Biotecnologia da

PESQUISA

Laboratrio de Biotecnologia: Micropropagao Vegetativa Universidade Regional de Blumenau (FURB) pescador@furb.rct-sc.br

Rosete Pescador Patrcia Sibila Arajo Cludio Hermes Maas

Piper hispinervium - Pimenta Longa

Protocolos para obteno de Safrol

Laboratrio de Qumica (FURB) rrcarbon@furb.rct-sc.br renato@ furb.rct-sc.br

Ricardo Andrade Rebelo Carmem Raquel Giotto Renato Wendhausen Jr. Graziela Largura

Laboratrio de Engenharia Bioqumica (FURB) lorena@furb.rct-sc.br

Lorena Benathar Ballod Tavares

Fotos cedidas pelos autores

Piper hispidinervium C.DC., popularmente conhecida como Pimenta Longa, planta arbustiva aromtica, e ocorre naturalmente da Floresta Amaznica at o sudoeste brasileiro. produtora de leo essencial voltil correspondente a 2,7% da sua massa verde total (Simionatto, et al.,1997), que apresenta concentraes superiores a 80% do importante metablito secundrio, safrol. O safrol ou 4 - alil -1,2 - metilenodioxibenzeno, um ter fenlico do grupo dos anilpropanides, com frmula molecular C10H10O2, ponto de ebulio de 232oC 235oC e que solidifica a uma temperatura de 11oC. um lquido levemente amarelo de odor caracterstico, insolvel em gua e solvel em solventes orgnicos, tais como lcool, clorofrmio e ter etlico. Embora apresente comprovada atividade carcinognica in vitro, de grande importncia cientfico-tecnolgica como precursor de uma variedade de compostos, notadamente, frmacos, bioinseticidas biodegradveis, fixadores de aroma e, mais recentemente, de drogas antitrombticas e auxinas endlicas (Rosa et al.,2000). Na Figura 1 esto representados alguns dos mais importantes derivados do safrol. Assim, pelas potencialidades acima descritas, tem sido estimulada a realizao de investigaes sobre a obteno de safrol a partir da Pimenta Longa. Portanto, este trabalho visa a apresentar alguns resultados sobre estudos de morfognese da Pimenta Longa com vistas obteno de safrol. Alm disso, apresentado um estudo sobre cintica de crescimento em meio lquido e sobre crescimento de clulas de Pi18 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento

menta Longa imobilizadas em crisotila. 1. Morfognese in vitro da Pimenta Longa A possibilidade de manipular sistemas in vitro para clonagem de gentipos superiores de espcies vegetais depende de uma srie de fatores. Destes, o conhecimento da fisiologia do desenvolvimento de fundamental importncia para se obter respostas morfogenticas, onde sistemas de cultura in vitro, correlaes morfolgicas, fisiolgicas, genticas e bioqumicas existentes em uma planta intacta so rompidas. A obteno de safrol no Brasil at cerca de 1990 era decorrente da atividade extrativista, onde a obteno da

madeira e do leo essencial ao longo de, aproximadamente, 45 anos, levou ao comprometimento da disponibilidade da canela (Ocotea odorifera), principal geradora desse composto. Como conseqncia disso, ocorreu uma reduo drstica na produo brasileira de safrol. Assim, com a proibio da extrao da canela, outras fontes de safrol comearam a ser pesquisadas. Portanto, a Pimenta Longa est sendo objeto de estudo em alguns laboratrios brasileiros pela potencialidade em produzir safrol. No Laboratrio de Biotecnologia: Micropropagao Vegetativa da Universidade Regional de Blumenau, a partir de 1996, iniciou-se o estudo da Pimenta Longa como fornecedora de material vegetal para o estudo da mor-

Fig.1: Derivados do safrol

Tabela 1. Percentual mdio de proliferaes adventcias in vitro oriundas de segmento nodal de Pimenta Longa em resposta ao meio de cultura MS, aps 60 dias de cultivo Meio de Cultivo

