Artigo de Reviso

Diagnstico molecular passado, presente e futuro

Molecular diagnosis past, present and future
Gustavo Barcelos Barra, Maria Cecilia Sant Anna Soares Borges Caixeta, Patrcia Godoy Garcia Costa Claudia Ferreira de Sousa, Lara Franciele Ribeiro Velasco

Resumo: Este artigo consiste em uma descrio dos fatos histricos relacionados ao diagnstico molecular, das tcnicas disponveis e do que se espera para o futuro do setor. Inicialmente, foram abordados as descobertas e os avanos originados dentro dos laboratrios de pesquisa das universidades, onde, efetivamente, nasceram as tcnicas de anlise de cidos nucleicos. Posteriormente foi descrita a evoluo que estas tcnicas vm sofrendo ao longo do tempo at se chegar ao formato atual, passando pela biologia molecular manual e automatizada, abrangendo, basicamente, a PCR e a PCR tempo real. Alm disso, foram discutidas e descritas brevemente outras tcnicas de amplificao de cidos nucleicos, amplificao de sinal e microarranjos. Por fim, foi apresentado um resumo das principais expectativas em relao ao diagnstico molecular, considerando seu crescimento, o mercado de anlises clnicas e as novas reas e abordagens. Palavras-chave: Biologia Molecular; PCR; Genotipagem; Sequenciamento

Abstract: This article is a description of historical events related to molecular diagnosis, the techniques used today, and what the hope for the future of this segment is. First, we turn back to discoveries and advances originated within the research laboratory inside the universities, where the nucleic acid analysis techniques were born and we describe the progress that they have suffered until the current format. Otherwise, this is a brief history from manual molecular biology to automated molecular biology covering mainly PCR, real time PCR. Moreover, we discuss briefly about other techniques for nucleic acid amplification, signal amplification and microarrays. Finally, we make a summary of the main expectations for the molecular diagnosis covering growth, market, new areas and approaches. Keywords: Molecular biology; PCR; Genotyping, Sequencing

INTRODUO
A biologia molecular um setor emergente na medicina laboratorial. Suas anlises se baseiam na deteco, identificao e quantificao de cidos nucleicos (DNA/RNA). Atualmente, as principais reas de interesse so a deteco de doenas genticas (X-Frgil, Fibrose Cstica delta F 507), deteco, identificao e quantificao de microrganismos (HIV, HCV, Micobacterium tuberculosis), genotipagem e estudos de vnculo gentico. Tais anlises so as responsveis pela maior parte da rotina do setor, auxiliam o diagnstico e prognstico de doenas infecciosas e genticas, alm de resolver questes familiares. (1,2) Ademais, a anlise da expresso gnica pela quantificao de RNA, determinao do nmero de cpias de DNA (dosagem gnica), farmacogenmica, tipagem de HLA, testes pr-implantacionais e anlise das condies fetais pela anlise do sangue materno representam reas de interesse em crescimento.(1-3) Alm disso, o setor se destaca pela sua capacidade inovadora de desenvolver e validar seus prprios exames e criar solues para pesquisas cientficas e clnicas.(2) Uma breve reviso sobre o passado, presente e futuro do diagnstico molecular, desde o desenvolvimento das primeiras ferramentas at a automao do setor e suas perspectivas para o futuro, apresentado. A Tabela 1 apresenta a

sequncia de eventos literrios relacionados com o desenvolvimento da biologia molecular

