UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU FURB

ELIZABETH APARECIDA KOLTZ WATTHIER

MTODO DE PR-CONCENTRAO E EXTRAO DE AGROQUMICOS ORGANOCLORADOS EM GUAS SUPERFICIAIS UTILIZANDO A TCNICA DE MICROEXTRAO LQUIDO-LQUIDO

BLUMENAU SC 2006

ELIZABETH APARECIDA KOLTZ WATTHIER

MTODO DE PR-CONCENTRAO E EXTRAO DE AGROQUMICOS ORGANOCLORADOS EM GUAS SUPERFICIAIS UTILIZANDO A TCNICA DE MICROEXTRAO LQUIDO-LQUIDO

Dissertao de Mestrado em Qumica Para a obteno do Ttulo de Mestre em Qumica Universidade Regional de Blumenau Departamento de Qumica Programa de Ps-Graduao em Qumica

Orientador: Doutor Marcos Rivail da Silva

BLUMENAU SC 2006

MTODO DE PR-CONCENTRAO E EXTRAO DE AGROQUMICOS ORGANOCLORADOS EM GUAS SUPERFICIAIS UTILIZANDO A TCNICA DE MICROEXTRAO LQUIDO-LQUIDO

Por

ELIZABETH APARECIDA KOLTZ WATTHIER

Dissertao apresentada para obteno do Ttulo de Mestre em Qumica, pela banca examinadora formada por:

_________________________________________________ Presidente: Prof. Dr. Marcos Rivail da Silva Orientador FURB

_________________________________________________ Membro: Prof.Dr. Marcio Barreto Rodrigues - UTFPR

_________________________________________________ Membro: Prof. Dr. Clodoaldo Machado - FURB

Blumenau, 08 de junho de 2006.

DEDICATRIA

Dedico este trabalho para meu marido Roque Roberto, aos meus filhos, Marina e Leonardo, e aos meus pais, pois o trmino s foi possvel devido compreenso e apoio da minha famlia.

AGRADECIMENTO

Tudo e todas as pessoas so importantes. A muitas devemos agradecer, a outras devemos amar eternamente. Porm, algumas agradecemos de forma especial. A Deus, o autor da vida e princpios de todas as coisas, pela oportunidade de ser o que sou. Especialmente ao meu marido Roque e aos meus filhos Marina e Leonardo, que sempre estiveram ao meu lado com seu apoio, compreenso e incentivo, principalmente nos momentos crticos desta jornada. Vocs so a essncia da magia, que a razo da minha energia, persistncia e luta. Aos meus pais, pelo amor, ensinamentos e preces que ajudaram a nutrir as foras e vencer todos os obstculos que surgiram nesta misso. Ao meu orientador professor Doutor Marcos Rivail da Silva pela pacincia, ensinamentos e apoio durante o desenvolvimento da dissertao. Ao Alberto Wisniewski Jnior que, pacientemente, colaborou com muitas informaes essenciais para o desenvolvimento deste trabalho. Ao meu amigo professor Marcio Barreto Rodrigues pela contribuio de conhecimentos e essencial ajuda na organizao e planejamento deste trabalho, alm do apoio e amizade. A minha amiga famlia Mariza Miola pelo incentivo desde o incio do mestrado e pela confiana depositada em mim. A Cleuza pela ateno aos meus filhos nos momentos de minha ausncia. Ao Lenidas da SANEPAR, pelo auxilio nas informaes e coletas. Aos meus colegas de mestrado que nos momentos difceis estavam junto para no deixar o desnimo vencer. E finalmente, agradeo a todas as pessoas que direta ou indiretamente contriburam para o desenvolvimento e elaborao deste trabalho: Roberta, Cleci, Vanessa, Rodrigo, Dirceu, professores do LPC (Laboratrio de Pesquisa em Combustveis), professores das disciplinas do mestrado e colegas da UTFPR.

O mais importante no parar de questionar. A curiosidade tem a sua prpria razo de ser. No podemos fazer nada seno contemplar extasiados os mistrios da eternidade, da vida, da maravilhosa estrutura da realidade. mais que suficiente tentarmos simplesmente compreender um pouco deste mistrio a cada dia. Nunca perca a sagrada curiosidade. Albert Einstein

RESUMO Muitos resduos de agroqumicos esto presentes em mananciais de guas em nvel de trao. Desta forma, o desenvolvimento e aperfeioamento das tcnicas analticas para o preparo de amostras tm sido de grande interesse para alcanar baixas concentraes e adequar os volumes da amostra aos sistemas de deteco. Para o desenvolvimento deste estudo foi empregada a tcnica de microextrao lquido-lquido, na investigao dos agroqumicos organoclorados, Aldrin, BHC(Lindane) e Heptacloro, utilizando o frasco de Murray modificado. A eficincia da extrao depende de uma srie de parmetros experimentais como o tipo do solvente orgnico extrator, tempo de repouso e tempo de agitao da amostra. De acordo com os experimentos foi estabelecido como melhor solvente orgnico o hexano, tempo de repouso e de agitao da amostra de 10 minutos. Foram estudadas as variaes dos fatores: pH, concentrao salina e tempo de agitao da amostra, enriquecida pelos agroqumicos, baseando-se em um planejamento fatorial 23 como ferramenta para encontrar as melhores condies de extrao dos analitos. A condio otimizada de extrao de acordo com o planejamento fatorial para os agroqumicos foi: pH 7,0, concentrao salina () de 5g de NaCl e tempo de agitao da amostra de 10 minutos. As curvas de calibrao foram construdas atravs pelo mtodo de calibrao externa, sob as condies de pH 5,0, concentrao salina de 117g (2,0 mol.dm-3) e tempo de agitao de 10 minutos. As recuperaes dos agroqumicos, Aldrin -BHC(Lindane) e Heptacloro ficaram entre 0,4 e 4,8g.dm-3, com valores do coeficiente de correlao (r2), 0,9892, 0,9986 e 0,9962, respectivamente. A metodologia proposta foi aplicada em amostras de guas da Bacia Rio Pato Branco e seus afluentes, Rio Divisa, Pinheiro, Captao do Rio Pato Branco, Lambedor, Mangueirinha e Panela no Estado do Paran, utilizando as condies demonstradas como as melhores pelo planejamento fatorial. Atravs da tcnica de microextrao lquido-lquido foi detectada no Rio Pinheiro a presena dos trs agroqumicos estudados com concentraes entre 0,3 e 0,5g.dm-3. Desta forma foi comprovada a eficincia do mtodo analtico para a deteco de concentraes em nvel de trao. Palavras-chave: guas - agroqumicos - microextrao lquido-lquido.

ABSTRACT

There are many agrochemicals residues in water sources in trace level. This way, the development and improvement of the analytical techniques to prepare the samples has been of great interest to reach low concentrations and to adapt the volumes of the samples to the detection systems. For the development of this study the liquid-liquid microextraction technique was used, in the investigation of the organochlorine agrochemical, Aldrin y-BCH (Lindane) and Heptachlor, using the Murray flask modified. The efficiency of the extraction depends on some experimental parameters such as the type of the extractor solvent, time of rest and shaking time of the sample. According to the experiments it established that the hexane was the best solvent, rest and shaking time of 10 minutes. Where studied the variation of the factors, pH, saline concentration and shaking time of the enriched sample water based on a factorial experimental 2 as tool to find the best conditions of the analytes extraction. The optimized condition of the extraction, according to the factorial experimental for the agrochemicals was: pH 7,0, saline concentration 5g NaCl and shaking time of the sample 10 minutes. The analytical curves were built through the calibration by the method, in the conditions of the pH 5,0, saline concentration 117g (2.0 mol.dm-3) and shaking time of 10 minutes. The recoveries of the agrochemicals Aldrin, y-BHC(lindane) and Heptachlor were between 0,4 and 4,8g.dm-3, with values of correlation coefficient (r), 0,9892, 0,9986 e 0,9962, respectively. The proposed methodology was applied in water samples from the Pato Branco River and its effluents, Rivers Divisa, Pinheiro, drinking water collection of Pato Branco River, Lambedor, Mangueirinha and Panela river in the state of Paran, using the demonstrated conditions as the best by the factorial experiment. Through the liquid-liquid microextraction technique were dectected on Pinheiro River the presence of three agrochemicals studied with concentrations between 0,3 and 0,5 g.dm-3. In this way, the efficiency of the analytical method for detection in concentrations in trace level was proved. Key-words: waters - agrochemicals - liquid-liquid microextraction.

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Frmula estrutural do agroqumico Aldrin .............................................................................. 23 Figura 2: Frmula estrutural do agroqumico -BHC(Lindane) ............................................................. 24 Figura 3: Frmula estrutural do agroqumico Heptacloro...................................................................... 25 Figura 4: Frasco de microextrao lquido-lquido. ............................................................................... 31 Figura 5: Frasco de microextrao lquido-lquido modificado.............................................................. 32 Figura 6: Frasco de microextrao utilizado por Zapf, Heyer e Stan .................................................... 32 Figura 7: Frasco de microextrao lquido-lquido modificado a partir do trabalho de Murray, utilizado no estudo dos agroqumicos organoclorados. ........................................................................ 40 Figura 8: Representao esquemtica do estudo e otimizao das condies de extrao dos agroqumicos utilizando o frasco de Murray.......................................................................................... 42 Figura 9: Mapa da Bacia do Rio Pato Branco - pontos de coleta ......................................................... 50 Figura 10: Cromatograma de estudos preliminares da amostragem sem adio de sal e sem correo de pH ...................................................................................................................................... 55 Figura 11: Estudo da recuperao dos diferentes tipos de solvente orgnicos, sem adio de sal na amostra e ausncia dos agroqumicos.................................................................................................. 57 Figura 12: Efeito do solvente orgnico extrator com adio de sal (KCl) na amostragem sobre a recuperao dos agroqumicos ............................................................................................................. 58 Figura 13: Formao de bolhas no brao lateral do frasco na recuperao do solvente orgnico durante o processo de extrao, utilizando o frasco de Murray modificado ......................................... 59 Figura 14: Recuperao do solvente orgnico hexano de acordo como a variao nos tempo 10, 30, 60 e 90 minutos de repouso. ........................................................................................................... 62 Figura 15: Cromatograma dos ensaios em triplicata realizados para o estudo do melhor tempo de repouso .................................................................................................................................................. 63 Figura 16: Estudo do tempo repouso na extrao dos agroqumicos em gua, sob agitao constante (900rpm) e temperatura ambiente (25C)............................................................................. 64 Figura 17: Recuperao dos agroqumicos sem adio de sal, 5g de sal na amostra (nvel -) e 112g de sal (nvel +) do planejamento fatorial ............................................................................................... 71 Figura 18: Diagrama para interpretao geomtrica dos efeitos da concentrao salina () e do pH 2 sob condies otimizadas para o Aldrin, no planejamento fatorial 2 ................................................... 73 Figura 19: Diagrama para interpretao geomtrica dos efeitos da concentrao salina() e do pH 2 sob condies otimizadas para o -BHC(Lindane), no planejamento fatorial 2 .................................. 74 Figura 20: Diagrama para interpretao geomtrica dos efeitos da concentrao salina () e do pH 2 sob condies otimizadas para o Heptacloro, no planejamento fatorial 2 ........................................... 74 Figura 21: Cromatograma da soluo padro 20mg/mL....................................................................... 76 Figura 22: Curva de calibrao para o agroqumico Aldrin ................................................................... 77 Figura 23: Curva de calibrao para o agroqumico -BHC(Lindane) .................................................. 78 Figura 24: Curva de calibrao para odo Heptacloro............................................................................ 79 Figura 25: Cromatograma de amostra de guas naturais do ponto 02 - Rio Pinheiro, na presena dos agroqumicos Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro....................................................................... 85

LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Variveis experimentais e respectivos nveis de estudo do planejamento fatorial.............. 46 Tabela 2 - Matriz de planejamento fatorial, demonstrando as combinaes das variveis experimentais em estudo....................................................................................................................... 46 Tabela 3 - Recuperao do Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro sem ajuste de pH e sem adio de sal na preparao da amostra.......................................................................................................... 55 Tabela 4 - Estudo da recuperao dos diferentes solventes extratores na ausncia dos contaminantes, com e sem adio de sal (KCl) na amostragem .......................................................... 56 Tabela 5 - Influncia da variao no tempo de repouso da amostra na recuperao do solvente orgnico extrator .................................................................................................................................... 61 Tabela 6 - Recuperao dos agroqumicos organoclorados de acordo com o tempo de repouso da amostra no frasco de microextrao ..................................................................................................... 62 Tabela 7 - Matriz de planejamento contendo os efeitos principais, secundrios e tri-fatorial de interaes e respostas em concentrao para os agroqumicos estudados ........................................ 65 Tabela 8 - Recuperao do agroqumicos de acordo com o ponto central conforme planejamento fatorial, desvio padro e coeficiente de variao .................................................................................. 66 Tabela 9 - Efeitos principais e de interaes calculados para as combinaes do planejamento 3 fatorial 2 a partir dos dados obtidos da Tabela 7 ................................................................................. 67 Tabela 10 - Dados obtidos atravs de ensaios experimentais para construo da curva de calibrao do Aldrin. .............................................................................................................................. 77 Tabela 11 - Dados obtidos atravs de ensaios experimentais para construo da curva de calibrao do -BHC(Lindane). ............................................................................................................. 78 Tabela 12 - Dados obtidos atravs de ensaios experimentais para construo da curva de calibrao do Heptacloro. ...................................................................................................................... 79 Tabela 13 Fator de recuperao dos analitos de acordo com a fortificao da amostra .................. 81 Tabela 14 - Limite de deteco e de quantificao dos agroqumicos organoclorados para a metodologia proposta ............................................................................................................................ 81 Tabela 15 - Descrio dos pontos de amostragem na Bacia do Rio Pato Branco, pH, temperatura do ar, temperatura da gua e profundidade da coleta .......................................................................... 83 Tabela 16 - Concentrao de organoclorados nas amostras de guas naturais da Bacia do Rio Pato Branco ........................................................................................................................................... 84

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Ai ANA ANVISA Ar BHC GC/MS CLAE CONAMA DDT DDTP DISAD EC ECD EPA - U.S EU C.S FAO FDA GC/ECD GPS HCl HPLC-MS HRGC-MS INMETRO IPTB KCl KOH LLE LOD LOQ mg -1 mg.mL MLLE NaCl -3 ng.dm OCPs OPPs pH ppb ppm 2 r rpm S SANEPAR SINDAG SPE SPME Sw T.A U.S.A UTM WHO -3 g.dm L

Unidades do analito introduzidas Agncia Nacional de guas Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria Unidades do analito recuperadas Hexaclorocicloexano Cromatografia gasosa acoplada a Espectrometria de massa Cromatografia lquida de alta eficincia Conselho Nacional do Meio Ambiente Dicloro Difenil Tricloroetano Dietilditiofosfato de amnio Diviso Nacional de Vigilncia de Produtos Saneantes Domissanitrios Comunidade Europia Deteco e captura de eltrons Environmental Protection Agency (Agncia de Proteo Ambiental dos Estados Unidos) Unio Europia Concentrao salina Organizao das Naes Unidas para e Agricultura e Alimentao Food and Drug Administration Cromatografia gasosa com deteco e captura de eltrons Global Positioning System cido clordrico Cromatografia lquida de alta eficincia acoplada a espectrometria de massa Cromatografia gasosa de alta resoluo acoplada espectrometria de massa Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial Instituto de Pesquisas Tecnolgicas de Blumenau Cloreto de Potssio Hidrxido de Potssio Extrao lquido-lquido Limite de deteco Limite de quantificao Miligrama Miligramas por mililitro Microextrao lquido-lquido Cloreto de Sdio Nanograma por litro Poluentes Orgnicos Persistentes Organofosforados Potencial Hidrogeninico Parte por bilho Parte por milho Coeficiente de correlao Rotao por minuto Desvio Padro Companhia de Saneamento do Paran Sindicato Nacional da Indstria de Produtos para Defesa Agrcola Extrao em fase slida Microextrao em fase slida Solubilidade em gua Tempo de agitao Estados Unidos da Amrica Universal Transverse Mercator Organizao Mundial de Sade Micrograma pr decmetro Microlitros

SUMRIO

INTRODUO.......................................................................................................... 13 1 OBJETIVOS .......................................................................................................... 15 1.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................ 15 1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS .............................................................................. 15 2 FUNDAMENTAO TERICA............................................................................. 16 2.1 AGROQUMICOS ............................................................................................... 16 2.2 AGROQUMICOS ORGANOCLORADOS NO BRASIL/PARAN E REGIO SUDOESTE .............................................................................................................. 19 2.3 LEGISLAO AMBIENTAL .............................................................................. 21 2.4 CLASSIFICAO E CARACTERSTICAS DOS ORGANOCLORADOS EM ESTUDO ................................................................................................................... 22 2.4.1 Aldrin - Grupo C ............................................................................................. 22 2.4.2 BHC - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - Hexaclorocicloexano - Grupo B................................ 23 2.4.3 Heptacloro - Grupo C..................................................................................... 24 2.5 TCNICAS DE EXTRAO E PR-CONCENTRAO DE AGROQUMICOS EM AMOSTRAS DE GUA...................................................................................... 25 2.5.1 Extrao Lquido-Lquido (LLE).................................................................... 26 2.5.2 Extrao em Fase Slida (SPE) .................................................................... 27 2.5.3 Microextrao em Fase Slida (SPME) ........................................................ 29 2.5.4 Microextrao Lquido-Lquido (MLLE)........................................................ 30 2.6 ANLISE CROMATOGRFICA DE AGROQUMICOS..................................... 34 2.7 VALIDAO DA METODOLOGIA DE EXTRAO ......................................... 35 2.7.1 Exatido .......................................................................................................... 35 2.7.2 Preciso .......................................................................................................... 36 2.7.3 Linearidade e Faixa Linear ............................................................................ 36 2.7.4 Limite de Deteco (LOD) e Limite de Quantificao (LOQ) ...................... 36 2.7.5 Recuperao .................................................................................................. 37 2.7.6 Robustez......................................................................................................... 37 2.8 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS ........................................................... 37 3 PARTE EXPERIMENTAL...................................................................................... 39 3.1 MATERIAIS E MTODOS.................................................................................. 39 3.1.1 Materiais Utilizados ....................................................................................... 39 3.1.2 Reagentes Utilizados ..................................................................................... 39 3.1.3 Solventes de Extrao................................................................................... 39 3.1.4 Padres de Agroqumicos............................................................................. 40 3.1.5 Amostra de gua Bruta ................................................................................. 40 3.1.6 Frasco de Murray Modificado - Caractersticas .......................................... 40 3.2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL.................................................................... 41 3.2.1 Preparo da Soluo Padro dos Agroqumicos.......................................... 41 3.2.2 Procedimento de Microextrao utilizando o Frasco de Murray Modificado ............................................................................................................... 41 3.2.3 Escolha do Solvente Extrator ....................................................................... 43