MS0 MS1 MS2

Percentual mdio com brotaes adventcias *

1,2 c 20,5 b 37,3a

* Letras distintas representam diferena significativa a 5%

fognese in vitro e cultivo de clulas, objetivando o desenvolvimento de mtodos alternativos para a produo de safrol. Inicialmente, sementes de Pimenta Longa foram germinadas in vitro com meio de cultura MS (Murashige e Skoog, 1962) para obteno de material vegetal (plntulas - Figura 2). As sementes foram submetidas a um rigoroso processo de assepsia e, aps, foram inoculadas e mantidas em cmara germinativa sob condies de temperatura e luminosidade controladas. 1.1. Organognese da Pimenta Longa A propagao de plantas atravs da cultura de tecidos ocorre em uma seqncia de estdios, cada qual com meios de cultura especfico, tipo e balano dos reguladores de crescimento e condies fsicas tais como intensidade luminosa, temperatura e fotoperodo. Em condies laboratoriais cada estdio deve ser identificado e as condies timas devem ser estabelecidas. Para a organognese da Pimenta Longa, segmentos nodais de 1cm de comprimento, originados de seedlings, foram inoculados em tubos de ensaio contendo 10mL de meio de cultura MS lquido, utilizando-se como suporte de papel filtro (Figura 3). Os seguintes balanos hormonais foram empregados: MS 0 (sem reguladores), MS 1 (2,69M de ANA [cido naftaleno actico] e 4,44M de BAP [6 benzilaminopurina]) e MS2 (4,03M de ANA e 6,67M de BAP). As culturas foram mantidas em cmara de crescimento com temperatura de 25 + 3oC e fotoperodo de 16h com intensidade luminosa de1600 Lux. Conforme a Tabela 1, os fitoreguladores BAP e ANA, adicionados ao meio MS induziram o desenvolvimento de brotaes adventcias a partir de segmento nodal. Observou-se uma associ-

ao na resposta morfogentica entre as concentraes mais elevadas de reguladores quando comparados com o MSO que no continha reguladores. Constatou-se ainda que o tamanho mdio (em cm) da parte area obtido nos trs balanos de reguladores de crescimento foi de 3,82 a em MS0, 1,62 b em MS1 e 1,43 b eMS2 (Figura 4). Quanto formao das plntulas, observou-se que o seu tamanho mdio, aps 30 dias da inoculao, apresentaram um tamanho mdio (em cm) de 1,84 b e 3,35 a e 1,67 b, aos 60 e aos 90 dias, respectivamente (Figura 5). Verificou-se que, ao final de 90 dias de cultivo as plntulas apresentaram necrose, alm de menor tamanho mdio em relao aquelas cultivadas durante 30 e 60 dias. Tal fato, segundo Mantell et al (1994) pode ser decorrente do esgotamento dos nutrientes no meio de cultura. Nos ensaios de cultivo in vitro da Pimenta longa tambm foram determinados os pesos mdios dos caules, folhas e razes. Conforme indicado na Figura 6, as plntulas apresentaram maior produo de sistema radicular em relao s outras partes da planta (caule e folhas) independente do meio.

Figura 2. Germinao de sementes de Pimenta Longa in vitro

J a maior produo de caule e folha foi obtida quando se utilizou o meio MS0, ou seja, sem reguladores. Em relao ao perodo de cultivo, registrou-se um peso mdio, aos 30 dias, de 0,020g, 0,036g e 0,017g; aos 60 dias, de 0,083g, 0,075g e 0,280g; e aos 90 dias, de 0,082g, 0,109g e 0,251g, para caules, folhas e razes, respectivamente (Figura 7). Quanto ao tempo de cultivo das plntulas, verificou-se que o peso mdio do caule e da raiz foi superior no ensaio com 60 dias de cultivo. A partir da, observou-se a formao gradativa de necrose das plntulas. Outra constatao importante foi que nas plntulas cultivadas em meio MS1 e MS2, apareceram formaes de massas celulares em razes e em partes caules que encontravam-se em contato com o meio de cultura, j que se utilizou como suporte ponte de papel filtro.

Tabela 2. Composio dos meios de cultura utilizados para embriognese da Pimenta Longa Meio de Cultura MSO MSBD0,75 MSBD0,50 MSBD0,25 MSD0,75 MSD0,50 MSD0,25 MSB0,75 Balano de Reguladores BAP 2,4 - D 0,0 0,25 0,25 0,25 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,75 0,50 0,25 0,75 0,50 0,25 0,75
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Figura 4. Tamanho mdio da parte area, em centmetros, das plntulas de Pimenta Longa obtido nos trs balanos de reguladores (MS0, MS1 e MS2) aps 30 dias de inoculao

Figura 3. Organognese da Pimenta Longa em meio MS0 em suporte de papel filtro

Figura 5. Tamanho mdio da parte area das plntulas de Pimenta Longa obtidas em um perodo de cultivo de 30, 60 e 90 dias, em meio de cultura MS0