DIAGNSTICO MOLECULAR - PASSADO

Por trs do sucesso do setor de biologia molecular no laboratrio clnico existem mais de trinta anos de histria envolvendo inovaes tcnicas para anlise de cidos nucleicos. O descobrimento das enzimas de restrio(4-6) e da transcriptase reversa,(7,8) a introduo do "Southern",(9) "Northern"(10) e "Dot Dlotting",(11) os mtodos de sequenciamento de DNA(12,13) e uma variedade de outras inovaes tcnicas promoveram o aparecimento de testes moleculares praticveis no incio dos anos setenta. Entretanto, foi a descoberta da reao em cadeia pela polimerase (PCR) e sua automao(14,15) na metade dos anos oitenta que realmente revolucionou a biologia e o diagnstico molecular. Interessantemente, a primeira descrio da PCR utilizou a tcnica para diagnstico pr-natal dos alelos beta A e beta S da anemia falciforme. A genotipagem envolvia amplificao da regio do gene da beta-globina que continha as mutaes e digesto de uma sonda marcada radioativamente com enzimas de restrio na presena do produto amplificado. Assim, o gentipo da beta-globina pde ser determinado em menos de um dia e com menos de um

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passando a anlise das reaes no formato de singleplex ou multiplex, a ser feita em gel de acrilamida, corado com prata.(18) Assim, um caso de paternidade clssico poderia ser resolvido em alguns dias.(19) Atualmente, os kits comerciais necessitam de uma quantidade nfima de amostra, alguns at inclusive, dispensam a extrao de DNA (AmpFlSTR Identifiler Direct PCR Amplification Kit, Life TechnologiesTM). Vrios STRs so amplificados simultaneamente em uma nica reao de PCR (na maioria das vezes quinze), com primers marcados com diferentes fluorescncias e analisados por eletroforese e capilar em sequenciadores genticos como o ABI 3500 (Life tecnologiesTM), equipamento j desenhado prevendo o diagnstico molecular (com rastreabilidade de reagentes, por exemplo), com capacidade de detectar seis fluorescncias simultaneamente e revelar o perfil gentico dos envolvidos, em um trio de paternidade, em 35-50 minutos.(18,19)

