Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2011

Rui Pedro Figueiredo Queirs

Reviso do Plano de Controlo Interno do Laboratrio de Microbiologia

Universidade de Aveiro Departamento de Qumica 2011

Rui Pedro Figueiredo Queirs

Reviso do Plano de Controlo Interno do Laboratrio de Microbiologia

Dissertao apresentada Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Biotecnologia Alimentar, realizada sob a orientao cientfica da Doutora Ana Xavier, Professora Auxiliar do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro e do Engenheiro Joo Borges do Departamento de Controlo de Qualidade da Nestl Fbrica de Avanca.

Dedico este trabalho aos meus pais, irm e namorada por acreditarem em mim e estarem sempre presentes.

o jri
presidente Prof. Doutor Joo Manuel da Costa E Arajo Pereira Coutinho
professor associado com agregao do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro

Prof. Doutor Jorge Manuel Saraiva

investigador auxiliar do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro

Prof. Doutora Ana Maria Rebelo Barreto Xavier

professora auxiliar do Departamento de Qumica da Universidade de Aveiro

Engenheiro Joo Lopes Borges

chefe do Controlo de Qualidade da Nestl Fbrica de Avanca

agradecimentos

Gostaria de agradecer ao Engenheiro Joo Borges pela oportunidade dada, Professora Ana Xavier pela sua orientao, Joana Castro pela incalculvel ajuda e a todos os funcionrios da Nestl Fbrica de Avanca que me fizeram sentir em casa.

palavras-chave

Controlo de qualidade, plano de controlo interno, equipamento, analistas, verificao de mtodo.

resumo

O presente trabalho teve como objectivo a reviso do plano de controlo interno do laboratrio de microbiologia do departamento de controlo de qualidade da Nestl Fbrica de Avanca. Foi desenvolvido um estudo terico que permitisse dar resposta a este objectivo, o qual se encontra exposto na introduo deste trabalho. Este estudo permitiu identificar as principais componentes de um plano de controlo interno: equipamento, meios de cultura e reagentes, higiene e ambiente, analistas e verificao do cumprimento dos mtodos analticos. Todas as componentes do plano existente foram revistas e actualizadas. Na componente de equipamento incidiu-se, maioritariamente, na documentao para os novos aparelhos, no contemplados no ltimo plano elaborado. Na componente de meios e reagentes foi desenvolvido um plano de rastreabilidade. Quanto parte de controlo do ambiente, foram revistas as frequncias de higienizao e desenvolvidos novos planos de controlo do ambiente. Relativamente aos analistas, avaliou-se o seu trabalho, recorrendo ao clculo de repetibilidade e reprodutibilidade intermdia dos seus resultados analticos. Devido inexistncia de um plano de verificao de cumprimento dos mtodos analticos, reconheceu-se a necessidade de efectuar este tipo de controlo e foi fundamental a concepo de um plano que permitiu efectuar esta verificao. Para alm da concepo deste plano de verificao, actualizaram-se as componentes de equipamento, meios de cultura e reagentes, higiene e analistas. Foi igualmente desenvolvido um plano de rastreabilidade de meios de cultura e um plano de controlo do ambiente. A reviso do plano de controlo interno foi extremamente importante, uma vez que permite a obteno de resultados fiveis e proporciona ao laboratrio os requisitos necessrios para futuras auditorias. Foi ainda realizado um estudo sobre a possvel mudana de parmetro de liberao para parmetro de monitorizao relativo quantidade de probiticos em farinhas lcteas.

keywords

quality control, internal control plan, equipment, analysts, method verification

abstract

This study aimed at reviewing the internal control plan of the microbiology laboratory in the quality control department in Nestl Avanca Factory. A theoretical study on the subject was developed, which is explained in the introduction. This allowed the identification of the main components of an internal control plan: equipment, culture media and reagents, hygiene and environment, analysts and verification of the compliance of analytical methods. All components of the existing plan were reviewed and updated. In the equipment component the main focus was the documentation for the new devices, not covered by the existing plan. In the culture media and reagents component a traceability plan was developed. To monitor the environment, the cleaning frequency was revised and a new control plan was developed. In order to control the analysts results, their work was evaluated calculating the repeatability and reproducibility of their results. Due to the lack of an existing plan for the verification of the compliance of the analytical methods, it was recognized the need for this type of control and was critical to design a plan to verify it. In addition, the following components were updated: equipment, culture media and reagents, hygiene and analysts. It was also developed a traceability plan for culture media and an environmental monitoring plan. The review of the internal control plan was extremely important because it allows obtaining reliable analytical results and provides the laboratory with the necessary requirements for future audits. It was also carried out a study on the possible change from a release parameter to a monitor parameter on the amount of probiotics in powder products.

NDICE
1. Introduo........................................................................................................................... 1 1.1. 1.2. 2. Nestl ........................................................................................................................... 1 Fbrica de Avanca ....................................................................................................... 1

Controlo de qualidade ........................................................................................................ 2 2.1. 2.2. Definio e importncia da qualidade ......................................................................... 2 Atributos de qualidade ................................................................................................. 2 Intrnsecos ............................................................................................................ 2 Extrnsecos ........................................................................................................... 3

2.2.1. 2.2.2. 2.3. 3. 4.

Departamento de controlo de qualidade ...................................................................... 4

Laboratrio de microbiologia ............................................................................................. 6 Plano de controlo interno ................................................................................................... 7 4.1. Equipamento ................................................................................................................ 7 Estufas .................................................................................................................. 9 Banho de gua com termstato .......................................................................... 10 Frigorficos ......................................................................................................... 11 Congeladores ...................................................................................................... 12 Estufas de esterilizao ...................................................................................... 12 Autoclaves .......................................................................................................... 14 Medidor de pH ................................................................................................... 16 Balanas ............................................................................................................. 17 Pipetas e outros instrumentos volumtricos ....................................................... 17

4.1.1. 4.1.2. 4.1.3. 4.1.4. 4.1.5. 4.1.6. 4.1.7. 4.1.8. 4.1.9. 4.2.

Meios de cultura e reagentes ..................................................................................... 18 Compra, recepo e armazenamento .................................................................. 20 gua ................................................................................................................... 20 Preparao e esterilizao .................................................................................. 21

4.2.1. 4.2.2. 4.2.3.

4.2.4. 4.2.5. 4.3. 4.4. 4.5. 5.

Uso de meios de cultura e reagentes esterilizados ............................................. 22 Qualidade de meios de cultura e reagentes ........................................................ 23

Higiene....................................................................................................................... 24 Analistas .................................................................................................................... 27 Plano de verificao de cumprimento dos mtodos .................................................. 28

Metodologia / Resultados ................................................................................................. 29 5.1. 5.2. Integrao .................................................................................................................. 29 Plano de controlo interno ........................................................................................... 30 PCI Equipamento ............................................................................................ 30 PCI Meios e reagentes ..................................................................................... 37 PCI Higiene e ambiente................................................................................... 40 PCI Analistas ................................................................................................... 47 PCI Plano de verificao de cumprimento dos mtodos ................................. 48

5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.2.4. 5.2.5. 5.3.

Outras Actividades exercidas .................................................................................... 50 Variabilidade dentro do lote ............................................................................... 51 Variabilidade entre lotes..................................................................................... 52 Desempenho do mtodo analtico ...................................................................... 53

5.3.1. 5.3.2. 5.3.3. 6. 7.

Concluso ......................................................................................................................... 54 Bibliografia....................................................................................................................... 55

Anexos ......................................................................................................................................... i 1. Produtos dos diversos sectores Fbrica de Avanca ....................................................... i 2. Esquema de identificao para bactrias de relevncia para alimentos e ambientes de produo alimentar ................................................................................................................ iii

NDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Exemplo de um tipo de registo possvel para calibrao de equipamentos com temperatura como factor crtico ............................................................................................... 15 Tabela 2 Exemplo de registo de monitorizao de temperatura ........................................... 16 Tabela 3 - Exemplo de tabela de registo de controlo de meios - gua peptonada tamponada 22 Tabela 4 - Exemplo de uma planificao de controlo do ambiente ......................................... 26 Tabela 5 Principais documentos trabalhados na parte de equipamento do PCI .................... 30 Tabela 6 - Mapeamento dos documentos relativos parte de equipamento do PCI ................ 32 Tabela 7 - Plano de controlo interno Equipamento Sala de preparao de meios ............. 34 Tabela 8 - Plano de controlo interno - Equipamento - Sala de microbiologia geral / sala de pesagem Salmonella / sala Salmonella..................................................................................... 36 Tabela 9 - Exemplo dos cdigos de rastreabilidade ................................................................. 37 Tabela 10- Registo de meios preparados e de cruzamento de cdigos entre reagentes e meios preparados ................................................................................................................................ 38 Tabela 11 - Plano de controlo interno - Meios e reagentes ...................................................... 39 Tabela 12 Principais documentos trabalhados na parte de higiene e ambiente do PCI ........ 40 Tabela 13 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala de preparao de meios ..................... 41 Tabela 14 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala de microbiologia geral ....................... 42 Tabela 15 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala de pesagem Salmonella ..................... 43 Tabela 16 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala Salmonella ......................................... 44 Tabela 17 - Plano de controlo interno - Ambiente - Sala de microbiologia geral.................... 45 Tabela 18 - Plano de controlo interno - Ambiente - Sala de pesagem Salmonella / Sala Salmonella ................................................................................................................................ 46 Tabela 19 - Resultados dos diferentes analistas na anlise da mesma amostra ....................... 47 Tabela 20 - Tratamento estatstico dos resultados obtidos na Tabela 19 ................................. 47 Tabela 21 - Exemplos de pontos abordados nas listas de ocorrncias ..................................... 48 Tabela 22 - Local para planos de aco e respectiva avaliao de eficcia existente nas listas de ocorrncias ........................................................................................................................... 49 Tabela 23 - Valores relativos homogeneidade dentro de um lote ......................................... 51

FBRICA DE AVANCA

1. INTRODUO
1.1. NESTL A Nestl uma companhia alimentar com origem na Sua que surgiu em 1867, quando o seu fundador, Henri Nestl, inventou uma farinha lctea para bebs de forma a suprir as carncias da alimentao infantil da poca. Em 1905 fundiu-se com a Anglo-Swiss Condensed Milk Company, data a partir da qual acelerou o seu processo de internacionalizao e diversificao de produo aumentando o seu crescimento interno, acompanhado pela criao e lanamento de novos produtos. Associado ao crescimento interno, tambm houve um grande crescimento externo, atravs da aquisio de empresas e fuses, assim como pela formao de novas fbricas. Desta forma, o grupo Nestl alargou a sua gama de produtos tornando-se actualmente numa das empresas mais importantes do seu sector. 1.2. FBRICA DE AVANCA No incio do sculo XX, o professor Egas Moniz foi o grande impulsionador do lanamento da indstria leiteira em Portugal ao promover, em Avanca, a primeira fbrica de leite em p a Sociedade de Produtos Lcteos, Lda., constituda a 10 de Maro de 1923, que se iria tornar no bero da Nestl Portugal. Em 1933, o professor Egas Moniz, bom conhecedor da vida e obra de Henri Nestl, deu novo passo decisivo para a indstria ao conseguir a participao da Nestl na Sociedade de Produtos Lcteos, obtendo assim o exclusivo de fabricao e venda de produtos Nestl. A Nestl iniciou o seu rpido crescimento e ascenso em Portugal com o lanamento de farinhas infantis e leite condensado. Actualmente a fbrica de Avanca est dividida em vrios sectores, nos quais se produz uma vasta variedade de produtos, como possvel verificar no anexo 1.

2. CONTROLO DE QUALIDADE
2.1. DEFINIO E IMPORTNCIA DA QUALIDADE A qualidade tornou-se uma caracterstica distintiva vital para a competio no mercado de produtos alimentares, de tal forma que o esforo para a obteno de qualidade j no uma escolha mas sim uma obrigao. Hoje em dia o conceito de qualidade abrange uma grande variedade de aspectos dos produtos alimentares. Como consequncia da industrializao e do aumento de escala associado aos sistemas de produo, um acidente de contaminao, por exemplo, pode pr em risco um elevado nmero de consumidores. Assim sendo, deve ser construdo um sistema que previna falhas, em vez de um que as corrija. Em 1990 houve em mdia 120 casos de doena causada por consumo de alimentos por cada 100.000 pessoas em 11 pases Europeus. Outras estimativas indicam que em alguns pases Europeus existem pelo menos 30.000 casos de gastroenterite por cada 1.000.000 pessoas. Face a estes dados, torna-se evidente a necessidade de um controlo adequado da qualidade do processo de fabricao e do produto terminado[1]. Existe um leque de definies para qualidade, no entanto, de uma forma resumida pode dizerse que qualidade corresponder ou exceder as expectativas do consumidor[2]. De referir que segundo a International Organisation of Standardisation (ISO), a definio de qualidade alcanar de forma sustentada a satisfao dos consumidores, juntando o alcance das necessidades e expectativas do consumidor com o compromisso da organizao em executar melhorias contnuas de eficincia e eficcia. 2.2. ATRIBUTOS DE QUALIDADE essencial ter uma viso global clara de quais os atributos que influenciam a percepo de qualidade dos alimentos para controlar e assegurar essa mesma qualidade. Estes atributos podem ser divididos em duas classes, intrnsecos e extrnsecos[3]. 2.2.1. INTRNSECOS Os atributos intrnsecos incluem os aspectos de segurana e sade, tempo de armazenamento e propriedades sensoriais, convenincia e confiana no produto.

