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FOSFATASES

FINALIDADE Sistema colorimtrico para determinao das fosfatases no soro, plasma e outros lquidos biolgicos. Somente para uso diagnstico in vitro. PRINCPIO O soro incubado com p-Nitrofenilfosfato, sal ciclohexilamina (substrato). Sob ao das fosfatases, d-se a hidrlise do sal com a liberao de p-Nitrofenol. Com adio de soda reao e alcalinizao do meio, o p-Nitrofenol liberado torna-se amarelo. A atividade de fosfatase proporcional quantidade de p-Nitrofenol neo-formado. PARTICULARIDADES DO SISTEMA Em 1930, Kay demonstrou a presena de fosfatase alcalina no soro usando como substrato -Glicerofosfato de Sdio. Na tcnica desenvolvida por King e Armstrong utilizando fenilfosfato, o fenol liberado na reao era quantificado e expresso em unidades King-Armstrong. A necessidade de tcnica mais rpida, com menos interferncias, levou Bessey e Lowry a pesquisarem novos substratos. O p-Nitrofenilfosfato mostrou-se ideal, sendo utilizado tanto na quantificao da fosfatase alcalina como na da fosfatase cida total e prosttica. A metodologia simples e toda reao se processa em um tubo num tempo de 10 minutos para fosfatase alcalina e 30 minutos para fosfatase cida. Doles Reagentes inclui, em um nico kit, reagentes necessrios para quantificao de ambas fosfatases. Os tampes, concentrados, so gotejados no substrato. Aps adio do soro, decorrido o tempo de incubao, bloqueia-se a atividade enzimtica com adio de soda. Modificaes na frmula da soluo tampo pH 10,3, permitem que o tempo de incubao seja de apenas 10 minutos. Tratase de um teste gil, simples e que atende s necessidades do laboratrio. A presena de tampes cidos permite a dosagem das fraes da fosfatase cida. Para cada indicao de fosfatase cida so realizados, aproximadamente, 250 testes para fosfatase alcalina no se justificando o investimento em kit especfico nos pequenos e mdios laboratrios. METODOLOGIA Bessey - Lowry modificado. REAGENTES Substrato p-Nitrofenilfosfato: cada frasco contm 35mg de p-Nitrofenilfosfato, sal ciclohexilamina, liofilizado. Tampo pH 10,3: soluo 3M de 2-Amino, 2-Metil, 1-Propanol e 0,85M de Dietanolamina tamponada a pH 10,3, 25oC. Tampo pH 4,8: soluo tampo 0,25M de Citrato Trissdico, pH 4,8. Tampo pH 4,8/cido Tartrico: soluo tampo 0,25M de Citrato Trissdico/cido Tartrico 0,4M, pH 4,8. Soluo padro: cada 20L da mesma corresponde a 150U.I./L de fosfatase alcalina ou 28U.I./L de fosfatase cida. Soluo estabilizadora: soluo 3,4M de cido Actico. Hidrxido de Sdio (concentrado): soluo de Hidrxido de Sdio 10M. APRESENTAO Substrato Tampo pH 10,3 Tampo pH 4,8 Tampo pH 4,8, cido Tartrico Soluo padro Soluo estabilizadora Hidrxido de Sdio (concentrado) NMERO DE TESTES 37 - 74 testes

BIOQUMICA CLNICA
EQUIPAMENTOS E MATERIAIS NECESSRIOS NO FORNECIDOS Espectrofotmetro ou fotocolormetro capaz de medir a absorvncia em 410nm ou filtro azul. Tubos de ensaio. Pipetas graduadas. Pipetas semiautomticas 50L e 200L. Ponteiras descartveis. gua destilada ou deionizada. Banho maria (37oC). Cronmetro. Balo volumtrico de 500mL. Frasco plstico com capacidade volumtrica de 500mL. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Substrato p-Nitrofenilfosfato: armazenar temperatura de 2-8oC. Em sua forma original, permanece estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco. Aps sua reconstituio estvel por 2 meses se armazenado temperatura de 2-8oC. Aliquotado e congelado (10oC negativos), a estabilidade se estende para 5 meses. Tampo pH 10,3: armazenar temperatura de 2-8oC. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo. Agitar antes de usar. Tampo pH 4,8: armazenar temperatura de 2-8oC. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo. Agitar antes de usar. Tampo pH 4,8/cido Tartrico 0,4M: armazenar temperatura de 2-8oC. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco. Agitar antes de usar. Soluo padro: armazenar temperatura de 2-8oC e ao abrigo da luz. Estvel at a data de vencimento indicada no rtulo do frasco. Soluo estabilizadora: armazenar temperatura de 2-30oC. Estvel at a data do vencimento indicada no rtulo do frasco. Hidrxido de Sdio (concentrado): armazenar temperatura de 2-30oC. Estvel at a data do vencimento indicada no rtulo do frasco. Hidrxido de Sdio 0,1M: armazenar temperatura ambiente (20-30 o C) em frasco plstico. Estvel por 3 anos aps a reconstituio, obedecidas as condies de armazenagem e preparo. CUIDADOS E PRECAUES COM O USO DOS REAGENTES Todos os reagentes so somente para uso diagnstico in vitro. Seu manuseio deve ser cuidadoso evitando-se contato com pele e mucosas. Os reagentes so corrosivos. Em caso de contaminao acidental, lavar a parte afetada em gua corrente. O descarte do material utilizado dever ser feito obedecendo-se aos critrios de biossegurana estabelecidos pelo laboratrio, de acordo com as normas locais, estaduais ou federais. Observar ainda a simbologia constante nos rtulos do produto:

Corrosivo

Irritante

3 1 1 1 1 1 1

x x x x x x x

35mg 10mL 6mL 4mL 3mL 3mL 5mL

AMOSTRA Fosfatase alcalina: soro ou plasma colhido com heparina. A fosfatase alcalina permanece estvel por 1 dia a 25oC, 7 dias sob refrigerao e 30 dias a 20oC negativos. Fosfatase cida: a atividade enzimtica sensvel temperatura e ao pH bsico. O sangue deve ser colhido sem anticoagulante e o tubo colocado em vasilhame com gelo. Centrifugar dentro de 30 minutos aps a coleta. Separar o soro e adicionar uma gota de soluo estabilizadora a cada 1,5-2mL do soro. As hemcias contm fosfatase cida. Evitar soro hemolisado. Vrios autores reportam que a massagem prosttica pode liberar enzima na corrente circulatria. Colher o sangue com intervalo de 24-48h em relao massagem. Aps acidificao, a fosfatase cida permanece estvel por 3 dias sob refrigerao (2-8oC) e 15 dias a -20oC. Os anticoagulantes usuais (citrato, fluoreto, edta) so inibidores das fosfatases. Todas as amostras biolgicas devem ser consideradas como sendo potencialmente infectantes.

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PROCEDIMENTO TCNICO Preparo do Hidrxido de Sdio 0,1M (soluo de uso): Adicionar o contedo de um frasco de Hidrxido de Sdio concentrado a um balo volumtrico de 500mL. Ajustar o volume com gua destilada ou deionizada e armazenar em frasco plstico. Estvel por 3 anos, temperatura ambiente (20-30oC). Etiquetar com o rtulo anexo. Preparo do substrato (uso): Adicionar 10mL de gua destilada ou deionizada a cada frasco de substrato. Estvel por 2 meses, armazenado temperatura de 2-8oC. Aliquotado e congelado a 10oC negativos, a estabilidade prolonga-se por 5 meses. DETERMINAO DA FOSFATASE ALCALINA Identificar dois tubos de ensaio com B (branco) e T (teste). Proceder como segue: Substrato (uso) Tampo pH 10,3 B 0,4mL T 0,4mL

Homogeneizar e ler as absorvncias dos tubos C (fosfatase cida total) e D (fostatase cida no prosttica) em espectrofotmetro ou fotocolormetro, em 410nm ou filtro azul, ajustando o zero com o tubo B. A cor final permanece estvel por 30 minutos, temperatura ambiente (20-30oC). OBSERVAES 1. Soros hemolisados no devem ser utilizados para dosagem de fosfatase cida. 2. Quando o resultado encontrado for superior a 50U.I./L o soro deve ser diludo e a dosagem repetida. CURVAS DE CALIBRAO

Padro Absorvncia

Conc. (U.I./L)

2 gotas 2 gotas

Colocar em banho maria, a 37oC durante 2 minutos. Amostra - 50L

Incubar a 37oC, durante 10 minutos. Usar o cronmetro. Hidrxido de Sdio 0,1M (sol. de uso) Amostra 5mL 50L 5mL Figura 1 - fosfatase alcalina