1.2. Embriognese Somtica A embriognese somtica pode ser aplicada em culturas celulares de Pimenta Longa, permitindo a conservao e o intercmbio de germoplasma, a obteno de plantas livres de patgenos e uma rpida multiplicao de plantas elites. Na Pimenta Longa, a embriognese somtica ocorreu de forma indireta (formao de massa pr-embriognica antes do surgimento dos embries, conforme Figura 8), apresentando vrios estdios de desenvolvimento simultneos (Figura 9). A origem do embrio foi a partir de um agrupamento de clulas ou clulas isoladas competentes. A formao da massa pr-embriognica ocorreu a partir dos explantes provenientes de caule de sementes
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Figura 6. Peso mdio de cada parte da Pimenta Longa (caule, folha e raiz) obtido nos trs balanos de reguladores (MS0, MS1 e MS2)

Figura 7. Peso mdio de cada parte da Pimenta Longa (caule, folha e raiz) obtido em um perodo de cultivo in vitro de 30, 60 e 90 dias

es somticos (Figura 9). germinadas in vitro. A formaOs embries somticos o dos embries somticos obtidos foram formados a ocorreram a partir de massa partir de grupos de clulas ou pr-embriognica, por meio de de clulas isoladas e enconum processo de diferenciao travam-se em diversos estdicelular, o qual foi ativado e os de desenvolvimento (Ficontrolado por reguladores de gura 11), caracterizando uma crescimento (BAP e 2,4 D [2,4 embriognese repetitiva. clorofenoxidoactico]). A condio ambiental Os fatores que levaram apresentou uma grande influembriognese somtica foram ncia na embriognese da a composio do meio de culFigura 8. Explante com formao regular de massa Pimenta Longa, principalmentura (balano de auxinas e pr-embriognica te na converso de massa citocininas), a condio ambipr-embriognica em embriental (luz e escuro) e a interaes somticos. Nos ensaios o entre os dois fatores. realizados na ausncia de luz A condio ambiental apre(escuro), ocorreu uma maior sentou uma grande influncia converso de massa em emna formao da massa prbries somticos, indepenembriognica e na sua difedente do meio de cultura utirenciao em embries somlizado (balano de reguladoticos. Exemplo disso que, na res). A luz atua como inibidor ausncia de luz, a taxa de na converso da massa celuconverso da massa pr-emlar em embries, fato j desbriognica em embries socrito por Guerra, (1996). mticos muito superior As anlises dos resultados taxa de converso da massa demonstraram que as expresexposta luz. ses embriognicas observaPara determinar quais foram os efeitos dos diferentes Figura 9. Embries somticos formados a partir de das nos explantes de Pimenta Longa so decorrncia da balanos de reguladores sobre massa pr-embriognica composio do meio de culos explantes, foi utilizado o tura, da condio ambiental meio de cultura teste MSO, o qual no era suplementado (luz e escuro) e da interao com reguladores de crescimento e os significativa entre os meios MSB0,25, dos dois fatores, com uma probabilidameios listados na Tabela 2. MSB0,50, MSB0,75, MSBD0,50 e MSBD0,75. O de de erro < 0,0001. A embriognese Os resultados obtidos nesses ensai- meio de cultura MSBD0,25 apresentou o somtica em Pimenta Longa ocorreu os foram comparados com o meio teste melhor desempenho na taxa de con- de forma indireta, apresentando vrios e avaliados estatisticamente (anlise de verso de massa em embries, com estdios de desenvolvimento simultvarincia) posteriormente. neos e a sua origem a partir de grupo uma mdia de 19,41 embries. Os reguladores de crescimento deObservou-se que o regulador 2,4 de clulas competentes ou de clulas terminam as respostas morfognicas D, quando utilizado de forma isolada, isoladas competentes. dos explantes, sendo a converso da no converteu massa pr-embriognimassa pr-embriognica em embries ca em embries, mas induziu a diviso 2 Induo de Calos Friveis somticos a resposta morfognica es- celular, formando somente massa prperada nos experimentos. Logo como embriognica. A ao isolada do reguA cultura de clulas iniciada a o meio teste no apresenta regulado- lador BAP promoveu formao de partir de explantes (Figura 2) em preres, sua resposta negativa (no pro- massa pr-embriognica e sua conver- sena de meio nutritivo acrescido de move formao de massa pr-embrio- so em embries somticos; porm os reguladores de crescimento, que so gnica ou sua converso em embries pontos de formao de massa nos usados na induo. A induo feita somticos). sob luz ou ausncia dela, em temperaexplantes, locais onde ocorrem o proOs resultados obtidos dos ensaios cesso de desdiferenciao, so irreguturas que podem variar entre 25 3oC. A caracterstica de friabilidade com diferentes concentraes de regu- lares e o volume de massa formada favorecida por uma alta relao auxiladores de crescimento so apresenta- baixo. dos na Figura 10. A melhor expresso embriognica na/citocinina, bem como pela adio de outros componentes ao meio nutriA anlise estatstica determinou no foi obtida na ao conjunta dos dois tivo. O gentipo tambm influencia a haver diferena significativa na taxa de reguladores de crescimento utilizados converso de massa pr-embriognica no meio MSBD0,25, no qual houve a facilidade de formar massa celular (caem embries somticos entre os mei- formao de uma massa regular em los friveis) cuja colorao pode variar os: MSD0, MSD0,50 e MSD0,75. Consta- todo o explante (Figura 8) e uma do amarelo ao bege. tou-se tambm no haver diferena elevada taxa de converso em embriA liberao de clulas a partir de
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Figura 10. Nmero mdio de embries somticos obtidos nos diferentes meios
calos friveis (Figura 12) mais rpida que de calos compactos. As clulas podem apresentar morfologia, tamanho, colorao e ploidia variada, dependendo do perodo de cultivo e composio do meio nutritivo. 3. Cultivo em suspenso celular de Pimenta Longa 3.1. Determinao da curva de crescimento A suspenso celular de pimenta longa destina-se obteno e proliferao de clulas em meio nutritivo lquido, sob condies de agitao, aerao e temperatura controladas. Nesse ambiente, essencial que as clulas suspensas se dividam e se multipliquem ativamente. De acordo com a composio do meio nutritivo, podese afetar o padro da diferenciao (lignificao e/ou alongamento), diviso e senescncia celular. A vantagem da cultura de clulas em meio lquido a sua alta taxa de multiplicao. Entretanto, dois aspectos devem ser considerados: a formao de agregados celulares e a existncia de mosaicismo ou mixoploidia, isto , coexistncia de diferentes populaes celulares com bases genticas distintas. Atualmente, vrios estudos com clulas vegetais cultivadas em reatores biolgicos (Doran, 1993) tm sido relatados visando produo de metablitos secundrios. Com esse objetivo, trabalhos preliminares para cultivo de clulas de Pimenta Longa em meio lquido foram realizados em agitador rotativo, com temperatura de
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30C, agitao de 100 rpm e ausncia de luz e aerao. Os ensaios foram conduzidos em frascos de vidro de 500 mL que continham 50 mL de meio MC23, com 1 g de massa celular mida em cada frasco. Em intervalos regulares, durante 31 dias, coletou-se um frasco para determinao da concentrao celular. Para este teste, quantificou-se a massa celular aps filtrao vcuo de todo o contedo presente no frasco de vidro. O material filtrado foi retido em membrana millipore com porosidade controlada de 0,45 m. A membrana contendo o material filtrado foi levada estufa com 85C at peso constante. Assim, a concentrao de clulas de Pimenta Longa expressa em gramas de clulas por volume de meio de cultivo determinado como massa seca apresentou um perfil de produo, segundo uma equao polinomial de terceira ordem (Figura 13 curva de X), caracterizando diferentes fases de crescimento. Quanto a velocidade es-