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Segurana alimentar e sade os aspectos de sade referem-se composio dos alimentos e dieta. A segurana alimentar refere-se aos requisitos que o alimento tem de apresentar de forma a estar livre de perigos, dentro de um risco aceitvel. Este risco pode ser descrito como a probabilidade e severidade de perigo para a sade humana, isto , um produto pode ser considerado como seguro se os seus riscos forem julgados como aceitveis. Existem vrias fontes de perigos que podem afectar a segurana alimentar, como o crescimento de microrganismos patognicos, a presena de compostos txicos, agentes fsicos, entre outros. Propriedades sensoriais e tempo de armazenamento as propriedades sensoriais (sabor, odor, cor, aparncia, textura, etc.) so determinadas por caractersticas fsicas e qumicas da composio do produto. O tempo de armazenamento pode ser definido como o tempo entre o processamento/empacotamento do produto e o ponto em que este se torna inaceitvel para consumo. Esta inaceitabilidade geralmente o reflexo da reduo das propriedades sensoriais, por exemplo, pela formao de odores desagradveis produzidos pela actividade microbiana. Confiana no produto e convenincia a confiana no produto refere-se concordncia entre a composio do produto e a sua descrio, por exemplo, se est descrito um enriquecimento em vitamina C, a sua concentrao aps processamento, empacotamento e armazenamento deve corresponder descrita na embalagem. A convenincia est relacionada com a facilidade de uso e consumo, logo contribui para a qualidade[2]. 2.2.2. EXTRNSECOS Caractersticas do sistema de produo estas caractersticas referem-se forma como o produto fabricado. Inclui factores como o uso de pesticidas durante o cultivo de vegetais, o tratamento dos animais durante a criao ou o uso de tcnicas de conservao. A forma como estas caractersticas influenciam a aceitao do consumidor bastante complexa. Aspectos ambientais esto relacionados com as implicaes ambientais, como o tipo de embalagem utilizado e gesto dos resduos gerados. Marketing o efeito do marketing num dado produto complexo, podendo determinar outras caractersticas extrnsecas, afectando a qualidade esperada ou a qualidade experienciada[4, 5].

2.3. DEPARTAMENTO DE CONTROLO DE QUALIDADE Como o prprio nome indica, a funo do departamento de controlo de qualidade, assegurar e controlar a qualidade dos produtos e processos de produo. Este controlo geralmente feito da seguinte forma: Estabelecer desempenhos padro Passo 1

Medir o desempenho actual

Passo 2

Comparar o desempenho actual com o desempenho padro

Passo 3

Tomar medidas correctivas (Se necessrio)

Passo 4

Para isto, o departamento de controlo de qualidade tem de efectuar diversas tarefas: Garantia e controlo da qualidade dos produtos, melhoria e controlo dos processos de controlo de qualidade; Recolha de dados e fornecimento de informao relativamente ao desempenho de qualidade; Avaliao dos processos de anlise de forma a estabelecer um controlo de qualidade eficiente e efectivo, como por exemplo, QMS (Quality Management System); Fornecer suporte aos outros departamentos na resoluo de problemas, fazendo reclamaes ou anulando processos; Manter-se a par do conhecimento base relacionado com a gesto da qualidade; Fornecer suporte no melhoramento de programas, tanto a nvel de processos como produtos; Fornecer suporte na definio e implementao de polticas de qualidade. Dado que o controlo de qualidade tem como funo garantir a qualidade dos produtos e dos processos, tambm sua funo a implementao de vrios sistemas de qualidade, como Boas Prticas de Fabricao, Boas Prticas de Higiene, padronizao atravs da ISO (International Standart Organization), HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), Boas Prticas de Laboratrio, etc., sistemas que fornecem orientaes, requisitos legais e normas. Estes

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sistemas de qualidade diferem no seu foco de qualidade (por exemplo, segurana alimentar, garantia dos fornecedores, qualidade total, etc.) e na sua abordagem (foco mais tecnolgico ou focando-se mais na gesto). Uma vez que estes sistemas so diferentes, podem complementarse entre si, cobrindo os diferentes aspectos da qualidade. O controlo de qualidade um processo contnuo de avaliao de desempenho, no entanto, controlar no apenas inspeccionar, mas tambm tomar medidas correctivas quando o desempenho no est em concordncia com as especificaes. O principal objectivo do controlo de qualidade a produo de um produto que cumpre as especificaes dentro de um intervalo de tolerncia[2]. O departamento de controlo de qualidade da Nestl Fbrica de Avanca est dividido em vrios laboratrios: Laboratrio de microbiologia Microbiologia geral Salmonella Anlises microbiolgicas: indicadores, patognicos, etc. Actividade da gua, anlise de protenas, acares, vitaminas, etc. Dimenses do material, condies de impresso, gramagem, espessura, etc. Sabor, cor, odor, aparncia (de matrias primas e produto final), treino de degustadores, etc.

Laboratrio fsico-qumico Laboratrio de material de embalagem

Sala de Degustao

3. LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
Os microrganismos vivem no nosso corpo e no nosso ambiente, logo no surpreendente encontrar vrios tipos destes organismos (leveduras, bolores, bactrias, vrus e protozorios) nos alimentos. A sua presena pode ser malfica (quando causam deteriorao dos alimentos ou doena em quem os consome) ou benfica (quando so utilizados, por exemplo, em fermentaes ou como probiticos). No anexo 2 so fornecidas caractersticas das bactrias de relevncia para alimentos e ambientes de produo alimentar, usadas para a sua identificao. O crescimento microbiano em alimentos bastante complexo, sendo regulado por factores genticos, bioqumicos e ambientais. Esses factores podem ser classificados como intrnsecos ou extrnsecos. As caractersticas dos prprios alimentos so os factores intrnsecos, estes incluem compostos de ocorrncia natural, compostos adicionados como conservantes, o potencial de oxidao reduo, actividade da gua e pH. Os factores extrnsecos so factores externos aos alimentos. A temperatura e composio do ar so os factores que tm maior influncia no crescimento microbiano. A carga microbiolgica dos alimentos tem essencialmente duas consequncias, a deteriorao dos alimentos e a transmisso de doenas. A deteriorao dos alimentos definida por uma mudana de caractersticas que os tornam inaceitveis. Um dos pontos-chave na indstria alimentar a garantia da segurana dos alimentos e uma parte fundamental dessa segurana o controlo microbiolgico dos diferentes componentes envolvidos na produo, desde as matrias-primas at ao produto terminado[6]. O laboratrio de microbiologia tem como funo a execuo de anlises de forma a monitorizar a carga microbiolgica dos vrios produtos (desde matrias primas, produtos em curso de fabricao e produtos terminados) e ambiente de fabricao (gua, ar, amostras de aspiradores, etc.), assim como higiene dos trabalhadores. O laboratrio de microbiologia da fbrica de Avanca encontra-se dividido em duas partes, microbiologia geral e Salmonella. A estrutura de microbiologia geral, e tal como o nome indica, efectua anlises procurando por indicadores microbiolgicos e uma variedade de estirpes de bactrias e fungos. A parte de Salmonella encontra-se parte do laboratrio de microbiologia geral devido s necessidades estruturais que este tipo de anlise requer, evitando uma contaminao cruzada do resto do laboratrio.

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4. PLANO DE CONTROLO INTERNO

Os laboratrios de microbiologia devem implementar um programa de Garantia de Qualidade para ajudar a garantir que os resultados obtidos so os correctos. Todos os mtodos utilizados no laboratrio devem ser includos, tanto quanto possvel, neste programa. Os procedimentos de Garantia de Qualidade e planos de monitorizao devem estar sumariados como um Plano de Controlo Interno, o qual deve estar disponvel para todo o pessoal e deve ser revisto e actualizado regularmente, para corrigir fraquezas e para avaliar a necessidade de substituio de equipamento e formao do pessoal[7]. Alm disso, a implementao e actualizao frequente do plano de controlo interno so essenciais para a obteno de resultados laboratoriais fiveis. Dados relacionados com medies de controlo tm de ser registados, para assegurar uma deteco rpida de desvios e demonstrar que os factores que influenciam os resultados analticos esto sob controlo. Assim, um plano de controlo interno (PCI) entende-se como sendo um conjunto de verificaes conduzidas pelo laboratrio, de forma a assegurar a fiabilidade dos resultados, e deve incluir planos de calibrao de todo o equipamento e instrumentos, de verificao de desempenho de meios e reagentes, de higiene, de avaliao dos analistas e de auditoria aos mtodos para verificar o cumprimento dos mtodos analticos[8]. 4.1. EQUIPAMENTO Deve ser includo no plano de controlo interno o equipamento cujo funcionamento tem impacto directo nos resultados das anlises, tal como estufas, banhos-maria, autoclaves, medidores de pH, etc. Equipamento como vortexs, agitadores, homogeneizadores, hottes, que tm um impacto menor sobre os resultados, tambm podem ser includos no plano de controlo interno, mas no so discutidos em pormenor. Deve existir um plano de calibrao de instrumentos, isto , uma verificao regular do equipamento de medio com padres definidos para assegurar a fiabilidade dos processos e resultados de laboratrio. O plano de controlo interno do equipamento deve conter uma descrio do equipamento e do seu uso, os aspectos crticos da sua utilizao, aspectos de controlo e registo, a pessoa responsvel pelo seu controlo, qual o mtodo utilizado para esse controlo, a frequncia com que efectuado e quais as aces de correco a tomar em caso de desvio. Assim sendo, deve ser criada, e

frequentemente actualizada, documentao que contenha todos os pontos acima mencionados[8]. Cada instrumento tem de ter um calendrio de manuteno e calibrao documentado, descrevendo os procedimentos a ser usados. Alm disso, deve estar disponvel uma folha de registo na qual se deve registar o seguinte: Nome do equipamento; Nome e identificao do fabricante (modelo e nmero de srie); Verso do software (quando aplicvel); Nmero de inventrio nico; Data em que foi colocado em funcionamento; Calendrio de manuteno; Avarias; Reparaes; Servios de contratos externos; Calibraes; Pessoa(s) responsveis. O manual de instrues fornecido pelo fabricante tambm dever estar disponvel para cada item do equipamento Resultados analticos correctos dependem do cumprimento das condies de operao, o que torna necessrio a existncia de registos que controlem estas condies com as seguintes informaes: Identificao do equipamento; Frequncia das verificaes; Valor alvo ou intervalo de tolerncia; Data e assinatura da pessoa que efectuou a verificao; Iniciais da pessoa que efectuou a observao; Uma coluna para aces correctivas no caso de desvios.[7] De seguida fornecida a descrio e forma de utilizao do tipo de equipamento que tem maior influncia nos resultados analticos, assim como os aspectos crticos que devem ser controlados, a forma como deve ser feita a sua monitorizao, respectivos registos e aces que se devem tomar em caso de desvios dos valores estabelecidos.

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4.1.1. ESTUFAS Descrio/uso: As estufas consistem numa cmara isolada que permite a manuteno de uma temperatura desejada em todo o seu volume. Esta temperatura constante um elemento crtico na maioria das anlises microbiolgicas dado que influencia a recuperao e crescimento de microrganismos relevantes. Principal parmetro e importncia de controlo: Um dos principais parmetros, seno o principal, a temperatura. A temperaturas muito baixas ou muito altas os microrganismos em geral no so capazes de crescer, podendo mesmo morrer. A temperatura mnima e mxima difere bastante entre microrganismos. Assim, a temperatura afecta os microrganismos em dois sentidos diferentes, medida que aumenta, as reaces qumicas e enzimticas na clula decorrem a taxas mais rpidas, aumentando a velocidade de crescimento. No entanto, acima de uma certa temperatura os componentes celulares podem ser danificados de forma irreversvel. medida que a temperatura aumenta, dentro de uma certa gama, o crescimento e funes metablicas aumentam, at ao ponto em que comeam a ocorrer reaces de inactivao ou mesmo de desnaturao. Acima deste ponto as funes celulares tornam-se nulas. Por outro lado, a baixas temperaturas a membrana citoplasmtica perde a sua fluidez, ficando com a capacidade de transporte de nutrientes bastante reduzida, impedindo o crescimento dos microrganismos. Para cada microrganismo existe ento uma temperatura mnima, abaixo da qual o crescimento no possvel, uma temperatura ptima, na qual o crescimento mais rpido e uma temperatura mxima, acima da qual no existe crescimento como se pode verificar na Figura 1[9].