DIAGNSTICO MOLECULAR - PRESENTE

Os exames que envolvem tcnicas de biologia molecular so divididos em trs etapas (extrao, amplificao e anlise). Tradicionalmente, no laboratrio clnico os cidos nucleicos so extrados de amostras como sangue total, lquido amnitico, soro, plasma, urina, tecidos parafinados, raspados bucais, cervicais, e uretrais.(1,17) Ademais, o DNA fetal circulante no sangue materno uma oportunidade de anlise no invasiva do feto.(20) A extrao de DNA/RNA realizada, na grande maioria das vezes, pela tcnica de Boom utilizando-se de slica convencional ou slica magntica de forma manual ou automatizada.(17) Aps a extrao, a mistura complexa de cidos nucleicos extrada pesquisada pela sequncia alvo que se deseja detectar. A sequncia amplificada ento analisada diretamente por eletroforese em gel de agarose ou acrilamida (pesquisa de agentes infecciosos Toxoplasma gondii), ou nestes mesmos gis aps digesto com enzimas de restrio (pesquisa de mutaes conhecidas Fator V Leiden), ou por eletroforese capilar (anlise de fragmentos para paternidade), ou sequenciada (pesquisa de mutaes desconhecidas BRCA 1 e 2), ou hibridizada contra um microarranjo (genotipagem do HPV), dentre outras. Na maioria das vezes, estas anlises so manuais ou semiautomatizadas. Entretanto, vm sendo continuamente aperfeioadas para que tenham uma melhor performance. Dentre as melhorias, destacam-se o PCR "Hot-Start", os primers e sondas modificadas, as novas enzimas e enzimas geneticamente modificadas e os sistemas de deteco semiautomatizados e automatizados.(3) Foi observado, h vrias dcadas, que a PCR geralmente resulta em produtos inespecficos. Uma das solues para este problema foi a abordagem "Hot-Start" da PCR, onde a polimerase se torna ativa apenas aps alguns minutos alta temperatura, evitando, assim, a extenso de primers anelados parcialmente, que so as principais fontes de produtos inespecficos.(21-23) O PCR "Hot-Start" no s melhora a sensibilidade e especificidade da reao como tambm resulta em amplificaes mais robustas, permitindo inclusive
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micrograma de DNA genmico.(15) Este tipo de abordagem modelou a forma com que o diagnstico molecular seria realizado nas duas dcadas seguintes, revolucionando a prtica clnica e tornando os cidos nucleicos humanos e de agentes infecciosos mais acessveis para deteco. Em seguida, a evoluo metodolgica da PCR clssica para a PCR em tempo real e o desenvolvimento dos microarranjos de DNA marcaram o incio de uma segunda revoluo no diagnstico molecular (iniciada nos anos 90 e que ainda est em andamento).(3) No se pode deixar de ressaltar a tcnica de extrao de cidos nucleicos descoberta por Boom,(16) que compe o princpio da maioria dos kits manuais de extrao de cidos nucleicos e tambm dos equipamentos automatizados de extrao.