3.2.4 Contaminao da Amostra pelos Agroqumicos Organoclorados e Estudo do Tempo de Repouso antes da Pr-concentrao no Frasco de Murray Modificado .................................................................................................. 44 3.2.5 Determinao do Tempo de Repouso para Separao de Fases dentro do Frasco de Murray Modificado........................................................................... 45 3.3 METODOLOGIA DE ESTUDO DOS EFEITOS EXPERIMENTAIS, pH, CONCENTRAO SALINA E TEMPO DE AGITAO SOBRE A RECUPERAO DOS AGROQUMICOS ............................................................... 45 3.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS (GC/MS) ................................................................................................... 47 3.5 CURVAS DE CALIBRAO EXTERNA PELO MTODO ................................ 47 3.6 VALIDAO DO MTODO E DETERMINAO DOS AGROQUMICOS EM GUAS ..................................................................................................................... 48 3.6.1 Curva Analtica............................................................................................... 48 3.6.2 Linearidade e Faixa de Aplicao................................................................. 48 3.6.3 Recuperao .................................................................................................. 49 3.7 AMOSTRAGEM REAL - CARACTERSTICAS GERAIS DA REA EM ESTUDO BACIA DO RIO PATO BRANCO.......................................................... 49 4 RESULTADOS E DISCUSSES .......................................................................... 52 4.1 ESTUDOS PRELIMINARES DOS PARMETROS DE EXTRAO ................ 54 4.2 ESCOLHA DO SOLVENTE ORGNICO ........................................................... 56 4.3 ESTUDO DO TEMPO DE REPOUSO ................................................................ 60 4.4 ESTUDO DO EFEITO PRINCIPAL E INTERAES ENTRE AS VARIVEIS NA AMOSTRAGEM, DE ACORDO COM O PLANEJAMENTO FATORIAL ........... 64 4.5 EFEITOS PRINCIPAIS ....................................................................................... 68 4.5.1 Efeito do pH.................................................................................................... 68 4.5.2 Efeito da Concentrao Salina () ................................................................ 69 4.5.3 Efeito do Tempo de Agitao........................................................................ 71 4.6 INTERPRETAO GEOMTRICA DOS EFEITOS........................................... 72 4.7 VALIDAO DO MTODO DE DETERMINAO DOS AGROQUMICOS ORGANOCLORADOS EM AMOSTRAS AQUOSAS .............................................. 75 4.7.1 Curva Analtica............................................................................................... 75 4.7.2 Recuperao .................................................................................................. 80 4.7.3 Limite de Deteco e Limite de Quantificao ............................................ 81 4.8 AVALIAO DO IMPACTO EM MATRIZES REAIS USANDO AS CONDIES OTIMIZADAS ATRAVS DO PLANEJAMENTO FATORIAL (TIMAS) ................................................................................................................. 82 CONCLUSO........................................................................................................... 86 REFERNCIAS ........................................................................................................ 89

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INTRODUO

aumento

da

populao

gera

maior consumo

de

alimentos e,

conseqentemente, aumento do uso de agroqumicos para o controle de ervas daninhas, doenas e pragas que atacam a produo agrcola. O Brasil dispe de uma das maiores reas agricultveis do mundo, sendo um dos primeiros no ranking de vendas de agroqumicos. O intensivo de produtos agrcolas, muitas vezes sem receiturio agronmico adequado, leva a produo de grandes quantidades de resduos que afetam os diversos ecossistemas existentes. Desde o incio da dcada de 1980 algumas classes de agroqumicos fazem parte das listas vermelhas e/ou negras desenvolvidas pelos rgos de proteo ambiental como a Agncia de Proteo Ambiental (EPA) ou a Comunidade Europia (EC). Nesta relao, agroqumicos como os organoclorados que so de grande periculosidade, esto includos. Sabe-se, no entanto, que resduos destas espcies qumicas tm sido encontrados no meio ambiente. Apesar do rigor e da severidade da legislao ainda existe uma grande preocupao com relao a entrada ilegal de produtos agroqumicos no Brasil. inclusive agroqumicos falsificados sem ao alguma no controle das pragas ou com ao danosa aos seres vivos, colocando em risco o prprio cultivo agrcola. Muitos agroqumicos apresentam efeito nocivo ao meio ambiente e devem ser recomendados de maneira criteriosa a fim de reduzir o impacto ambiental. A necessidade de reduzir o impacto ambiental tem despertado o interesse cientfico em pesquisas que visam contribuir para a identificao, anlise e monitoramento dos compostos encontrados nos diferentes compartimentos ambientais (gua, solo e ar). Dentre todas as preocupaes, a gua por ser um dos elementos de maior importncia para todas as formas de vida na terra, o compartimento ambiental que mais sofre contaminao qumica por agroqumicos. Atravs da gua, todas as espcies qumicas no degradadas podem chegar at os organismos vivos e, dependendo da concentrao e da bioacumulao ao longo da cadeia trfica, podem causar danos sade, como tambm tornarem-se cancergenos. Os organoclorados, por exemplo, quando presentes no metabolismo dos seres vivos so solveis em gorduras e se bioacumulam em nveis txicos por grande perodo de tempo.

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Em funo desta problemtica, muitas tcnicas de digesto e/ou extrao tm sido desenvolvidas e aperfeioadas, visando a pr-concentrao de agroqumicos em guas para posterior quantificao. A anlise quantitativa exige mtodos analticos eficientes que consigam detectar e quantificar nveis cada vez mais baixos em matrizes ambientais. Este trabalho prope o estudo de um mtodo de pr-concentrao de agroqumicos organoclorados em matrizes aquosas atravs do processo de microextrao lquido-lquido utilizando o frasco de Murray modificado, levando em considerao a influncia de fatores como: pH, concentrao salina, tempo de agitao da amostra, bem como o solvente extrator a ser usado. Espera-se que este trabalho possa contribuir para melhorias na recuperao de analitos, utilizando pequenas quantidades de solvente orgnico para o preparo da amostra, economizando custo e tempo. Com o objetivo de diminuir o nmero de ensaios laboratoriais, durante a avaliao dos efeitos dos fatores experimentais propostos, utilizou-se uma estratgia multivariada fundamentada em planejamento fatorial de experimentos. Diante destes aspectos, com base na literatura, foi otimizada a metodologia de microextrao lquido-lquido, em amostras fortificadas com os agroqumicos organoclorados, Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro e, posteriormente, testou-se com amostras reais coletadas na Bacia Hidrogrfica do Rio Pato Branco e seus afluentes, responsveis pelo abastecimento de gua da cidade de Pato Branco - PR. O mtodo instrumental empregado para a anlise aps preparao das amostras de gua (sintticas e reais) foi a cromatografia gasosa, com o emprego de um detector de espectrometria de massa (GC/MS). Este mtodo instrumental tem sido indicado em literatura como um dos mais eficientes devido a sua grande confiabilidade e sensibilidade.

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1 OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GERAL

Esse trabalho tem como objetivo geral o estudo e otimizao de um mtodo simples e eficiente para determinao dos agroqumicos Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro em guas, empregando a tcnica de microextrao lquido-lquido, utilizando o Frasco de Murray modificado para posterior anlise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa.

1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

- Avaliar o uso de diferentes solventes orgnicos para pr-concentrar e extrair agroqumicos organoclorados das amostras de guas; - Verificar a influncia dos fatores como, concentrao salina, pH, tempo de agitao e tempo de repouso na preparao da amostra; - Otimizar a metodologia, para extraes em nvel trao de compostos organoclorados em matrizes aquosas; - Validar a metodologia levando em considerao os efeitos de variao dos fatores e suas respostas obtidas atravs de um planejamento experimental; - Avaliar a presena de molculas de organoclorados, proibidos por lei, em guas utilizadas para o consumo humano na Bacia Hidrogrfica do Rio Pato Branco.

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2 FUNDAMENTAO TERICA

2.1 AGROQUMICOS

A agricultura vem fazendo um grande esforo para alm de aumentar o setor produtivo de alimentos promover colheitas com maior qualidade. A produo agrcola contribui de forma efetiva para a contaminao das guas, tanto em nveis superficiais ou subterrneos, seja por meio de despejos de substncias eutrofizantes como os fertilizantes base de fsforo e nitrognio, seja pelos detritos de animais, que pela ao das chuvas so carregados para os recursos hdricos ou, ainda, pelo uso inadequado dos agroqumicos (DORES, 2001; MAGOSSI apud MACDO, 2002; SANTOS NETO, 2005). Segundo a Lei Federal n 7.802 de 11/07/89 o termo agroqumico definido da seguinte forma:
Os produtos e os componentes de processos fsicos, qumicos ou biolgicos destinados ao uso nos setores de produo, armazenamento e beneficiamento de produtos agrcolas, nas pastagens, na proteo de florestas nativas ou implantadas e de outros ecossistemas e tambm em ambientes urbanos, hdricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composio da flora ou fauna, a fim de preserv-la da ao danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como substncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores do crescimento.

Conforme cita Bortoluzzi (2005), os agroqumicos compem-se de uma grande variedade de princpios ativos e concentraes. Aps a aplicao, uma parte alcana o alvo sanitrio, cumprindo a sua finalidade, porm outra liberada no ambiente interagindo com o solo, a gua e a atmosfera (DONG, 2005). A transferncia de molculas de agroqumicos no ambiente regida por uma srie de fenmenos, como: evaporao, lixiviao e adsoro. O solo tem o papel de receptor e de agente tamponante para certas molculas, reduzindo assim a possibilidade de contaminao das guas. No entanto, o uso e o manejo imprprio do solo, restringem sua capacidade de reteno de gua (menor taxa de infiltrao), elevando a possibilidade de contaminao dos mananciais. Esta problemtica particularmente importante para as micro-bacias hidrogrficas destinadas ao abastecimento pblico, pois, segundo a legislao em vigncia, a gua nessas condies precisa ser de excelente qualidade.

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Segundo as consideraes de Rissato (2004) o problema de intoxicaes por agroqumicos preocupa principalmente pelo fato de que essas acontecem pela ingesto gradativa destes produtos que contaminam a gua, o solo e uma variedade de alimentos. O uso de muitos destes compostos foi proibido devido constatao dos efeitos cumulativos e prejudiciais, que ocorre pela transferncia de pequenas quantidades ao longo das cadeias alimentares (GONALVES, 2002). De acordo com a Agncia de Proteo Ambiental, (EPA Environmental Protection Agency), o uso difundido de organoclorados persistentes (OCPs) em pocas passadas criou preocupao ambiental significativa devido a grande persistncia. A natureza perigosa dos OCPs um resultado da sua toxicidade e liposolubilidade (FIDALGO, 2003). Autores como Galassi (1996) e Lanas (1996) apud RISSATO (2004), afirmam que os agroqumicos organoclorados so relativamente inertes quando comparados a outras classes de agroqumicos, pois possuem alta estabilidade devido s ligaes carbono-cloro apresentadas em sua estrutura qumica. Entretanto, conforme Grande (2003), so conhecidos por sofrerem desidroclorao, oxidao, desclorinao, rearranjos, hidrlise e reaes fotoqumicas. Estes compostos so muito estudados, devido alta toxicidade, baixa biodegradabilidade e biossolubilidade em tecido lipdico (BASHEER, 2005). O emprego de agroqumicos organoclorados nas ltimas dcadas conforme afirma Guzzella (2004), tem produzido acumulao de resduos txicos em vrios ecossistemas de todo o mundo e, de acordo com informaes citada por Amato (2002), podendo ser transportados por grandes distncias, retidos no organismo de animais migrantes marinhos (ROUTTI, 2004). Para Oliveira (1995), a concentrao destes compostos tem alcanado nveis txicos em vrios organismos terrestres, como pssaros e mamferos, assim como em organismos aquticos. Zhou (2001) apud AMATO (2002), reportou contaminaes de organoclorados em algumas amostras de gua, partculas em suspenso e sedimentos, na Baa de Daya, China. Segundo este autor, os perfis de distribuio destes poluentes sugerem que existem vrias fontes contribuindo para a contaminao da baa, incluindo lixiviao de solos, descargas de guas contaminadas por lixo, esgoto e detrito de indstria naval. Os resduos de agroqumicos organoclorados tm se tornado parte intrnseca dos ciclos biolgicos, geolgicos e qumicos da Terra e tm sido detectados no ar, gua, solo, plantas,

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invertebrados marinhos e mesmo em locais onde eles no so empregados. Para Campanilli (2004), os nveis de organoclorados na gua dos oceanos tm causado srios problemas ecolgicos como, por exemplo, o fracasso da reproduo da truta-do-mar, na Laguna Madre, no Texas, e da guia-marinha, no Bltico (FLORES, 2004-b). Alm disso, tem-se encontrado golfinhos contaminados com DDT, desde o litoral paulista at regies da Antrtida. Para Drea (2004), a eliminao das pragas que atacam a agricultura, atravs dos agroqumicos proporciona benefcio inquestionvel na produo dos alimentos. Porm, os resduos de pesticidas permanecem nos alimentos, no solo, nas guas subterrneas e nas guas de descarte aps a aplicao desses componentes qumicos. Lopes (2003), em outro estudo cita que esses compostos so altamente nocivos ao homem, podendo causar efeitos adversos ao sistema nervoso central e perifrico, ter ao imunodepressora, ser cancergeno, entre outros males. Em gua potvel podem aumentar os riscos de ocorrncia de cncer, bem como causar danos ao sistema: nervoso, cardaco, endcrino e reprodutivo (BAIRD, 2002; GRANDE, 2003). Na dcada de 1960 conforme Roberts (1999), verificou-se uma grande contaminao ambiental em vrios pases do mundo, como principal contaminante encontrou-se o Dicloro Difenil Tricloroetano (DDT), seguido por outros que tambm so responsveis pela contaminao, entre eles esto o endrin, o lindano, o aldrin, o dieldrin, o heptacloro, o clorodano e o endossulfano: famlia dos compostos organoclorados com potencial txico. Segundo Konradsen (2004), na Europa, os agroqumicos, organoclorados em especial o DDT, foram considerados produtos milagrosos a tal ponto que, para prevenir uma epidemia de tifo (doena transmitida por piolhos) que ocorria em Npoles (1943-1944), as tropas americanas e a populao local foram pulverizadas com este produto, contribuindo para a diminuio da doena. O efeito do DDT foi to prolongado, que uma vez aplicado s paredes internas de uma casa, matava qualquer inseto que ali pousasse, mantendo essa ao por vrios meses. De acordo com Mozaz (2004), alm da diversificao destes compostos, a sua utilizao na agricultura disseminou-se por todo o planeta. Para agravar as condies ambientais, cita Queiroz (2001), que em 1967 j haviam sido aplicadas em lavouras de todo o planeta aproximadamente 1.700.000 toneladas de agroqumicos, comprometendo a sanidade dos recursos naturais, bem como, a

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fauna, a flora e a sade humana. Amato (2002) reportou que a elevao da temperatura e a influncia do pH nos compostos organoclorados em corpos dgua afetam tanto a sua solubilidade quanto a volatilidade destes compostos. Em corpos aquticos, como rios e lagos, os organoclorados tm maior probabilidade de estarem ligados superfcie do material particulado orgnico em suspenso e aos sedimentos nas regies mais profundas do que estar dissolvidos na prpria gua. Devido a esse fenmeno, a concentrao de organoclorados freqentemente tem atingido nveis perigosos em muitas espcies (BAIRD, 2002). Quanto ao transporte dos organoclorados, conforme Fatoki (2003), pelo fato de possuir baixa solubilidade em gua, o DDT e demais organoclorados, quando carreados para corpos dgua (lagos, rios etc) tendem a se acumular na superfcie. Agroqumicos de baixa solubilidade em gua tendem a escapar da fase aquosa e aderir a substncias lipoflicas que ocorrem no sistema, ou se suas presses de vapores forem altas o suficiente, volatilizam gradualmente para a atmosfera (GRANDE, 2003). A exemplo do que acontece com outros agroqumicos organoclorados, o transporte atmosfrico a principal via de disseminao do ambiente aqutico. Sua baixa presso tambm no impede que os organoclorados existentes na superfcie do solo se volatilizem, diluindo para o ambiente atmosfrico e, assim, pode ocorrer que as molculas dos pesticidas sejam carreadas por meio da ao elica ficando em suspenso no ambiente atmosfrico (MACDO, 2002).

2.2 AGROQUMICOS ORGANOCLORADOS NO BRASIL/PARAN E REGIO SUDOESTE

Queiroz (2001) observa algumas tendncias na cincia dos agroqumicos como resultado da mudana no uso de pesticidas e no desenvolvimento de novos produtos. Segundo a autora, observa-se o decrscimo no uso de inseticidas persistentes (de longo tempo), tais como organoclorados, substitudos por agroqumicos mais polares e mais rapidamente degradados (tempo de meia-vida curto), como exemplo cita-se os N-metilcarbamatos. Tambm se pode substituir o uso de herbicidas tradicionais, tais como, triazinas, cidos clorofenoxi e fenilurias

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pelos sulfonilurias e imidazolinonas, que apresentam uma baixa dose de aplicao e alto grau de biodegradao. No Brasil, conforme um relatrio apresentado em 2001 pela Agncia Nacional de guas (ANA), cerca de 70% dos rios que fazem parte das bacias hidrogrficas que vo do Sergipe ao Rio Grande do Sul apresentaram altos ndices de contaminao, principalmente por efluentes urbanos, substncias lixiviadas de grandes lixes e agroqumicos. Quanto ao Estado do Paran, segundo pesquisas realizadas pelo Sindicato Nacional da Indstria de Produtos para Defesa Agrcola (SINDAG, 2005), um dos estados, juntamente com o Mato Grosso do Sul, que recebe grandes quantidades de produtos ilegais, entre eles inclusive agroqumicos falsificados, sem ao alguma no controle de pragas, pois o alto valor do produto nacional faz com que o estado fique suscetvel ao recebimento de produtos ilegais. De acordo com artigo publicado por Silva (2004), alguns resduos de agroqumicos organoclorados foram monitorados em sedimentos de superfcie dos rios como: Chopim e seus afluentes, Caldeiras, Bandeira e Lontras, localizado no municpio de Palmas - PR. Segundo os autores, os agroqumicos organoclorados em estudo nas amostras de gua foram extrados atravs de extrao em fase slida (SPE). Os extratos foram analisados por cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massa, entre eles esto: BHC (hexaclorocicloexano), aldrin e o heptacloro-epxido em amostras de guas. No Rio Caldeira, que o principal responsvel pelo abastecimento de gua pblica do municpio de Palmas, foi encontrado o aldrin em quantidade trs vezes superior ao permitido conforme legislao do Ministrio da Sade Portaria n 518 de 25 de maro de 2004. O BHC tambm foi encontrado, mas com concentraes abaixo dos valores mximos preconizados pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA). Tambm nesta mesma linha, Andreoli (2004) fez um levantamento e monitoramento dos nveis de agroqumicos entre 1994 e 1998 nas guas in natura e tratada nos municpios de Curitiba e de Londrina. Os agroqumicos pesquisados foram: Andrin, BHC, Clordano, HCB, Heptacloro, Lindano, Parathion, entre outros. No municpio de Curitiba, em 100% das anlises realizadas, no foram encontrados quaisquer nveis de agroqumicos. No laboratrio de Londrina foram encontrados resduos em 0,966% de amostras na gua tratada e 2,012% amostras de gua in natura.

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Portanto, pode-se dizer que apesar dos baixos percentuais apresentados, evidenciam a absoluta inadequao da norma em relao realidade agrcola do Paran, pois no garantem que a gua no apresenta problemas, sendo que muitos dos produtos pesquisados, j esto proibidos pela Portaria 329/2002 de 02 de setembro de 1985 e no so monitorados (ANDREOLI, 2004).