Figura 1 - Efeito da temperatura no crescimento microbiano

Aspectos crticos: Se a temperatura ambiente for apenas ligeiramente mais baixa que a temperatura de incubao, a estufa deve estar equipada com um sistema de arrefecimento. Existem gradientes de temperatura no interior das estufas, que devem ser conhecidos e tidos em conta. Se a transferncia de calor for insuficiente podem ocorrer gradientes de temperatura no interior do material incubado. necessrio que a cmara seja alvo de limpeza e desinfeco regulares. As estufas no devem ser completamente cheias porque os meios de cultura iro demorar mais tempo a equilibrar a temperatura e a circulao de ar torna-se reduzida. Monitorizao e registo: Para monitorizar as estufas devem ser utilizados termmetros calibrados independentes do sistema automtico de regulao. A exactido dos instrumentos de medida tem de ser quatro vezes superior (exemplo: para uma exactido requerida de 1C, a exactido do instrumento de medida deve ser 0,25C). necessrio que os termmetros sejam colocados em glicerol para evitar mudanas rpidas de temperatura devido abertura da estufa e a temperatura deve ser registada, pelo menos, uma vez por dia, sendo que a situao ideal seria registo em contnuo com suporte informtico. Aces em caso de desvio: Se forem detectados desvios fora dos limites crticos, as definies da estufa devem ser ajustadas e a temperatura verificada novamente aps um curto perodo de tempo. Se necessrio deve-se recorrer a pessoal qualificado para a reparao do equipamento. Dependendo da extenso do desvio, os resultados podero ter que ser descartados e as anlises repetidas[8]. 4.1.2. BANHO DE GUA COM TERMSTATO Descrio/uso: Banho de gua consiste num contentor cheio de gua mantida a uma temperatura constante regulada por um termstato automtico. A exactido requerida depende do tipo de utilizao (geralmente 1C). Para uma melhor exactido o banho deve estar equipado com um sistema de circulao. Principal parmetro e importncia de controlo: Nos banhos de gua a temperatura o parmetro principal a ter em conta pelas razes j mencionadas anteriormente. Aspectos crticos: Para garantir a temperatura correcta e um tratamento trmico eficiente, necessrio ter sempre lquido suficiente e assegurar que o material est imerso de forma apropriada. necessrio colocar um segundo termmetro num recipiente de referncia com o

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mesmo solvente ou meio para se obter a temperatura real. O banho de gua deve ser limpo e a gua substituda frequentemente. Monitorizao e registo: A monitorizao deve ser efectuada com termmetros calibrados independentes do sistema automtico de regulao e devem ser posicionados de forma a no serem afectados pela resistncia de aquecimento. A monitorizao e registo devem ser feitos pelo menos diariamente. Aces em caso de desvio: Quando se verificarem desvios na temperatura relativa aos limites fixados, devem-se ajustar as definies do aparelho e voltar a verificar a temperatura aps um curto perodo de tempo, recorrendo a pessoal qualificado para a reparao do aparelho quando necessrio. Dependendo da extenso do desvio, os resultados podem ter de ser descartados e as anlises repetidas[8]. 4.1.3. FRIGORFICOS Descrio/uso: Consistem numa cmara isolada que permite manter temperaturas baixas (04,5C) de uma forma estvel em todo o seu volume. So maioritariamente utilizados para armazenamento de meios de cultura e reagentes estreis, amostras e estirpes. Principal parmetro e importncia de controlo: Uma vez que o principal objectivo dos frigorficos o armazenamento (controlo do crescimento microbiano e actividade enzimtica), o principal parmetro a temperatura, mais especificamente a temperatura mnima, pelos motivos anteriormente referidos[9]. Aspectos crticos: A temperatura ambiente alta pode afectar o desempenho dos frigorficos, por isso os aparelhos devem estar colocados em stios protegidos de temperaturas altas e de luz solar directa. A existncia de gradientes de temperatura deve ser considerada e a sua distribuio conhecida. Podem tambm ocorrer gradientes de temperatura no material colocado no frigorfico, promovido pelo enchimento excessivo e de forma incorrecta, impossibilitando a circulao de ar. A cmara do frigorfico deve ser limpa de desinfectada de forma regular. Meios de cultura e reagentes estreis devem ser armazenados separadamente de estirpes. Monitorizao e registo: A monitorizao efectuada recorrendo a termmetros calibrados independentes do sistema automtico de regulao, colocados em glicerol. A monitorizao e respectivos registos devem ser feitos diariamente.

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Aces em caso de desvio: Ao verificar desvios fora do intervalo definido, as definies do equipamento devem ser ajustadas e caso seja necessrio deve-se recorrer a pessoal qualificado para a sua reparao. Dependendo da extenso do desvio pode ser necessria a repetio das anlises[8]. 4.1.4. CONGELADORES Descrio/uso: Os congeladores consistem em cmaras isoladas que permitem baixas temperaturas entre -18C at -80C e as mantm estveis entre 1C da temperatura desejada em todo o seu volume. So utilizados principalmente para o armazenamento de meios e reagentes estreis, amostras e estirpes. Principal parmetro e importncia de controlo: O mesmo que os frigorficos. Aspectos crticos: Temperatura ambiente alta pode afectar o desempenho dos congeladores, devendo ser colocados em stios protegidos de fontes de calor e luz solar directa. Podem existir gradientes de temperatura dentro da cmara, que devem ser medidos e tidos em conta. Deve ser feita uma descongelao frequentemente, assim como limpeza e desinfeco. A colocao do material no congelador deve ser feita tendo em conta as circulaes de ar, no enchendo muito o congelador e deixando espao entre o material. Monitorizao e registo: Tal como os outros equipamentos em que a temperatura um factor crtico, a monitorizao deve ser feita atravs de termmetros calibrados independentes do sistema de controlo automtico. O registo deve ser feito diariamente. Aces em caso de desvio: Se forem detectados desvios fora dos limites crticos, as definies do congelador devem ser ajustadas e a temperatura verificada novamente aps um curto perodo de tempo. Se necessrio deve-se recorrer a pessoal qualificado para a reparao do equipamento. Dependendo da extenso do desvio, os resultados podem ter que ser descartados e as anlises repetidas[8]. 4.1.5. ESTUFAS DE ESTERILIZAO Descrio/uso: Estufas de esterilizao consistem em cmaras isoladas que permitem temperaturas at cerca de 180 1C e a sua conservao em todo o volume da estufa. So utilizadas para esterilizar utenslios de vidro ou metal.

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Principal parmetro e importncia de controlo: Alm de se utilizar a temperatura para melhorar o crescimento microbiano, esta tambm utilizada como forma de esterilizao, sendo uma das formas mais utilizadas. Aps ultrapassar a temperatura mxima anteriormente mencionada as clulas comeam a morrer. A eficcia da esterilizao por calor medida pelo tempo necessrio para que ocorra uma reduo decimal na viabilidade de uma populao microbiana a uma dada temperatura. Esta reduo geralmente denominada por tempo de reduo decimal (D). A relao entre D e temperatura exponencial, assim, ao efectuar um grfico entre o logaritmo de D em funo da temperatura obtm-se uma linha recta para cada temperatura Figura 2. Esse grfico pode ser utilizado para calcular o tempo de processamento trmico necessrio para se alcanar a esterilizao[9].
110 100 90 Fraco Sobrevivente 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 Tempo (min) 50 60 70 80

50C

70C

Tempo de Reduo decimal (D)

Figura 2 - Efeito da temperatura por tempo na viabilidade de bactrias mesfilas

importante ter em conta as bactrias formadoras de esporos. Os esporos so clulas vegetativas de grande resistncia, sendo necessrias temperaturas mais altas para os destruir. Aspectos crticos: A eficincia da esterilizao nas estufas de esterilizao depende do cumprimento dos parmetros de esterilizao (180C durante pelo menos 1,5horas). Para que estas condies sejam cumpridas necessrio ter em conta os gradientes de temperaturas que se formam devido a m instalao ou isolamento. Tambm importante adaptar o tempo de esterilizao ao tipo e quantidade de utenslios que se coloca na estufa, uma vez que baixam a temperatura a que esta se encontra, sendo necessrio um perodo de tempo superior. No se devem esterilizar recipientes volumtricos de vidro em estufas dado que podem ser descalibrados.

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Monitorizao/registo: Tal como indicado anteriormente, para equipamento em que o factor crtico a temperatura, devem ser utilizados termmetros calibrados para a monitorizao. Estes devem ser colocados em areia para evitar flutuaes de temperatura quando a porta da estufa aberta. Aces em caso de desvio: Se forem observados desvios na temperatura devem ser tomadas medidas de correco apropriadas. No caso da esterilizao de utenslios a forma mais fcil a repetio do ciclo de esterilizao[8]. 4.1.6. AUTOCLAVES Descrio/uso: Os autoclaves so utilizados para esterilizar utenslios, meios de cultura e reagentes usados em anlises microbiolgicas, assim como para a sua descontaminao aps uso. Devem estar equipados com, pelo menos, uma vlvula de segurana, um dreno e um termmetro colocado no interior da cmara da autoclave. Um segundo termmetro deve ser colocado directamente no produto a esterilizar. Principal parmetro e importncia de controlo: Para a destruio dos esporos referidos anteriormente so necessrias temperaturas superiores a 100C. Para tal pode ser utilizado calor hmido, por via de um autoclave, no qual a esterilizao se faz de uma forma geral a 121C durante 15 minutos. No entanto necessrio tomar algumas precaues, uma vez que ao esterilizar produtos volumosos, a transferncia de calor para o interior retardada e o tempo total de aquecimento deve ser estendido para assegurar que todo o objecto est a 121C durante 10-15 minutos. Tambm deve ser tido em ateno que ao esterilizar meios de cultura, temperaturas excessivas podem destruir os nutrientes. De forma a se conseguir uma esterilizao eficaz sem grandes danos para a constituio dos meios de cultura aconselhvel recorrer ao clculo do F0, que tem em conta o atraso do aquecimento do meio de cultura em relao cmara do autoclave assim como a temperatura mxima do meio de cultura em questo para que no haja degradao do mesmo[9]. Aspectos crticos: Podem ocorrer gradientes de temperatura se o autoclave no for purgado, de forma apropriada, com vapor saturado. Se tal acontecer a esterilizao pode variar no mesmo ciclo de autoclavagem. A esterilizao depende do volume a esterilizar, do tipo de recipientes e de fenmenos de transferncia de calor. recomendado o uso de grupos de recipientes de tamanho semelhante em cada ciclo para evitar grandes diferenas e obter resultados optimizados. No se deve esterilizar meios de cultura frescos juntamente com

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meios contaminados para evitar contaminao cruzada. Os programas da autoclave devem ser ajustados ao tipo de meio a esterilizar atravs do clculo F0, evitando o sobreaquecimento dos meios e consequente deteriorao dos mesmos. Monitorizao/registo: A monitorizao deve ser efectuada utilizando o termmetro interno, e se possvel um segundo termmetro inserido num recipiente representativo colocado no ponto mais frio do autoclave. Devem ser usados regularmente (exemplo: semanalmente) indicadores de fim de esterilizao ou indicadores biolgicos. O registo deve ser feito em cada ciclo de esterilizao. Aces em caso de desvio: necessria a aplicao de medidas correctivas no caso de se verificarem desvios, estas medidas dependem do tipo e extenso do desvio. Por questes de segurana, apenas pessoal qualificado deve efectuar a manuteno e reparao dos autoclaves[8]. Na Tabela 1 dado um exemplo de como pode ser feito o registo da calibrao de equipamentos em que o factor crtico a temperatura e na Tabela 2 dado um exemplo de como pode ser feito o registo da monitorizao da temperatura.
Tabela 1 - Exemplo de um tipo de registo possvel para calibrao de equipamentos com temperatura como factor crtico Equipamento:_____________ Data Temperatura Requerida:______ Temperatura termmetro de calibrao Responsvel:___________ Observaes Visto

Temperatura determinada (exibida)

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Tabela 2 Exemplo de registo de monitorizao de temperatura

Registo N.: . TEMPERATURA ALVO: ............ MS/ANO...............................
Exactido necessria(especificada ou de uso): +/- 1CFrequncia: todo o dia de trabalho