pecfica de crescimento (X) definida pela equao 01, que mede a velocidade de crescimento relativa massa de clulas presentes no meio de cultivo, est representada pela Figura 13 - curva de X. Analisando a Figura 13, observa-se um aumento da concentrao celular de cerca de 8,5 vezes o valor inicial, aps 24 dias de cultivo. No entanto, esses valores podem ser aumentados com a utilizao de outras estratgias de cultivo, fato este que j est sendo estudado com o emprego de biorreatores de bancada. Como conseqncia desse estudo, espera-se elevar a velocidade especfica de crescimento e a produtividade em clulas. 3.2. Imobilizao das clulas de Pimenta Longa sobre crisotila A imobilizao de clulas vegetais tem sido descrita na literatura como um mtodo eficiente de otimizar a produo de metablitos secundrios, uma vez que, nessas condies, as clulas vegetais imobilizadas tm comportamento semelhante ao daquelas em estado de agregao, formando tecidos vegetais (Mavituna, 1987), onde existe um grande contato clula-clula (Doran, 1993). A crisotila um argilo mineral que tem sido explorado para a imobilizao de clulas de microorganismos em processos de biotransformao em sntese orgnica, apresentando tima eficincia (Wendhausen Jr.,1998). Para os experimentos de imobilizao de clulas de pimenta longa sobre crisotila, essas aps o cultivo em suspenso celular, foram submetidas ao contato com crisotila ativada em suspenso, sob agitao e temperatura controladas. O sistema mantido ento nas condies normais de cultivo em meio lquido. A figura mostra uma fotografia em microscpio tico das clulas vegetais, aps duas semanas de cultivo. Observa-se boa interao da crisotila com as clulas de Pimenta Longa, com a formao de aglomerados de clulas dispersas na malha formada pelas fibras de crisotila. A quantificao de safrol via cromatografia gasosa para o

