Introduo

Cromatografia uma tcnica analtica usada para separar componentes de uma mistura para ajudar na identificao e quantificao dos mesmos. Baseia-se na partio do soluto entre duas fases:
Fase estcionria Fase mvel

CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA (HPLC / CLAE )

CROMATOGRAFO LQUIDO
SOLVENTES

BOMBA

DETETOR

COLETOR

INJETOR

COLUNA DESCARTE

Aparelhagem
A bomba fora a fase mvel, que se encontra em um reservatrio, atravs da coluna numa determinada velocidade de fluxo. A presso monitorada atravs de um transdutor. Por um sistema de injeo, a amostra introduzida na coluna. Esta carregada atravs da coluna pela fase mvel, onde ocorre a separao. Um detetor usado para detectar a eluio dos solutos. Amplificadores e controles eletrnicos convertem a resposta do detetor em um sinal para o registrador, integrador ou sistemas de dados.

Partio do Soluto
A migrao atravs da coluna depende das solubilidades dos solutos nas fases mvel e estacionria.
Mais solvel na fase mvel, mais rpido migrar pela coluna; Mais solvel na fase estacionria, mais lentamente migrar pela coluna

Pela diferena de velocidades se separam os componentes.

Tipos de Separao

Fator de Capacidade (k)

Determina a quantidade de amostra que pode ser introduzida na coluna. Depende da temperatura. calculado pela equao: k = (tR - t0) / t0 = tR / t0 Onde tR = tempo de reteno do soluto t0 = tempo de reteno para um soluto no retido tR = tempo de reteno ajustado para o soluto

Seletividade da Coluna ()

Onde: tR2 = tempo de reteno ajustado do 2o 2o pico tR1 = tempo de reteno ajustado do 1o 1o pico

= t tR2 / t t R1 > 1 ... separao aceitvel

Resolution Vs Selectivity, Capacity and Efficiency

Otimizando a Separao
Para otimizar o fator de capacidade (k):
Ajustar a fora do solvente Mudar a fase estacionria

Para otimizar a seletividade ():

Mudar a composio da fase mvel Usar aditivos na fase mvel Mudar o pH Mudar a fase estacionria Mudar a temperatura

Otimizando a Separao
Para otimizar a eficincia da coluna:
Diminuir o tamanho da partcula Reduzir a velocidade do fluxo Usar duas ou mais colunas em srie Utilizar solventes menos viscosos Aumentar a temperatura da coluna Aumentar a uniformidade da coluna

O Sistema de Solventes
A fase mvel pode ser constituda por uma ou mais solues aquosas de sais, ou um ou mais solvente orgnico. A fase mvel bombeada pelo sistema HPLC para que ocorra o arraste da amostra pelo sistema, interagindo com a amostra durante a separao.

Miscibilidade dos Solventes

Os solventes (fase mvel) podem formar bolhas de ar a partir de misturas pobres. Deve-se verificar antes a miscibilidade entre os solventes, quando se trabalha com mais de um solvente de fase mvel.

Viscosidade dos Solventes

Altas viscosidades originam altas presses na cabea da coluna e baixa eficincia. A viscosidade no muda linearmente com a quantidade de solvente na mistura. Quando se faz anlises com gradiente, no ponto mais alto de viscosidade, a presso do sistema aumenta consideravelmente.

Fora do Solvente
A fora do solvente a soma de trs tipos de interao intermolecular: disperso, orientao e ligaes de hidrognio. Uma fase mvel mais forte resulta em um menor tempo de reteno. Solventes polares so mais fortes para a fase normal. Solventes no polares ou orgnicos so mais fortes para fase reversa.

Propriedades dos Solventes

Preparao da Fase Mvel Degaseificao da Fase Mvel Filtrao da Fase Mvel

FILTROS/FILTRAO

Frit Poroso

Escolha da Fase Mvel

A fase mvel a ser escolhida deve em primeiro lugar separar a amostra. Fora isso, ela deve :
No alterar a coluna e suas caractersticas; Ser compatvel com o detetor; Dissolver a amostra; Permitir a recuperao da amostra, se desejada; Ser de alta pureza; No ser txica; Ter baixa viscosidade.