Temperatura 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728293031 DIA

4.1.7. MEDIDOR DE pH Descrio/uso: Um medidor de pH um aparelho que mede a actividade de ies de hidrognio numa soluo a uma dada temperatura, utilizando uma sonda de leitura e um elctrodo de referncia, os quais so colocados na amostra. Os elctrodos de pH devem ser capazes de medir com uma exactido de 0.1 unidades de pH. Estes medidores so utilizados para a medio de pH de meios de cultura, reagentes, amostras ou diluies iniciais. O ajuste do pH deve ser feito atravs da adio de uma soluo de 40 g/l (1M) de NaOH ou 36,5 (1M) de HCl. Principal parmetro e importncia de controlo: Cada microrganismo tem um intervalo de pH no qual o seu crescimento possvel e geralmente apresenta uma curva de crescimento bem definida. A maior parte dos microrganismos apresentam um alcance de crescimento de 2 a 3 unidades de pH. O pH do meio vai influenciar as taxas de actuao das enzimas da clula, assim como a funcionalidade das protenas membranares[9]. Aspectos crticos: bastante importante a utilizao de meios e reagentes com o pH correcto, dado que determina o crescimento dos microrganismos. Para tal necessrio considerar

vrios aspectos ao elaborar um plano de controlo interno, tal como a temperatura, uma vez que influencia o pH. Diferentes tipos de elctrodos podem necessitar de diferentes condies de armazenamento, sendo necessrio seguir rigorosamente as instrues do fabricante. Aps

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cada utilizao os elctrodos devem ser enxaguados para eliminar resduos, e depois de uso prolongado pode ser necessria uma limpeza mais pormenorizada e regenerao. Monitorizao/registo: O medidor de pH deve ser calibrado diariamente antes de ser usado com pelo menos duas solues de tampo padro (geralmente pH 4,0 e pH 7,0 a 20C). Se forem feitas muitas medies, necessrio efectuar verificaes intermdias da calibrao. Aces em caso de desvio: Em caso de serem observados desvios, necessrio efectuar ajustes. Se os ajustes e uma limpeza minuciosa no resolverem o problema, deve-se trocar os elctrodos de pH[8]. 4.1.8. BALANAS Descrio/uso: As balanas so aparelhos utilizados para a pesagem de meios de cultura desidratados, reagentes e amostras. Principal parmetro e importncia de controlo: necessria a pesagem correcta dos meios meios de cultura para que haja uma quantidade correcta de componentes necessrios ao crescimento microbiano (discutido mais frente em meios de cultura). Aspectos crticos: O uso de quantidades correctas de meios e reagentes essencial para garantir a sua qualidade. Como tal, a pesagem de quantidades correctas de amostras analticas fundamental para a obteno de resultados correctos. As balanas devem ser instaladas num suporte horizontal estvel protegido de vibraes. importante utilizar uma balana apropriada quantidade a ser pesada e limpar o prato da balana para evitar contacto de resduos com o mecanismo interno da balana. Monitorizao/registo: Deve-se verificar a exactido das balanas regularmente por calibrao com pesos padro que so fornecidos pelos fornecedores e registar os resultados. Aces em caso de desvio: Pelo menos uma vez por ano, todo o intervalo da balana deve ser monitorizado, os mecanismos limpos e verificados por uma pessoa qualificada. Deve-se ajustar e recalibrar sempre que necessrio[8]. 4.1.9. PIPETAS E OUTROS INSTRUMENTOS VOLUMTRICOS Descrio/uso: As pipetas e outros instrumentos volumtricos so utilizados para distribuir volumes especficos de lquidos. Em certos casos, e dependendo da exactido necessria, so

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utilizados bales volumtricos. As pipetas so utilizadas para preparar diluies e inoculaes. Principal parmetro e importncia de controlo: Tal como nas balanas, a medio correcta de volumes utilizados na preparao dos meios tem um impacto directo na concentrao dos componentes presentes no meio. Alm disso, o uso de quantidades correctas nas diluies de amostras permite a obteno de resultados precisos. Aspectos crticos: A distribuio de volumes correctos de meios, diluentes ou reagentes durante a preparao importante para assegurar a qualidade das anlises subsequentes e para a obteno de resultados fiveis. Devem-se utilizar as pipetas adequadas ao volume a medir. Em aparelhos de medio automtica ou micropipetas, deve-se garantir uma instalao e manuteno de acordo com as recomendaes do fabricante. Monitorizao/registos: O equipamento deve ser calibrado regularmente, especialmente se tiver de ser desmontado para ser limpo ou esterilizado. As micropipetas automticas devem ser calibradas regularmente. As pipetas graduadas (plstico ou vidro) utilizadas para diluies no necessitam calibrao. Aces em caso de desvio: Ajustar e recalibrar. Pode ser necessrio recorrer a uma pessoa qualificada[8]. Deve ento existir uma planificao que apresente todo o equipamento que tem influncia nos resultados analticos, nomeie quais os parmetros crticos associados, qual a pessoa responsvel pela sua manuteno, o mtodo aplicado para o seu controlo, que indique a frequncia com que esse controlo deve ser feito e as aces a serem tomadas quando os valores esto desviados do valor padro definido. 4.2. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES Os meios de cultura e os reagentes utilizados em anlises microbiolgicas tm um papel essencial na obteno de resultados correctos e fiveis. Assim sendo, devem ser preparados com bastante cuidado, e a sua qualidade assegurada e controlada. Devem-se obter meios de cultura desidratados e produtos prontos a usar a partir de fornecedores que garantam princpios modernos de garantia de qualidade. De qualquer forma,

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importante efectuar verificaes espordicas de lotes comprados, em particular de meios de cultura. Vrios aspectos so crticos para a qualidade dos meios preparados e reagentes e devem ser abordados no plano de controlo interno, sendo exemplos a recepo e o armazenamento, a preparao e esterilizao, a utilizao e a verificao da qualidade. Em todas estas fases devem existir aspectos crticos a ser controlados, monitorizao e os devidos registos e aces previamente definidas em caso de desvio. Devem ainda existir planos de rastreabilidade que permitam identificar a origem, em caso de se detectarem problemas, dos meios e reagentes[8]. Detalhes para diferentes passos so desenvolvidos a seguir. Principal parmetro e importncia de controlo: Para que os microrganismos cresam necessrio que estes tenham disponveis diferentes monmeros (ou os seus precursores), ao conjunto destas substncias requeridas para o crescimento chama-se nutrientes. Diferentes microrganismos necessitam diferentes complementos nutricionais e nem todos os nutrientes so necessrios na mesma quantidade. Nutrientes Todas as clulas necessitam de carbono, uma vez que o composto principal em todas as classes de macromolculas. A seguir ao carbono, o elemento mais abundante na clula o azoto. Uma clula bacteriana constituda por cerca de 12% de azoto, sendo um elemento chave em protenas, cidos nucleicos e outros constituintes celulares. Desta forma fundamental a presena destes elementos nos meios de cultura. Alm dos elementos j referidos, existem outros essenciais, mas que so requeridos em menores quantidades. Estes elementos so P, S, K, Mg, Ca e Na. O fsforo necessrio para a sntese de cidos nucleicos e fosfolpidos. O enxofre requerido pelo seu papel estrutural nos aminocidos cistena e metionina e pela sua presena em vrias vitaminas. A importncia do potssio est relacionada com a sua utilizao por parte de muitas enzimas. O magnsio funciona como estabilizador dos ribossomas, membranas e cidos nucleicos, alm de tambm ser necessrio para a actividade de algumas enzimas. O clcio ajuda a estabilizar a parede celular e desempenha um papel fulcral na estabilidade trmica dos endosporos. Por fim, o sdio tipicamente um reflexo do habitat onde os microrganismos geralmente se encontram, havendo casos em que so necessrias grandes quantidades de Na e outros casos em que acontece o contrrio. ainda necessria a presena de vestgios de ferro e outros metais. So

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ainda necessrios factores de crescimento, como por exemplo, vitaminas, aminocidos, purinas e pirimidinas. A combinao de todos estes elementos, juntamente com pH, aw e potencial redox torna os meios de cultura ferramentas essenciais na recuperao de microrganismos, de forma selectiva ou apenas como forma de enriquecimento para obteno de nmeros quantificveis[9]. 4.2.1. COMPRA, RECEPO E ARMAZENAMENTO Aspectos crticos: A qualidade do meio de cultura deve ser assegurada desde os fornecedores at o seu uso final os fornecedores de meios de cultura prontos a usar devem providenciar certificados de qualidade dos meios que fornecem, o que elimina a necessidade do laboratrio efectuar testes extensivos aos meios. No entanto, deve-se assegurar que as condies de armazenamento so adequadas dado que estes meios so higroscpios e necessitam cuidados especiais com a absoro de humidade. Tanto os recipientes abertos como os fechados devem ser armazenados em condies apropriadas (temperatura, humidade, proteco da luz, perodo de armazenamento, etc.). Monitorizao: fundamental cruzar a conformidade da composio do meio de cultura e reagentes, com o descrito nos protocolos antes de fazer as encomendas. Em caso de desvios significativos na composio do produto, escolher produtos de outro fornecedor. Os meios e reagentes devem ser inspeccionados visualmente durante a recepo, alm de registar o nmero dos lotes e datas de validade para assegurar uma gesto adequada do stock. necessrio monitorizar os parmetros de armazenamento, como o tempo e a temperatura. Aces em caso de desvio: As unidades danificadas devem ser devolvidas e para produtos prximos do fim da validade, necessrio assegurar o desempenho dos meios (ou reagentes) antes de os usar para anlises de rotina utilizando estirpes de referncia, positivas e negativas[8]. 4.2.2. GUA Aspectos crticos: A gua um componente muito crtico que influencia o resultado das anlises. necessrio usar gua destilada ou de qualidade equivalente e esta deve ser armazenada em recipientes feitos com material inerte como vidro neutro ou polietileno livre de inibidores.

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Monitorizao e registo: A gua destilada deve ter uma resistncia elctrica de pelo menos 300000 cm. necessrio inspeccionar visualmente, procurando depsitos e em caso de dvida efectuar anlises para inibidores como metais pesados[8]. 4.2.3. PREPARAO E ESTERILIZAO Para que se obtenham resultados fiveis, deve haver uma preparao e esterilizao correcta. Para que isso acontea necessrio ter em ateno vrios aspectos crticos. Aspectos crticos: No utilizar meios de cultura desidratados ou qumicos que apresentem mudana de cor ou aparncia tais como escurecimento, endurecimento ou com formao de aglomerados. Evitar aglutinao ao dissolver o meio. Deve-se permitir que meios que contenham agar embebedam apropriadamente antes do aquecimento e deve haver uma agitao durante o aquecimento para evitar sobreaquecimento local. Se necessrio, o pH deve ser ajustado para que aps a esterilizao e arrefecimento o meio de cultura e os reagentes (se aplicvel) estejam com o pH correcto. Durante a esterilizao ocorrem algumas perdas de lquido, logo necessrio ter em conta essas perdas. fundamental evitar esterilizao insuficiente mas tambm sobreaquecimento, pelo que se deve ter cuidado em carregar correctamente os autoclaves e fazer uma escolha adaptada dos programas de autoclavagem em relao ao meio a esterilizar. Deve-se remover os produtos esterilizados do autoclave o mais rapidamente possvel para evitar exposio prolongada a altas temperaturas. Monitorizao e registo: Deve-se verificar a aparncia do meio de cultura desidratado e outros ingredientes, classificar e datar o material esterilizado para evitar confuses e assegurar gesto de stock adequada[8]. A qualidade e pureza de todos os reagentes qumicos e solventes devem ser apropriadas ao mtodo a ser executado. Os meios e reagentes preparados devem estar identificados com as seguintes informaes: Data de preparao; Concentrao; Data de validade; Avisos das precaues de segurana necessrias; Condies de armazenamento; Referncia pessoa que o preparou.

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As solues volumtricas devem ser verificadas por um mtodo apropriado, como parte do plano de controlo interno[7]. Na Tabela 3 possvel ver um exemplo de como pode ser feito o registo dos meios preparados.
Tabela 3 - Exemplo de tabela de registo de controlo de meios - gua peptonada tamponada

Meio de cultura desidratado: gua peptonada tamponada Preparao: Dissolver a quantidade de meio apropriada na quantidade de gua necessria, aquecer se necessrio. pH final: 7,2+/-0,2 (a 25C)
Data preparao Responsvel Fornecedor Lote Quantidade preparada Concentrao Autoclave: n esterilizao pH final

Aces em caso de desvio: Descartar meios de cultura e reagentes que no cumprirem os requisitos[8]. 4.2.4. USO DE MEIOS DE CULTURA E REAGENTES ESTERILIZADOS Aspectos crticos: Aps a esterilizao, os meios de cultura e, alguns reagentes extensos, podem ser utilizados de vrias formas em diferentes perodos de tempo. Os aspectos crticos podem variar dependendo do item considerado. Os meios de cultura e reagentes que tm de ser armazenados a temperaturas de refrigerao devem ser equilibrados at a temperatura ambiente antes de serem usados. Para liquefazer o meio solidificado, deve ser utilizado um banho de gua a ferver ou um microondas. Deve-se evitar o sobreaquecimento dos meios, removendo os recipientes assim que o agar estiver liquefeito e colocando-os num banho de gua com termstato, controlado a 461C antes de usar. Uma vez liquefeito, no se deve repetir este procedimento e as sobras devem ser descartadas.