Figura 11. Embries somticos em diferentes estdios de desenvolvimento: estdio cordiforme, estdio globular e estdio torpedo

sistema imobilizado mostrou ainda uma produo pelo menos trs vezes maior deste metablito, comparado ao sistema com clulas livres cultivadas nas mesmas condies. 4. Anlise Qumica Qualitativa de Safrol Caules, folhas e razes provenientes de 5 tubos de ensaio foram separadamente submetidos hidrodestilao segundo a tcnica clssica descrita em Fessenden (1983). Aps a extrao do material destilado em n-hexano (4 x 10mL), este foi tratado com sulfato de magnsio, filtrado gravimetricamente e concentrado em evaporador rotatrio, fornecendo amostras de 5mL. Os meios de crescimento foram diretamente extrados em n-hexano (5 x 10mL) e submetidos ao protocolo descrito anteriormente. O safrol foi caracterizado por cromatografia gasosa, comparando-se os tempos de reteno das amostras com aquele obtido para o padro PA procedncia Aldrich. A anlise cromatogrfica foi conduzida em aparelho Shimadzu 14B, configurado com detector de ionizao de chama e coluna capilar de slica fundida CB-P20 (SE-54, 25m x 0,25mm), sendo empregado Hidrognio como gs de arraste, regulado para fornecer uma velocidade linear de 1,5mL/min a 150oC. As amostras foram injetadas no modo split e detectadas a 280oC e 300oC, respectivamente. Referncias Doran, M. P. Design of reactors for plant cells and organs. Adv. in Biochem. Eng. Biotechnol. v.48, p.115168, 1993. Fessenden. S.J. e Fessenden, R.J. Technics experiments for organic chemistry. Ed. Willard. Grandt. Press, Boston. 1983. Guerra, M. P. Embriognese Somtica. Curso de Biologia Celular e Tranaformao de Plantas. Distrito Federal, 1996. Mantell, S. H.; Matthews, J. A. & Mckee, R. A. Princpios de biotecnologia em plantas. Uma introduo engenharia gentica em plantas. Ribeiro Preto: Editora FCA/ Sociedade Brasileira de Gentica, 1994, 344p. Mavituna, F., Park, J. M.,Williams, P. D., Wilkinson, A. K. Characteristics of immobilized cell reactors In: WEBB, C., MAVITUNA, F. Plant and Animal Cell cuttures: Process Possibilities. Manchester, Ellis Horwood. p. 92-114 1987. Murashige, T.; Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology Plant, n.15, p.473-497, 1962. Rosa, F.A.F.; Nascimento, M.G.;

Figura 12. Calo frivel de Pimenta Longa

Figura 13. Curva de crescimento celular e de velocidade especfica de crescimento de Pimenta Longa em suspenso durante cultivo em sistema descontnuo

1997. Wendhausen Jr. R. Estudo sobre utilizao de crisotila como suporte de clulas de Saccharomyces cerevisiae para uso em processo contnuo de fermentao alcolica e biorredues. Tese de Doutorado, UNICAMP, Campinas, SP, 1998.

Rebelo, R.A.; Pescador, R. Avaliao da atividade regulatria de crescimento de compostos anlogos ao cido indolactico em sementes de alface. In: 23a Reunio Anual da Sociedade Brasileira de Qumica. Livro de Resumos, v.2, QB-010, Poos de Caldas, 2000. Simionatto, E.L.; Rebelo, R.; Ramos, M.G.; Zanette, V.C. Fontes altenativas de safrol propagao da pimenta longa pela tcnica de estaquia. FNMA, processo anterior n. 1668/92 referente ao Convnio Anterior n.058/95,

Figura 14. Clulas de Pimenta Longa imobilizadas em crisotila

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