(17) Para ilustrar os fatos relatados acima, pode-se rever o histrico dos testes de vnculo gentico (paternidade). Inicialmente, a anlise de vnculo gentico necessitava de uma grande quantidade de DNA porque no existia a etapa de amplificao por PCR. Os perfis genticos, ou seja, as "impresses digitais" moleculares eram obtidas por digesto do DNA genmico com enzimas de restrio, separao por eletroforese seguida de Southern Blot com uso de sondas radioativas.(18) Desta forma, um caso de paternidade clssico com suposto pai, me e filho (trio) poderia ser resolvido em algumas semanas.(19) Posteriormente, com o advento da PCR, a quantidade de DNA inicial necessria para o teste diminuiu, o que permitiu o uso dos "Shorts Tandem Repeats" (STRs),
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que a reao seja preparada temperatura ambiente. (3) As principais estratgias para se obter o "hot-start" atualmente so a inativao com reagentes qumicos, haptmeros, anticorpos e introduo de mutaes na polimerase.(3,24,25) Com relao aos primers e sondas modificadas, atualmente existe uma srie de modificaes disponveis, principalmente, no que diz respeito a fluorforos e atenuadores. Nas ltimas duas dcadas, diversos tipos de sondas para deteco e quantificao de cidos nucleicos foram desenvolvidos; dentre eles destacam-se as sondas de hidrlise (Taq ManTM), "Beacons" moleculares, os primers "Sunrise", "Scorpions" e "DzyNA". Um grande avano tem sido notado na tecnologia das enzimas utilizadas no diagnstico molecular, principalmente, em relao s enzimas termoestveis, que desempenham um papel crtico nos mtodos de amplificao de cidos nucleicos, que necessitam de desnaturao do DNA e termociclagem.(3) Diversas polimerases termoestveis j foram geneticamente modificadas e as principais vantagens que apresentam so maior fidelidade e velocidade.(29,30) A Tabela 2 apresenta uma lista das principais polimerases utilizadas na atualidade. Com relao velocidade das reaes, termocicladores capazes de realizar troca de temperaturas ultrarrpidas (StepOneTM Realtime PCR System - Life tecnologiesTM)(27) e polimerases ultrarrpidas (Kod DNA polimerase)(31) j esto disponveis. O carreamento de produtos pr-amplificados uma das principais preocupaes de quem excuta a PCR, pois podem gerar reaes falso-positivas, sendo este o motivo pelo qual o setor de biologia molecular dividido fisicamente em reas Pr-PCR, Trans-PCR e Ps-PCR.(32,33) A enzimologia para PCR avanou tambm no sentido de se evitar este carreamento. A substituio do deoxitimidina trifosfato (dTTP) pela deoxiuridina trifosfato (dUTP) e a adio da enzima Uracil DNA Glicosilase (UDG) na reao de PCR elimina produtos pr-amplificados que contenham o dUTP, preservando o DNA