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Os suplementos sensveis ao calor devem ser adicionados ao meio quando este estiver arrefecido a 461C. Deve-se ter ateno e adicionar apenas suplementos que tenham sido equilibrados para a temperatura ambiente, dado que solues frias podem levar gelificao, e assim, a uma distribuio desigual do suplemento. Monitorizao e registo: Antes de usar, necessrio verificar visualmente a aparncia de meios e reagentes armazenados, procurando particularmente por dessecao de meios slidos, evaporao de solues lquidas, mudanas de cor, formao de precipitados, sinais de crescimento que indiquem contaminaes, etc. [8] A esterilidade dos meios de cultura e diluentes deve ser verificada sistematicamente. Para os meios de cultura, devem-se incubar as placas de meios nas mesmas condies nas quais so geralmente utilizados. No caso dos diluentes, devem ser colocados em meio de cultura e de seguida incubados. Em ambos os casos deve-se verificar se ocorreu crescimento microbiano no final do tempo de incubao[10]. Aces em caso de desvio: Descartar meios de cultura e reagentes que apresentem desvios[8]. 4.2.5. QUALIDADE DE MEIOS DE CULTURA E REAGENTES A qualidade de meios de cultura e reagentes usados essencial nas anlises microbiolgicas. Esta qualidade assegurada a diferentes nveis: procedimentos de Garantia de Qualidade e Controlo de Qualidade ao nvel do fornecedor e preparao, armazenamento e utilizao aplicando Boas Prticas de Laboratrio e cumprindo os aspectos crticos delineados anteriormente. A qualidade dos meios de cultura e reagentes utilizados pode ser verificada utilizando diferentes abordagens: Verificao da qualidade de lotes que so recepcionados. Verificao de meios preparados e reagentes utilizando estirpes positivas/negativas ou amostras contaminadas/preparadas regularmente. Controle de qualidade sistemtico e liberao de lotes preparados para utilizao em anlises de rotina. As duas primeiras alternativas so abordagens teis e frequentemente implementadas em combinao em laboratrios para demonstrar o desempenho do mtodo analtico de anlise

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microbiolgica. A ltima alternativa requer uma carga de trabalho elevada, muito ineficiente e no corresponde a princpios modernos de garantia de qualidade no laboratrio. A primeira aplicada frequentemente em etapas nicas de anlise onde, por exemplo, utilizado apenas um meio. O segundo pode ser bastante til para demonstrar o desempenho de um mtodo utilizando uma sequncia de meios diferentes, como cultura de prenriquecimento, enriquecimento e seleco. Em ambos os casos, dados adicionais registados e medidas de controlo (p. ex. pH do meio preparado, condies de esterilizao, condies de incubao) permitem a fiabilidade do trabalho analtico a ser demonstrado. A melhor forma de verificar a qualidade e desempenho de meios de cultura e de reagentes a utilizao de estirpes conhecidas como controlo positivo e negativo. Estes testes, quando efectuados em condies controladas e aplicando boas prticas de laboratrio no contribuem para o risco de contaminao cruzada do laboratrio e da fbrica. O seguimento destas prticas tambm evita a obteno de falsos positivos ao analisar amostras de rotina. Para evitar contaminaes cruzadas, particularmente importante efectuar estas verificaes seguindo a anlise de rotina completa. As placas e recipientes utilizados nestas verificaes devem ser claramente classificados e identificados. Estirpes positivas so usadas para demonstrar a habilidade do meio selectivo suportar o seu crescimento e mostrar as reaces caractersticas (exemplo: S. aureus em Baird-Parker ou agar RPF ou teste da catalase). Estirpes negativas so usadas para demonstrar a habilidade do meio selectivo suprimir ou inibir o seu crescimento e para mostrar as reaces caractersticas de presena/ausncia (exemplo: Pseudomonas spp. em VRBG e para o teste da oxidase). Suspenses diludas ou amostras comerciais que contenham baixos nveis de clulas (como cpsulas de Salmonella) podem ser usadas para meios de cultura utilizados em mtodos de deteco de patognicos[8]. 4.3. HIGIENE A higiene do ambiente do laboratrio e das superfcies das bancadas um elemento muito importante das boas prticas de laboratrio. Inclui elementos diferentes como: Aplicao de tcnicas de trabalho em asspsia.

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Limpeza e desinfeco das superfcies de trabalho, pelo menos antes e depois de efectuar anlises, e particularmente aps derrame de material contaminado. Limpeza e desinfeco, se necessrio, dos sistemas de ventilao ou ar condicionado, banhos de gua, incubadores, frigorficos, etc. Assegurar a qualidade do ar tomando as medidas apropriadas como evitar correntes de ar (fechar portas e janelas), manuteno e substituio de filtros de hottes e cmaras de fluxo laminar, se necessrio. A qualidade microbiolgica de superfcies e do ar (ter em conta o ar condicionado e respectivos filtros) deve ser monitorizada regularmente. Eliminao de resduos e produtos testados[8]. Para a desinfeco mencionada recorre-se a desinfectantes, que so qumicos utilizados para matar microrganismos, mas no necessariamente esporos, e so utilizados em objectos inanimados. Por exemplo, desinfectantes como etanol e detergentes catinios so utilizados para descontaminar cho, mesas, superfcies de bancadas, etc. Podem actuar de vrias formas, sendo as mais comuns, a disrupo das membranas celulares, a dissoluo de lpidos e desnaturao de protenas ou actuando como agentes oxidantes[11]. Para efectuar o controlo da qualidade microbiolgica do ar utiliza-se o mtodo de sedimentao, que se baseia na contagem de microrganismos que se acumulam na superfcie de um meio de cultura de agar (numa caixa de Petri aberta) durante um determinado perodo de tempo (geralmente 15 minutos). uma forma passiva de amostragem que recolhe principalmente partculas pesadas. A placa no deve ser colocada sob luz directa nem numa superfcie quente. Aps o tempo de amostragem terminar, deve-se fechar a caixa e incubar[12]. O controlo da qualidade microbiolgica das superfcies pode ser feito atravs de trs mtodos: Placas de contacto so indicadas para superfcies lisas, secas e no porosas (p. ex. equipamento de linha) e no devem ser usadas em superfcies muito contaminadas; Zaragatoas de algodo so indicadas para reas relativamente inacessveis (p. ex. fendas, cantos e rachaduras) ou superfcies totais de equipamentos pequenos;

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Esponjas so indicadas para grandes superfcies que podem estar fortemente contaminadas (p. ex. cho, paredes). Com estes mtodos possvel (semi-)quantificar nveis microbiolgicos nas superfcies. O meio de cultura para a contagem deve ser seleccionado de acordo com os microrganismos alvo[11]. Devem ser estabelecidos horrios regulares e sistemticos para manuteno, limpeza e desinfeco, incluindo monitorizao. Devem ser definidas aces correctivas em caso de desvios[8]. Alm da limpeza e higienizao tambm necessrio efectuar um plano de controlo do ambiente que identifique quais os locais crticos que justifiquem este controlo, qual o mtodo a ser aplicado, a frequncia, a pessoa responsvel e o devido registo. Na Tabela 4 possvel ver uma planificao deste tipo de controlo.
Tabela 4 - Exemplo de uma planificao de controlo do ambiente

Local

Mtodo de anlise

Frequncia

Responsvel

Documento de registo

Ar do laboratrio Ar das estufas gua dos banhos Filtro da cmara de fluxo laminar Ar da cmara de fluxo laminar Hottes

Placa de sedimentao Placa de sedimentao Deteco de E. coli Anlise microbiolgica do filtro Sedimentao Sedimentao

Semanalmente Semanalmente Semanalmente 1x3meses

Analista Analista Analista Analista

Diariamente Diariamente

Analista Analista

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4.4. ANALISTAS feita uma verificao do desempenho dos analistas, analisando a preciso, repetibilidade e reprodutibilidade, para assegurar que os resultados so fiveis e reprodutveis, atravs da monitorizao de resultados e verificando a repetio de resultados para a mesma amostra. A preciso entende-se como sendo o grau de concordncia entre resultados de testes independentes, obtidos sob condies estipuladas. (ISO 5725-1). A repetibilidade corresponde preciso sob condies de repetibilidade, isto , representa a variabilidade esperada entre resultados quando uma amostra analisada em duplicado. A reprodutibilidade intermdia, representa a variabilidade de resultados independentes obtidos por analistas diferentes, durante um perodo de tempo estendido, utilizando equipamentos diferentes num nico laboratrio (variaes dentro do laboratrio). Existe ainda a reprodutibilidade, que representa a variabilidade de resultados independentes obtidos em laboratrios diferentes, em dias diferentes, com analistas diferentes, calibraes diferentes e equipamentos diferentes (variao entre laboratrios). Isto feito atravs de testes de proficincia e permite verificar a necessidade de formao e treino adequado dos analistas[13]. Os testes de proficincia so testes colaborativos inter-laboratrios testes P, em que desempenhos inadequados em testes particulares tm de ser seguidos posteriormente e necessrio efectuar aces correctivas[7]. Estes testes tm vrios objectivos: Fornecer uma das ferramentas para avaliar o laboratrio; Identificar problemas no laboratrio e iniciar aces para os corrigir; Providenciar uma ferramenta de controlo externa de forma a ajudar gesto e melhoria da qualidade dos dados analticos e mtodos; Providenciar um certificado de Proficincia necessrio ao processo de acreditao. De uma forma sumarizada, feita uma (ou vrias) anlise a amostras com concentrao de microrganismos conhecida (amostras de referncia) e os resultados obtidos so comparados com o valor de referncia. Todos os maus desempenhos devem ser alvo de estudo, determinando o que est errado, implementando aces correctivas e acompanhando a eficcia dessas mesmas aces[14].

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4.5. PLANO DE VERIFICAO DE CUMPRIMENTO DOS MTODOS A existncia de um plano de auditorias internas necessria, elaborando listas de ocorrncias, documentos de registo, entre outros, para assegurar o cumprimento dos mtodos e protocolos estipulados e para preparao para auditorias externas. Devem ser levadas a cabo, pelo chefe ou supervisor do laboratrio, auditorias internas regulares, nas quais se deve verificar a organizao, procedimentos e resultados. As auditorias devem incluir: Registos de manuteno e limpeza; Uso correcto dos cadernos de laboratrio; Auditoria completa a um ou mais mtodos analticos; Registos de calibrao de instrumentos; Registos de monitorizao das condies de operao[7]. Estas auditorias aos mtodos analticos tm como objectivo identificar incumprimentos e falhas na execuo dos diversos protocolos efectuados no laboratrio, estabelecer planos de aco para corrigir essas falhas e fazer um acompanhamento da eficcia das medidas aplicadas. Ao efectuar a auditoria ao mtodo analtico h vrios factores a ter em conta, nomeadamente o cumprimento das medidas de segurana associadas ao mtodo em questo (exemplo: pesagem dos meios na hotte ou utilizao de luvas no manuseamento de alguns reagentes), seguimento correcto do protocolo (exemplo: cumprimento dos tempos e temperaturas de incubao, aplicao de boas prticas de laboratrio), verificar a execuo dos analistas (exemplo: repetibilidade e reprodutibilidade intermdia) e assegurar que o plano de controlo interno est a ser cumprido (exemplo: verificar o preenchimento correcto das folhas de registo de temperaturas das estufas ou registos de calibrao de balanas). Nota: Este tipo de verificao deveria ser efectuado por pessoas exteriores ao departamento de controlo de qualidade, mas no caso da Fbrica de Avanca, tem de ser levado a cabo pelos chefes de laboratrio uma vez que no existe mais pessoal qualificado para este efeito. No entanto, esta situao colmatada pelas auditorias frequentes efectuadas por auditores especializados provenientes dos laboratrios regionais.

