temperatura de 2 a 10C, sendo que o tempo mximo decorrido entre a coleta e o ensaio deve ser de 24 horas, podendo no caso de gua tratada atingir 30 horas. 8 INTERFERENTES Amostra com turbidez elevada pode inviabilizar o ensaio devido ao entupimento da membrana. Excesso de bactrias heterotrficas. Presena de cloro residual na amostra. 9 PROCEDIMENTO ANALTICO 9.1 Diluio ou diviso de amostras A diluio de amostras deve ser feita com o tampo, definida de acordo com sua procedncia: guas tratadas para consumo humano ou guas minerais ou guas de poos profundos no necessitam de diluies em uma primeira avaliao; guas de superfcie ou contaminadas: Quando se tratar de amostras analisadas com freqncia esperado que o tcnico de laboratrio saiba o valor da diluio. Caso contrrio deve optar por vrias propores de diluio da amostra. Tcnicas de diluio Baixas concentraes de coliformes Com auxlio de uma proveta estril de 100 mL fazer as diluies conforme tabela abaixo (usar uma proveta para cada diluio realizada): Diluio Volume da amostra Volume de tampo Fator de multiplicao nos resultados (f) mL mL 20% 20 80 5 30% 30 70 3,33 50% 50 50 2 60% 60 40 1,67 80% 80 20 1,25
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Altas concentraes de coliformes: diluies exponenciais de base 10; Utilizar frascos de diluio contendo 902 mL de tampo, e pipeta graduada esterilizada de 10 mL; Homogeneizar a amostra; Com auxlio da pipeta graduada, transferir 10 mL da amostra para o frasco de diluio com 90 mL de tampo; Agitar a mistura, esta diluio ser conhecida como 10-1; Com auxlio da pipeta graduada, transferir 10 mL da diluio 10-1 para outro frasco de diluio com 90 mL de tampo; aps agitao esta diluio ser 10-2; Fazer o mesmo procedimento anterior at obter a diluio desejada. Nos resultados, utilizar a tabela a seguir para corrigir o resultado final da anlise. Diluio 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Fator de multiplicao nos resultados f 101 102 103 104 105

Tcnica de diviso de amostra: Utilizar quando a concentrao bacteriana esperada for baixa, mas maior que 80 coliformes/100mL. Filtrar pores da amostra em membranas diferentes e inocular em placas distintas. O volume final de amostra filtrada deve ser 100 mL. Nota 10: Por exemplo: Filtrar pores de 5, 10, 15, 20 e 50 mL. Realizar a leitura de todas as placas considerando a quantidade de coliformes totais tpicos e atpicos como sendo a soma das contagens inferiores a 80 coliformes em cada uma das placas (p). 9.2 Preparao da sala de filtrao Todos os materiais utilizados neste ensaio devem ser previamente esterilizados de acordo com o item 6; Fazer assepsia da bancada e das mos com lcool Etlico 70%, aguardando a secagem; Acender o bico de Bnsen sobre a bancada onde for realizar o ensaio. 9.3 Procedimento bsico Verificar a esterilizao do tampo, meio de cultura e conjunto de filtrao antes e durante o processo de filtrao de amostra, filtrando 100 mL do tampo simulando uma amostra. Preparar o sistema de filtrao com a membrana de 0,45m. Homogeneizar a amostra. Medir a poro predeterminada da amostra e filtrar. Lavar com o tampo as paredes do copo do sistema de filtrao. Remover a membrana do sistema de filtrao com auxlio da pina flambada e esfriada e coloc-la na placa de Petri contendo o meio endo agar les. Tampar a placa e coloc-la em posio invertida em uma bandeja.