nativo da amostra, devido ao da UDG sobre DNA dupla fita com dUTP, o que no ocorre com o DNA nativo que contm dTTP.(34) Atualmente, os "master mixes" comerciais para PCR e PCR em tempo real contemplam o dUTP na sua composio. As reaes de RT-PCR em um nico passo (contnua) tambm outro avano importante, pois evita abertura dos tubos para transferncia do cDNA para reao de PCR, aps sua transcrio reversa, a partir do RNA. A RT-PCR contnua tornouse vivel com o uso de enzimas que apresentam tanto atividade transcriptase reversa quanto DNA polimerase (Tth DNA polimerase) ou com a mistura das duas enzimas envolvidas no processo, a transcriptase reversa (AMV ou MMLV) com uma Taq DNA polimerase "Hot-Start".(35) Quando os mtodos de RT-PCR foram comparados, o mtodo contnuo com duas enzimas mostrou-se o mais sensvel, seguido pela reao de RT-PCR em dois passos (no contnua) e, por fim, o mtodo contnuo com uma nica enzima.(35) A tecnologia de RT-PCR contnua com duas enzimas foi extremamente importante na deteco do vrus H1N1, durante a pandemia de 2009. Para aumentar a utilidade diagnstica de um teste molecular, existe um forte interesse nas reaes "multiplex" (onde mais de um DNA/RNA alvo so analisados por reao simultaneamente), assim, uma variedade de novos desenhos analticos foram introduzidos na rotina laboratorial, (3) como, por exemplo, a genotipagem de HPV realizada em microarranjos de DNA e que ser discutida posteriormente. Uma importante revoluo ocorreu no diagnstico molecular com o advento do PCR em tempo real. Inicialmente, o funcionamento de uma reao de PCR era semelhante a uma caixa preta. Os reagentes eram misturados com o DNA molde a ser avaliado em um tubo, que, em seguida, era colocado no termociclador. Aps algumas horas, se tudo ocorresse bem, uma banda de tamanho esperado apareceria no gel aps a eletroforese. Com o advento da tcnica de PCR em tempo real, tornou-se possvel olhar para dentro do tubo durante o

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processo e "ver" o que est acontecendo com o DNA molde, medida que ele vai sendo amplificado, ao longo dos ciclos.(24,27) Assim, a PCR em tempo real a coleta contnua de sinal fluorescente de uma ou mais reaes de PCR em um intervalo de ciclos. Esta tcnica pode ser utilizado tanto para anlises qualitativas quanto quantitativas, pois a PCR quantitativa em tempo real a converso dos sinais fluorescentes de cada reao em um valor numrico para cada amostra.(24,27) O monitoramento em tempo real da reao de PCR pode ser alcanado por uma variedade de molculas fluorescentes reprteres, como corantes (SYBR Green I) ou sondas de hidrlise (TaqManTM), "Beacons" moleculares, primers "Sunrise", "Scorpions" e "DzyNA".(24-27) Algumas dessas molculas so reprteres DNA-dupla fita especficos (SYBR Green I), enquanto outros so sequncias especficas (TaqManTM).(24,27) Desse modo, o PCR em tempo real considerado homogneo por combinar a amplificao e anlise em um nico passo. Anteriormente, discutimos que os testes moleculares consistiam de trs etapas (extrao, amplificao e anlise), o PCR em tempo real combinou as duas ltimas etapas e, com isso, diminuiu o tempo de liberao de resultados e aumentou a faixa dinmica de anlise para 107 (faixa dinmica de anlise do PCR convencional 103), reduzindo o problema de carreamento de produtos pr-amplificados devido ao fato de ser desnecessrio abrir o tubo onde houve a reao de PCR.(3) Alm disso, esta tcnica apresenta outros benefcios no que diz respeito a ensaios diagnsticos. Dispensa manipulao Ps-PCR e a contaminao do laboratrio com produtos de PCR diminuda ou eliminada, permitindo, inclusive, a unificao das reas Pr-PCR e Ps-PCR. Assim, ensaios mais rpidos, e mais confiveis podem ser realizados.(37) Nos ltimos anos, devido s suas vantagens e grande disperso nos laboratrios, houve um aumento progressivo no nmero de publicaes a respeito de PCR em tempo real (Figura 1-A), demonstrando o ganho de importncia da tcnica. Para comparao, o nmero de publicaes envolvendo PCR convencional est representado na Figura 1-B. O aparecimento dos extratores de DNA automatizados, como Nuclisens easyMag (bioMerieux), QIAcube (Qiagen), QIAxtractor (Qiagen), bem como as plataformas fechadas para testes moleculares como o m2000 real-time system (Abbott), QIAsymphony RGQ (Qiagen) e Cobas 4800 system (Roche), onde amostra primria colocada no equipamento e todo processo de extrao e amplificao realizado com pouca dependncia de um operador, hoje uma realidade no laboratrio clnico. Outro avano importante a anlise de variaes na sequncia de DNA pela curva de desnaturao de alta resoluo (HRM). Uma tcnica relativamente nova como abordagem diagnstica. Esta anlise baseada na propriedade fundamental do DNA dupla fita em se desnaturar com o aquecimento da amostra. Geralmente, a anlise por HRM tem sido utilizada para deteco de mutaes conhecidas e desconhecidas. Sua incluso nos equipamentos de PCR em tempo real simplificou o processo, aumentou a capacidade de anRBAC. 2011;43(3):254-60