Solventes para Fase Reversa

Em fase reversa, a fase mvel tem polaridade maior que a fase estacionria. A gua o mais comum lquido polar, portanto o solvente mais utilizado para fase reversa. Para se mudar a reteno do soluto, necessrio utilizar um modificador orgnico. Os modificadores mais comuns so o metanol, a acetonitrila e o tetrahidrofurano (THF).

Solventes para Fase Normal

Em fase normal, a polaridade da fase mvel e menor que a da fase estacionria. Em fase normal, utiliza-se misturas de um solvente no polar e um ou mais solventes polares (modificadores). A composio isocrtica composta de hidrocarboneto, 10-50% de hidrocarboneto clorado e 1-5% de lcool. As fases mvel e estacionria ficam em competio pelo soluto.

Solventes para Cromatografia de ons

Utiliza um tampo aquoso num pH adequado carga da amostra.
Para cidos, o pH deve ser maior que 5; Para bases, o pH deve ser menor que 5.

A medida que a concentrao do tampo aumenta, a fora do solvente aumenta e a reteno diminui. Neste caso, para se mudar a reteno e a seletividade, adiciona-se um solvente orgnico, sendo o metanol o mais utilizado.

Solventes
Nmero de canais: Sistema isocrtico - um canal de solvente Sistema gradiente -Binrio - dois canais Ternrio - trs canais Quaternrio - quatro canais Modos de desaerao dos solventes: Vcuo + ultrassom Hlio (He) Membrana Mecnico

Separao Isocrtica vs. Gradiente

Bomba
Uma boa bomba para HPLC deve ter as seguintes qualidades:
Ser capaz de suportar altas presses; Ter grande intervalo de programao de fluxos
(Analtica: 0,01 a 10,0 mL/min , Preparativa: 0,1 a 20,0 mL/min pelo menos)

Ter reprodutibilidade de velocidade de fluxo; As partes que entram em contato com a amostra e/ou solvente devem ser inertes; Ser capaz de fazer eluio com gradiente Ter rpida mudana de solvente; Ser fcil de desmontar e reparar.

Bomba

Mixers
A composio do solvente deve ser bem homognea antes de alcanar a cabea da coluna. A Varian utiliza mistura em alta presso, que evita a formao de bolhas, no necessitando degaseificao obrigatria da fase mvel. Mixers dinmicos usam pequenas peas para misturar. Mixers estticos dependem do fluxo laminar.

Vlvulas de Injeo de Amostra e Autosamplers

Uma vlvula de seis vias acomoda a porta de injeo e o loop de amostra que coloca a amostra lquida no sistema. A virada da vlvula pode ser manual ou automtica. A automao aumenta a preciso como agiliza as anlises.

CAMINHO DO FLUXO EM UM INJETOR

Injeo de loop cheio

O volume do loop determina quanto de amostra deve ser injetado --Se um injetor de 20 uL usado , o volume introduzido na coluna de 20 uL * O volume a ser introduzido deve ser no mnimo 4 vezes o volume nominal do loop(looping)

Injeo parcial do loop

*Pode-se injetar uma quantidade menor de uma amostra (concentrada), que de outra forma cairia fora do intervalo de linearidade do detetor. * O volume de amostra na seringa determina o volume de amostra que entra no sistema * Preciso da Injeo aumentada pelo uso de um padro interno

Autosampler

Colunas
A coluna o corao do cromatgrafo. Nela ocorre a separao dos compostos presentes na amostra para que possam ser analisados pelos detetores.

FASE ESTACIONRIA LIGADA

LIGADA FSICA E QUIMICAMENTE , EVITANDO ADSORES NO DESEJADAS A Slica porosa contm grupos silanis os quais so ativos com pontes de hidrgenio e reaes cidas

Preparando a fase ligada

FASES LIGADAS
R2 Si OH R2 Si O Si R2 R1

Cl

Si R2

R1

ODS, RP-18, C-18 RP-8, C-8 Fenil TMS, C-1 CN, Cianopropil NH2, Propilamino Diol

Si O Si

H CH3

Si O Si

Si

CH3
CH3

CH3
Si O Si
HSi CH3 CH3

Si O Si

Si O Si

N NH2 OH OH

Vantagens:
- Equilbrio mais rpido - menor adsoro irreversvel - gua no influi na reprodutibilidade

Si O Si

Si O Si

Pr-colunas

Intervalos de pH das Fases Estacionrias

Regenerao com Solvente

Estocagem da Coluna
Guardar as tampas da coluna e recoloclas sempre que a coluna no estiver sendo usada. Manter a coluna molhada (preenchida) com o solvente recomendado para estocagem.