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Caso continue com outras filtraes de amostras, com o auxlio da pissete contendo tampo, lavar as paredes internas do conjunto de filtrao e repetir desde o incio do item 9.3. Aps a filtrao de todas as amostras, incubar as placas em posio invertida, em estufa de cultura a 350,5oC por 22 a 24 horas. Aguardar o prazo de incubao e retirar as placas da estufa. Observar se houve formao de colnias tpicas de coliformes totais (vermelhas com brilho verde metlico) e/ou colnias atpicas (vermelhas escuras ou colnias nucleadas sem brilho). Com o auxlio de um microscpio estereoscpico com aumento de 10 a 15 vezes e fonte de luz fluorescente, contar o nmero de colnias tpicas e/ou atpicas. Realizar a confirmao de colnias de coliformes totais conforme item 9.4. 9.4 Confirmao de termotolerantes colnias tpicas e atpicas de coliformes totais e

9.4.1 Confirmao de colnias tpicas e atpicas de coliformes totais PRESENA/ AUSNCIA Selecionar as placas que contenham colnias tpicas e/ou atpicas de coliformes totais; Repicar todas as colnias para um nico tubo de ensaio contendo caldo lactosado. 9.4.2 Confirmao de colnias tpicas e atpicas de coliformes totais QUANTIFICAO Selecionar as placas que forneceram contagem de colnias tpicas de coliformes totais (colnias vermelhas com brilho verde metlico) e/ou atpicas de coliformes totais (vermelhas escuras ou colnias nucleadas sem brilho metlico) entre 1 e 80 coliformes/100mL; Utilizar o critrio descrito abaixo para proceder o ensaio presuntivo: Repicar todas as colnias quando a contagem total for inferior a 10 colnias; Repicar 10 colnias, quando a contagem total for igual ou superior a 10 colnias, sendo quando possvel, 5 colnias tpicas e 5 colnias atpicas; Raspar toda a placa quando a contagem de colnias tpicas e atpicas de coliformes totais for superior a 80 coliformes/100mL e/ou quando o total de colnias de bactrias for superior a 200 coliformes/100mL ou ainda, quando houver crescimento confluente inviabilizando a contagem. 9.4.3 Ensaio presuntivo Transferir cada colnia ou raspar toda a placa utilizando ala de repique seguindo critrio estabelecido em 9.4.1 e 9.4.2 para um tubo contendo o meio de cultura caldo lactosado com prpura de bromocresol, de tal forma que cada colnia corresponda a um tubo, previamente identificado; Homogeneizar os tubos; Incubar todos os tubos a 350,5C, por 242 horas e mais 242 horas para tubos com resultados negativos; Aps o perodo de incubao, realizar leitura e confirmar os tubos positivos no caldo lactosado (mudana de colorao de roxa para amarela) seguindo item 9.4.4. 9.4.4 Ensaio confirmativo para coliformes totais Inocular cada tubo com resultado positivo no Caldo Lactosado (CL) com auxlio da ala de repique para cada tubo contendo meio de cultura Caldo Lactosado Verde Brilhante e
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Bile 2% (CLVBB), de tal forma que cada tubo de CL corresponda a um tubo de CLVBB, previamente identificado; Incubar todos os tubos contendo meio de cultura CLVBB a 350,5C, por 242 horas e mais 242 horas para tubos com resultados negativos; Aps o perodo de incubao, fazer leitura. 9.4.5 Ensaio confirmativo para coliformes termotolerantes Inocular todos os tubos com resultados positivos no Caldo Lactosado (CL) para um nico tubo contendo meio de cultura Caldo EC, previamente identificado; Incubar o tubo com o meio Caldo EC em banho trmico, a 44,50,2C por 242 horas. Aps o perodo de incubao, fazer leitura. 10 RESULTADOS 10.1 Ensaio presuntivo Aguardar o perodo de incubao e retirar os tubos com o meio CL e efetuar a leitura da seguinte maneira: - Resultado positivo: acidificao do meio evidenciada pela mudana de colorao do mesmo de roxa para amarela; - Resultado negativo: no acidificao do meio evidenciada pela no alterao da cor do mesmo (roxa). 10.2 Ensaio confirmativo para coliforme total PRESENA/AUSNCIA Aguardar o perodo de incubao e retirar os tubos com o meio CLVBB e efetuar a leitura da seguinte maneira: - Se no houver gs no tubo de Durhan o resultado ser dado como AUSNCIA de coliformes totais; - Se houver gs no tubo de Durhan o resultado ser dado como PRESENA de coliformes totais. 10.3 Ensaio confirmativo para coliforme total QUANTIFICAO Aguardar o perodo de incubao e retirar os tubos com o meio CLVBB e efetuar a leitura da seguinte maneira: - Resultado positivo: presena de gs no tubo de Durhan; - Resultado negativo: ausncia de gs no tubo de Durhan. Efetuar o clculo do resultado final de coliformes totais quando houver diluio ou no, conforme descrito abaixo:

Resultado final = N x P x f
(coliformes/100mL)

Onde: N o n de colnias confirmadas de coliformes totais no CLVBB; P n total de colnias (tpicas+atpicas) presentes na placa contendo m-endo agar les; R n de colnias submetidas confirmao; f o fator de diluio (quando houver) encontrado no item 9.1. Efetuar o clculo do resultado final de coliformes totais quando houver DIVISO da amostra, conforme descrito abaixo:

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Resultado final = N x p x F
(coliformes/100mL)

Onde: N o n de colnias confirmadas de coliformes totais no CLVBB; p n total de colnias (tpicas+atpicas) presentes nas placas com quantidade inferior a 80 coliformes; F o fator de diviso = 100 mL/V; R n de colnias submetidas confirmao. Nota 11: O resultado final de coliformes totais (tpicos e atpicos) poder ser superior a 80 COLIFORMES tanto na tcnica de diluio como de diviso. NOTA 12: Quando a contagem de colnias tpicas e/ou atpicas de coliformes totais for superior a 80 coliformes/100mL ou quando houver crescimento confluente inviabilizando a contagem, expressar o resultado como maior que 80 coliformes/100 mL. 10.4 Ensaio confirmativo para coliforme termotolerante PRESENA/AUSNCIA Aguardar o perodo de incubao da amostra no tubo com meio de cultura Caldo EC e efetuar a leitura da seguinte maneira: Se no houver gs no tubo de Durhan o resultado ser dado como AUSNCIA de coliformes termotolerantes; Se houver gs no tubo de Durhan o resultado ser dado como PRESENA de coliformes termotolerantes. 11 BIBLIOGRAFIA Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - 20 edio - 1998

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Coliformes Totais e Termotolerantes - Mtodo de membrana filtrante

Consideraes finais: 1) Esta norma tcnica, como qualquer outra, um documento dinmico, podendo ser alterada ou ampliada sempre que for necessrio. Sugestes e comentrios devem ser enviados Assessoria para Desenvolvimento Tecnolgico TVV. 2) Esta norma tcnica seguiu as orientaes dadas na NTS 160. 3) Tomaram parte na elaborao desta Norma: REA UNIDADE DE TRABALHO NOME

M
M

MCEC
MOEC

Maria Teresa Berardis

Patrcia da Silva Franco

M M R R R R R R R R T T T T T

MSOC MTO RAOC RBOC RGOC RMOC RMOC ROA RSOC RVOC TCCL TCCL TCCL TCCL TCCL

Mrcia Ceclia G. S. da Costa Moacir Francisco Brito Anna Cristina Kira Amlia Yoshie Ossugui Lus Antnio Salomo Denise de Oliveira Marina R. de Moura Kaneno Mauro Igncio Lcia Rodrigues de vila Jos Aparecido Oliveira Lemes Elvira Antonieta Simi Ely Yamamura Jos Borge Umbelino Lgia Marino Maria Clia Goulart

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Sabesp - Companhia de Saneamento Bsico do Estado de So Paulo Diretoria de Tecnologia e Planejamento - T Assessoria para Desenvolvimento Tecnolgico - TVV Rua Costa Carvalho, 300 - CEP 05429-900 So Paulo - SP - Brasil Telefone: (0xx11) 3388-8096 / FAX: (0xx11) 3814-6323 E-MAIL: marcoabarbosa@sabesp.com.br

- Palavras-chave: coliformes, determinao, contagem

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