1 2 3 4 5 6

0.000 0.158 0.316 0.633 1.263 1.490

0 33.4 66.8 133.6 267.2 334.0

Homogeneizar e ler as absorvncias do T (teste) em espectrofotmetro ou fotocolormetro, em 410nm ou filtro azul ajustando o zero com o tubo B. A cor permanece estvel por 30 minutos, temperatura ambiente (20-30oC). OBSERVAES 1. Sendo o perodo de incubao apenas 10 minutos, o tempo crtico. Usar um cronmetro. 2. Quando o resultado encontrado superar a 267 U.I./L, procedese nova dosagem com soro diludo. Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluio. DETERMINAO DAS FOSFATASES CIDA TOTAL E PROSTTICA A tcnica baseia-se no princpio de que a fosfatase cida prosttica inibida pelo cido tartrico. Nessas condies, utilizam-se 3 tubos: B (branco), C (fosfatase cida total) e D (onde se determina a fosfatase cida no inibida pelo cido Tartrico). A fosfatase cida prosttica representa a diferena em unidades entre os tubos C e D. Na determinao da fosfatase cida total basta a utilizao de dois tubos B (branco) e C (fosfatase cida total). Identificar 3 tubos com B (branco), C (fosfatase cida total) e D (fosfatase cida no prosttica). Proceder como segue: Substrato (uso) Tampo pH 4,8 B 0,8mL 4 gotas C 0,8mL 4 gotas D 0,8mL 4 gotas

Padro Absorvncia

Conc. (U.I./L)

1 2 3 4 5 6

0.000 0.159 0.316 0.633 1.260 1.460

0 6.26 12.52 25.05 50.10 62.62

Figura 2 - fosfatase cida Obs.: No utilizar estas curvas para determinar o resultado de seu ensaio. A curva de calibrao a representao grfica da relao entre os valores das absorvncias com os valores das concentraes de um conjunto de solues padro. A curva de calibrao demonstra a linearidade da reao at uma determinada concentrao, na qual pode ser determinado um fator de calibrao (F), de acordo com a Lei de Beer. A reao linear at 50 U.I./L para fosfatase cida e 267 U.I./L para fosfatase alcalina (ver curvas acima). Obtendo-se valores mais elevados, dilui-se a amostra com soluo fisiolgica e procede-se nova dosagem. Multiplicar o valor encontrado pelo fator de diluio. O kit de Fosfatases Doles possui padro no intervalo de linearidade da metodologia adotada de Bessy-Lowry modificado. O laboratrio deve realizar o ensaio com o padro que acompanha o kit e calcular seu fator de calibrao (F), a exemplo do demonstrado nos clculos abaixo. O fator deve ser refeito periodicamente e a cada lote do produto. As concentraes dos padres utilizados na montagem da curva de calibrao foram ajustadas como descrito em Alkaline and Acid Phosphatase, Louis Berger e Guilford G. Rudolph in Standards Methods of Clinical Chemistry, vol. 5, 1968, pg. 211-221.

Tampo pH 4,8 cido Tartrico Colocar em banho maria, a 37oC durante 2 minutos. Amostra - 200L

200L

Incubar a 37oC, durante 30 minutos. Usar o cronmetro. Hidrxido de Sdio 0,1M (soluo de uso) Amostra 5mL 200L 5mL - 5mL -

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CLCULOS DETERMINAO DO FATOR (F)


A determinao do fator F para fosfatase alcalina e cida feita com uma nica soluo e com apenas um tubo. Proceder como segue: a um tubo de ensaio, adicionar 5,5mL da soluo de Hidrxido de Sdio 0,1M (soluo de uso). Pipetar nesse tubo 20L da soluo padro. Homogeneizar. Ler a

absorvncia da soluo padro zerando o aparelho com gua destilada em 410nm ou filtro azul. Fosfatase alcalina Fator (F) = 150 absorvncia P

Fosfatase cida Fator (F) = 28 absorvncia P

Fosfatase alcalina (U.I./L) = absorvncia T x fator (F) Fosfatase cida total (U.I./L) = absorvncia tubo C x fator (F) Fosfatase cida no prosttica (U.I./L) = absorvncia tubo D x fator (F) A leitura do tubo C representa un. de fosfatase cida total. A leitura do tubo D representa un. de fosfatase cida no inibida por tartarato. A fosfatase cida prosttica corresponde diferena de unidades entre os tubos C e D. Fosfatase cida prosttica (U.I./L) = Fosfatase cida total (U.I./L) Fosfatase cida no inibida (U.I./L) Exemplos: Leituras: P = 0,485 T = 0,106 (fosfatase alcalina) C = 0,179 (fosfatase cida total) D = 0,156 (fosfatase cida no inibida por tartarato) Clculo do Fator (F) FOSFATASE ALCALINA (F) Fator (F) = 150 0,485 = 309,28