2.3 LEGISLAO AMBIENTAL

De acordo com Tiburtius (2004), nas ltimas dcadas, o aumento populacional e o conseqente aumento das atividades industriais vm contribuindo para o agravamento dos problemas ambientais, principalmente com respeito preservao das guas superficiais e subterrneas. A Unio Europia (EU) preconiza que a concentrao de agroqumicos individuais em gua potvel no deve exceder 0,1 g.dm-3, para agroqumicos individuais e 0,5g. dm-3 para o total de agroqumicos encontrados. A quantificao a este nvel requer limites de deteco de 0,01g. dm-3 (LUTHJE, 2004). O Brasil apresenta uma legislao que tambm regulamenta os nveis mximos de agroqumicos em gua potvel, baseados em sua periculosidade, similarmente a EPA. A portaria nmero 518 de 25 de maro de 2004 do Ministrio da Sade, estabelece padres de potabilidade para substncias qumicas que representam riscos a sade, entre elas esto os organoclorados em estudo: Aldrin 0,03g.dm-3, y-BHC(Lindane) 2g.dm-3 e Heptacloro 0,03g.dm-3. Tanto a EC como o EPA colocam o Aldrin, o y-BHC (Lindane) e o Heptacloro (agroqumicos estudados neste trabalho) nas listas vermelhas e/ou negras, tendo estes maiores

periculosidades de acordo com a toxicidade, persistncia e uso (AMATO, 2002). Deve-se lembrar que a portaria 329 de 02 de setembro de 1985 do Ministrio da Sade probe em todo o territrio nacional, a comercializao, o uso e a distribuio dos produtos organoclorados destinados agropecuria. Sendo que a Portaria 11 do Ministrio da Sade Sistema Nacional de Vigilncia Sanitria, em de 8 de janeiro de 1998 proibiu completamente (Aldrin, DDT, Endrin, Heptacloro e outros), para todos os setores da agricultura e produtos domissanitrios.

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2.4 CLASSIFICAO E CARACTERSTICAS DOS ORGANOCLORADOS EM ESTUDO

Todas as espcies de agroqumicos podem ser classificadas de acordo com sua toxicologia que indica o risco oferecido pelo uso de uma substncia ou produto qumico sade dos seres vivos, em especial aos seres humanos. Segundo o Ministrio da Sade essa classificao foi estabelecida pela portaria nmero 04 da Diviso Nacional de Vigilncia de Produtos Saneantes Domissanitrios (DISAD) de 30 de abril de 1980, que especifica a classificao toxicolgica em: Classe I Aquela onde se encontram as substncias ou compostos qumicos considerados Altamente Txicos para o ser humano. Classe II Aquela onde se encontram as substncias ou compostos qumicos considerados Mediamente Txicos para o ser humano. Classe III Aquela onde se encontram as substncias consideradas Pouco Txicas para os seres humanos. Classe IV Aquela onde se encontram substncias ou compostos qumicos considerados Praticamente no Txicos para o ser humano. Os agroqumicos organoclorados podem ser divididos em grupos (A, B, C e D) de acordo com a semelhana (frmulas estruturais, ao sobre os insetos etc). Os agroqumicos organoclorados, objeto deste estudo, foram descritos a seguir segundo aspectos gerais relacionados toxicidade, suas propriedades fsicoqumicas, seus impactos sobre os ecossistemas e outras caractersticas de relevncia ambiental.

2.4.1 Aldrin - Grupo C

O Aldrin foi descoberto em 1948, nos Estados Unidos, por Julius Hyman sendo fabricado comercialmente em 1950 (GRANDE, 2003). Sua ao se d atravs da ingesto, contato ou fumigao. Usado na pulverizao e tratamento sendo que o calor diminui seu poder residual, pois a volatilidade aumenta com a elevao da temperatura, mesmo assim pode-se dizer que o Aldrin possui um bom poder residual. Segundo Baird (2002), o Aldrin solvel em quase todos os compostos orgnicos e insolvel na gua. O Aldrin apresenta-se no estado slido, cristalino,

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pouco voltil, quase sem odor e de cor levemente pardacenta, bastante txico ao homem quando ingerido, apresenta tempo de meia vida de 760 dias temperatura de 25C e pH 7, com solubilidade em gua Sw = 17 - 180g.dm-3 a 25C (MONTGOMERY, 1997). O Aldrin foi utilizado no Brasil no tratamento do solo para pr-plantio, no controle de pulgas, moscas, piolhos, caros, cupins e formigas. Este agroqumico provoca bioacumulao nos tecidos gordurosos, efeitos sobre o meio ambiente, resduos prolongados, riscos toxicolgicos indevidos. Entrou no mercado para complementar o DDT (BAIRD, 2002). Segundo Solomons (1996), o Aldrin pode ser obtido por uma reao de Diels-Alder entre o hexaclorociclopentadieno e norbornadieno. Sua frmula qumica molecular C12H8Cl6 e sua frmula estrutural apresentada na figura 1.

Figura 1: Frmula estrutural do agroqumico Aldrin Fonte: Compendium of Pesticide Common Names, 2006

2.4.2 BHC - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - Hexaclorocicloexano - Grupo B

O BHC foi sintetizado por Michael Faraday, em 1825 e a existncia de estereoismeros foi demonstrada em 1912, por Van der Linden. um dos inseticidas mais conhecidos, foi utilizado no controle de gafanhotos e vrias outras pragas do solo, principalmente broca do caf. Para Grande (2003), o BHC consiste de uma mistura de uma srie de ismeros em diferentes percentagens. Segundo Oliveira (1995), a composio centesimal desta mistura de 65 - 70% para o ismero , 7-10% para o ismero , 14-15% para o ismero , 7% para o ismero e 1 - 2% para impurezas e -(Lindano) possui

subprodutos. Dentre esses compostos, somente o ismero propriedades inseticidas.

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De acordo com Grande (2003), este agroqumico insolvel em gua e solvel em benzeno, clorofrmio, ter dietlico e hexano. Aparentemente no sofre reaes fotoqumicas na atmosfera e nem hidrlise (BAKAN, 2004). No Brasil o consumo deste agroqumico foi utilizado em maior escala no Estado de So Paulo devido a enorme quantidade de culturas cafeeiras. No homem esses compostos podem ser identificados no sangue, no plasma, no soro, no tecido adiposo e no leite. Em pocas passadas foi este o ingrediente ativo de vrias preparaes mdicas comerciais usadas para liberar crianas de piolhos e sarna e tambm no tratamento de sementes e mudas (BAIRD, 2002). O BHC pode ser obtido atravs da clorao do benzeno em presena de luz ultravioleta. De acordo com Queiroz (2005), este produto pode ser aplicado por contato, ingesto ou fumigao, apresenta cheiro desagradvel, se encontra na forma de p amorfo, voltil, acinzentado ou ligeiramente pardo, insolvel em gua dissolvendo apenas 0,0062mg de BHC em um litro de gua. Sua frmula qumica molecular C6H6Cl6 e sua frmula estrutural apresentada na figura 2.

Figura 2: Frmula estrutural do agroqumico -BHC(Lindane) Fonte: Compendium of Pesticide Common Names, 2006

2.4.3 Heptacloro - Grupo C

Segundo Baird (2002), o Heptacloro em estado puro slido, de cor branca, cristalina, com leve odor de cedro. Apresenta solubilidade em gua Sw = 180 g.dm-3 a 25C (MONTGOMERY, 1997). solvel em cetonas, benzeno, tetracloreto de carbono, hexano, xileno etc. apresenta poder residual curto por ser bastante voltil, estvel ao calor, luz, umidade e ar. Nos animais e nos seres humanos tido como de toxidade aguda oral. O Heptacloro mata insetos por ingesto, contato e fumigao.

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No Brasil foi usado no cultivo de arroz, milho, cana, banana, essncias florestais e em aplicaes localizadas no controle de cupins, besouro cinzento-preto, besouro da banana e formigas (GRANDE, 2003). Sua frmula qumica molecular C10H5Cl7 e sua frmula estrutural apresentado na figura 3:

Figura 3: Frmula estrutural do agroqumico Heptacloro Fonte: Compendium of Pesticide Common Names, 2006

2.5 TCNICAS DE EXTRAO E PR-CONCENTRAO DE AGROQUMICOS EM AMOSTRAS DE GUA

Existem vrias publicaes como de Barrionuevo (2002), Carasek (2002), Doong (1999), Drea (2004), Facchin (1997), Flores (2004-a), Rissato (2004), Santos Neto (2005), que descrevem os processos de preparao de amostras para anlise de agroqumicos individuais ou classes de compostos. Neste trabalho sero apresentados os mtodos de extrao e pr-concentrao mais utilizados com agroqumicos, para posterior quantificao. Segundo Queiroz (2001), as tcnicas de extrao e pr-concentrao tm como objetivo obter uma subfrao da amostra original enriquecida com o substrato de interesse analtico, de forma que se obtenha uma separao cromatogrfica livre de interferentes, com deteco adequada e um tempo razovel de anlise. De acordo com Drea (2004), quando se deseja a deteco em nveis de traos, a instrumentao existente tem que possibilitar sensibilidade analtica suficiente para sua deteco. Alm disso, comumente no se analisam amostras em sua forma aquosa ou slida, pois elas podem conter espcies interferentes e serem incompatveis com os equipamentos analticos (CARASEK, 2002). Segundo os autores, uma opo para essa problemtica empregar procedimentos de preparo da amostra, os quais envolvem vrias etapas: coleta, armazenagem, solubilizao,

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extrao, pr-concentrao, isolamento dos compostos de interesse e anlise qualitativa e quantitativa. Para Oliveira (2004), a amostragem o passo inicial e uma das etapas mais crticas. Tanto as agncias de regulamentao quanto os rgos de pesquisa levam em considerao a representatividade da amostra. Quantidade suficiente de amostra deve ser coletada de forma a representar a variabilidade total do sistema, com garantia da integridade da amostra at o momento da anlise. Quando se trata de agroqumicos, em muitos casos, as meias-vidas dos pesticidas e as baixas concentraes (g.dm-3) so dependentes das condies de estocagem (pH, exposio luz e temperatura). De acordo com Dores (2001), deve-se ressaltar que a concentrao das substncias qumicas em meio aquoso apresenta-se baixa, pelo fato de muitas vezes serem pouco solveis ou devido ao efeito da diluio. Citando Carasek (2002), as perdas podem ser devido adsoro dos agroqumicos nos frascos, hidrlise, biodegradao, fotlise e evaporao. Cada um destes mecanismos ir depender das propriedades fsico-qumicas dos agroqumicos e da matriz. Em se tratando de agroqumicos como os organoclorados, ressalta-se a dificuldade de interpretar o tempo de sua presena no ambiente, pois tanto pode indicar que foi despejado recentemente no local, ou transportado por longas distncias pela atmosfera, ou ainda um resduo remanescente de seu uso em uma poca passada (AMATO, 2002),. Komatsu (2004), cita que as tcnicas de extrao mais usadas para amostras lquidas dividem-se em: extrao lquido-lquido (LLE), extrao em fase slida (SPE), estando em ascenso microextrao em fase slida (SPME). Alm dos procedimentos de extrao citados, outra tcnica que vem sendo estudada e desenvolvida a microextrao lquido-lquido (MLLE). Neste estudo, ser visto detalhadamente cada uma destas tcnicas, em especial o mtodo de microextrao lquido-lquido.

2.5.1 Extrao Lquido-Lquido (LLE)

A extrao lquido-lquido uma das tcnicas mais simples de extrao, onde ocorre a partio da amostra entre duas fases imiscveis, a orgnica e a aquosa (BRONDI, 2005). Segundo Queiroz (2001), a eficincia da extrao depende

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da afinidade do soluto pelo solvente orgnico de extrao, da razo das fases e do nmero de extraes. Essa forma de extrao considerada uma tcnica clssica de preparo de amostras e tem sido utilizada na anlise de diversos tipos de substncias (LPEZBLANCO, 2003). A LLE apresenta vantagens de ser limpa e possuir um nmero grande de solventes extratores puros disponveis comercialmente, que fornecem amplas faixas de solubilidade e seletividade (TAHBOUB, 2005). Entretanto, tambm possui uma srie de desvantagens, tais como: as amostras com alta afinidade pela gua so parcialmente extradas pelo solvente orgnico, resultando em perdas do analito; impurezas do solvente extrator so concentradas junto com a amostra, implicando no uso de solventes ultrapuros; pode ocorrer a formao de emulses, o que implica em grande consumo de tempo; volumes relativamente grandes de amostras e de solvente extratores so requeridos, gerando problemas de descartes; alguns solventes orgnicos so txicos; o processo suscetvel a erros e, relativamente, de fcil automao (CARASEK, 2002; DINIZ, 2004). Essas desvantagens esto abrindo amplo espao para a tcnica de microextrao lquidolquido, que est sendo considerada alternativa vivel para pr-concentrao de compostos em gua (QUEIROZ, 2001). Ferracini (2005), realizou um trabalho usando o mtodo extrao lquidolquido seguida de cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE) para a determinao simultnea de hexazinone e tebutiuron em amostras de gua. A validao do mtodo proposto foi obtida por meio da avaliao dos parmetros de linearidade, limite de deteco (LOD), limite de quantificao (LOQ), exatido e preciso. Segundo os autores, a resoluo na linha de base dos herbicidas foi obtida aps um estudo das condies cromatogrficas. Os resultados obtidos mostraram por meio dos parmetros de validao, ser eficiente e confivel para a determinao dos herbicidas tebutiuron e hexazinone em amostras de gua subterrnea.

2.5.2 Extrao em Fase Slida (SPE)

Para Santos Neto (2005), a extrao em fase slida muito empregada para a extrao e/ou pr-concentrao do analito presente em matrizes complexas, permitindo que concentraes em nveis muito baixas sejam detectadas pelos instrumentos. Conforme Perez-Trujillo (2002), a SPE, quando comparada com a LLE

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possui avanos importantes, pois permite uma grande reduo na quantidade de solventes extratores e amostras para cada extrao. Alm disso, muitos analitos polares, tais como, produtos de degradao de micropoluentes, no podem ser extrados com boas recuperaes, quaisquer que sejam os solventes orgnicos imiscveis em gua. Uma conseqncia disso que a SPE tem sido utilizada cada vez mais, inclusive em mtodos oficiais, como os recomendados pela Agncia EPA (LUTHJE, 2004; QUEIROZ, 2001). De acordo com Queiroz (2001), a SPE uma tcnica de separao lquidoslido que tem mecanismos de reteno como cromatografia lquida de baixa presso, que emprega uma pequena coluna aberta, denominada cartucho de extrao, nas formas de barril ou seringa, a qual contm a fase slida (LYYTIKAINEN, 2003). Tradicionalmente como citado acima, usada na forma de cartuchos, porm, com a passagem de grandes volumes de gua estes podem ser obstrudos, tornando o processo lento. Santos Neto (2005), cita que discos extratores em fase slida, de introduo mais recente, admitem fluxos mais altos, diminuindo o tempo de extrao permitindo a passagem de maior volume de lquido e desta forma, obtendo uma maior concentrao de analitos. Drea (2004), aponta que alguns resultados tm mostrado que as vantagens do mtodo SPE a tornam superior LLE e tem desempenho (em termos de recuperao, preciso, tempo e nmero de etapas) similar extrao com fluido supercrtico quando utilizada na anlise de agroqumicos em frutas. O procedimento de extrao em fase slida envolve 5 etapas: I) ativao dos adsorventes para deixar os stios ativos disponveis; II) condicionamento do adsorvente com o solvente extrator adequado para ajustar as foras do solvente de eluio com o solvente da amostra; III) introduo da amostra, quando ocorre a reteno do analito s vezes de alguns interferentes; IV) limpeza da coluna para retirar os interferentes menos retidos que o analito; V) eluio e coleta do analito. Alguns resultados obtidos mostram a eficincia deste mtodo, como exemplo pode-se citar o trabalho de Rissato (2004), que fez a coleta de amostras de guas e solo dos rios Batalha e Bauru - SP, utilizando extrao por SPE. Depois de

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obtidos os extratos, os mesmos foram submetidos anlise por cromatografia gasosa com detector de captura de eltrons (GC/ECD), e os resultados indicaram valores de recuperao que variaram entre 80 e 99%, com desvio padro relativo de 3 a 6% (n=5) para os seis pesticidas estudados (BHC, Dieldrin, Endosulfan, Aldrin, Heptachlor e DDT), pertencentes classe dos organoclorados. Os resultados obtidos detectaram a presena desses compostos nos corpos dgua, porm, foram inferiores ao admitidos pela legislao brasileira. As extraes em fase slida podem ser divididas em dois modos: off-line e on-line. Segundo Queiroz (2001), no modo off-line, a etapa de extrao e/ou prconcentrao do analito realizada separadamente do sistema cromatogrfico, e no modo on-line, a etapa realizada no prprio sistema cromatogrfico.

2.5.3 Microextrao em Fase Slida (SPME)

Esta tcnica de extrao e pr-concentrao, microextrao em fase slida (SPME - Solid Phase Microextraction) foi desenvolvida pelo grupo Pawliszyn a partir de 1989 (SILVA, 1999) e consiste em duas etapas bsicas: a adsoro e a desoro dos compostos em uma fibra de slica fundida recoberta com material polimrico. A etapa de adsoro realizada expondo a fibra diretamente na amostra ou em sua fase gasosa e a desoro ocorre no prprio injetor do cromatgrafo a gs ou no injetor de um CLAE (KOMATSU, 2004). A base deste mtodo est na fase imobilizada (polidimetilsiloxano, policrilatos), que atua como fase estacionria, para extrair diretamente traos de compostos orgnicos da gua, onde a fibra imersa (KRUTZ, 2003). A SPME difere das outras tcnicas de extrao para amostras aquosas pela no utilizao de solventes extratores pela exposio ocupacional e pelo menor tempo de anlise. uma tcnica simples, rpida, de fcil manuseio que utiliza pequena quantidade de amostra. Atualmente, a minimizao de descartes como solventes orgnicos vem se tornando cada vez mais necessria, tendo em vista as leis de proteo ambiental (FACCHIN, 1997; PEREZ-TRUJILLO, 2002). Em programas de monitoramento rotineiro de guas na frica do Sul, conforme Dalvie (2005), a tcnica SPME tem sido recomendada por oferecer sensibilidade, confiana e apresentar baixo custo.

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A tcnica SPME um procedimento de preparao de amostra que permite concentrar vrios grupos de agroqumicos eficazmente, usando detectores como espectrmetro de massa ou tcnicas combinadas cromatografia gasosa como deteco e captura de eltrons (ECD), entre outras. Gonalves (2002), utilizou a tcnica SPME para a extrao simultnea de 34 combinaes, incluindo organoclorados (OCPs), organofosforados (OPPs), piretrides e grupos de triazinas. Gonalves (2002), Komatsu (2004), citam que as condies de extrao como, modo de extrao (headspace ou imerso direta na amostra lquida), tipo de fibra, pH, velocidade de agitao, concentrao inica e temperatura, devem ser otimizadas para cada tipo de amostra. Segundo ressalta Bagheri (2005), por ser uma tcnica de adsoro a SPME pode estar sujeita aos chamados efeitos de memria ou carryover, caracterizados pela desoro incompleta dos analitos adsorvidos na fibra, podendo ser mais acentuada para compostos com alta afinidade, pelo recobrimento da fibra (BASHEER, 2005). Para eliminar o efeito carryover os estudos demonstram que necessrio deixar a fibra inserida no injetor durante toda a corrida cromatogrfica para a remoo total dos analitos absorvidos (KOMATSU, 2004).