Figura 1. Nmero de publicaes envolvendo as tcnicas de PCR em tempo real (A) e PCR (B) no Pubmed do NCBI de 1984 a 2010.Pesquisa para PCR realizada com o termo "Polymerase Chain Reaction" e "PCR". Pesquisa para PCR tempo real realizada com os termos: "Real-time PCR", "qPCR" "real time PCR", e "quantitative PCR" em 19/04/2011.

lises simultneas, reduziu os custos com reagentes e manteve a anlise em tubo fechado, ou seja, um sistema homogneo. Uma nica sonda fluorescente (Simple ProbeTM), ou um corante ligador de DNA fluorescente (LightCycler Green TM), o suficiente para as anlises de HRM.(39,40) Com relao aos microarranjos, o impacto desta tecnologia na pesquisa biomdica comparvel ao sequenciamento de DNA e a descoberta da PCR. Sua introduo provocou uma minirrevoluo no mundo da cincia e da medicina.(41-43) O conceito dos microarranjos muito similar ao das tcnicas de blottings.(41) Por definio, os sistemas e equipamentos de microarranjos realizam vrias anlises de hibridizao de DNA/RNA em paralelo e em um formato miniaturizado, permitindo assim a anlise da expresso de mRNAs, polimorfismos no DNA genmico ou genotipagem de patgenos. Estes microarranjos podem ser fabricados sobre suportes de vidro, slica, ou plstico e contm centenas de stios discretos contendo sondas imobilizadas em sua superfcie. A anlise das reaes de hibridizao geralmente envolve a deteco do sinal gerado pela ligao da sequncia de DNA/ RNA alvo, normalmente um produto de PCR, marcado fluorescentemente com as sondas dispostas no microarranjo. Na
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maioria das vezes, um escner de fluorescncia utilizado para analisar o padro de hibridizao formado.(42) Atualmente, no Brasil, o principal ensaio envolvendo microarranjos de DNA realiza a genotipagem de HPV em amostras biolgicas. O teste conhecido como Papillocheck (Greiner-bio-one) capaz de genotipar 24 subtipos de HPV, 18 gentipos de alto risco e seis de baixo, simultaneamente, aps a amplificao do DNA HPV por PCR, com primers marcados fluorescentemente. Os produtos de PCR so hibridizados contra um microarranjo contendo sequncias especficas para os 24 diferentes tipos de HPV detectados pelo exame. A hibridizao contra determinado local (ou stio) do microarranjo indica o gentipo presente na amostra. Uma das principais vantagens da genotipagem de HPV ser realizada em microarranjo de DNA o fato de permitir a deteco de infeces mltiplas, ou seja, aquelas com mais de um tipo de HPV, que normalmente est associada a um maior risco de progresso para o cncer cervical.(44) A amplificao de cidos nucleicos baseada na sequncia (NASBA) uma tecnologia primer-dependente que pode ser utilizada para a amplificao contnua de cidos nucleicos em uma mistura em uma nica temperatura.(45) Imediatamente aps sua inveno, o NASBA foi usado para o diagnstico rpido e quantificao do HIV-1, no soro de pacientes.(46) Apesar do RNA poder ser amplificado por RT-PCR, a vantagem do NASBA que se trata de uma reao isotrmica, geralmente na temperatura constante de 41C, ou seja, dispensa termociclagem exigida na PCR. Alm das tcnicas que envolvem amplificao do DNA/ RNA existem aquelas que permitem apenas uma forte amplificao de sinal da presena do alvo. Diversas aplicaes diagnsticas atuais so dependentes destas tcnicas. Que no envolvem amplificao da molcula de DNA/RNA do alvo. Dentre elas, destaca-se o Branched DNA (bDNA) e a captura hbrida. Nos ensaios de bDNA, a amplificao de sinal obtida pela ligao de uma grande quantidade de molculas da enzima fosfatase alcalina na molcula de DNA ou RNA alvo via hibridizao de uma srie de sondas de oligonucleotdeos. Cada evento de reconhecimento molecular leva formao de estruturas ramificadas. Estas ramificaes contm a regio de reconhecimento para a sonda subsequente e so as responsveis pela amplificao do sinal indicativo da presena do DNA/RNA alvo.(47) O bDNA o terceiro maior mtodo molecular (juntamente com a RT-PCR e o NASBA) para quantificao da carga viral do vrus da imunodeficincia humana (HIV) e tambm usado para determinao da carga viral do HCV e HBV. Para compensar a baixa sensibilidade apresentada pelas verses iniciais do bDNA, uma variao foi desenvolvida e a sensibilidade do sistema atingiu a faixa do zeptomoles, fazendo com que o sistema pudesse rivalizar com o PCR.(48) A captura hbrida um ensaio rpido no radioativo, no qual as molculas de DNA alvo se hibridizam a sondas de RNA especficas. Aps uma etapa de hibridizao em soluo, os hbridos de DNA/RNA formados so capturados por uma superfcie slida coberta com anticorpos especficos antihbridos e detectados por um sensvel sistema de amplifica258

o de sinal quimioluminescente.(49) Ensaios de captura hbrida esto disponveis comercialmente para deteco de agentes microbianos. A captura hbrida o principal ensaio para deteco do Papilomavirus humano (HPV) no Brasil e vem sendo gradativamente substituda por tcnicas mais modernas e que incluem a genotipagem do HPV, como o Papillocheck. Entretanto, tanto a captura hbrida quanto o bDNA e outras tcnicas de amplificao de sinal, atualmente, vm sendo gradativamente substitudas pelo PCR tempo real devido s vantagens de um ensaio homogneo, j descritas anteriormente.