Solventes para Estocagem de Colunas

Detectores
O detector deve ter as seguintes caractersticas: Detectar os solutos de interesse(seletividade) Ter alta sensibilidade (rudo) Possuir mltiplos ranges (linearidade) No ser destrutivo para a amostra Baixo volume morto Seguro e fcil de manuteno.

DETETOR - Tipos
Em relao forma de resposta: Detetor diferencial Mede a diferena instantnea na composio do eluente Detetor Integral Mede a quantidade acumulada de componentes da amostra que atingem o detetor Em relao ao tipo de resposta: Detetor sensvel concentrao A resposta proporcional quantidade de analito no eluente Detetor sensvel ao fluxo de massa A resposta proporcional quantidade de analito que atinge o detetor, por unidade de tempo Em relao seletividade: Detetor Universal Responde a qualquer analito que elua do sistema, exceto FM Detetor Seletivo Responde a grupos relacionados de analitos Detetor Especfico Responde a um componente especfico da amostra, ou a um nmero limitado de componentes que possuem caractersticas qumicas similares

DETETOR
Duas classes: Monitoram propriedades do eluente (FM + Analito) Monitoram propriedades especifica do analito

Caractersticas de um bom detetor Alta sensibilidade Baixo limite de deteco Linearidade Reprodutibilidade

DETETOR
Rudo e deriva

Rudo (N) (N): : Incerteza no valor da linha de base, sem o analito. Alta freqncia (> 1Hz): rudo eletrnico do detetor, intregrador e/ou da pulsao do sistema de bombeamento; Baixa freqncia (<0 (<0,1 Hz): Interferncia externa ou sistema com problemas: FM mal misturada Variao na temperatura Sangria da FE Analitos de amostras anteriores com eluio tardia Lmpada ruim (velha) Deriva Deriva: : Inclinao mdia da linha de base, em Volts, Amperes ou Uabs por hora

DETETOR
Linearidade e Sensibilidade

Resposta linear linear: : Quando a intensidade do sinal proporcional concentrao do analito. Limite de deteco deteco: : Quantidade mnima do analito que pode ser detectada (diferenciada do rudo). Isto , pelo menos 2x a altura mdia do rudo. Limite de Quantificao inferior inferior: : Quantidade que pode ser quantificada com segurana, com um nvel especificado de exatido e preciso. Usualmente, altura do sinal do analito 5 a 10x maior que o sinal o rudo mdio. Limite de Quantificao superior superior: : Maior quantidade de analito para a qual o detetor ainda responde linearmente.

Detectores de Absorbncia UV-Visvel

O detector de UV-Vis, trabalha com um comprimento de onda somente, sendo que este, pode ser fixo durante a anlise toda ou trocado por outro, durante a anlise. A luz, emitida pela lmpada de deutrio, coleta da no monocromador. Este por sua vez seleciona o comprimento de onda desejado e o emite para a clula de fluxo, onde a amostra absorve a luz e esta absorbncia coletada em um diodo. Pela diferena da absorbncia do diodo da amostra, com o diodo do referncia (fase mvel), se tem um sinal.

UV Cut-off
0,05 M 1% acido Actico Tampo Fosfato 0,1 M Agua Tetrahidrofurano Pentano isopropanol Hexano Metanol Diclorometano O-Diclorobenzeno Clorofrmio Acetona Acetonitrila 180 200 220 240 260 280 300 320 340

nm

Detectores de Absorbncia UV-Visvel

O sinal amplificado e enviado para uma estao de trabalho de dados. O detetor compatvel com eluio de gradiente e no destrutivo.