2.5.4 Microextrao Lquido-Lquido (MLLE)

Para preparao de amostras de acordo com o volume requerido pelas tcnicas cromatogrficas, o mtodo de microextrao lquido-lquido mostra-se eficiente. Oferece vantagens como: economia de solventes extratores facilidade de extrao e rapidez na anlise (BALINOVA, 1996; CARASEK, 1997). Comparada com a extrao convencional, a microextrao se caracteriza por piores recuperaes do analito, mas a concentrao na fase orgnica aumentada. Adicionalmente, o volume de solvente orgnico usado reduzido e somente uma etapa de manipulao necessria, diminuindo assim os problemas de contaminao e perdas do analito (CARASEK, 2002). Segundo Attygalle (1986), foi desenvolvido um micro reator/extrator de Keele com objetivo de encontrar concentraes em nveis de traos, permitindo tambm a realizao de reaes, derivatizaes e extraes, utilizando volumes de amostra e de solventes, na ordem de microlitros. O micro reator/extrator de Keele pode ser usado em temperatura abaixo ou acima da ambiente, presses moderadas e na

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ausncia de gua. O solvente usado na extrao pode ter densidade maior ou menor que da amostra. Conforme estudos realizados, foi desenvolvido por Grob outro microextrator de operao rpida e simples. Este microextrator pode ser usado com volumes de 1,0L de soluo e 0,5 a 1mL de solvente extrator, com imediata anlise cromatogrfica, permitindo determinaes em nveis de at parte por trilho (GROB, 1975). Posteriormente, um frasco de microextrao rpida, similar ao de Grob, foi desenvolvido a partir do trabalho de Murray (Figura 4), que permite extraes com volumes de 980mL de amostra de gua contaminada e 200 L de solvente extrator para a extrao. O processo operacional para a extrao do analito consiste na agitao da amostra, separao das fases por decantao e adio de gua atravs do brao lateral, permitindo que o solvente extrator chegue at o tubo capilar e seja coletado por uma seringa, para anlise cromatogrfica. No trabalho de Murray, conforme Carasek (1997) citada a possibilidade da realizao de trs extraes sucessivas que permite maior quantidade de recuperao do solvente extrator e melhor recuperao do analito.

Figura 4: Frasco de microextrao lquido-lquido (1) Tubo capilar, (2) camada de solvente, (3) frasco volumtrico, (4) amostra de gua Fonte: Carazek, 1997

Posterior ao trabalho de Murray, foi reproduzido por Carasek (1997), um novo microextrator lquido-lquido (Figura 5), com modificaes no brao lateral para que as condies de extraes sucessivas fossem aperfeioadas.

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Figura 5: Frasco de microextrao lquido-lquido modificado (1) Tubo capilar, (2) frasco de 1L modificado e (3) brao lateral Fonte: Carazek, 2002

Conforme Zapf (1995), foi desenvolvido um outro microextrator (Figura 6) que utilizava 400mL de amostra aquosa, saturada com cloreto de sdio (NaCl) e 500 L de solvente tolueno para a extrao.

Figura 6: Frasco de microextrao utilizado por Zapf, Heyer e Stan (a) Funil de separao com soluo saturada de NaCl, (b) camada de solvente tolueno e (c) amostra Fonte: Zapf, Heyer e Stan, 1995

Aps 20 minutos de agitao mecnica, uma nova soluo de NaCl saturada era adicionada do balo A para o frasco que continha a amostra, desta forma, deslocando o extrato para o topo do frasco de coleta. Em seguida o extrato era

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analisado diretamente por CG. Os nveis de recuperao de agroqumicos testados variaram na concentrao entre 50 e 500 ng.dm-3.

2.5.4.1 Frasco de Murray Modificado

Conforme Carasek (1997), o modo de operao do frasco de Murray modificado (Figura 5) era semelhante ao original (Figura 4). Consistia em adicionar no frasco 980mL de amostra contaminada por agroqumicos e em seguida o solvente extrator atravs do tubo capilar. Depois se realizava a agitao do sistema, seguido de tempo de repouso at a separao completa das fases orgnica e aquosa. A parte orgnica era coletada em uma nica etapa ou atravs de sucessivas extraes e encaminhada para anlise cromatogrfica. Foram realizados estudos utilizando o frasco de Murray modificado para amostras sintticas dos agroqumicos organoclorados, AldrinTM, DieldrinTM, LindanoTM, EndrinTM, Hexaclorobenzeno (HCB) e MirexTM, que aps extrao foram diretamente analisados por cromatografia gasosa com detector por captura de eltrons (ECD). As recuperaes dos agroqumicos chegaram acerca de 90% com extraes sucessivas, indicando a eficincia do mtodo para a determinao de quantidades traos dos agroqumicos em guas (CARAZEK, 1997). No trabalho desenvolvido por Carasek (2002), foi demonstrada a viabilidade do uso do frasco de Murray modificado para pr-concentrao de ouro em gua do mar aps complexao com dietilditiofosfato de amnio (DDTP), com limite de deteco para o ouro na ordem de ng.dm-3. Com o mesmo frasco de Murray modificado, Carasek (2002), otimizou um procedimento analtico rpido e de baixo custo para a pr-concentrao em nvel de trao de chumbo e cdmio em guas naturais, e posterior determinao por espectrometria de absoro atmica com chama. Conforme o trabalho desenvolvido foram comparados os resultados da microextrao, com uma metodologia alternativa de preparo de amostras e ficou comprovada a eficincia do frasco de Murray modificado para pr-concentrao dos baixos nveis de cdmio e chumbo em amostras de gua.

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2.6 ANLISE CROMATOGRFICA DE AGROQUMICOS

Cromatografia um termo geral aplicado a uma variedade de tcnicas, nas quais uma amostra contendo dois ou mais componentes separada como resultado de um equilbrio entre duas fases, uma mvel e a outra estacionria. Durante a passagem da fase mvel sobre a fase estacionria, os componentes so retidos de acordo com a sua distribuio relativa nas duas fases, resultado de processos fsicos, qumicos e mecnicos (COLLINS, 1990; HARRIS, 2003). A cromatografia gasosa baseia-se na distribuio de substncias entre uma fase estacionria (slida ou lquida) e uma fase mvel (gasosa), sendo aplicada a gases ou substncias volatilizveis. , muito provavelmente, a mais valiosa tcnica hoje para anlise orgnica (LANAS, 2004). A anlise de agroqumicos organoclorados em guas constantemente realizada por Cromatografia Gasosa e Cromatografia Lquida (SHERMA, 2005). Conforme Mhlen (2004), a GC/ECD um mtodo de anlise muito eficiente, porque, aliando-se a capacidade de resoluo cromatogrfica da CGAR, com a seletividade e sensibilidade do DCE para organoclorados, possvel processar amostras complexas e viabilizar as monitoraes destes compostos em nveis to baixos como 0,1 g.dm-3, que a mxima permitida para cada pesticida (CARAZEK, 1998). Grosser (1993), estudando mtodos de anlise nos Estados Unidos da Amrica (USA), concluiu que o controle de qualidade adotado pela EPA caracteriza as tcnicas como cromatografia lquida (HPLC-MS) e cromatografia gasosa de alta resoluo acoplada a espectrometria de massas (HRGC-MS), precisas rpidas, bem como confiveis para anlises ambientais. As tcnicas cromatogrficas so utilizadas em grande escala para a determinao de agroqumicos em solos e consideradas eficientes para a identificao e quantificao, conforme Andreu (2004). Atualmente, as tcnicas cromatogrficas se tornaram uma poderosa ferramenta analtica para determinao de resduos de agroqumicos em muitas matrizes como alimentos, guas, solos, sedimentos entre outros (CAJKA, 2004). Conforme Mhlen (2004), uma das melhores escolhas de detector para a cromatografia a espectrometria de massa, sendo considerada uma das tcnicas mais importantes de anlise molecular devido ao seu potencial de fornecer

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informaes estruturais do analito e dos pontos de degradao desde a fragmentao das molculas (HARRIS, 2004).

2.7 VALIDAO DA METODOLOGIA DE EXTRAO

De acordo com a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA - 2003), a validao deve garantir, atravs de estudos experimentais, que o mtodo atenda s exigncias das aplicaes analticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. A anlise cromatogrfica de uma amostra envolve etapas de preparo dessa amostra, cromatografia e identificao dos compostos separados. Para garantir a certeza e qualidade dos resultados analticos, os mtodos que empregam tcnicas cromatogrficas devem ser validados de acordo com procedimentos muito bem definidos (LANAS, 2004). Conforme Ribani (2004), todo sistema apresenta limitaes, a validao se faz necessria para conhecer essas limitaes e assegurar que o sistema analtico apresente o desempenho esperado, dentro dos limites determinados no processo de validao. Com estas informaes pode-se garantir que o novo mtodo analtico gere informaes confiveis e interpretveis sobre as amostras. A validao de um mtodo um processo contnuo que comea no planejamento da estratgia analtica e continua ao longo de todo o seu desenvolvimento.

2.7.1 Exatido

A exatido expressa a concordncia entre o valor encontrado e o valor aceito como verdadeiro. Na prtica, a exatido o grau de concordncia entre os resultados individuais encontrados pelo mtodo a validar comparado aos obtidos por intermdio de um mtodo estabelecido como referncia (US-EPA, FDA), ou rgo similares (VIEIRA, 2004).

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2.7.2 Preciso

A preciso a expresso da concordncia entre vrios resultados analticos obtidos para uma mesma amostra. A preciso pode ser determinada em condies de repetibilidade ou condies de reprodutibilidade. Condies de repetibilidade so aquelas em que resultados so obtidos a partir do mesmo mtodo, para a mesma amostra, mesmo laboratrio, pelo mesmo operador, com mesmo equipamento e em curto intervalo de tempo. As condies de reprodutibilidade so obtidas usando o mesmo mtodo, para a mesma amostra, em diferentes laboratrios, por diferentes operadores, com diferentes equipamentos. Normalmente, a preciso medida por meio do desviopadro ou do coeficiente de variao (LANAS, 2004).

2.7.3 Linearidade e Faixa Linear

A linearidade a resposta obtida em funo da concentrao do analito, a qual deve ser estudada em um intervalo de concentrao apropriado. Pode ser expressa como uma equao de reta chamada de curva analtica (RIBANI, 2004). Atravs de tratamento estatstico, a partir dos dados experimentais, podem-se estimar os coeficientes de uma curva de calibrao (BARROS NETO, 2002). O coeficiente de correlao (r2) permite uma estimativa da qualidade da curva obtida. A ANVISA recomenda um coeficiente de correlao acima de 0,99 e o INMETRO -Instituto Nacional de Metrologia, Normalizao e Qualidade Industrial um valor acima de 0,90.

2.7.4 Limite de Deteco (LOD) e Limite de Quantificao (LOQ)

O limite de deteco (LOD) corresponde menor quantidade de um analito que pode ser detectada, porm, no necessariamente quantificada como um valor exato, utilizando um determinado procedimento experimental. O LOD pode ser calculado de trs maneiras diferentes: mtodo visual, mtodo relao sinal-rudo e mtodo baseado em parmetros da curva analtica. Um procedimento comum aceitar como limite de deteco a concentrao ou massa do analito que geram um sinal trs (3) vez maior do que o rudo do sistema (RIBANI, 2004).

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O limite de quantificao (LOQ) corresponde menor quantidade de um analito que pode ser quantificada com exatido e com uma fidelidade determinada. Para calcular o LOQ podem ser adotados: o mtodo visual, o mtodo relao sinalrudo (normalmente 10 vezes) e o mtodo baseado em parmetros da curva analtica. Este ltimo considerado, estatisticamente, o mais confivel (LANAS, 2004).

2.7.5 Recuperao

A recuperao a medida de eficincia no processo de isolamento do analito de interesse da matriz na qual se encontra presente. importante avaliar a recuperao em vrias concentraes, uma vez que esta pode variar bastante em concentraes muito baixas (LANAS, 2004).

2.7.6 Robustez

A robustez a medida da capacidade de um mtodo de no sofrer alteraes em decorrncia a pequenas variaes, deliberadamente introduzidas nos parmetros do mtodo. A robustez mede a confiabilidade do mtodo em condies normais de operao, permitindo fixar as tolerncias dos fatores do mtodo. A influncia dos fatores na resposta pode ser verificada individual (mtodo univariado) ou simultaneamente (mtodo multivariado). No caso em que se deseja avaliar a influncia de vrios parmetros, simultaneamente, um mtodo multivariado, como um planejamento fatorial, sugerido. Os fatores determinados como relevantes no planejamento fatorial so, ento, submetidos a um estudo do tipo superfcie de resposta para obter uma descrio mais completa dos fatores (LANAS, 2004).

2.8 PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS

O planejamento de experimentos est baseado em princpios estatsticos que por sua vez, conforme Buchmann (2002), ferramenta indispensvel nos procedimentos de medio, e em geral, a maneira mais eficiente para estimar os

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efeitos de diversas variveis simultaneamente. De acordo com Tefilo (2006), esta ferramenta d suporte aos pesquisadores para extrair o mximo de informaes teis do sistema em estudo com um nmero mnimo de ensaios laboratoriais, oferecendo vantagens como economia de tempo, gastos com reagentes e qualidade no processo (BRUNS, 1996). O uso das ferramentas estatsticas potencializa o conhecimento estatstico do pesquisador que, por sua vez, conforme Neuman (1993), deve: 1. 2. Selecionar as variveis independentes a serem avaliadas; Selecionar os nveis mximo e mnimo para cada varivel que

possibilitem a obteno de amostras cuja variao dos resultados seja significativo e mensurvel sobre a resposta que se deseja otimizar; 3. Projetar o planejamento de experimento de forma que ele possa

fornecer exatamente o tipo de informao desejada. No tpico 3 (parte experimental), sero apresentados os detalhes sobre as variveis e as respostas estudadas de acordo com o planejamento fatorial proposto para o desenvolvimento deste trabalho.

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3 PARTE EXPERIMENTAL

3.1 MATERIAIS E MTODOS

Neste captulo foram apresentados os materiais e os mtodos utilizados no procedimento experimental de microextrao lquido-lquido, na deteco de agroqumicos organoclorados.

3.1.1 Materiais Utilizados

Os materiais utilizados para o procedimento analtico foram: frasco de Murray modificado Bomex 1000mL (Figura 7); Micro seringa Microliter 702 de 25 L marca Hamilton CO. Reno Nevada; Vial de poliestireno; Bomba a vcuo TE058 TECNAL; Cronmetro STOP WATCH; Agulha PERICAN Tuohy-Kaniile G18 1,3 x 150mm; agitador magntico mecnico micro Qumica MQAMA-301; barra magntica de 2cm de comprimento; balana analtica AG-200 GEHAKA; frasco mbar de volumes 1L, 2L e 4L; papel filtro QUANTY TP42 faixa azul cinza 0,00005 permeabilidade ao ar: 31/s m2 maioria dos poros 8 m; pH-metro B474 Micronal; pipetas de micropreciso 2L, 10L, 100L, 200L e 1000L; termmetro.

3.1.2 Reagentes Utilizados

Todos os reagentes utilizados foram de grau analtico, gua utilizada na preparao de todas as solues e fortificao das amostras de trabalho foi do tipo 1 (gua ultrapura), do Sistema de Purificao de gua Master System - GEHAKA. Cloreto de sdio (NaCl) e Cloreto de potssio (KCl) P. A. - Reagentes Analticos CRQ. Solues de HCl e NaOH de 0,1M e 2M - P.A - VETEC (37%).

3.1.3 Solventes de Extrao

Os solventes orgnicos acetato de etila, tolueno, hexano e acetona, utilizados neste trabalho apresentaram alto grau de pureza (HPLC) e foram adquiridos junto a J.T. Baker Corporation.

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3.1.4 Padres de Agroqumicos Solues estoque individuais de 200mg.mL-1 dos padres de pesticidas Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro foram obtidos da Aldrich. A partir da soluo estoque foi preparada a soluo padro na concentrao de 20mg.mL-1 utilizada para fortificar as amostras experimentais.

3.1.5 Amostra de gua Bruta

A amostra de gua bruta foi coletada no Municpio de Pato Branco e no Municpio de Maripolis, no Estado do Paran, junto a Bacia Hidrogrfica do Rio Pato Branco e seus afluentes, conforme descrio no item 3.7.

3.1.6 Frasco de Murray Modificado - Caractersticas

O frasco de Murray modificado, demonstrado na Figura 7, foi reproduzido a partir do trabalho de Carasek (1997). O mesmo um frasco de vidro volumtrico, composto por: (1) tubo capilar, dimetro interno de 3mm e altura de 10cm, (2) frasco de 1L modificado e (3) brao lateral - dimetro interno de 20mm e altura de 30 cm.

Figura 7: Frasco de microextrao lquido-lquido modificado a partir do trabalho de Murray, utilizado no estudo dos agroqumicos organoclorados Fonte: CARASEK, 2002

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3.2 METODOLOGIA EXPERIMENTAL

3.2.1 Preparo da Soluo Padro dos Agroqumicos

Em um balo volumtrico de 5mL, foi adicionado com auxlio de uma micropipeta 0,5mL de cada um dos agroqumicos (Aldrin, -BHC(Lindane) e

Heptacloro). Em seguida foram diludos para 5mL com uma mistura de hexano e acetona na proporo 90/10 (v/v). Aps aferio a mistura foi transferida para um frasco mbar hermeticamente fechado e armazenada em freezer a -20oC. Essa soluo foi utilizada para determinar a linearidade do detector, fortificaes das amostras e obteno das curvas analticas.

3.2.2 Procedimento de Microextrao utilizando o Frasco de Murray Modificado

O procedimento de utilizao do frasco de Murray modificado seguiu as etapas descritas na Figura 8. Aps preparao da amostra foi escolhido o solvente orgnico e para a contaminao da amostra. Selecionado o tempo de repouso mais conveniente para a extrao. A seguir foi selecionada a condio experimental para melhor recuperao, levando-se em considerao os fatores, pH, concentrao salina () e tempo de agitao. Finalmente, foi efetuada a anlise cromatogrfica das amostras.

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Estudo e otimizao das condies de extrao

Escolha do solvente

Escolha do tempo de repouso pH Microextrao T.A Contaminao com agroqumico

Agroqumico recuperado

Anlise Cromatogrfica
Figura 8: Representao esquemtica do estudo e otimizao das condies de extrao dos agroqumicos utilizando o frasco de Murray. (T.A) tempo de agitao, () concentrao salina

O frasco de Murray modificado para cada experimento realizado passou por um procedimento de lavagem rigoroso, diversas vezes com gua e detergente, soluo alcolica de KOH, seguido de enxge com gua destilada e finalmente foi rinsado com solvente orgnico, como o hexano ou tolueno, para ter a certeza que no havia traos de qualquer contaminao antes de cada procedimento de extrao. Todo material de apoio tambm passou pelo mesmo procedimento de limpeza. Para cada ensaio, com o auxlio de uma proveta, transferiu-se o volume de 1 litro de gua ultrapura para um frasco mbar com capacidade 1L. Quando realizada amostragem em replicata, esta foi preparada em nica etapa, utilizando o frasco mbar de capacidade 2L ou 4L. No frasco mbar foi medido o pH da gua ultrapura que sempre ficou na faixa de 5,8 a 6,5. Foi ento, adicionado o sal cloreto de sdio (NaCl), ajustado o pH da soluo com cido clordrico (HCl - 0,1 e 2M) nas

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condies otimizadas para cada experimento, de acordo com a matriz de planejamento fatorial (Tabelas 1 e 2), ficando assim a soluo pronta para ser contaminada com quantidades da mistura dos agroqumicos organoclorados Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro estabelecida. Depois da contaminao a soluo permaneceu em repouso por um tempo tambm otimizado, como ser tratado no item 3.2.4. Aps o procedimento de preparao, a soluo foi transferida com auxlio de um funil, atravs do brao lateral do microextrator, para o frasco de Murray modificado. Com a micropipeta (1000 L) conectada a uma agulha PERICAN 1,3 x 150mm, 1mL de solvente hexano, foi introduzido atravs do tubo capilar, de forma que fosse totalmente lanado na amostra de gua sem contato com as paredes superiores do frasco. A mistura foi levada para o agitador magntico para que ocorresse o contato da amostra com a alquota de solvente orgnico, seguindo o tempo determinado pelo planejamento de acordo com a Tabela 1 e 2, para realizao do planejamento ou pelo tempo estabelecido para cada ensaio preliminar. Aps o tempo de agitao, o frasco permaneceu em repouso para a separao de fases (otimizado e descrito no item 3.2.4). A camada de fase orgnica imiscvel foi deslocada para o tubo capilar atravs da adio de gua pelo brao lateral do Frasco de Murray modificado at chegar ao tubo capilar, onde foi possvel, com o auxlio de uma microseringa retirar e quantificar o solvente extrator acompanhado ou no do analito. O contedo extrado foi transferido para um vial e encaminhado para anlise cromatogrfica.