DIAGNSTICO MOLECULAR - FUTURO

O mercado de diagnstico molecular o segmento que mais cresce no diagnstico in vitro e est sendo impulsionado por vrios fatores. Isto inclui a necessidade de tcnicas automatizadas e de fcil manuseio que combinam otimizadamente a preparao de amostras, a anlise e a avaliao de dados. Alm disso, h uma crescente disponibilidade de testes moleculares para monitorar a eficcia teraputica de medicamentos de alto custo. Atualmente, o diagnstico molecular um mercado de 2-3 bilhes de dlares, que cresce a uma taxa 25% anuais, e previsto que atinja 6,4-7 bilhes de dlares em 2012.(2,50) Atualmente, os imunoensaios representam aproximadamente 25% do mercado global e o diagnstico molecular, cerca de 6%. No entanto, este "novo" segmento est pronto para assumir uma parcela maior do diagnstico in vitro nos prximos anos. As doenas infecciosas e a triagem de sangue so os maiores segmentos do diagnstico molecular (>70%) e devero crescer a uma taxa anual de 7-8% nos prximos anos. Outros segmentos do mercado incluem a gentica tradicional, a medicina personalizada, e o cncer, com 13%, 9% e 8% do mercado nos laboratrios clnicos americanos, respectivamente. Como as doenas infecciosas so um segmento maduro, outras categorias esto crescendo relativamente mais rapido.(50-52) A introduo de novos testes diagnsticos, principalmente na rea de doenas infecciosas, manter o crescimento do setor no curto prazo. Nos pases em desenvolvimento, as infeces respiratrias, HIV/AIDS, doenas diarreicas, a malria e tuberculose esto entre as dez principais causas de morte. Os novos testes moleculares devem contemplar os patgenos destas doenas.(2,50,51) Por outro lado, o cncer a segunda causa mais comum de morte, depois das doenas cardiovasculares. E o envelhecimento da populao favorece que esta estatstica piore. Assim, os testes moleculares para o cncer tendem a crescer nos prximos trs a cinco anos. Atualmente, o diagnstico do cncer baseado principalmente no imunodiagnstico para a deteco de marcadores tumorais. Vrias empresas esto desenvolvendo testes de predisposio com base nas variaes genmicas associadas a fases anteriores do cncer. Alm disso, o codesenvolvimento do diagnstico molecular e teraputica alvo associados uma estratgia bem sucedida no desenvolvimento de drogas anticncer.(2,50,51)
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Os recentes desenvolvimentos no campo da farmacogenmica podem fazer uma evoluo rpida entre o diagnstico da doena e a terapia adaptada s caractersticas genticas de um indivduo (muitas vezes referida como a medicina personalizada). Embora ainda esteja em desenvolvimento, este segmento tem imenso potencial para se tornar um mercado lucrativo.(2,50,51) Os atuais produtos de diagnstico molecular consistem, principalmente, em testes concebidos em torno de um nico marcador associado a um estado de doena. A prxima gerao vai empregar ainda mais plataformas "multiplex". H indcios de que as prximas tecnologias envolvero a medio de vrios tipos de biomarcadores simultaneamente (por exemplo, DNA e protenas). Tais inovaes dizem respeito a construes, tais como o microarrays DNA/anticorpos, capazes de dosar cidos nucleicos e protenas simultaneamente, ou imunoensaios utilizando marcaes de cidos nucleicos, onde os resultados so gerados por PCR (ImunoPCR). Estes testes devem permitir que os imunoensaios e os testes de cidos nucleicos sejam realizados em um nico equipamento,(52) o que pode significar a unio dos dois setores. A nanobiotecnologia e os "biochips" tambm devem impulsionar o crescimento futuro e fazer uma contribuio significativamente notvel para o crescimento do diagnstico molecular, inclusive com o desenvolvimento de instrumentos portteis "Point-of-care testing" (POCT) para execuo de testes moleculares.(2,3)

CONCLUSO
A partir do exposto, possvel concluir que o diagnstico molecular um setor do laboratrio clnico em crescimento literalmente exponencial. Adquiriu considervel importncia clnica e comercial, nas ltimas dcadas. Continuamente, novas abordagens e ferramentas dependentes da anlise de cidos nucleicos vm sendo desenvolvidas. Isto tem impulsionado o crescimento do segmento. O grande destaque nesta dcada, sem dvida, a automao do setor, avano inimaginvel at alguns anos atrs.

AGRADECIMENTOS
Agradecimento especial para Dra. Janete Ana Ribeiro Vaz e Dra. Sandra Santana Soares Costa por incentivarem a pesquisa cientfica, desenvolvimento tecnolgico e inovao na iniciativa privada, disponibilizando recursos do Laboratrio Sabin para tal finalidade. Um agradecimento especial tambm para os demais colegas do Laboratrio Sabin que de alguma maneira contriburam para este trabalho.

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