CONTROLE DA QUALIDADE DO SISTEMA 1. A limpeza e a secagem adequada do material a ser utilizado so de fundamental importncia para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados corretos. 2. A gua utilizada na limpeza do material, no preparo dos reagentes e na dosagem, deve ser de boa qualidade. 3. Colunas deionizadoras saturadas liberam ons diversos, aminas e agentes oxidantes, que deterioram os reagentes. 4. As pipetagens devem ser precisas. 5. O nvel da gua do banho maria deve ser superior ao nvel dos reagentes nos tubos de ensaio. A temperatura (37oC) deve ser rigorosamente observada. 6. O uso de soro controle de referncia deve ser uma prtica rotineira do laboratrio. Recomenda-se utilizar um soro controle com valor na faixa de normalidade (soro controle N - Doles) e outro soro controle de valor elevado (soro controle P Doles). VALORES DE REFERNCIA recomendado que cada laboratrio estabelea sua prpria faixa de valores de referncia na populao atendida. Como orientao, sugerimos os seguintes valores: Fosfatase alcalina Adultos 13 - 45 U.I./L Crianas 7 - 115 U.I./L Fosfatase cida total Fosfatase cida prosttica 2,20 - 11 U.I./L 0,17 - 2,5 U.I./L

SIGNIFICADO CLNICO Fosfatase cida A determinao da atividade da fosfatase cida no soro tem como principal finalidade o diagnstico e a monitorizao do cncer prosttico e particularmente o da forma metasttica. A fosfatase cida total e seu isoenzima fosfatase cida prosttica encontram-se aumentados nos casos de adenocarcinoma prosttico. O aumento mais evidente nas condies em que j h infiltrao da pseudo cpsula com metstases por vias hematognica e linftica. Os aumentos so mais acentuados com relao fosfatase cida prosttica. Discretos aumentos de fosfatase cida total so encontrados na enfermidade de Paget, anemia hemoltica e anemia megaloblstica. A fosfatase cida total utilizada como marcador da doena de Gaucher. O antgeno prosttico especfico (PSA), frao antignica especfica do tecido prosttico, vem substituindo, progressivamente, atravs de sua dosagem a dosagem das fosfatases cidas devido a sua maior especificidade e sensibilidade. Fosfatase alcalina Os nveis de fosfatase alcalina srica so de grande significado na investigao das desordens hepatobiliares e sseas. Nas enfermidades hepatobiliares, as elevaes so encontradas, predominantemente, na obstruo extra-heptica (clculo vesical, cncer de cabea do pncreas). Na obstruo do trato biliar, a atividade da fosfatase alcalina pode estar elevada at dez vezes em relao aos mais altos valores de referncia. O aumento da fosfatase alcalina encontra-se presente em vrias enfermidades sseas, especialmente naquelas que evoluem com quadro de ostelise. A doena de Paget talvez seja, a doena ssea que apresenta as maiores atividades de fosfatase alcalina, com nveis 10 a 25 vezes acima dos limites superiores dos valores de referncia. Discretos aumentos se verificam na osteomalcia, raquitismo, hiperparatiroidismo, fraturas e durante o crescimento sseo. Nveis elevados de fosfatase alcalina so encontrados no sarcoma osteognico. Pequenos a moderados aumentos podem ser observados durante a gravidez, sendo essa fosfatase de origem placentria.

FOSFATASE CIDA (F) Fator (F) = 28 0,485 = 57,73 0,106 x 309,28 0,179 x 57,73 0,156 x 57,73 10,33 - 9,01 = = = = 32,78 10,33 9,01 1,32

Fosfatase alcalina (U.I./L) = Fosfatase cida total (U.I./L) = Fosfatase cida no prosttica (U.I./L) = Fosfatase cida prosttica (U.I./L) =

Uma U.I. de fosfatases (alcalina ou cida) a quantidade de enzima que cataliza o desdobramento de 1mol de substrato/ minuto/ litro de soro. O resultado pode ser expresso em unidade Bessey-Lowry dividindo-se o resultado de U.I./L por 16,7.
LIMITAES DO SISTEMA Para se obter timo desempenho do sistema, necessrio que o procedimento tcnico seja rigorosamente seguido conforme instrues de uso.