3.2.3 Escolha do Solvente Extrator

Para este estudo, foram levadas em considerao as informaes das prticas experimentais e operacionais realizadas por Carasek (1997), descrita na literatura, observando o coeficiente de solubilidade, a densidade, o tempo de agitao, e a influncia da concentrao salina no rendimento na separao de fases. Os solventes orgnicos utilizados para os testes foram: acetato de etila, tolueno e hexano. O experimento para a escolha do solvente extrator consistiu em adicionar 1000mL de gua ultrapura, obtida pelo sistema de purificao Master System

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GEHAKA, no frasco de Murray modificado com 1mL de hexano que foi inserido pelo tubo capilar. Essa mistura no fortificada por agroqumicos permaneceu no agitador magntico pelo tempo de 10 minutos, com rotao de 90rpm. Logo aps o perodo de agitao, o frasco permaneceu em repouso por mais 10 minutos, tempo satisfatrio, atravs da observao visual, para ocorrer separao de fases. Em seguida, foi adicionada no frasco, pelo brao lateral, quantidade suficiente de gua para elevar a fase orgnica at o tubo capilar, possibilitando a recuperao e quantificao do hexano. Foram realizados testes com os solventes orgnicos puros e tambm com mistura entre eles em diversas propores. Aps observaes, a mesma metodologia foi utilizada na recuperao do solvente nas amostras com a adio de sal. O sal KCl 0,1mol.dm-3 (7,45g) foi pesado em balana analtica, e transferido para o frasco mbar onde estava a amostra e foi para a agitao magntica at a total diluio. O pH do sistema permaneceu entre 5,8 e 6,2.

3.2.4 Contaminao da Amostra com Agroqumicos Organoclorados e Estudo do Tempo de Repouso antes da Pr-concentrao no Frasco de Murray Modificado

Na metodologia utilizada para a construo das curvas analticas, as amostras de gua ultrapura foram fortificadas com 60L, 120L, 240L, 480L e 720L, da soluo padro (20mg.mL-1) dos agroqumicos (Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro) e deixadas em repouso por um perodo de 2 horas antes de serem transferidas para o frasco extrator. Os ensaios para a construo das curvas analticas, em todas as concentraes foram habilitados em triplicata. Para a execuo dos oito ensaios e o ponto central determinado pelo planejamento fatorial (Tabela 2), o tempo de repouso foi estabelecido em 10 minutos e a amostra foi fortificada com 80L da soluo padro (20mg.mL-1) antes da transferncia da amostra para o frasco de Murray modificado.

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3.2.5 Determinao do Tempo de Repouso para Separao de Fases dentro do Frasco de Murray Modificado

Na determinao do tempo necessrio ou mais adequado para ocorrer separao das fases, orgnica e aquosa, foram estabelecidas algumas constantes para o preparo da amostra, entre elas o tempo de agitao de 10 minutos. No frasco mbar contendo 4L de gua ultrapura, sem fortificao dos agroqumicos, foram adicionados 234g de NaCl (cloreto de sdio) de forma que a soluo ficasse com concentrao salina () de 1mol.dm-3, o pH foi ajustado para 5,0 com soluo de HCl (0,1M). Cada volume de 1L da soluo foi transferido para o frasco de Murray modificado, onde foi adicionado 1mL de solvente hexano a cada experimento, e levado para agitao em agitador magntico 90rpm por 10 minutos. O tempo de repouso, otimizado para cada replicata do experimento foi de 10, 30, 60 e 90 minutos. A avaliao foi feita atravs da quantificao da fase orgnica recuperada. Em seguida foram executadas as mesmas etapas do procedimento experimental descrito acima, com 3 amostras de guas fortificadas por 80L para cada litro, da soluo padro de organoclorados (20mg.mL-1). Foram feitos trs ensaios com tempos de repouso de 10, 30 e 60 minutos e posterior comparao dos resultados de quantificao do solvente e recuperao dos analitos.

3.3 METODOLOGIA DE ESTUDO DOS EFEITOS EXPERIMENTAIS: pH, CONCENTRAO SALINA E TEMPO DE AGITAO SOBRE A RECUPERAO DOS AGROQUMICOS

A metodologia consistiu em adequar fatores experimentais de relevncia a uma estratgia multivariada fundamentada no planejamento fatorial de experimentos 23 com ponto central em duplicata. Os fatores experimentais selecionados a partir de antecedentes bibliogrficos (CARASEK, 2002; KOMATSU, 2004) foram: pH, concentrao salina () e tempo de agitao da amostra, buscando atingir maior sensibilidade possvel do mtodo. Os fatores experimentais e seus respectivos nveis foram demonstrados na Tabela 1.

46 Tabela 1 Variveis experimentais e respectivos nveis de estudo do planejamento fatorial

Variveis pH (g. dm-3) T.A (min)

Nvel (-) 3,0 5 10

Ponto Central 5,0 58,5 20

Nvel (+) 7,0 112 30

() Concentrao salina, (T.A) tempo de agitao

A combinao dos fatores experimentais (Tabela 1) gerou uma matriz contendo 8 ensaios e um ponto central, o qual foi realizado em duplicata, para atestar o erro experimental do sistema (Tabela 2). A Tabela 2 mostra os ensaios de acordo com a variao e a combinao dos fatores para cada experimento executado.
Tabela 2 Matriz de planejamento fatorial, demonstrando as combinaes das variveis experimentais em estudo

exp., y

pH

+ + + + 0 0

T.A

pH

(g; dm-3)
5,0 5,0 112,0 112,0 5,0 5,0 112,0 112,0 58,5 58,5

T.A (min)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

+ + + + 0 0

+ + + + 0 0

3,0 7,0 3,0 7,0 3,0 7,0 3,0 7,0 5,0 5,0

10 10 10 10 30 30 30 30 20 20

() Concentrao salina, (T.A) tempo de agitao

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Para a avaliao dos efeitos isolados e combinados dos fatores experimentais, foi considerada como resposta eficincia de recuperao do analito (avaliada atravs da concentrao residual), utilizando a microextrao lquidoliquido atravs de anlise cromatogrfica, acoplada a espectrometria de massa.

3.4 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS (GC/MS)

A composio qumica dos extratos de agroqumicos em amostras de guas obtidos atravs da microextrao lquido-lquido, foi determinada por um GC-MS (Cromatgrafo Gasoso Varian CP-3800 acoplado ao Espectrmetro de Massas Saturn 2000 - Autosample CP-8410) equipado com uma coluna capilar CP-Sil 8 CB low Bleed/MS (30m x 0,25mm filme 0,25 m). O gs de arraste foi o Hlio (Fluxo Constante de 1mL/min). As anlises foram realizadas no Instituto de Pesquisas Tecnolgicas de Blumenau (IPTB) - FURB (SC). A coluna foi aquecida a 80C por 3 minutos, programada a 10C/min 11 min at 250C. Volume de injeo: 2uL Splitless. MSTemp. on Trap: 220C, Temp. Manifold: 80C, Temp. Transferline: 240C. O software de gerenciamento foi Saturn GC/MS Workstation 5.51. A identificao das substncias foi realizada atravs de comparao com o tempo de reteno do padro e confirmados pelo espectro de massa das substncias analisadas, com banco de dados do sistema GC-MS (Standard Reference Data Series do National Institute of Standard and Technology - NIST 98 MS Library /Database in Saturn and NIST Format).

3.5 CURVAS DE CALIBRAO EXTERNA PELO MTODO

A resposta considerada para avaliao dos estudos de extrao dos agroqumicos organoclorados nas amostras de gua foi obtida por Cromatografia Gasosa utilizando um cromatgrafo a gs, equipado com detector e espectrometria de massa (GC-MS). O mtodo cromatogrfico empregado foi o de calibrao externa associada ao mtodo de microextrao, desta forma, para cada amostra fortificada, foram inicialmente construdas curvas de calibrao para cada padro, utilizando no mnimo quatro concentraes diferentes.

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3.6 VALIDAO DO MTODO E DETERMINAO DOS AGROQUMICOS EM GUAS

3.6.1 Curva Analtica

Obtiveram-se curvas analticas dos agroqumicos em estudo empregando a microextrao lquido-lquido com faixas de concentrao entre 0,4g.dm-3 (ppb) 4,8g.dm-3 (ppb), injetando-se 2 L de cada extrato no cromatgrafo gasoso, em triplicata e, finalmente, fazendo o grfico da rea versus concentrao dos agroqumicos, atravs do programa Microsoft Excel que forneceu os coeficientes de correlao das retas obtidas, coeficientes angulares e lineares, estimativas de desvio padro e coeficiente de variao. As condies de amostragem para a construo da curva analtica de cada um dos agroqumicos foram: pH = 5,0, = 2mol.dm-3 de NaCl (117g. dm-3), tempo de agitao de 10 minutos, tempo de repouso 10 minutos. As amostras foram fortificadas com volumes de 20, 40, 80, 160 e 240L da soluo padro (20mg.mL-1) para cada litro de gua. A partir dos resultados obtiveram-se os valores da equao da reta para cada contaminante.

3.6.2 Linearidade e Faixa de Aplicao

Para a determinao dos limites de deteco (LOD) e de quantificao (LOQ) do instrumento, foram construdas as curvas analticas a partir das triplicatas obtidas sob condies descritas no item 3.6.1. O LOD e o LOQ foram calculados atravs da expresso 1.0 e 2.0, pelo mtodo baseado nos parmetros da curva analtica.

LOD = 3,3 x a/b LOQ = 10 x a/b

(1.0) (2.0)

Onde: a = coeficiente linear da equao b = coeficiente angular da curva analtica

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3.6.3 Recuperao

Os valores referentes s recuperaes dos agroqumicos de cada experimento realizado em triplicata, das amostras de gua tipo 1 (ultrapura) fortificadas com a soluo padro, aps procedimento de extrao foram calculados atravs da expresso 3.0:

R = Ar x 100 Ai onde: Ar = unidades do analito recuperadas Ai = unidades do analito introduzidas

(3.0)

3.7 AMOSTRAGEM REAL - CARACTERSTICAS GERAIS DA REA EM ESTUDO: BACIA DO RIO PATO BRANCO

As amostras de gua dos rios foram coletadas na primeira quinzena do ms de agosto de 2005, com um tempo ensolarado, sem chuvas h 3 semanas, em 6 pontos de amostragem na Bacia Hidrogrfica do Rio Pato Branco e seus principais contribuintes, responsveis pelo abastecimento de gua da cidade de Pato Branco/PR. Os pontos de amostragem foram selecionados com ajuda de funcionrios da Companhia de Saneamento do Paran (SANEPAR), utilizando pontos estratgicos, marcados com aparelho GPS (Global Positioning System) ao longo da bacia, em locais onde haveria maior probabilidade de contaminao por agroqumicos. Ponto 01 - Rio Divisa - Altitude 700m Coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator) Ponto 02 - Rio Pinheiro - Altitude 711m Coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator) Ponto 03 - Rio Pato Branco (captao) - Altitude 698m Coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator) Ponto 04 - Rio Lambedor - Altitude 739m Coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator) Ponto 05 - Rio Mangueirinha - Altitude 786m x: 0339913, y: 7086122. x: 0341433, y: 7091869. x: 0339987, y: 7090551. x: 0341428, y: 7091826.

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Coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator) Ponto 06 - Rio Panela - Altitude 780m Coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator)

x: 0341331, y: 7084649.

x: 0341300, y: 7084530.

A gua foi coletada de acordo com a metodologia Standard Methods (1998), e armazenada em frascos de polietileno, com capacidade para 2 litros, previamente limpos com detergente, gua, soluo alcolica, rinsados com hexano e finalmente com a prpria amostra. No momento da coleta foram determinadas as condies de pH, temperatura da gua, bem como temperatura do ar e mantidas sob refrigerao 4C, at o momento dos procedimentos experimentais, que foi aproximadamente dois dias aps a coleta. Sendo de 7 dias o tempo mximo indicado para armazenamento das mesmas. A Figura 9 mostra os pontos de coleta dentro da Bacia do Rio Pato Branco.

DIVISA

PINHEIRO

M ANGUEIRINHA

LAMBEDOR PANELA

Figura 9: Mapa da Bacia do Rio Pato Branco - pontos de coleta

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Todas as amostras foram coletadas a uma profundidade de 0,5m e longe das margens dos rios, com o objetivo de evitar possveis interferncias de matrias em deslocamento pelo rio. No laboratrio, as amostras de guas foram filtradas com filtro de poro 0,45 m utilizando sistema a vcuo, a fim de eliminar o material particulado e colides presentes. Em seguida, foi realizado o processo de pr-concentrao e extrao, utilizando o frasco de Murray modificado e anlise cromatogrfica.

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4 RESULTADOS E DISCUSSES

Este trabalho descreve um mtodo analtico utilizado na determinao dos agroqumicos Aldrin, -BHC (Lindane) e Heptacloro, em amostras de guas

fortificadas e amostras reais provenientes da Bacia do Rio Pato Branco. O mtodo utilizado e estudado baseado em microextrao lquido-lquido (MLLE), que oferece vantagens como baixo custo, utilizao de pequenas quantidades de solvente orgnico na pr-concentrao do analito e ainda permite deixar a amostra compatvel com o volume requerido pelas tcnicas cromatogrficas (CARASEK, 1997). A etapa inicial da pesquisa consistiu em realizar testes com o objetivo de detectar os agroqumicos Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro, variando

aleatoriamente o pH, concentrao salina e tempo de agitao. As primeiras deteces atravs da cromatografia gasosa ocorreram quando foi utilizado como solvente extrator o hexano, pH na faixa de 5,0, de 2mol. dm-3 (117g de NaCl) e tempo de agitao de 10 minutos. Este ensaio foi levado em considerao para quantificar nessas condies a recuperao dos agroqumicos e a partir destes dados, construir as curvas de calibrao. Aps a construo das curvas analticas sob as condies j citadas, foi traado um planejamento para verificar a deteco e a recuperao dos agroqumicos estudados em condies variadas de pH, concentrao salina e tempo de agitao, executando combinaes entre esses fatores e observando as respostas obtidas em nveis de concentrao. Este estudo teve por objetivo entender o comportamento do sistema, a influncia isolada e combinada dos fatores experimentais e alcanar condies timas de recuperao. Apesar da microextrao lquido-lquido ser uma tcnica simples, verifica-se que h necessidade da otimizao dos parmetros de extrao para que seja obtido o melhor rendimento possvel a cada tipo de matriz analisada. Com o objetivo de minimizar o nmero de ensaios necessrios para as demais otimizaes do processo de pr-concentrao e extrao, utilizou-se uma estratgia multivariada, que consiste em um sistema de planejamento fatorial de experimentos para definir a influncia e o efeito das variveis, pH, concentrao salina e tempo de agitao, em um sistema de dois nveis (+) e (-). A estrutura do planejamento correspondeu a um planejamento fatorial 23, com duplicata no ponto central. Os resultados foram

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processados na forma de recuperao dos agroqumicos, determinados por cromatografia gasosa CG-MS. Com as respostas obtidas foi possvel calcular os coeficientes de influncia para cada parmetro estudado e obter a interpretao geomtrica posteriormente apresentada. Os dados relativos aos teores de agroqumicos recuperados foram tratados atravs de tcnicas estatsticas, as quais so ferramentas indispensveis no desenvolvimento e na validao do procedimento em estudo (BUCKMANN, 2002). Outros parmetros considerados importantes para o estudo, alm dos citados no planejamento foram: o melhor tipo de solvente extrator o tempo de contato do contaminante com a amostra antes do procedimento de pr-concentrao no frasco e o tempo de repouso para separao de fases (amostra e solvente extrator) dentro do frasco de Murray modificado. Aps a otimizao das condies de extrao e interpretao dos dados obtidos a partir dos experimentos realizados com a matriz fortificada e amostra real, o mtodo foi validado. A validao foi necessria para garantir a confiabilidade dos resultados. A metodologia experimental seguiu a seqncia ilustrada pela Figura 8, descrita na parte experimental, para todos os experimentos. No frasco de Murray modificado, foram adicionados 1 litro de amostra contaminada com a soluo padro dos agroqumicos (20mg.mL-1) e 1mL do solvente extrator hexano, deixados sob agitao por um perodo de tempo definido na Tabela 1 e finalmente em repouso pelo tempo otimizado (item 3.2.4) at ocorrer separao das fases. Em seguida, por meio da adio de gua, atravs do brao lateral do frasco, a camada de solvente extrator foi deslocada para um tubo capilar, coletada com uma microseringa, transferida para um frasco vial e encaminhada para a anlise cromatogrfica. As extraes utilizando o frasco de Murray modificado foram feitas em uma nica etapa, pois quando se adicionava gua pelo brao lateral para a fase orgnica chegar at o tubo capilar, o volume da amostra aumentava e s seriam possveis mais etapas de extrao, se parte da amostra fosse retirada, deixando-a, com o mesmo volume inicial para recomear o processo. No caso da retirada, poderia acorrer alm da diluio, a perda de parte do analito. Carasek (1997), em seu trabalho, utilizou presso de ar com uma seringa atravs do brao lateral do frasco para deslocar o hexano at o tubo capilar. Desta forma, o mesmo conseguiu fazer sucessivas etapas de extraes, sem diluir ou

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retirar parte da amostra. Conforme o autor, etapas sucessivas de extraes melhoram significativamente o rendimento da recuperao dos agroqumicos. Nos experimentos realizados neste estudo, no foi possvel utilizar a presso de ar para mais de uma etapa de extrao, pois no momento em que se injetava ar com a seringa atravs do brao lateral, ocorria formao de bolhas de ar dentro do frasco, no obtendo a fora necessria para elevao da fase orgnica at o tubo capilar.

4.1 ESTUDOS PRELIMINARES DOS PARMETROS DE EXTRAO

A eficincia de extrao da MLLE depende de uma srie de parmetros experimentais, sendo assim, foi feito um estudo da otimizao do processo envolvendo o comportamento da MLLE com relao ao tipo e recuperao do solvente extrator, tempo de repouso da amostra e tempo de agitao do sistema, antes de estudar os efeitos da variao dos fatores, demonstrados no planejamento fatorial (Tabela 2 parte experimental). Como ensaio preliminar, com o objetivo de adequar condies de trabalho e de ensaios cromatogrficos foi realizado um experimento onde a amostra passou pelo processo de extrao, sem adio de sal e sem correo de pH. A amostra de gua permaneceu nas seguintes condies: com pH 6,01 (pH normal da gua ultrapura), fortificao de 80L da soluo padro (20mg.mL-1) em triplicata. No microextrator a amostra recebeu 1mL de hexano e passou por todo o procedimento de extrao, com tempo de agitao de 10 minutos e tempo de repouso para separao de fases tambm de 10 minutos. A quantidade de hexano recuperado em cada experimento foi

aproximadamente 700L, que imediatamente foi transferido para o vial e enviado para anlise cromatogrfica. Como a adio do padro foi de 80L dos agroqumicos, esperava-se um valor para a recuperao para cada um dos agroqumicos de 1,6g.dm-3. Observando-se os resultados, verifica-se que no ocorreu recuperao de 100% de nenhum dos analitos conforme demonstrado na Tabela 3.