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FBRICA DE AVANCA

5. METODOLOGIA / RESULTADOS
5.1. INTEGRAO Este estgio iniciou-se com a integrao na equipa do controlo de qualidade e com o conhecimento do tipo de trabalho realizado neste departamento, assim como as metodologias necessrias realizao desse mesmo trabalho. Assim, de forma a aprender e entender os diferentes protocolos utilizados frequentemente nas anlises microbiolgicas, o trabalho inicial passou pela traduo e actualizao de todos os protocolos utilizados neste laboratrio. Este trabalho tambm permitiu a melhor compreenso e facilidade de consulta dos protocolos por parte dos analistas, dado que alguns deles apresentam alguma dificuldade com a lngua inglesa. Apesar de em auditorias apenas ser exigido a existncia dos protocolos em suporte fsico, independentemente de ser em ingls ou portugus, de todo preferencial que estes se encontrem na lngua portuguesa. De seguida so apresentados os protocolos trabalhados: Tcnicas microbiolgicas Contagem de aerbios mesofilos Deteco de Enterobacteriaceae MPN mtodo reduzido Deteco e contagem de coliformes Deteco e contagem de Escherichia coli presuntiva MPN Deteco de Salmonella Esporos bacterianos Contagem de Clostridium perfringens Contagem de presumveis Bacillus cereus Contagem de leveduras e bolores Deteco de Enterobacter sakazakii Deteco e contagem de Staphilococci coagulase positiva Deteco de Enterobacteriaceae contagem padro Deteco de Enterobacteriaceae MPN padro Contagem de bactrias probiticas Microrganismos do ar Anlise microbiolgica de superfcies Leites em p e produtos similares exame microbiolgico Amostragem, manuseamento e preparao de amostras para anlises microbiolgicas

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Plano de controlo interno para laboratrios de microbiologia Filtrao de guas por membrana guas Nestl deteco e contagem de Enterococci intestinais guas Nestl contagem de microrganismos cultivveis

Terminado o conhecimento terico iniciou-se a aplicao prtica dos contedos assimilados. Nesta parte foram abordadas as vrias componentes das anlises microbiolgicas, efectuando a preparao dos materiais e instrumentos, a preparao de meios de cultura e diluentes e execuo das anlises microbiolgicas propriamente ditas. Este trabalho, aprendido nos primeiros meses de estgio, foi sendo realizado ao longo de todo o tempo de estgio de forma a ajudar a escoar o volume de trabalho muitas vezes elevado. Estando entendido o funcionamento do departamento do controlo de qualidade, e mais especificamente do laboratrio de microbiologia, foi realizado o estudo do plano de controlo interno existente, efectuando um mapeamento de todos os documentos relativos ao plano em funcionamento equipamento; meios e reagentes; higiene. Este mapeamento permitiu identificar quais os documentos com necessidade de actualizao e quais os documentos em falta. 5.2. PLANO DE CONTROLO INTERNO 5.2.1. PCI EQUIPAMENTO Aps a identificao atrs referida, iniciou-se o trabalho de actualizao e criao dos documentos essenciais implementao do plano de controlo interno relativo parte de equipamento. A Tabela 5 permite ver os documentos criados ou alvo de maiores actualizaes, alm dos documentos de registo correspondentes.
Tabela 5 Principais documentos trabalhados na parte de equipamento do PCI

Equipamento Criao Instruo de controlo de tempos e temperaturas de incubao para diferentes microrganismos Actualizao Instruo de manuteno de Autoclaves Instruo de operao de Autoclaves Instruo de operao, manuteno e verificao do stomacher

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FBRICA DE AVANCA

Instruo de operao de balanas Instruo de verificao e manuteno de balanas Plano de manuteno do equipamento da sala de preparao de meios Plano de manuteno do equipamento da sala de microbiologia geral

Terminada a documentao que serve de suporte a esta parte do plano de controlo interno, a qual se encontra mapeada na Tabela 6, em que os AVAxxxx correspondem codificao dos documentos. Os prximos passos consistiram na implementao das modificaes efectuadas e na elaborao do plano propiamente dito, o qual pode ser visualizado nas Tabelas 7 e 8. Ainda na parte de equipamento do plano de controlo interno, foi realizado um estudo terico em como ajustar os programas dos autoclaves (atravs do clculo de F0) aos meios de cultura a esterilizar. Com este estudo foi possvel determinar a forma de calcular este ajuste, o qual se inicia com a determinao do ponto mais frio do autoclave. Estando esse ponto determinado, a fase seguinte consiste no registo do comportamento da temperatura com as diferentes configuraes de carga utilizadas, assim como com os diferentes meios de cultura. Com esses registos possvel contabilizar o efeito do aquecimento e arrefecimento do autoclave, e consequentemente do meio de cultura, no resultado da esterilizao. Este ajuste permite determinar o tempo a 121C a que o aquecimento/arrefecimento corresponde de forma a que o tempo total a 121C a que o meio exposto seja reduzido No entanto, para a determinao do ponto mais frio, necessrio recorrer a termopares espalhados pelo interior do autoclave, e como este material no estava disponvel, no foi possvel prosseguir com este estudo.

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Tabela 6 - Mapeamento dos documentos relativos parte de equipamento do PCI

Equipamento Sala de preparao de meios Balana Toledo Banho-maria (Memmert W8 14; Salvis WKV 25E) Dispensador (Omnispense) Estufa (ST5050) Frigorifico (Bosh) Medidor de pH Autoclave (Fedegari) Autoclave (ELV3870 1&2) Millipore Elix Hotte Placas de aquecimento (1;2;3) Sala de microbiologia geral Balana (PJ4000) Balana (PM2000) Banho-maria (WB14 44C) Banho-maria (Julabo 20B 46C) Estufas (Heraeus: B5042; B5050; B5090E) Frigorifico (Liebherr) Ar Condicionado (Carrier) Microscpio (Nikon) Stomacher (Starblender LB400)

Instruo de Operao AVA7042.02

Instruo de Manuteno AVA7070.00

Plano de Manuteno

Registo AVA7311.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7311.00 AVA7513.00 AVA7312.00 AVA7313.00 AVA7249.00 AVA7377.01 AVA7377.01 AVA7311.00 AVA7311.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7312.00 AVA7313.00 -

AVA7385.00 AVA7352.01 AVA7389.00 AVA7260.01 AVA7351.01 AVA7388.00 AVA7199.00 AVA7258.00 AVA7379.01 AVA7392.00 AVA7042.00 AVA7391.00 AVA7070.00 AVA7328.01

AVA7385.00 AVA7348.00 AVA7371.00 AVA7198.00 AVA7199.00 AVA7363.00 AVA7365.01 AVA7326.00

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FBRICA DE AVANCA

Sala de pesagem Salmonella Mini-aspirador (Dustbuster) Cmara fluxo laminar (Protect Laminaire) Balana Sala Salmonella Cmara de fluxo laminar (Nuaire)

121 ADS AVA7373.00 AVA7042.00

AVA7399.00 AVA7372.00 AVA7070.00 AVA7405.00 AVA7327.00

AVA7370.01 AVA7311.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7312.00 AVA7313.00 -

Estufas (Memmert ICP400 / ICP800 1;2;3) Frigorficos (Mele / Fricon) Cmara UV (Fisher bioblock)

AVA7509.00 -

AVA7412.00 AVA7329.00 AVA7199.00 AVA7407.00

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Tabela 7 - Plano de controlo interno Equipamento Sala de preparao de meios Equipamento Balana (PG 2002-S) Banho-maria (Memmert W8 14) Banho-maria (Salvis WKV 25E) Dispensador (Omnispense) Responsvel Analista Parmetro Preciso Estabilidade temperatura Estabilidade temperatura Preciso 1) Preciso 2) Controlo temperatura Estabilidade temperatura da da Mtodo Verificao com pesos padro Termmetro Termmetro independente da Termmetro Termmetro independente Medir um mnimo de 5 quantidades em frascos de medio 1.1) Bio-indicador 1.2) Papel indicador 2) Termmetro independente da Termmetro Termmetro independente Frequncia 1xSemana 1xDia 1xMs 1xDia 1xMs 1xSemana 1.1) 1xSemana 1.2) 1xCiclo 2) 1xCiclo 1xDia 1xMs Registo AVA7311.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7311.00 AVA7377.01 AVA7377.01 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00 Ajustar Termmetro Ajustar Definies Verificar elctrodo e electrlito. Limpar elctrodo, ajustar e calibrar medidor de pH ou substituir elctrodo. Substituir as solues tampo regularmente. Contactar servios tcnicos Aco em caso de desvio Ajustar e calibrar, tem de ser feito por pessoa qualificada Ajustar Termmetro Ajustar Definies Ajustar Termmetro Ajustar Definies Ajustar e calibrar, tem de ser feito por pessoa qualificada

Analista

Analista

Analista

Estufa (ST5050)

Pessoa que prepara meios

Frigorifico (Bosh)

Analista

Medidor de pH

Analista ou pessoa que prepara meios

Preciso

Calibrao com solues tampo padronizadas pH 4,0 e pH 7,0

1xDia, antes de usar

AVA7249.00

1) Gravao contnua Autoclave (Fedegari) Pessoa que prepara os meios Preciso 2) Bio-indicador 3) Papel indicador

1) Cada ciclo 2) 1xSemana 3) Cada ciclo AVA7377.01 Contactar servios tcnicos

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FBRICA DE AVANCA

1) Gravao contnua Autoclave (ELV3870 1&2) Pessoa que prepara os meios Preciso 2) Bio-indicador 3) Papel indicador 1) pH, visualizar cor/depsitos Millipore Elix 1) Analista 2) Dep. Qumica Funo 2.1) Condutividade 2.2) Anlise da gua para ausncia de metais pesados, ies, etc. Funo aspirao de Papel contra grelha de pr-filtro

1) Cada ciclo 2) 1xSemana 3) Cada ciclo 1) 1;2xSemana 2.1) Continuamente 2.2) 1xMs 1xMs Substituir filtro regularmente Tratar para remover depsitos de calcrio se necessrio. AVA7377.01 Contactar servios tcnicos

Hotte

Pessoa que prepara os meios

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Tabela 8 - Plano de controlo interno - Equipamento - Sala de microbiologia geral / sala de pesagem Salmonella / sala Salmonella Sala de microbiologia geral Equipamento Balana (PJ4000) Responsvel Analista Parmetro Preciso Mtodo Verificao com pesos padro Frequncia 1xSemana Registo AVA7311.00 Aco em caso de desvio Ajustar e calibrar, tem de ser feito por pessoa qualificada Ajustar e calibrar, tem de ser feito por pessoa qualificada Ajustar Termmetro Ajustar definies Ajustar Termmetro Ajustar definies Ajustar Termmetro Ajustar Definies Ajustar Termmetro Ajustar Definies

Balana (PM2000)

Analista

Preciso Estabilidade temperatura Estabilidade temperatura Estabilidade temperatura Estabilidade temperatura da

Verificao com pesos padro Termmetro Termmetro independente da Termmetro Termmetro independente da Termmetro Termmetro independente da Termmetro Termmetro independente

1xSemana 1xDia 1xMs 1xDia 1xMs 1xDia 1xMs 1xDia 1xMs

AVA7311.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00

Banho-maria (WB14 44C)

Analista

Banho-maria 46C)

(Julabo

20B

Analista

Estufas (Heraeus)

Analista

Frigorifico (Liebherr) Sala de pesagem Salmonella Balana (Mettler PE6000) Sala de Salmonella Estufas (Memmert ICP400 / ICP800 1;2;3)

Analista

Analista

Preciso

Verificao com pesos padro

1xSemana

AVA7311.00

Ajustar e calibrar, tem de ser feito por pessoa qualificada

Analista

Estabilidade temperatura Estabilidade temperatura

da

Termmetro Termmetro independente

1xDia 1xMs 1xDia 1xMs

AVA7518.00 AVA7313.00 AVA7518.00 AVA7313.00

Ajustar Termmetro Ajustar Definies Ajustar Termmetro Ajustar Definies

Frigorficos (Mele/Fricon)

Analista

da

Termmetro Termmetro independente

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FBRICA DE AVANCA

5.2.2. PCI MEIOS E REAGENTES Quanto componente de meios e reagentes do plano de controlo interno, esta tambm foi alvo de alteraes, mostrando a necessidade de actualizaes a nvel de documentos de registo e da criao de um plano de aco que estabelecesse os parmetros que necessitam de controlo, os mtodos de controlo, assim como a frequncia e respectivo responsvel. A necessidade de conseguir determinar a origem de um problema num reagente ou meio de cultura, quando detectado, deu origem criao de um plano de rastreabilidade. Foi necessrio a concepo de uma forma simples de acompanhar o percurso dos constituintes dos reagentes e meios de cultura desde a sua recepo at ao resultado final da anlise. Para esse efeito concebeu-se um cdigo de identificao para acompanhar cada um dos constituintes atravs das diversas fases at ser utilizado na anlise microbiolgica. Na Tabela 9 apresentam-se os cdigos de identificao que permitem a rastreabilidade.
Tabela 9 - Exemplo dos cdigos de rastreabilidade

Cdigo interno (Recepo): 100111 186181864 F1

Cdigo Autoclavagem: A1 120111 C1

Cdigo meios no autoclavados: NA1 250111

100111 = Data de recepo (10.01.11) 186181864 = Lote do reagente F = nmero do frasco (exemplo: 1 de 10)

A = Autoclave (1 ou 2) 120111 = Data 12.01.11 C = Ciclo de autoclave dirio

250111 = Data 25.01.11 NA = Meio No Autoclavado

atribudo um cdigo aquando da recepo, como exemplificado anteriormente, que ir posteriormente corresponder a um segundo cdigo, de meio autoclavado ou de meio no autoclavado, no momento da preparao do meio em questo. Pode-se verificar a forma de como esta correspondncia foi feita atravs da observao da Tabela 10. Estando o plano de rastreabilidade delineado e os respectivos registos adaptados para a insero, a ltima etapa passou pela formao dos funcionrios a fim de aprenderem como efectuar a rastreabilidade dos meios. Os documentos de registo criados assim como o plano de controlo em si podem ser visualizados na Tabela 11.