DETETOR -UV/VIS
A: absorbncia I0: luz incidente I: luz transmitida : absortividade molar b: compr. Do caminho tico (cm) c: concentrao molar

Leitura: unidades de absorbncia (ua) 1 ua = depreciao da luz incidente em 90%

: depende do comprimento de onda () e das condies

cromatogrficas (solvente, pH e temperatura)

max = > = > sensibilidade

DETETOR -UV/VIS
A: absorbncia I0: luz incidente I: luz transmitida : absortividade molar b: compr. Do caminho tico (cm) c: concentrao molar
Criptomoscatona D2
mAU 500

OH

OH

215 nm
O O

223 nm

252 nm

280 nm

300

100

250

300

350

nm

max = > = > sensibilidade

Detector DAD (diode array detector)

O DAD um detector de absorbncia. Ele trabalha com a tica inversa, ou seja, a luz emitida pela lmpada de deutrio passa pela cela de fluxo, sem se selecionar o comprimento de onda a ser utilizado. Aps isto a luz refratada e coletada por um arranjo de fotodiodos, onde se posteriormente pode se escolher qualquer comprimento de onda de uma faixa previamente especificada. Muitos recursos ps corrida so disponveis, como a comparao com bibliotecas de espectros. Pode-se utilizar como tcnica qualitativa.

DETETOR - FLUORESCNCIA

Eltrons , conjugados Anis aromticos***

Substncias no fluorescentes

DERIVADOS

Detector de Fluorescncia
Muitos compostos so capazes de absorver radiao e subsequentemente emitir radiao num comprimento de onda maior (de menor energia). A radiao emitida causada pelas molculas excitadas que liberam ftons para voltar para seus estados fundamentais (ground state).
A frao de energia absorvida que reemitida normalmente muito baixa.

Detector de Fluorescncia
Fluorescncia requer caractersticas estruturais que reduzam a velocidade de relaxao por calor e aumente a velocidade de fluorescncia. Compostos que fluorescem naturalmente tem uma estrutura cclica conjugada (ex: PAHs -hidrocarbonetos poliaromticos). Muitos compostos no fluorescentes podem ser derivativados. O detector pode ser altamente seletivo porque tanto o comprimento de onda de excitao quanto de deteco podem ser variados.
til para anlises de traos.

Resposta do detector linear, 103 - 104

Detector de ndice de Refrao Estes detectores percebem a diferena de ndice de refrao entre o eluente da coluna e uma cela de referncia com fase mvel pura.
A cela de referncia preenchida com fase mvel e ento isolada do caminho do fluxo. A fase mvel passa somente atravs da cela da amostra.

A luz brilha num par de fotodiodos; a diferena nos sinais medida.

ndice de Refrao (RI)

Medida de como diferentes solventes refratam a luz.

Dicas para deteco com RI

No utilizar a bomba para fazer a mistura de solventes. Preencher a cela de referncia com fase mvel que esteve fluindo pelo sistema todo. De 1 a 3 horas de estabilizao trmica so necessrias. Passar uma pequena quantidade de fluxo quando no estiver em uso Manter o detector sempre ligado. Termostatizar o ambiente.

DETETOR - ELETROQUMICO
Seletividade e sensibilidade para substncias que possam ser facilmente oxidadas ou reduzdas. Mede a corrente gerada na oxidao/reduo de analitos, num eletrodo adequado. Requer FM condutora, com eletrlitos e ajuste de pH. Presena de O2, contaminao por metais ou haletos na FM causam corrente de fundo e, assim, rudo e deriva na linha de base. Sensibilidade a fenis, nitrosaminas, catecolaminas, cidos orgnicos: nanogramas. Eletrodo de trabalho (ET) (ER) Eletrodo de referncia Aplicao: monitoramento dessas substncias em matrizes complexas: fludos corpreos, produtos naturais, etc.