55 Tabela 3 Recuperao do Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro sem ajuste de pH e sem adio de sal na preparao da amostra

Agroqumicos Aldrin -BHC(Lindane) Heptacloro

X(g. dm ) e S(%) 1,3030,106 1,3540,113 1,1620,162

-3

CV (%) 8,13 8,36 14,01

Recuperao(%) 81,43 84,62 72,62

(X) Mdia aritmtica, (S) desvio padro, (CV) coeficiente de variao

Os resultados obtidos esto demonstrados no cromatograma apresentado na Figura 10:

Figura 10: Cromatograma de estudos preliminares da amostragem sem adio de sal e sem correo de pH

importante salientar a observao de rudos e picos com intensidades significativas, proporcionais ou maior que os picos dos analitos identificados no cromatograma. Isso se deve, provavelmente, as impurezas presentes nos materiais utilizados. Em etapas mais avanadas deste trabalho, os dados desses estudos preliminares sero comparados com os obtidos atravs da otimizao considerando a importncia dessas variveis a sua influncia na recuperao de cada agroqumico.

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4.2 ESCOLHA DO SOLVENTE EXTRATOR

Foram selecionados trs solventes orgnicos para os testes e realizados estudos comparativos, com o objetivo de selecionar o mais adequado para a prconcentrao do analito na amostra, levando-se em considerao a solubilidade em gua de cada um deles e sua densidade, pois o frasco modificado de Murray foi adaptado para trabalhar com solventes menos densos do que a gua. importante lembrar ainda que a escolha dos solventes orgnicos se deu tambm pelo fato de serem os mais utilizados para a extrao destes agroqumicos de acordo com o levantamento bibliogrfico realizado nesta dissertao. A solubilidade de extrema importncia, pois a menor quantidade de solvente orgnico dissolvido na gua pode carregar traos do material a ser extrado. Para se determinar reprodutibilidade da MLLE no processo de extrao foi calculado o desvio padro (S), sendo este um parmetro de indicao da repetibilidade do mtodo. Os experimentos foram realizados com o solvente acetato de etila, hexano e tolueno puro ou com combinaes entre eles, em replicata. Ainda foram feitos testes com e sem adio de sal (KCl - 0,1mol.dm-3) na amostra, para verificar se a concentrao salina gera influncia na recuperao do solvente orgnico, conforme representado na Tabela 4:
Tabela 4 Estudo da recuperao dos diferentes solventes extratores na ausncia dos contaminantes, com e sem adio de sal (KCl) na amostragem

Solvente Hexano Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Tolueno

Proporo da mistura (%) 100 0,90 + 0,10 0,80 + 0,20 0,70 + 0,30 0,60 + 0,40 0,50 + 0,50 0,90 + 0,10 0,80 + 0,20 0,70 + 0,30 0,60 + 0,40 0,50 + 0,50 100

Recuperao sem sal (mL. dm-3) 0,94 0,05 0,67 0,06 0,58 0,04 0,46 0,05 0,33 0,04 0,30 0,07 0,70 0 0,78 0,04 0,78 0,04 0,84 0,05 0,66 0,05 0,80 0

Recuperao com sal (mL. dm-3) 0,86 0,05 0,75 0,07 0,44 0,10 0,50 0,07 0,42 0,04 0,34 0,05 0,76 0,05 0,82 0,04 0,80 0,07 0,80 0,10 0,82 0,04 0,81 0,08

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A partir da Tabela 4, pode ser visualizada a melhor recuperao do solvente extrator atravs da apresentao grfica das Figuras 11 e 12. O acetato de etila (C4H8O2), pertence ao grupo ster, tem peso molecular igual a 88,11, densidade 0,902g.mL-1 a 20C (lquido), portanto, um composto menos denso que a gua, apresenta solubilidade de 8,7g/100mL em gua a 20C (pouco solvel em gua), voltil (CETESB, 2006), porm, quando realizados os testes, nas combinaes com o hexano e tolueno foi o solvente que teve a menor recuperao pois apresentou maior solubilidade que os demais, conforme Tabela 4 e Figura 11.

Recuperao de Solvente
1 0,9
Hexano Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Tolueno Recuperao sem sal (mL) Recuperao sem sal (mL)

Volume Recuperado Volm e Adicionado(1m Volume Recuperado L)

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Volume Recuperado

Volume Adicionado (1mL)

Figura 11: Estudo da recuperao dos diferentes tipos de solventes extratores, sem adio de sal na amostra e ausncia dos agroqumicos

O tolueno (C6H5CH3) pertence ao grupo hidrocarboneto aromtico, apresenta massa molecular de 92,14dm-3 um composto menos denso que a gua, com densidade 0,867g.mL-1 a 20C (lquido), solubilidade de 0,05g/100mL de gua a 20C, mas bastante voltil (CETESB, 2006). Este apresentou maior solubilidade que o hexano e teve menor recuperao conforme demonstrado nas Figuras 11 e 12.

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0,9 0,8

Hexano Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila

Volume Recuperado

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Recuperao com sal (mL)

Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + acetato de etila Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Hexano + tolueno Tolueno

Volume Adicionado (1mL)

Figura 12: Efeito do solvente extrator com adio de sal (KCl) na amostragem sobre a recuperao dos agroqumicos

O hexano (C6H14) possui massa molecular 86,17g.dm-3 e o solvente extrator que apresenta, entre os estudados, menor densidade, 0,659g.mL-1 a 20C (lquido) e solubilidade de 0,01g/100mL sendo o menos solvel em gua, comparando aos demais utilizados (CETESB, 2006). Alguns ensaios obtiveram desvio padro de at 10% na recuperao do solvente orgnico isso pode ser explicado pelo fato que, alm das propriedades especficas de cada solvente orgnico o sistema pode apresentar dificuldades em manter a forma de agitao idntica da amostra oferecendo condies de parte do solvente orgnico/analito ficar retido nas paredes do frasco. possvel tambm a evaporao do solvente extrator de acordo com a variao na temperatura. Os ensaios foram realizados a temperatura ambiente sem controle deste parmetro. Observou-se na juno do brao lateral do frasco a formao de bolhas de solvente orgnico que ficavam grudadas na parede de vidro como mostrado na Figura 13 contribuindo, portanto, para que no fosse possvel a recuperao de todo o volume adicionado ao frasco. Esse mesmo fato foi observado no experimento realizado por Carasek (1997) quando utilizou o frasco de Murray modificado para a prconcentrao de organoclorados em guas.

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Acmulo de solvente orgnico no frasco

Figura 13: Formao de bolhas no brao lateral do frasco na recuperao do solvente durante o processo de extrao, utilizando o frasco de Murray modificado

Com base nos resultados, o solvente orgnico que obteve a menor solubilidade e melhor recuperao no processo de separao de fases foi o hexano, sendo escolhido para ser o solvente extrator. A Tabela 4 mostra que dos doze testes realizados, somente 3 obtiveram rendimento maior na recuperao sem a presena de sal. O hexano foi o solvente orgnico que obteve melhor recuperao sem adio e com adio de KCl, quando comparado com os demais experimentos. De acordo com anlise da totalidade dos experimentos, em geral, a adio de sal (KCl) na amostra nos permite confirmar o que a literatura informa (CARASEK,1997; KOMATSU, 2004). Sendo que o sal minimiza a solubilidade do solvente orgnico na gua, pois na maioria dos testes foram observadas melhorias na recuperao e com o aumento de fora inica. Com relao ao tempo de agitao, foi determinado o tempo de 10 minutos para a seleo do solvente extrator, considerando este como varivel de nvel menor (-) nos fatores experimentais propostos pelo planejamento fatorial (Tabelas 1 e 2). Para escolher esse tempo como sendo o mais adequado, foi observado o comportamento de cada um dos solventes orgnicos quanto temperatura e volatilizao, pois o experimento estava sendo realizado em sistema fechado somente com papel alumnio, sem vedao, e desta forma, sugerindo que quanto maior o tempo de agitao, maior a possibilidade de evaporao do solvente orgnico. O tempo de repouso de 10 minutos foi suficiente para ocorrer separao de fases, pois acima disso, j se percebia perdas considerveis na recuperao do solvente orgnico.

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4.3 ESTUDO DO TEMPO DE REPOUSO

A metodologia inicial consistiu em preparar a amostra e transferi-la para o frasco de Murray modificado, adicionar o contaminante pelo tubo capilar com uma seringa. Aps misturar, adicionar o hexano. Levar a amostra para agitao, depois para repouso e coletar o solvente orgnico recuperado para anlise cromatogrfica. Quando procedido desta forma, em algumas anlises no foi possvel deteco dos agroqumicos. O procedimento foi ento modificado e a amostra deixada por um tempo em contato com o analito antes da sua adio no frasco de Murray modificado. A partir desse procedimento, pode-se observar que o contato entre o contaminante e a amostra possivelmente favoreceu a deteco dos agroqumicos em estudo. Na etapa de preparao da amostragem, as amostras fortificadas permaneceram por um tempo de repouso dentro do frasco mbar para que desta forma ficassem com caractersticas mais semelhantes s amostras reais de guas naturais, pois estas, possivelmente j estavam em contato com o analito, quando presente, em tempo maior que as amostras preparadas para testes laboratoriais. Na construo das curvas de calibrao a amostra preparada e fortificada permaneceu pelo tempo de 2 horas em repouso dentro do frasco mbar, antes de ser transferida para o frasco de Murray modificado. As amostras de guas que foram utilizadas para a realizao dos experimentos do planejamento fatorial foram fortificadas e deixadas por 10 minutos em repouso no frasco mbar, seguidos de 5 minutos de agitao mecnica ainda dentro do mbar para homogeneizao. Em seguida passaram pelo processo de pr-concentrao no frasco de Murray modificado. Os resultados demonstraram que em todos os experimentos ocorreu a extrao dos analitos, porm com variao na quantidade recuperada. Atravs dos experimentos foi possvel concluir que no h necessidade de deixar a amostra fortificada por tempo de repouso de 2 horas antes da adio no frasco de Murray modificado, mas o tempo de 10 minutos foi importante para o contato entre o analito e a amostra, favorecendo melhor recuperao dos agroqumicos. necessrio que, antes da amostragem ser transferida para o frasco de extrao (Murray modificado), seja feita a homogeneizao para que o analito

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esteja em condies uniformes de distribuio por toda a amostra, principalmente quando h preparo de quantidades maiores de amostra em uma nica etapa. Definido o tempo de repouso para melhor contato entre analito e amostra antes da pr-concentrao, foram realizados testes em duplicatas para a escolha do tempo de repouso mais adequado dentro do frasco de Murray, para a separao das fases orgnica e aquosa. Os tempos estabelecidos para os testes foram entre 10 a 90 minutos. As observaes aconteceram a partir do preparo de 4L de amostra, com 234g de NaCl (1Mol.dm-3), o pH foi ajustado para 5,0 e agitao de 10 minutos (90rpm, primeiramente sem contaminao da amostra). Os experimentos com o objetivo de verificar o melhor tempo de repouso e a resposta (mL) da recuperao do solvente hexano esto demonstrados na Tabela 5 e na Figura 14.
Tabela 5 Influncia da variao no tempo de repouso da amostra na recuperao do solvente orgnico extrator

Tempo de repouso (min) 10 30 60 90

Solvente Extrator Recuperado (mL) 0,780,03 (78%) 0,600,07 (60%) 0,500,08 (50%) 0,350,07 (35%)

O volume de solvente adicionado no frasco de extrao para cada experimento foi de 1mL de hexano. O tempo de repouso de 10 minutos foi o que apresentou o melhor resultado com relao recuperao do solvente sendo que o volume recuperado foi de 78% (0,780,03mL) do volume adicionado. Quando a amostra foi deixada sob repouso por 30 minutos no frasco, observou-se conforme a tabela 5, que diminuiu a quantidade do hexano recuperado para 60% (0,60 0,07mL) do volume adicionado. Nos experimentos onde as amostras ficaram em repouso por 60 minutos a recuperao foi de 50% do volume inicial. Com 90 minutos de repouso conseguiu-se quantificar somente 35% do hexano adicionado.

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TEMPO DE REPOUSO
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 10 min 30 min 60 min 90 min

Figura 14: Recuperao do solvente hexano de acordo como a variao nos tempo 10, 30, 60 e 90 -3 minutos de repouso. Condies: 1mol. dm de NaCl, pH ajustado em 5,0 e agitao: 10 minutos (90rpm), sem contaminao da amostra

Analisando a Figura 14 e comparando os resultados verificou-se que o tempo de repouso ideal para maior recuperao de volume de solvente orgnico na separao de fases (orgnica e aquosa) utilizando o procedimento de operao com o frasco de Murray modificado foi de 10 minutos, visto que, quando deixado o hexano em contato com a amostra por maior tempo pode ocorrer, como j citado, evaporao dos extratos para o ambiente externo. Depois da observao do tempo de repouso da amostra sem contaminao dentro do frasco de Murray modificado, foram realizados experimentos com preparo da amostra em triplicata nas mesmas condies citadas acima, com a fortificao de 80L da soluo padro dos agroqumicos organoclorados. Foi desconsiderado o tempo de 90 minutos visto que, este apresentou menor recuperao de solvente no experimento realizado sem contaminao. Os resultados esto demonstrados na Tabela 6 e no cromatograma apresentado na Figura 15.
Tabela 6 Recuperao dos agroqumicos organoclorados de acordo com o tempo de repouso da amostra no frasco de microextrao

Recuperao de Solvente (mL)

Tempo de Repouso 10 min 30 min 60 min

Recuperao Aldrin (mg dm-3) 1.956 1.822 1.966

Recuperao do BHC (mg dm-3) 1.620 1.595 1.831

Recuperao do Heptacloro (mg dm-3) 1.985 1.817 2.386

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Figura 15: Cromatograma dos ensaios em triplicata realizados para o estudo do melhor tempo de -3 repouso. Condies: 1mol. dm de NaCl, pH ajustado em 5,0 e agitao: 10 minutos (90rpm), com a amostra contaminada por 80L dos agroqumicos

Conforme demonstrado na Figura 16, quanto maior o tempo de repouso da amostra, maior a possibilidade de concentrao do analito em volume menor de solvente extrator, ultrapassando inclusive a concentrao esperada (1.6g.dm-3 do analito para 1mL de hexano), sugerindo a evaporao do solvente orgnico. A evaporao um fenmeno de difcil controle, que provoca uma situao desfavorvel, podendo implicar em alteraes da concentrao da amostra nas diversas etapas do processo analtico, como na amostragem, no transporte, na conservao e no acondicionamento. Nesse contexto, considera-se desejvel uma amostragem tanto mais representativa quanto for possvel, principalmente quando se trabalha com concentraes em nvel de traos. Portanto para os estudos posteriores foi escolhido o tempo de 10 minutos, sendo este tempo o qual permite recuperao do solvente hexano (0,78mL) mais prximo da quantidade adicionada (1mL).

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Concentrao (mg dm-3)

2.500 2.000 1.500 1.000 500 0

Recuperao Aldrin -31 (mg. dm ) Recuperao do BHC -31 (mg. dm ) Recuperao do -31 Heptacloro (mg. dm )

10 min 30 min 60 min

Agroqumicos

Figura 16: Estudo do tempo repouso na extrao dos agroqumicos em gua, sob agitao constante (90rpm) e temperatura ambiente (25C)

A variao na temperatura pode influenciar na recuperao ou at na remoo do solvente orgnico, pelo fato do sistema ser aberto, maior ser a evaporao ou degradao. Os agroqumicos estudados, especialmente o -BHC (Lindane), apresentam-se estveis em temperatura ambiente, desta forma, pode ter ocorrido uma maior concentrao dos analitos na extrao, pelo fato de que a temperatura nessas condies tenha favorecido para a volatilizao de parte do hexano para o ambiente externo e, os agroqumicos devido a esta estabilidade, tenham permanecido no frasco e se concentrado na alquota de hexano que permaneceu dentro do frasco.

4.4 ESTUDO DO EFEITO PRINCIPAL E INTERAES ENTRE AS VARIVEIS NA AMOSTRAGEM, DE ACORDO COM O PLANEJAMENTO FATORIAL

Como j foi citado, o processo de MLLE necessita da otimizao dos parmetros de extrao para cada tipo de matriz. Considerando essa necessidade, utilizando-se das condies experimentais previamente estudadas foram realizados estudos para definir a influncia dos nveis de pH, concentrao salina () e tempo de agitao (T.A) da amostra, buscando atingir a maior sensibilidade possvel do mtodo na recuperao dos agroqumicos. Amostras de gua ultrapura foram contaminadas com 80 L da soluo padro dos agroqumicos para cada ensaio de 1 litro, seguida da realizao das combinaes entre as variveis, previstas pelo planejamento de fatores que

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consistiu em realizar 8 ensaios e registrar as respostas observadas em todas as combinaes dos nveis escolhidos e um ponto central em duplicata, demonstradas na Tabela 7. A concentrao prevista para ser recuperada foi de 1,6 g. dm-3dos agroqumicos em 1L de gua concentrados em 1mL de solvente hexano. A Tabela 7 demonstra a matriz do planejamento juntamente com as respostas obtidas por cromatografia na forma de concentrao, para cada experimento.
Tabela 7 Matriz de planejamento contendo os efeitos principais, secundrios e tri-fatorial de interaes e respostas em concentrao para os agroqumicos estudados

Variveis pH
-3

Nvel baixo 3,0 (-) 5,0 (-) 10 (-) Interaes pH TA 13 + + + + 0 0 pH

Ponto Central 5,0 58,5 20

Nvel alto 7,0 (+) 112 (+) 30 (+)

-3

(g.dm )
Tempo de Agito (min) Efeitos principais exp. pH 1 + + + + + + + + 0 0 + + + + 0 0

Respostas (g.dm )
ALDRIN -3 (g.dm ) -BHC -3 (g. dm )

2 + + + + 0 0

TA 3 + + + + 0 0

pH

TA 23 + + + + 0 0

12 + + + + 0 0

TA 123 + + + + 0 0

HEPTACLORO -3 (g. dm )

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1,840 2,258 1,677 1,879 1,789 2,517 1,637 1,778 X=2,518 X=2,518

1,796 1,804 1,848 1,790 1,476 1,921 1,753 1,974 =2,011 =2,011

1,812 2,197 1,457 1,963 1,738 2,378 1,597 1,852 X=2,207 X=2,207

(X)Mdia, () concentrao salina, (T.A) tempo de agitao

O planejamento fatorial teve como objetivo executar todas as possveis combinaes dos fatores em relao aos nveis escolhidos, possibilitando a extrao do maior nmero de informaes possveis do sistema em estudo, com um nmero mnimo de ensaios.

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Estimativa do erro experimental: A estimativa do erro experimental foi calculada atravs do ponto central com o respectivo coeficiente de variao (CV%) para cada um dos agroqumicos. A extenso desse erro importante para avaliar a significncia estatstica dos fatores sobre a resposta. Em mtodos de anlise de traos ou impurezas, so aceitos CV de at 20% (Ribani, 2004).
Tabela 8 Recuperao do agroqumicos de acordo com o ponto central conforme planejamento fatorial, desvio padro e coeficiente de variao

Organoclorados Aldrin BHC Heptacloro

X(g. dm-3) 2,518 2,011 2,207

S(%) 0,179 0,062 0,122

CV% 7,13 3,13 5,54

(X) Mdia, (S) desvio padro, (CV) coeficiente de variao

Para a construo dos resultados da Tabela 9, primeiramente foram somadas as respostas obtidas em termos de concentrao atravs da CG para cada um dos agroqumicos Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro, relacionados aos

ensaios 01 a 08 da Tabela 7. Em seguida, este valor foi dividido por 8 para encontrar a mdia global que demonstra o rendimento da recuperao. Todas as colunas da tabela tm quatro sinais positivos e quatro sinais negativos, qualquer efeito, portanto, pode ser interpretado como a diferena entre as duas mdias (BRUNS, 1996). As expresses, 4.0, 5.0 e 6.0 podem ser reescritas nas expresses 4.1, 5.1 e 6.1, como a diferena entre a resposta mdia no nvel superior e nvel inferior para os trs agroqumicos, as quais foram utilizadas para encontrar os valores dos efeitos principais (pH, U e T.A) demonstrados na Tabela 9.