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Tabela 10- Registo de meios preparados e de cruzamento de cdigos entre reagentes e meios preparados

Reagente Nome Cdigo Qtd Nome Cdigo Qtd

Programa

Volume por Autoclave frasco (ml)

Meio pH Rbrica Nome Cdigo

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FBRICA DE AVANCA

Tabela 11 - Plano de controlo interno - Meios e reagentes

Item Preparao de

Parmetro Preparao correcta

Responsvel Pessoa prepara meios que os

Mtodo pH aps esterilizao,

Frequncia Cada preparao

Registo AVA7335 -

Comentrios/Aces em caso de desvio pH Incorrecto, meio no solidifica, cor anormal, formao de precipitado, etc. Verificar pH e medidor de pH, qualidade da gua, ciclo de esterilizao (sobreaquecimento), qualidade do meio, etc.

meios e diluentes

observao da turbidez, cor, anormalidades, etc.

Registo Meios Preparados

Meios

Esterilidade

Analista

Preparar e incubar vrias placas (>2)

Cada Lote

AVA7507.00 Registo de

Contaminao verificar autoclave, qualidade do ar, etc. Resultados anormais. Verificar qualidade do meio, formulao, suplementos, utilizar novos lotes

esterilidade dos Diluentes Esterilidade Analista Inocular e incubar Cada Lote meios diluentes e

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5.2.3. PCI HIGIENE E AMBIENTE Tal como nas outras componentes, tambm a parte de higiene do PCI teve que ser actualizada aumentando-se a frequncia de limpeza e introduzindo no plano alguns locais a higienizar, e a parte de controlo do ambiente planeada. A Tabela 12 mostra quais os principais documentos trabalhados nesta parte. Para tal foi redefinida a frequncia de limpeza dos vrios locais, assim como quais os locais a higienizar. Alm disso foram criadas/actualizadas as folhas de registo que permitem assegurar que estas aces so levadas a cabo. O plano de controlo pode ser verificado nas Tabelas 13 a 16. No plano estabelecido esto definidos quais os locais a higienizar, qual o responsvel a verificar essa higienizao (e a forma como verificar), a frequncia e a forma como deve ser feita. Quanto parte de controlo do ambiente, foram estabelecidos novos planos de controlo e os respectivos registos. Estes possibilitaram um controlo mais restrito de possveis contaminantes em diferentes partes do laboratrio, e verificar se o plano de higiene institudo adequado aos locais determinados, ou se necessita de nova reviso. No plano criado para controlo do ambiente foram definidos os locais a serem controlados, o responsvel por esse controlo, qual o microrganismo a ser pesquisado (na sua maioria microrganismos indicadores), a frequncia do controlo e o mtodo que deve ser utilizado. Este plano pode ser observado nas Tabelas 17 e 18.
Tabela 12 Principais documentos trabalhados na parte de higiene e ambiente do PCI

Higiene e Ambiente Actualizao Criao Plano de higiene da sala de preparao de meios Plano de higiene da sala de microbiologia geral Plano de higiene da sala de pesagem S Plano de higiene da sala da sala S Registo de limpeza de aparelhos Registo de limpeza de autoclaves Plano de controlo do ambiente da sala de microbiologia geral Plano de controlo do ambiente da sala de pesagem S Plano de controlo do ambiente da sala S Registo de qualidade microbiolgica ambiente

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FBRICA DE AVANCA

Tabela 13 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala de preparao de meios

Frequncia Por utilizao Trimestral Quinzenal Semestral Semanal Mensal

Local/Item

Responsvel

Descrio

Dirio

Comentrio/Aco

Locais de Laboratrio Superfcies de trabalho Bacias Balanas Banhos-maria Estufa esterilizadora Autoclaves Dispensador Placas de Aquecimento Microondas Medidor de pH Hotte Recipientes de Lixo Utenslios amostragem Mat. Limpeza/desinfeco

Chefia Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Chefia

Visual Visual Visual Visual Visual Visual Automtico Automtica Visual Visual Visual Visual Visual Visual Visual X X X X X X

X X X Desinfectar antes de iniciar trabalho Desinfeco Limpar prato e superfcie exterior X X X Mudar gua, lavar, limpar com pano e sol. limpeza Higienizar e desinfectar Esterilizar 10min, com HCl Higienizar tubagens Higienizar Higienizar Limpar e acondicionar electrodo Limpar e higienizar aps utilizar X X X Esvaziar, limpar e desinfectar Higienizar e esterilizar antes de usar Controlar stocks

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Tabela 14 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala de microbiologia geral

Frequncia Por utilizao Trimestral Quinzenal Semestral Semanal

Local/Item

Responsvel

Descrio

Mensal

Dirio

Comentrio/Aco

Locais de Laboratrio Superfcies de trabalho Bacia Ar Condicionado Balanas Banhos-maria Estufas Frigorfico Microscpio Stomacker Recipientes de Lixo Utenslios amostragem Mat. Limpeza/desinfeco

Chefia Analista Analista Chefia Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Chefia

Visual Visual Visual Visual Contagem de colnias de ar Visual Visual Visual Visual Visual Visual Visual Visual Visual X X

X X X X X Desinfectar antes de iniciar trabalho Desinfeco Mudar filtros se necessrio Limpar prato e superfcie exterior X X X Mudar gua, lavar, limpar com pano e sol. limpeza Higienizar e desinfectar Higienizar e desinfectar Higienizar X X X X X Exterior - Higienizar e desinfectar Interna - Higienizar e desinfectar Esvaziar, limpar e desinfectar Higienizar e esterilizar antes de usar Controlar stocks

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FBRICA DE AVANCA

Tabela 15 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala de pesagem Salmonella

Frequncia Por utilizao Trimestral Quinzenal Semestral

Semanal

Tipo de equipamento

Responsvel

Descrio

Mensal

Dirio

Comentrios/Aco

Locais de Laboratrio Superfcies de trabalho Utenslios

Chefia Analista Analista Analista

Visual Visual Visual Visual Aspirao pr-filtro Mudar pr-filtro Mudar filtro absoluto Visual Visual X

X X X Desinfectar antes de iniciar trabalho Higienizar e esterilizar antes de usar Limpar X X X X X Limpar prato e superfcie exterior Controlar stocks Controlo analtico "S" das poeiras

Cmara fluxo laminar

Chefia

Balanas Meios de Cultura/Reagentes

Analista Chefia

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Tabela 16 - Plano de controlo interno - Higiene - Sala Salmonella

Frequncia Por utilizao Trimestral Quinzenal Semestral Semanal

Local/Item

Responsvel

Descrio

Mensal

Dario

Comentrio/Aco

Locais de Laboratrio Superfcies de trabalho Utenslios Estufas Cmara fluxo laminar Cmara UV Mat. Limpeza/desinfeco

Chefia Analista Analista Analista Analista Analista Chefia

Visual Visual Salmonella Visual Visual Visual Salmonella Visual Visual

X X X X X X X X X Higienizar Controlar stocks Higienizar e esterilizar antes de usar Higienizar e desinfectar Higienizar e desinfectar Desinfectar antes de iniciar trabalho

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FBRICA DE AVANCA

Tabela 17 - Plano de controlo interno - Ambiente - Sala de microbiologia geral

Frequncia Trimestral Quinzenal Semestral Semanal Mensal Dirio

Local/Item

Responsvel

Descrio

Comentrio/Aco

Estufa Heraeus B5042 Estufa Heareus B5050 Estufa Heraeus B5090E Ar Condicionado Banho Memmert Banho Julabo Superficie local 1 Superficie local 2 Superficie local 3

Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista

Enterobacterias / GAM Fungos e leveduras Enterobacterias / GAM Enterobacterias / GAM Presena/Ausncia de E. coli

X X X X X X

Placa de Sedimentao Placa de Sedimentao Placa de Sedimentao Placa de Sedimentao

Enterobacterias / GAM Enterobacterias / GAM Enterobacterias / GAM

X X X

Zaragatoa / Algodo Zaragatoa / Algodo Zaragatoa / Algodo

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Tabela 18 - Plano de controlo interno - Ambiente - Sala de pesagem Salmonella / Sala Salmonella

Frequncia

Trimestral

Quinzenal

Local/Item

Responsvel

Descrio

Semestral

Semanal

Mensal

Dirio

Comentrio/Aco

Sala de pesagem Salmonella

Superfcie Cmara de fluxo laminar Cmara de fluxo laminar Analista Analista Analista Salmonella Salmonella Salmonella X Sala Salmonella Estufa Memmert ICP 400 Estufa Memmert ICP 800 (1) Estufa Memmert ICP 800 (2) Estufa Memmert ICP 800 (3) Ar condicionado Hotte Superficie local 1 Superficie local 2 Superficie local 3 Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Analista Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella Salmonella X X X X X X X X X Placa de sedimentao Placa de sedimentao Placa de sedimentao Placa de sedimentao Placa de sedimentao Placa de sedimentao Zaragatoas / Algodo Zaragatoas / Algodo Zaragatoas / Algodo X X Zaragatoa / Algodo Anlise do filtro Placa de Sedimentao

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FBRICA DE AVANCA

5.2.4. PCI ANALISTAS Para avaliar o desempenho dos analistas, utilizou-se o mtodo de contagem de probiticos, uma vez que os outros mtodos geram, na sua maioria, resultados nulos ou contagens muito baixas. Assim, e tendo em conta as condies referidas na introduo, foi calculada a repetibilidade e reprodutibilidade dos analistas:
Tabela 19 - Resultados dos diferentes analistas na anlise da mesma amostra

Data Anlise 26-04-2011 26-04-2011 27-04-2011 27-04-2011 28-04-2011 28-04-2011

Analista Analista 1 Analista 2 Analista 3 Analista 4 Analista 5 Analista 6

Resultado 1 Resultado 2 Log (UFC/g) Log (UFC/g) 7,920 7,969 7,939 7,822 7,819 7,848 7,992 7,984 7,913 7,859 7,927 7,851

Mdia 7,956 7,977 7,926 7,840 7,873 7,849

Desvio Padro 0,036 0,007 0,013 0,019 0,054 0,001

Tabela 20 - Tratamento estatstico dos resultados obtidos na Tabela 19 Robusto Clssico

Mdia geral Desvio Padro da mdia das rplicas Resultados de Repetibilidade Desvio padro de repetibilidade SD(r) Desvio padro relativo de repetibilidade CV(r) Limite de repetibilidade a 95%(r) para resultados em duplicado Limite de repetibilidade relativo a 95%(r%) para resultados em duplicado Resultados de Reprodutibilidade Desvio padro de reprodutibilidade SD(R) Desvio padro relativo de reprodutibilidade CV(R) Limite de reprodutibilidade a 95%(R) para resultados em duplicado Limite de reprodutibilidade relativo a 95%(R%) para resultados em duplicado