Contra-eletrodo

Condies para uma reao eletroqumica

8Reao do analito no superfcie do ET monitorado atravs do tempo (t) 8O composto deve ser eletroquimicamente ativo. 8O potencial estabelecido entre o ET e o ER determinar a reatividade do analito Reao eletroqumica para diis aromticos geminais

HO HO

+ 2H+ + 2eO

DETETOR - ELETROQUMICO

Tipos de eletrodo
Material do ET Limites de Potencial (V) Alcalino cido -1,50 -1,25 -0,90 -1,20 --+0,60 +0,75 +0,65 +0,10 +0,60 -0,80 +1,30 -0,35 +1,10 -0,20 +1,30 -0,50 +0,40 ---Aplicaes

Carbono Ouro Platina Prata Cobre

Catecolaminas Carboidratos lcoois, glicis Haletos,cianetos Aminocidos

Riber, J.;... Snchez-Batanero, P. Talanta. 2000, 52, 241.

DETETOR - ESPALHAMENTO DE LUZ EVAPORATIVO

O eluente, ao sair da coluna, misturado com um gs nebulizador (N2) para formar um aerosol: disperso uniforme de gotas. A FM vaporizada no tubo de deriva, restando gotculas de analitos. As gotculas espalham a luz do laser. Esse espalhamento medido pelo fotomultiplicador, colocado a 90o do feixe laser. Outro sensor colocado em frente (180o) do feixe laser, e mede qualquer luz no desviada.

Coluna

Nebulizador Despressurizador

Gs N2 Nebulizador Tubo de deriva aquecido

Gotculas de a mostra

Fonte de Luz Laser

Amplificador

Exaustor

Fotodetector

INTERFACES - CAMPO DE APLICAO

FATORES : DISPONVEL

EQUIPAMENTO NATUREZA DA AMOSTRA

La Espectrometria de Masas en Imagenes - Luis Esteban -(1993) - p.189

FONTES DE IONIZAO: - ons representativos da substncia analisada - Fragmentos caractersticos (informaes estruturais)

TIPOS : SOFT HARD EI

ES
CI FAB TSP LSIMS MALDI

INCOMPATIBILIDADE LC-MS
HPLC Fase lquida 25 - 50C No limita amostra No limita PM Usa tampes inorgnicos Gera fluxos de gases maiores de 10 torr x 1 x s-1 MS Fase gasosa 100-350C Amostra voltil Limita PM No tolera tampes Aceita fluxos de gases menores de 0,15 torr x l x s-1

ELECTROSPRAY

Etapas principais :

* Nebulizao e formao do spray de gotculas carregadas eltricamente;

* Desintegrao das gotculas e liberao dos ons e

* Transporte desses ons da fonte de ionizao (P. Atm.) at o analisador (Alto vcuo).

135
O O

O N H MM = 275 u.m.a.

[M+H]+

135

[M-30+H]+

[M+Na]+

135
[M+H]+ [M+Na]+

10 eV

10 eV

10 eV

50 eV

- Multidimensional data obtained by HPLC/PDA/MS analysis of an alfalfa root extract. The HPLC retention time, the UV absorbance spectrum, and the mass spectrum readily identify the peak eluting at 45 minutes as medicarpin, a known phytoalexin in alfalfa.

ESPECTROMETRIA DE MASSAS VANTAGENS * capacidade de identificao (fragmentaes caractersticas) * qualitativa e quantitativa * pode analisar misturas complexas * alta sensibilidade e seletividade * universal e especfica * rapidez * acoplamentos

ESPECTROMETRIA DE MASSAS

DESVANTAGENS

- Instrumentao complexa; - Habilidade e especializao por parte do usurio; - Recente popularizao; - Dificuldades na interpretao de alguns espectros; - CARO !!!

ELECTROSPRAY
VANTAGENS -Uma das mais importantes tcnicas disponveis; - simples; - Mtodo soft de ionizao; - Molculas polares de vasta faixa de PM (at 200.000 Da) -Opera presso atmosfrica; - Temperatura ambiente

DESVANTAGENS - Fluxo (at 50 l / min); analisa molculas apolares; - No

ESPECTROS - ES
Modo Positivo : [M+H]+, [M+Na]+ , [M+K]+, [M+NH4]+ , [M-gli+H]+, [A+H]+[A+Na]+ , [A+K]+, [A+NH4]+ Modo Negativo: [M-H]- , [M+CF3COO-] [M-gli-H][A-H]- , [A+CF3COO-]