Expresso para o clculo de efeito do pH:

pH = (){(y2 + y4 + y6 + y8) () (y1 + y3 + y5 + y7)} pH =

+

(4.0) (4.1)

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Expresso para o clculo do efeito da concentrao salina ():

= (){(y2 + y4 + y6 + y8) () (y1 + y3 + y5 + y7)} =

+

(5.0) (5.1)

Expresso para o clculo de efeito do tempo de agitao (T.A):

TA = (){(y2 + y4 + y6 + y8) () (y1 + y3 + y5 + y7)} TA =

+

(6.0) (6.1)

O efeito das interaes entre dois fatores pode ser calculado pela expresso 7.0 e seus resultados esto demonstrados na Tabela 9:

pHxCS = pHCS = (

-)

(7.0)

O efeito de interaes entre os trs fatores foi calculado pela equao 8.0 e seus resultados esto demonstrados na Tabela 9:

pHxCSxTA = pHCSTA = (

-)

(8.0)

Tabela 9 Efeitos principais e de interaes calculados para as combinaes do planejamento fatorial 2 a partir dos dados obtidos da Tabela 7
3

Aldrin Mdia Global 1,921(0,179) Efeitos principais (1) pH +0,372(0,179) (2) -0,358(0,179) (3) T.A +0,016(0,179) Efeitos de interao (entre dois fatores) (1) pH x (2) -0,201(0,179) (1) pH x (3) T.A +0,062(0,179) (2) x (3) T.A +0,087(0,179) Efeitos de interao (entre trs fatores) (1) pHx(2) (3)TA -0,093(0,179)

-BHC(Lindane) 1,795(0,062) +0,15(0,062) +0,09(0,062) -0,02(0,062) -0,07(0,062) +0,17(0,062) -0,07(0,062) -0,03(0,062)

Heptacloro 1,874(0,122) +0,44(0,122) -0,31(0,122) +0,03(0,122) -0,06(0,122) +0,001(0,122) -0,01(0,122) -0,12(0,122)

68

Atravs dos dados apresentados na Tabela 9, pde-se observar que os efeitos principais significativos entre os fatores para os agroqumicos Aldrin, -

BHC(Lindane) e Heptacloro so, pH e , podendo ser desconsiderado o tempo de agitao por estar abaixo do erro padro calculado atravs do coeficiente de variao do ponto central. Isso significa que o efeito principal tempo de agitao (T.A), pode ser interpretado isoladamente, porque o seu valor estando abaixo do coeficiente de variao, demonstra que no h interao, ou seja, influncia desse fator nos demais resultados. Esse assunto ser discutido detalhadamente no item 4.5.3, que se refere ao efeito principal tempo de agitao. A Tabela 9 demonstra que quando existe a interao entre os dois fatores pH e , h influncia na recuperao do Aldrin. Para o -BHC(Lindane) observa-se que a interao entre dois fatores foi significativa em todas as combinaes. O Heptacloro no demonstrou efeito de interaes entre dois fatores nos experimentos. A interao entre trs fatores se mostrou sem significncia para os trs agroqumicos em estudo por estar abaixo da estimativa de erro padro calculado.

4.5 EFEITOS PRINCIPAIS

4.5.1 Efeito do pH

A anlise da significncia estatstica para o efeito principal do pH na recuperao do Aldrin, -BHC (Lindane) e Heptacloro, foi determinada atravs das expresses 4.0 e 4.1. Para o Aldrin, -BHC (Lindane) e Heptacloro, obtiveram-se as respostas

+0,372 (0,179), +0,15(0,062) e +0,44(0,122), respectivamente, demonstradas na Tabela 9 como efeitos significativos na recuperao de todos estes agroqumicos. Quando transformados esses resultados em pontos percentuais para melhor interpretao, observa-se que a elevao do pH favorece para as extraes dos agroqumicos, pois observando os trs resultados pode-se concluir que quando se avana de um nvel inferior (-) onde o pH 3, para um nvel superior (+) onde o pH 7, h tendncia de ganhos na eficincia de extrao em 23,3 pontos percentuais para o Aldrin, 9,4 pontos percentuais para o -BHC (Lindane) e 27,5 pontos

percentuais para o Heptacloro, sendo este um fator altamente significativo na

69

recuperao dos compostos estudados, por estar acima do erro experimental da determinao. De modo geral, conclui-se para os trs agroqumicos estudados que o pH 7,0 o ponto timo de acordo com as respostas das variaes experimentais.

4.5.2 Efeito da Concentrao Salina ()

A sensibilidade do mtodo pode em muitos casos ser aumentada na presena de sal, conforme cita Komatsu (2004), devido ao efeito salting out (conduo dos analitos da soluo para a fase orgnica). Quando se trata de microextrao lquido-lquido utilizando o frasco de Murray modificado para os agroqumicos organoclorados em estudo, Carasek (1997) concluiu em seu estudo que o efeito salting-out favorece a passagem dos pesticidas para a fase orgnica e que no h necessidade de saturar a fase aquosa com sal. O mesmo cita que a adio de sal na amostra aquosa minimiza solubilidade do solvente orgnico na gua. O trabalho desenvolvido por Zapf (1995) utilizando um frasco microextrator, tambm demonstra melhorias na recuperao quando adicionado NaCl na amostragem, afirmando que no momento da partio do solvente orgnico e a gua, o sal favorece para a menor solubilidade. Em estudo recente (FARIA, 2004), sobre extrao de alguns agroqumicos em gua, o autor cita que o aumento da concentrao salina tem como objetivo diminuir as interaes do analito com a gua (solvente) e assim facilitar a reteno no solvente orgnico utilizado e, portanto, aumentar a recuperao dos analitos. Assim, a adio de sal na amostra deve ter maior influncia para pesticidas polares. No se pode dizer que s pela adio de sal amostra as recuperaes sero maiores. Conforme experimentos, a influncia da concentrao salina foi determinada empregando-se solues contaminadas e insaturadas com 5g em nvel (-) e 112g em nvel (+) de NaCl em 1 litro de amostra. Para o clculo de efeito da tendncia foram utilizadas a expresso 5.0 e 5.1 e os valores foram demonstrados na Tabela 9. Os resultados obtidos para o Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro so,

respectivamente, -0,358(0,179), +0,09(0,062) e -0,31(0,122). Esses resultados demonstram na interpretao isolada deste fator que o efeito da adio do nvel (+)

70

de sal na amostra favorece negativamente na recuperao dos agroqumicos Aldrin e Heptacloro. Isso significa dizer que, quando se avana ao longo do planejamento de um nvel superior (+) 112g da NaCl onde gerada maior fora inica para um nvel inferior (-) 5g de NaCl, h tendncia de ganhos em eficincia de 22,4 pontos percentuais na recuperao do Aldrin e 19,38 pontos percentuais na recuperao do Heptacloro, sendo altamente significativos esse valores por estarem acima do erro experimental da determinao. Os clculos foram demonstrados em percentual para melhor comparao deste efeito. Entre os compostos analisados, o -BHC(Lindane) foi o nico que

demonstrou ter melhor recuperao na extrao com a presena do nvel (+) de sal. Esse resultado demonstra que o efeito da adio de maior quantidade de sal gera fora inica suficiente para favorecer positivamente a recuperao do pesticida. Isso significa dizer que, quando se avana ao longo do planejamento de um nvel inferior (-) de para um nvel superior (+), se ganha em eficincia 5,63 pontos percentuais na recuperao do agroqumico BHC, sendo significativo esse valor por estar acima do erro experimental da determinao, demonstrado atravs da duplicata do ponto central na Tabela 8. Pode-se concluir, observando a Figura 17 e comparando com os resultados do experimento preliminar da amostra sem ajuste de pH (6,01) e sem adio de sal, demonstrado na Tabela 3 e no cromatograma da Figura 10, que a concentrao salina de grande importncia para a extrao dos agroqumicos, porm, no h necessidade de adicionar quantidade acima de 5g de NaCl na amostra, pois a partir dessa quantidade para os agroqumicos Aldrin e Heptacloro observou-se perda na eficincia de recuperao, concordando esse resultado com o estudo anterior realizado por Carasek (1997) utilizando o mesmo frasco como extrator. Observando o clculo, verifica-se que a recuperao do -BHC(Lindane) melhora com a adio do nvel (+) de sal, mas a diferena no se sobressai a 6%. Para melhores concluses foi realizada a interpretao geomtrica desse efeito interagindo com o pH que ser discutido no item 4.6. tambm interessante em trabalhos futuros detalhar outros nveis de concentrao salina para o estudo, pois se esse percentual de recuperao no for to significativo e representativo na recuperao implicaria na economia de 100g de NaCl para cada ensaio realizado, utilizando-se de um nvel menor de na amostragem.

71

2.500

Concentrao (mg.dm )

-3

2.000 1.500 1.000 500 0 Recuperao Aldrin -3 (mg.dm ) (mg.dm-3) Recuperao do BHC -3 (mg.dm ) (mg.dm-3)
Agroqum icos pH=7,0 =5g pH=7,0 =112g pH=6,01 =0

Recuperao do (mg.dm-3) Heptacloro (mg.dm-3)

Figura 17: Recuperao dos agroqumicos sem adio de sal, 5g de sal na amostra (nvel -) e 112g de sal (nvel +) do planejamento fatorial

4.5.3 Efeito do Tempo de Agitao

A quantidade de analito extrado depende da razo entre o contato e a transferncia de massa da fase aquosa para o solvente orgnico (KOMATSU, 2004). Usualmente pode-se melhorar a transferncia de massa atravs da agitao da amostra, pois uma forma de transporte entre as fases. A influncia do tempo de agitao (10, 20 e 30 minutos) nas combinaes de variveis estabelecidas pelo planejamento de fatores, pode ser demonstrada para cada um dos agroqumicos estudados, atravs da eficincia na extrao de acordo com a quantidade de analito adicionado (1,6g. dm-3) na amostra e a quantidade de analito recuperado. Os valores demonstrados na Tabela 9 para a avaliao da influncia do efeito principal tempo de agitao nos experimentos, foram obtidos pela expresso 6.0 e 6.1. Atravs da observao dos efeitos calculados, +0,016(0,179) para o Aldrin, -0,02(0,062) para o -BHC(Lindane) e +0,03 (0,122) para o Heptacloro, foi

demonstrado que no h evidncias da interao entre o tempo de agitao (T.A) com os outros dois fatores, pois os valores calculados para o T.A, so inferiores aos valores de estimativa do erro padro, sendo a extenso desse erro considerada importante para a deciso da existncia ou no de efeito significativo do fator sobre a resposta. Desta forma o T.A foi considerado um fator entre os trs nveis sem

72

interferncia significativa na recuperao dos agroqumicos, quando varia do nvel menor para o nvel maior entre os valores estabelecidos no planejamento. Pode-se concluir que a eficincia na extrao dos agroqumicos considerada semelhante quando o experimento realizado com tempo de 10, 20 ou 30 minutos de agitao. Neste caso, no foram observadas diferenas significativas entre as diversas condies experimentais utilizadas do nvel (-) para o nvel (+), por questo de simplificao e economia de tempo, optou-se por utilizar o tempo de agitao de 10 minutos como condio tima para a validao do mtodo. A interao entre dois e trs fatores somente se mostrou significativa para o -BHC(Lindane) por estar acima do erro experimental, mas observando a Tabela 9 verifica-se que quando h interao entre trs fatores a resposta obtida est muito prxima do erro experimental, no oferecendo uma significncia relevante.

4.6 INTERPRETAO GEOMTRICA DOS EFEITOS

O planejamento fatorial tambm foi aplicado em um sistema geomtrico para melhor compreenso dos resultados. As respostas em concentrao esto demonstradas atravs das figuras 18, 19 e 20 que representam a interpretao geomtrica dos resultados referentes recuperao, mostrando o efeito principal para cada agroqumico (pH, e T.A), bem como o efeito da interao entre eles. A representao geomtrica foi dada atravs de um diagrama de planejamento fatorial 22 pois as interaes foram observadas somente entre dois fatores (pH e ). Os resultados foram novamente demonstrados na forma de percentual de recuperao, para possibilitar a melhor interpretao da influncia de cada parmetro na representao geomtrica, conforme as Figuras 18, 19 e 20. Os valores numricos percentuais dentro dos crculos, representam a eficincia de recuperao medida por cromatografia gasosa e as setas apontam para as tendncias de maior eficincia. O valor que est no centro a mdia de recuperao obtida. Nesta representao foram considerados somente os efeitos significativos. Deve-se lembrar que esses percentuais foram obtidos pr-concentrando os analitos no volume de 1mL de hexano adicionado, mas dessa totalidade, somente foram recuperados aproximadamente 0,7mL do solvente orgnico adicionado. Atravs da representao geomtrica observa-se para o Aldrin (figura 18) que a elevao do pH do nvel (-) para o nvel (+), aumenta o rendimento da

73

extrao, mas esse efeito muito mais pronunciado quando a concentrao salina () est no nvel menor, igual (5g) do que quando a concentrao salina () est igual a 112g (nvel +), obtendo-se +36,3% de eficincia nesta condio, contra +10% no nvel (+). A condio tima de extrao para o Aldrin foi considerada pH = 7,0 e = 5g de NaCl.

ALDRIN
+10% (+)112
104,0% 114,3%

%% -9% +35%

(g)

120.0%

(-) 5

113,0%

149,3%

+36,3%

pH (-) 3,0 (+) 7,0

Figura 18: Diagrama para interpretao geomtrica dos efeitos da concentrao salina () e do pH 2 sob condies otimizadas para o Aldrin, no planejamento fatorial 2

A representao geomtrica dos resultados na Figura 19 demonstra o rendimento da extrao do -BHC(Lindane). Quando se tem menor concentrao salina a variao de pH de 3,0 para 7,0 resulta em um aumento de eficincia de 14,4 pontos percentuais. Por outro lado, em nvel (+) de concentrao salina a elevao do pH implica em um ganho de eficincia de apenas 5,3 pontos percentuais.

74

-BHC(Lindane)
+5,3%

(+)112

112,3%

117,6%

(g)

+10,3%

112.0%

-1,2%

(-) 5

102,0%

116,4%

+14,4%

pH (-) 3,0 (+) 7,0

Figura 19: Diagrama para interpretao geomtrica dos efeitos da concentrao salina() e do pH sob 2 condies otimizadas para o -BHC(Lindane), no planejamento fatorial 2

Observando a figura 19, verifica-se pelos clculos que a melhor condio de extrao, considerando a determinao do erro experimental a de nvel (+) para a concentrao salina e nvel (+) para pH, resultando em uma eficincia 1,2 % superior segunda opo de melhor condio de extrao. Apesar da maior eficincia indicada ser 117,6%, considerou-se a melhor condio a de nvel (+) para o pH e nvel (-) para a concentrao salina que indica recuperaes de 116,4% para o BHC(Lindane), pois utilizar a condio de nvel (+) para a concentrao salina implicaria no uso de mais sal, para resultados muito semelhantes, essa informao est em conformidade com a literatura (CARASEK, 1997).

Heptacloro
+23,9% (+)112
95,4% 119,3%

(g)

-15,5%

112.0%

+23,7%

(-) 5

110,9%

143,0%

+32,0%

pH (-) 3,0 (+) 7,0

Figura 20: Diagrama para interpretao geomtrica dos efeitos da concentrao salina () e do pH 2 sob condies otimizadas para o Heptacloro, no planejamento fatorial 2

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Da mesma forma que foi observada para o -BHC(Lindane), neste caso na extrao do Heptacloro (figura 20) considerando a menor concentrao salina a elevao do pH, implica em um aumento de eficincia de aproximadamente 32 pontos percentuais. Este comportamento tambm foi observado utilizando um nvel maior de concentrao salina, ocorrendo neste caso, um aumento de eficincia de 23,9 pontos percentuais. Observa-se claramente uma tendncia evidenciada tambm no estudo para o -BHC(Lindane) de aumento de eficincia com o pH.

Desta forma conclui-se que a condio tima de extrao para o Heptacloro aquela que utiliza um nvel menor de (5g) e maior de pH (7,0).

4.7 VALIDAO DO MTODO DE DETERMINAO DOS AGROQUMICOS ORGANOCLORADOS EM AMOSTRAS AQUOSAS

4.7.1 Curva Analtica

A validao da metodologia realizada para garantir a exatido analtica, a especificidade e a reprodutibilidade. A interao entre o principio ativo e a matriz dentro de uma tcnica analtica resulta na quantificao desejada e correta. A conformidade da metodologia deve ter alguns parmetros obrigatrios como cita Vieira (2004) e Ribani (2004), como: linearidade, especificidade, exatido, preciso, limite de deteco, limite de quantificao, robustez. O trabalho iniciou pela determinao do mtodo cromatogrfico que foi de calibrao externa pelo mtodo. Para tal comparao e conformidade foi obtido primeiramente um cromatograma, atravs da adio da soluo padro dos agroqumicos, demonstrando a concentrao de 20mg.mL-1 conforme Figura 21.