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CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO Fosfatase cida Foram realizados 45 testes em amostras cujos teores de fosfatase cida situavam-se no intervalo de 0,25 a 27 U.I./L. Esses ensaios foram realizados em paralelo com uma metodologia de referncia. A comparao da Fosfatase cida Doles (Y) com a metodologia mencionada (X) deu origem seguinte equao de regresso linear: Y= 0,03 + 1,024X, sendo o coeficiente de correlao 0,99. Em oito amostras de soros com teor de fosfatase cida total entre 5 - 38 U.I. /L foram adicionados 15 U.I./L de fosfatase cida (proveniente de lquido seminal) havendo uma recuperao entre 97 - 102%. O erro da mdia foi de 1,82%. Fosfatase Alcalina Foram realizados 45 testes em amostras cujos teores de fosfatase alcalina situavam-se no intervalo de 14 a 220 U.I./L.. Esses ensaios foram realizados em paralelo com uma metodologia de referncia. A comparao da Fosfatase Alcalina Doles (Y) com a metodologia mencionada (X) deu origem seguinte equao de regresso linear: Y= 0,68 + 1,005X, sendo o coeficiente de correlao 0,99. Fosfatase alcalina (origem intestinal) numa concentrao de 80 U.I./L foi adicionada em 6 amostras de soros cujos valores iniciais de fosfatase alcalina situavam-se entre 35 e 120 U.I./L A recuperao nas diversas amostras situou-se entre 98 e 102%. O erro da mdia foi de 1,60%. Fosfatase Alcalina Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com 3 amostras, obtendo-se os seguintes resultados:
Concentrao (U.I./L) Desvio padro Coeficiente de variao (%)
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

Especificidade: a presente metodologia especfica para determinao da fosfatase alcalina e da fosfatase cida prosttica. A especificidade da fosfatase cida relaciona-se presena de cido Tartrico na soluo tampo, que inibe a fosfatase cida proveniente de outros tecidos. Sensibilidade: a absorvncia encontrada, de 0,025, corresponde a 1 U.I./L de fosfatase cida e a absorvncia encontrada, de 0,0047, corresponde a 1 U.I./L de fosfatase alcalina, quando realizados os testes em espectrofotmetro, a 410nm. A sensibilidade do sistema est diretamente relacionada com a do aparelho utilizado no laboratrio. A metodologia sensvel a outras fosfatases cidas que no sejam de origem prosttica. Diluio da matriz: estudos sucessivos de diluio da matriz mostraram que no h interferncia na sensibilidade diagnstica da presente metodologia de Bessey - Lowry modificado. Substncias interferentes: no utilizar amostras hemolisadas e lipmicas para determinao das fosfatases. O uso de tais amostras pode levar a resultados falsamente elevados. Podem-se obter resultados errneos caso no se observem cuidados com a conservao da amostra e a temperatura da reao. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA Bessey, O.A., Lowry, O.H. e Brock, M.J. J.: Biol. chem., 164: 321-9, 1946. Pesce, A.J.; Kaplan, L.A.: Methods in clinical chemistry; 683-690, 1074-1087, 1987 Tibrcio, H.M.: Controle interno da qualidade analtica, 1aed. maro/1995. Doles: dados de arquivo. TERMOS E CONDIES DE GARANTIA DA QUALIDADE DO PRODUTO As garantias do fabricante ao consumidor seguem estritamente as relacionadas na Lei no 8.078, de 11 de setembro de 1.990 - Cdigo de Defesa do Consumidor. Os reagentes que compem este sistema para diagnstico so garantidos na sua performance, reprodutibilidade e qualidade at a data de vencimento. Os produtos que apresentarem problemas tcnicos comprovados sero substitudos, sem nus para o consumidor. Doles Reag. Equip. para Laboratrios Ltda. CNPJ: 01.085.513/0001-05 Rodovia BR 153, Km 493, Lt.07 Chcara Retiro, Conjunto Palmares. CEP: 74775-027 Goinia - GO Brasil e-mail: doles@doles.com.br M.S.: no 10231810001 Reviso: 14 (11/2010)

9,08 0,36 3,96

40,31 0,66 1,64

161,10 2,36 1,46

Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens, durante 20 dias consecutivos, obtendo-se os seguintes resultados:
Concentrao (U.I./L) Desvio padro Coeficiente de variao (%)
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

8,02 0,35

35,18 0,97

148,40 2,41

4,36 2,76 1,62 Fosfatase cida Repetitividade: foram realizadas 20 dosagens sucessivas, com 3 amostras, obtendo-se os seguintes resultados: Concentrao (U.I./L) Desvio padro Coeficiente de variao (%)
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

2,39 0,06 2,51

8,54 0,16 1,87

38,10 0,45 1,18

Reprodutibilidade: foram realizadas 20 dosagens, durante 20 dias consecutivos, obtendo-se os seguintes resultados:
Concentrao (U.I./L) Desvio padro Coeficiente de variao (%)
Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

2,24 0,07 3,13

9,92 0,33 3,33

41,93 0,89 2,12

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