76

Figura 21: Cromatograma da soluo padro 20mg.mL

-1

Para verificar a capacidade do mtodo em fornecer resultados diretamente proporcionais a concentrao da substncia dentro de uma determinada variao, o primeiro e mais simples parmetro a ser avaliado a linearidade que foi obtida plotando os valores da rea contaminada conforme o cromatograma versus a concentrao da soluo analtica adicionada, sendo este fator normalmente relacionado com a variao da inclinao da linha de regresso. Desta forma, as curvas analticas para cada um dos agroqumico, foram obtidas utilizando solues padres de referncia (20mg.mL-1) nos volumes 20L, 40L, 80L, 160L, 240L na contaminao utilizada nos experimentos. As respostas de recuperao esperadas foram de 0,40g, 0,8g, 1,6g, 3,2g e 4,8g a cada litro, respectivamente. Realizou-se uma regresso linear pelo mtodo dos mnimos quadrados e verificou-se o coeficiente de determinao, r2, adequado para cada um dos agroqumicos estudados (LEITE, 2002). As curvas de calibrao obtidas com as fortificaes das amostras a partir dos padres dos agroqumicos apresentaram um desvio padro relativo variando de 6% a 25% para n=5. O r2 calculado para cada agroqumico em mdia 0,9900 como mostrados nas Figuras 22, 23 e 24. Estes resultados indicam que as curvas de

77

calibrao so representativas para comparao com os valores dos agroqumicos organoclorados encontrados nas amostras de guas naturais analisadas.
Tabela 10 Dados obtidos atravs de ensaios experimentais para construo da curva de calibrao do Aldrin. Condies: solvente extrator = 1mL de hexano, pH = 5,0, = 117g de NaCl, T.A = 10min e Tempo de repouso = 10min
CONSTRUO DA CURVA DE CALIBRAO ALDRIN EXP. 1 2 3 4 5 Conc. do ponto da curva 0,0 0,4 0,8 1,6 3,2 rea Conc. do CG Corrigida 0,0 1401,5 1624,0 3422,0 6302,7 -0,1374 0,5977 0,7143 1,6573 3,1681 % desvio 0,0000 33,0718 -11,9908 3,4574 -1,0083 0 0 1579 1847 3350 8160 Coeficiente ngular da reta Coeficiente Linear da reta 0 1565 0 1423 3340 5331 0 1612 1224 1602 3576 5417
MDIA DA REA DO CROMATOGRAMA 0,0 1588,5 1401,5 1624,0 3422,0 6302,7 14387,0

13548 16058 13555 1906,770938 Mdia % desvio %RSD 4,7060

261,908275

16,88014963

CURVA DE CALIBRAO DO ALDRIN

7000,0 6000,0 5000,0 4000,0 3000,0 2000,0 1000,0 0,0 0,000 y = 1906,8x + 261,91 R2 = 0,9892

rea

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

-1 -3) Concentrao(g.L (g.dm ) Concentrao

Figura 22: Curva de calibrao para o agroqumico Aldrin

78 Tabela 11 Dados obtidos atravs de ensaios experimentais para construo da curva de calibrao do BHC(Lindane). Condies: solvente extrator = 1mL de hexano, pH = 5,0, = 117g de NaCl, T.A = 10min., Tempo de repouso = 10min

CONSTRUO DA CURVA DE CALIBRAO BHC(LINDANE)

EXP. 1 2 3 4 5 6 Coeficiente ngular da reta Coeficiente Linear da reta

Conc. do ponto da curva 0,0 0,4 0,8 1,6 3,2 4,8

rea do CG 0,0 2383,7 4707,3 9159,7 20091,0 31071,3

Conc. Corrigida 0,0387 0,4196 0,7908 1,5022 3,2488 5,0031

% desvio 0,0000 4,6598 -1,1626 -6,5108 1,5008 4,0604 0 2466 1599 4470 8634 0 3812 2746 5084 8838 0 3679 2806 4568 10007

MDIA DA REA DO CROMATOGRAMA 0,0 3319,0 2383,7 4707,3 9159,7 20091,0 31071,3

23895 21853 14525 31674 34341 27199

6258,75

Mdia % desvio %RSD

-0,3026

-242,16

4,100336844

CURVA DE CALIBRAO DO -BHC(LINDANE)

35000,0 30000,0 25000,0 20000,0 rea 15000,0 10000,0 5000,0 0,0 0,000 -5000,0 y = 6480,5x - 429,43 R2 = 0,9986

1,000

2,000

3,000

4,000

5,000

6,000

-1 -3 ) Concentrao Concentrao (g.dm (g.L )

Figura 23: Curva de calibrao para o agroqumico -BHC(Lindane)

79 Tabela 12 Dados obtidos atravs de ensaios experimentais para construo da curva de calibrao do Heptacloro. Condies: solvente extrator = 1mL de hexano, pH = 5,0, = 117g de NaCl, T.A = 10min e Tempo de repouso = 10min
CONSTRUO DA CURVA DE CALIBRAO HEPTACLORO EXP. 1 2 3 4 5 6 Coeficiente ngular da reta Coeficiente Linear da reta Conc. do ponto da curva 0,0 0,4 0,4 0,8 1,6 3,2 rea Conc. do CG Corrigida 0,0 1231,7 1210,7 1826,7 3643,3 6868,7 -0,1128 0,4769 0,4668 0,7618 1,6316 3,1758 % desvio 0,0000 16,1209 14,3142 -5,0204 1,9343 -0,7614 0 1034 1428 2026 3490 8347 0 1625 1000 1696 3547 6127 0 1036 1204 1758 3893 6132
MDIA DA REA DO CROMATOGRAMA 0,0 1231,7 1210,7 1826,7 3643,3 6868,7 13844,3

12968 15705 12860 2088,596154 Mdia % desvio %RSD 4,4313

235,6641026

8,677416976

CURVA DE CALIBRAO DO HEPTACLORO

8000,0 7000,0 6000,0 5000,0 rea 4000,0 3000,0 2000,0 1000,0 0,0 0,000 y = 2088,6x + 235,66 R2 = 0,9962

0,500

1,000

1,500

2,000
-3

2,500

3,000

3,500

Concentrao (g.L Concentrao (g.dm ) -1)

Figura 24: Curva de calibrao para o agroqumico Heptacloro

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As curvas analticas obtidas para o Aldrin, -BHC(Lindane) e Heptacloro, indicam boa linearidade do mtodo na faixa de concentrao estudada. Analisando a equao das retas obtidas observa-se que a resposta do detector mostrou-se linear mesmo para faixas extensas de concentrao, pois as curvas de calibrao apresentaram valores de r2, 0,9892, 0,9986, 0,9962, respectivamente. Estes resultados permitiram indicar uma estimativa da qualidade da curva obtida, pois quanto mais prximo de 1,0, indicativo de menor disperso do conjunto de pontos experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regresso estimados. A ANVISA recomenda um coeficiente de correlao igual a 0,99 e o INMETRO um valor acima de 0,9. Deste modo nota-se a representatividade das curvas de calibrao obtidas para os agroqumicos em estudo. A preciso do mtodo foi avaliada pela estimativa do desvio padro relativo, ou seja, pelo coeficiente de variao (CV) Para a exatido, pode-se expressar a relao do resultado obtido com o resultado esperado.

4.7.2 Recuperao

Com o fator de recuperao, o resultado fica mais prximo da realidade analtica, ou seja, determina-se a eficincia do mtodo (LEITE, 2002). As recuperaes foram determinadas a partir de uma nica etapa de extrao e as concentraes adicionadas nas amostras variaram entre 0,4 e 4,8 g. dm-3. A Tabela 13 demonstra a recuperao quantificada atravs da cromatografia gasosa e o fator de recuperao que se d atravs da comparao das concentraes definidas dos analitos adicionadas e retiradas de acordo com a expresso, j demonstrada nos materiais e mtodos. Fator rec = Ar x 100 Ai A tabela abaixo apresenta o resultado do fator de recuperao, desvio padro (S) e coeficiente de variao (CV%) dos agroqumicos estudados em amostras de guas fortificadas, utilizando o dispositivo de microextrao lquidolquido e a quantificao por CG:

81 Tabela 13 Fator de recuperao dos analitos de acordo com a fortificao da amostra

Agroqumicos Aldrin Aldrin Aldrin Aldrin Aldrin -BHC(Lindane) -BHC(Lindane) -BHC(Lindane) -BHC(Lindane) -BHC(Lindane) Heptacloro Heptacloro Heptacloro Heptacloro Heptacloro

Fortificada Esperada Recuperada -3 -3 (L) g.dm g. dm 20 40 80 160 240 20 40 80 160 240 20 40 80 160 240 0,4 0,8 1,6 3,2 4,8 0,4 0,8 1,6 3,2 4,8 0,4 0,8 1,6 3,2 4,8 0,3 0,4 0,9 1,7 4,0 0,4 0,8 1,6 3,5 5,5 0,3 0,5 1,1 2,1 4,3

S 0,07 0,06 0,03 0,45 0,408 0,66 0,059 0,13 0,088 0,645 0,66 0,05 0,06 0,397 0,50

Fator de CV (%) Recuperao (%) 17,70 98,75 13,10 57,25 3,10 60,31 25,52 55,53 10,06 84,50 15,50 106,50 5,94 105,25 7,93 102,44 24,52 112,38 11,61 115,88 17,50 94,00 8,80 70,88 5,30 70,69 18,64 66,66 11,62 89,58

(S) Desvio padro, (CV) coeficiente de variao

4.7.3 Limite de Deteco e Limite de Quantificao

Na Tabela 14 esto demonstrados os parmetros e resultados obtidos atravs das curvas analticas (inclinao e interseco), faixa linear, coeficiente linear, coeficiente angular, correlao linear (r2) encontrados para os agroqumicos, empregando o mtodo de microextrao lquido-lquido e anlise por CG. Para o Aldrin foi observado que a concentrao abaixo 0,4g. dm-3, apresentou instabilidade na quantificao. A partir dos dados obtidos atravs das curvas de calibrao foi possvel calcular os limites de deteco e quantificao dos agroqumicos, demonstrado na tabela 14.
Tabela 14 Limite de deteco e quantificao dos agroqumicos organoclorados para a metodologia proposta CLCULO DO LIMITE DE DETECO E QUANTIFICAO

Coeficiente Coeficiente linear angular ALDRIN -BHC(LINDANE) HEPTACLORO 261,9083 242,1600 235,6641 1906,7709 6258,7500 2088,5962

Faixa de concentrao R2 -3 g. dm 0,4533 1,3736 0,4 - 4,8 0,989 0,1277 0,3869 0,4 - 4,8 0,999 0,3724 1,1283 0,4- 4,8 0,996 LOD LOQ

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Os limites de deteco para os trs agroqumicos estudados foram calculados considerando os resultados da linearidade oferecidos pelas curvas analticas em relao as suas concentraes. Os valores de limite de deteco so da ordem de g. dm-3, indicando a viabilidade deste mtodo para a determinao de quantidades traos de agroqumicos em guas. Os valores, referentes ao mtodo, do LOD foram 0,1 e 0,5 g. dm-3 e LOQ 0,3 e 1,4g dm-3. Estes resultados indicam que o mtodo sensvel para detectar a presena de agroqumicos em nveis baixos de concentrao nas matrizes aquosas.

4.8 AVALIAO DA METODOLOGIA EM MATRIZES REAIS UTILIZANDO AS CONDIES OTIMIZADAS ATRAVS DO PLANEJAMENTO FATORIAL A Bacia do Rio Pato Branco ocupa uma rea de 270Km2 e est situada na regio Sudoeste do Estado do Paran, entre os municpios de Pato Branco e Maripolis, a 261442 de latitude Sul e 523303 de longitude Oeste, com altitude variando entre 700 e 800m. Os principais mananciais fornecedores desta bacia so os rios: Divisa, Panela, Mangueirinha, Lambedor, Pinheiro e Conrado (MELLO, 2002). A regio compe-se de solos planos e acentuadamente ondulados. Os solos de declive mais suave so latossolos que esto sendo utilizados para o cultivo anual atravs de plantio direto, principalmente no vero. Logo aps so utilizados para cobertura de inverno utilizada na bovinocultura de leite. Os solos mais declivosos, litlicos ou cambissolos, so utilizados principalmente com pastagens ou com florestas secundrias, de acordo com Diagnstico realizado em 1998 (SILVA, 1998). As guas da Bacia Hidrogrfica do Rio Pato Branco e afluentes, segundo a Resoluo do CONAMA n 357/05, se enquadram na classificao de gua doce, classe 2, desta forma, podendo ser utilizada para o abastecimento domstico aps tratamento convencional. No que se refere questo ambiental, de acordo com estudos realizados desde 1998 atravs do Diagnstico da Bacia do Rio Pato Branco, a maioria das propriedades vizinhas da bacia hidrogrfica no satisfazem as premissas legais que so 20% da rea coberta com vegetao nativa (Reserva Legal) e 30 metros de cada lado do curso de gua com mata ciliar, contribuindo assim para a incluso de qualquer espcie qumica at o corpo dgua.

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De acordo com dados apresentados pela SINDAG, a regio sudoeste faz parte da rota do trfico de agrotxicos inclusive sendo um dos possveis destinos finais desses produtos (proibidos ou ilegais), o monitoramento dos princpios ativos proibidos por lei de grande relevncia neste sistema hidrolgico que se tem a suspeita da utilizao de agroqumicos que no se conhece a procedncia e formulao dos mesmos, especialmente porque a gua desta bacia abastece a populao da cidade de Pato Branco - PR. A metodologia de MLLE proposta neste trabalho foi aplicada em amostras de guas coletadas da Bacia do Rio Pato Branco e seus afluentes. A coleta foi realizada a uma profundidade de 50 centmetros da superfcie das guas, em perodos sem chuvas e fora da poca de plantio. Foram determinados in situ os parmetros: pH, temperatura da gua e do ar. O pH manteve-se dentro do esperado para guas naturais, entre 6,5 a 7,3. A temperatura variou entre 15C a 17C, conforme tabela 15. Para determinar a concentrao dos agroqumicos na gua fez-se uma prconcentrao destes, utilizando o frasco de Murray modificado, como solvente extrator foi usado o hexano e os demais fatores foram ajustados de acordo com as condies timas para extrao, obtidas atravs do planejamento fatorial estudado neste trabalho. Desta forma, cada amostra de guas coletada de cada afluente contribuinte da Bacia do Rio Pato Branco, recebeu 5g de NaCl, o pH foi ajustado para 7,0 com HCl ou NaOH, 0,1Mol. dm-3 (quando necessrio) o tempo de agitao da amostra foi 10 minutos e o tempo de repouso tambm foi otimizado em 10 minutos. Os extratos depois de coletados foram armazenados em vails e analisados por cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas.
Tabela 15 Descrio dos pontos de amostragem na Bacia do Rio Pato Branco: pH, temperatura do ar e temperatura da gua

Pontos de coleta - Local 01 Rio Divisa 02 Rio Pinheiro 03 Captao Rio Pato Branco 04 Rio Lambedor 05 Rio Mangueirinha 06 Rio Panela

pH 7,3 6,8 7,2 6,8 6,4 6,7

Temperatura Temperatura do ar (C) da gua (C) 15 17 16 17 15 17 16 18 17 18 17 18

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Os resultados obtidos atravs da cromatografia gasosa indicaram a presena dos trs compostos organoclorados estudados neste trabalho no ponto 02 correspondente ao Rio Pinheiro. As amostras foram analisas em duplicata e as concentraes obtidas para o Aldrin, -BHC (Lindane) e Heptacloro foram de 0,3 a 0,5 g.dm-3 demonstrados na Tabela 16, indicando que essa regio pode estar sendo contaminada com organoclorados em dias atuais mesmo estando proibidos ou ainda pode ser reflexo da utilizao desses produtos em pocas passadas.
Tabela 16 Concentrao de organoclorados nas amostras de guas naturais da Bacia do Rio Pato Branco

Ponto 01 02

Localizao rea/Cromatograma Concentrao (g.L-1) Rio Divisa 0 0 Rio Pinheiro Aldrin = 1395 (1) 0,394 (1) 1720 (2) 0,485 (2) -BHC = 2344 (1) 2133 (2) Heptacloro = 1055 (1) 1999 (2) 0 0 0 0 0,420 (1) 0,382 (2) 0,328 (1) 0,414 (2) 0 0 0 0

03 Captao Rio Pato Branco Rio Lambedor 04 Rio Mangueirinha 05 Rio Panela 06

A concentrao desses agentes txicos na gua no constante, pois o lanamento agrcola intermitente, ou seja, no contnuo. Desta forma, a presena desses compostos na gua pode variar ao longo de um mesmo dia e, em escala maior ou menor, dependendo da diluio. A Figura 25 apresenta o cromatograma referente s amostras de guas naturais contaminadas por organoclorados: Aldrin, coletada no ponto 02 - Rio Pinheiro. -BHC(Lindane) e Heptacloro

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Figura 25: Cromatograma da amostra de guas naturais do ponto 02 - Rio Pinheiro, na presena dos agroqumicos Aldrin, -BHC (Lindane) e Heptacloro

Na observao visual, o Rio Pinheiro foi um dos pontos de coleta em que aparentemente a gua era menos turva comparando como os demais. A turbidez das guas naturais, especialmente no caso dos rios, pode ser considerada como um fator positivo para a remoo dos organoclorados, pois no caso os agroqumicos ficam retidos na matria orgnica (Amato, 2002). Levando em considerao esse conceito, h possibilidade dos outros afluentes tambm estarem contaminados por molculas de organoclorados. Uma anlise de gua e sedimento poderia confirmar essa hiptese.

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CONCLUSO Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que o mtodo de microextrao lquido-lquido, utilizando o frasco de Murray modificado, na prconcentrao dos agroqumicos organoclorados (Aldrin, -BHC(Lindane) e

Heptacloro, foi eficiente, simples e rpido. A utilizao da tcnica de MLLE em amostras de guas teve como caracterstica relevante na preparao da amostra, a reduo do volume de solvente orgnico utilizado na pr-concentrao, diminuindo desta forma, rejeitos txicos que, em geral, so descartados para o meio ambiente e tambm ofereceu a vantagem de adequar o volume recuperado ao requerido pelas tcnicas cromatogrficas. A utilizao do planejamento fatorial de experimentos foi uma ferramenta estatstica de extrema importncia, pois permitiu extrair um nmero elevado de informaes com um nmero mnimo de ensaios laboratoriais, oferecendo vantagens como: economia de tempo, diminuio nos gastos com reagentes e informaes eficazes no processo de avaliao do mtodo. As melhores condies de anlise demonstradas pelo mtodo MLLE foram determinadas atravs da cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massa. Para a pr-concentrao dos analitos na amostra, o solvente orgnico que se mostrou mais eficiente foi o hexano e o volume utilizado foi de 1mL em 1 litro de amostra. Os solventes extratores utilizados na anlise de agroqumicos podem ser particularmente problemticos, pois as impurezas presentes desde o manuseio at o momento da anlise podem dificultar a interpretao dos resultados obtidos. As variveis estudadas, atravs de planejamento fatorial de experimentos foram: pH, e tempo de agitao da amostra. Os resultados obtidos demonstraram interao entre dois fatores e as combinaes mais relevantes. Desta forma, o pH encontrado como adequado para a recuperao de todos os agroqumicos estudados foi na faixa de 7,0, sendo demonstrado ganhos entre 9,4 e 27,5 pontos percentuais comparados aos resultados de extrao onde se trabalha com o pH 3,0. A sensibilidade do mtodo de microextrao tambm aumenta quando existe a presena de sal na amostra. Os resultados demonstraram que quando utilizado o nvel (-) do planejamento (5g de NaCl), h aumento na eficincia de recuperao do Aldrin e Heptacloro de 19,38 e 22,40 pontos percentuais. O -BHC(Lindane) foi o nico que demonstrou a sua eficincia melhorada em 5,63 pontos percentuais,

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quando se utilizou um nvel (+)de , nos experimentos, quando avaliado de forma isolada dos outros fatores. O tempo de agitao da amostra foi analisado como um fator independente de acordo com o planejamento, pois atravs dos clculos estatsticos foi demonstrado que no houve a interao entre o T.A com os outros dois fatores. Este fator foi analisado isoladamente e a condio mais adequada de trabalho foi a de 10 minutos para agitao da amostra. A tcnica permitiu a construo de curvas analticas com coeficientes de correlao de 0,9892 para o Aldrin, 0,9986 para o -BHC(Lindane) e 0,9962 para o Heptacloro. Estes valores indicaram a linearidade da curva de calibrao na faixa de 0,4g. dm-3e 4,800g. dm-3. A metodologia, nas suas condies otimizadas como as melhores atravs do planejamento de experimentos, foi aplicada em amostras reais da Bacia Hidrogrfica do Rio Pato Branco e seus afluentes, atravs da microextrao lquido-lquido, com a utilizao do frasco de Murray modificado, foram encontradas no ponto 02, referente ao Rio Pinheiro, concentraes entre 0,3 e 0,5g.dm-3, dos organoclorados estudados, j proibidos em legislao desde 1985. As contaminaes podem ter ocorrido pelo uso inadequado de produtos ilegais que no trazem especificaes dos princpios ativos ou ainda pela aplicao em pocas passadas. A procedimento analtico foi validado podendo ser recomendado para a prconcentrao e monitoramento de poluentes em nvel de trao nas amostras de guas naturais. O custo baixo, o processo de operao fcil e relativamente rpido.

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SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

Estudo de um procedimento para viabilizar mais de uma etapa de extrao, utilizando a mesma amostra. Verificao da influncia da concentrao salina em nveis diferentes dos realizados neste trabalho. Avaliao das respostas em nveis de recuperao atravs de outros detectores, como ECD acoplado a cromatografia gasosa. Quantificao e influncia do volume de solvente extrator retirado de acordo com as concentraes adicionadas e retiradas, para verificar a estabilidade do sistema de acordo com o procedimento da anlise.

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