7,883 0,054

7,888 0,041

0,037 0,5% 0,102 1,3%

0,038 0,5% 0,103 1,3%

0,060 0,8% 0,165 2,1%

0,049 0,6% 0,137 1,7%

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Para o mtodo de anlise em questo, segundo as especificaes internas da Nestl, o limite de repetibilidade no deve ultrapassar os 0,10 e o limite de reprodutibilidade no deve ser superior a 0,24. Tendo em conta estes valores e os resultados obtidos, pode-se concluir que o desempenho do mtodo positivo. 5.2.5. PCI PLANO DE VERIFICAO DE CUMPRIMENTO DOS MTODOS Para o plano de verificao de cumprimento dos mtodos foram elaboradas listas de ocorrncias a serem utilizadas em auditorias internas. Estas listas abordam vrios pontos essenciais execuo correcta das anlises efectuadas no laboratrio. So abordados tpicos como medidas de segurana, boas prticas de laboratrio, procedimento e aces de controlo interno (registos de temperatura, limpeza, etc), como pode ser visto na Tabela 21. Os diversos pontos so classificados como Conforme (C) ou No Conforme (NC), podendo ser ainda um questo No Aplicvel (NA) anlise em questo. As listas contm locais para estabelecer planos de aco para corrigir as no conformidades e para posterior avaliao desses mesmos planos de aco, que podem ser observados na Tabela 22. As listas contm tambm um fluxograma da anlise em questo para um melhor acompanhamento por parte dos responsveis pela verificao do cumprimento do mtodo. Foram elaboradas listas de ocorrncias para todos os protocolos mencionados anteriormente.
Tabela 21 - Exemplos de pontos abordados nas listas de ocorrncias

NA C MEDIDAS DE SEGURANA Boas prticas de laboratrio Material de laboratrio em condies adequadas Utilizao de luvas Pesagem e hidratao dos meios na hotte PROCEDIMENTO Amostra em p: Distribuir os ps na superfcie do TS e permitir hidratao e absoro lentas Entre a preparao da suspenso inicial e o tratamento trmico no devem passar mais de 10 minutos Homogeneizao mo da suspenso inicial (-1) e retirar X ml para Y ml de TS para efectuar a diluio seguinte (-2) Transferir X ml da diluio -1 para 3 tubos de LST duplo e misturar cuidadosamente

NC OBSERVAES

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Incubar a 371C durante 242h Incubar em banho-maria a 441C durante 242h; se no formar gs estender incubao at 482h AUTOCONTROLO Registo da monitorizao da temperatura das estufas e banhos-maria Registo do controlo dos termmetros Registo de limpeza (incluindo estufas e banhos-maria) Registo da qualidade do ar das estufas e laboratrio

Tabela 22 - Local para planos de aco e respectiva avaliao de eficcia existente nas listas de ocorrncias N NC PLANO DE ACO RESPONSVEL PRAZO IMPLEMENTADO (S/N)

1 Avaliao da eficcia:

2 Avaliao da eficcia:

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5.3. OUTRAS ACTIVIDADES EXERCIDAS Para se obter uma minimizao dos custos de anlise e de trabalho pode-se recorrer a uma mudana de parmetro de liberao de produto para um parmetro de monitorizao. No entanto, para efectuar esta mudana necessrio demonstrar que certas especificaes esto sob controlo, de forma a garantir que os produtos sero conforme as indicaes estabelecidas. Assim, foi feito um estudo sobre a quantidade de probiticos em certos produtos. A distribuio da quantidade de probiticos em produtos terminados determinada pela variabilidade do processo global, o que inclui a variabilidade analtica. Devem ser considerados dois aspectos da capacidade de processo: variabilidade dentro do lote e variabilidade entre lotes. Estes aspectos esto relacionados com a variabilidade da quantidade de probiticos nas diversas embalagens, dentro do mesmo lote, e tambm em embalagens de lotes diferentes. Alm disso, e como referido anteriormente, tambm necessrio ter em conta a variabilidade analtica. Assim sendo, necessrio testar os diversos analistas que efectuem esta anlise, calculando os valores j mencionados em 5.2.4 de repetibilidade e reprodutibilidade. Para que um produto possa ser alvo desta mudana de parmetro, deve cumprir as seguintes especificaes estipuladas pela Nestl: Todas as embalagens apresentarem uma concentrao mnima de probiticos de 1,0x107UFC/g ou 7,0log; As anlises efectuadas dentro do mesmo lote devem apresentar um coeficiente mximo de variao (CV) de homogeneidade mximo de 18%; As anlises efectuadas entre lotes devem demonstrar uma capacidade de processo (CpK) maior ou igual a 1,3. O desempenho analtico, para esta anlise especfica, deve ser comprovado atravs dos seguintes valores: o Limite de repetibilidade (r) <0,1; o Limite de reprodutibilidade (R) <0,24. tambm necessrio a participao em testes de proficincia com amostras dos probiticos em questo. Alm das especificaes referidas tambm necessrio efectuar um estudo aos custos do trabalho analtico de forma a verificar se realmente se verificar uma reduo de custos.

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De forma a efectuar o estudo que visa determinar se possvel passar de um parmetro de liberao para um parmetro de monitorizao de produto, foram efectuadas vrias anlises. Os resultados destas anlises foram trabalhados utilizando o software de anlise estatstica Qstat, que permitiu obter aos seguintes valores. 5.3.1. VARIABILIDADE DENTRO DO LOTE Data da amostra: 17-03-2011 Probitico: Bifidobacterium lactis Produto: Farinha lctea com probiticos Lote: L1076030

Homogeneidade
Nmero de clulas (UFC/g)

1,2E+08
1,0E+08 8,0E+07 6,0E+07 4,0E+07 2,0E+07

0,0E+00
0 1 2 3 4 5 6 7 Amostra 8 9 10 11 12

Figura 3 - Concentrao de probiticos em diferentes amostras do mesmo lote Tabela 23 - Valores relativos homogeneidade dentro de um lote

Valor Mdia SD (Total) CV (Total) SD (Homogeneidade) CV (Homogeneidade) 7,4x107 1,3Ex107 18,00% 1,3x107 18,00%

Limites de confiana Inferior 5,2x107 9,4x106 12,70% 9,4x106 12,70% Superior 9,5x107 2,2x107 30,50% 2,2x107 30,50%

SD = Desvio Padro; CV = Coeficiente de Variao

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Analisando os resultados obtidos, verifica-se que todos os valores esto acima do mnimo especificado (1,0x107UFC/g) e que o coeficiente de variao no ultrapassa os 18%. Estes dados demonstram que a homogeneidade dentro do mesmo lote se encontra sob controlo e dentro dos limites especificados. 5.3.2. VARIABILIDADE ENTRE LOTES

1,8E+08 1,6E+08 Nmero de clulas (UFC/g) 1,4E+08 1,2E+08 1,0E+08 8,0E+07 6,0E+07 4,0E+07 2,0E+07 0,0E+00 Limite Mnimo Amostra Mdia BL Valores de BL

Bifidobacterium lactis CFU/g

Figura 4- Concentrao de probiticos em lotes diferentes ao longo do tempo

Desvio Padro: 1,58x107 Mdia: Limite: Cpk= 7,06x107 1,00x107 1,3

Mnimo: Mximo: N pontos:

4,25x107 1,57x108 213

CpK = Capacidade de Processo

Na anlise dos dados obtidos nesta parte do estudo possvel verificar que tambm aqui todos os valores esto acima do mnimo requerido e que o valor da capacidade de processo o pedido, CpK=1,3. Estes valores vm comprovar que a homogeneidade entre lotes tambm est sob controlo e conforme os limites especificados.

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5.3.3. DESEMPENHO DO MTODO ANALTICO Em relao aos dados correspondentes ao desempenho do mtodo analtico, dado que j tinham sido obtidos resultados relativos a este mtodo, foram utilizados os resultados obtidos na avaliao dos analistas. Assim, possvel verificar que o limite de repetibilidade obtido (0,102; 0,103) se encontra no limite do mximo pretendido (0,10). Quanto ao limite de reprodutibilidade, este encontra-se abaixo do limite estabelecido (0,24), tendo sido obtido os valores 0,165 e 0,137. Face a estes resultados, verifica-se que possvel fazer a alterao de parmetro. No entanto, ainda se encontra em fase de estudo a anlise aos custos, o que vai ditar se a mudana vantajosa ou no.

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6. CONCLUSO
Aps seis meses de estgio, o plano de controlo interno existente no laboratrio foi completamente revisto. As componentes de equipamento e higiene foram na sua maior parte actualizadas, o que se deveu a mudanas de algum do equipamento de laboratrio e a necessidade de aumentar a frequncia de limpeza de certos locais/aparelhos. Na parte de controlo dos meios e reagentes as maiores alteraes foram ao nvel do registo dos meios de cultura preparados e da implementao de um sistema de rastreabilidade desses mesmos meios. A componente de controlo microbiolgico do ambiente foi completamente reestruturada, tendo sido feito um novo planeamento assim como criados novos registos. Por fim foi introduzida uma nova componente, respeitante verificao do cumprimento dos mtodos de anlise. Desta forma, agora possvel efectuar um melhor controlo dos parmetros que influenciam os resultados analticos, conferindo uma maior fiabilidade a esses mesmos resultados. Quanto mudana de um parmetro de liberao para um parmetro de monitorizao verificou-se que esta alterao possvel. No entanto, necessrio que o estudo sobre os custos, que se encontra em curso, viabilize esta mudana. A nvel pessoal, este estgio possibilitou a oportunidade de ter contacto com reas de trabalho diferentes, realizando um tipo de trabalho diferente do desenvolvido ao longo do percurso acadmico, algo que penso ser essencial nos dias de hoje em que fundamental ter a capacidade de adaptao aos mais diversos tipos de trabalho. Permitiu tambm o contacto com pessoas de reas diferentes, mostrando como se trabalha em equipas multidisciplinares e na indstria. Aprendi novas metodologias de trabalho e verifiquei as principais diferenas de trabalho efectuado a nvel de universidade e trabalho industrial.

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7. BIBLIOGRAFIA
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Instructions. [Norma Interna Nestl]. 2009.

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ANEXOS
1. PRODUTOS DOS DIVERSOS SECTORES FBRICA DE AVANCA
Gelatina (Morango, Laranja, Anans, Tuti-fruti, Pssego) Click (Maracuj, Limo, Anans, Laranja) Top / Chocolate em p / Chocolate Quente / Achocolatados Sector IIA Mousse (Morango, Chocolate, Anans) (misturas a seco) Pudim (Flan de ovos, Chocolate, Caramelo, Baunilha) Leite-creme Solveis em saquetas

Cappuccino Topping com soro Milano Cappuccino Topping Sector Nestl Professional com acar Matriaprima: Leite 1% sem acar sem soro Milano Premium Dairy Whitener Nestl 1% Carnation Nestl 1% aucarado

Sector IV (leites em p) com clcio Molico

Classic Topping 5,8% (com soro e acar) Lacta Lacta maxi

Matriaprima: Leite 16%

10% (sem soro e com acar)

Alpina Melkproduct

Com lecitina

Nestl 16%

6 de Julho de 2011

Sector II

Bolero; Brasa; Cevada; Eko; Eko mel; Eko fibra, Mokambo; Tofina

Cerelac (Standart, Banana 0% acar c/ BL, Lcteas Banana Laranja 0% acar c/ BL, 5 Frutos c/ BL, 5 Frutos 0% acar c/ BL, Ma 0% acar c/ BL, Pra 0% acar c/ BL)

Alimentao infantil

8 Cereais mel 0% acar c/ BL, 8 Cereais No Sector III Lcteas Multifrutos 0% acar c/ BL, 5 Cereais 0% acar c/ BL, 5 Cereais 0% acar s/ BL, 8 Cereais cacau 0% acar c/ BL

Farinha Pensal Cacau All Family Nestum (Mel, Mel 20% integral 5 Cereais, Multifrutos, Ma-canela, Chocolate)

Sector IIIA

Chocapic; Estrelitas; Trio; Fibre1

Sector V (Goliath)

Nescafe mocha cap; Nescafe capp.; Nescafe Leite macchiato

Sector VIII

Natas

Natas Longa vida (30% gordura) Natas light - Sveltesse (16% gordura)

ii

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2. ESQUEMA

DE

IDENTIFICAO

PARA

BACTRIAS

DE

RELEVNCIA

PARA

ALIMENTOS E AMBIENTES DE PRODU O ALIMENTAR

Bactrias Gram negativas Fentipo Oxidase Dissimilao1 da glucose 1-2 Mveis No mveis Dissimilao da glucose 3-4 Lactose + Citrato Citrato + Reaco vermelho metilo + Reaco vermelho metilo Mveis No mveis Lactose -Galactosidase Mveis Ureia Ureia + No mveis -Galactosidase + Produo H2S + Produo H2S Lisina Descarboxilase Lisina Descarboxilase + Arabinose + Arabinose Oxidao do etanol a cido actico a pH<4,5 Oxidase + Dissimilao da glucose 1 Micro-aerfilo Aerbio Mveis No mveis Dissimilao da glucose 2 Dissimilao da glucose 3 Dissimilao da glucose 4
1

Gnero

Xanthomonas Acinetobacter

Escherichia

Citrobacter/Kluyvera

Enterbacter/Erwinia Klebsiella

Salmonella Proteus No mveis

Citrobacter

Yersinia

Hafnia Serratia Acetobacter/Gluconobacter

Campylobacter

Alcaligenenes/Comamonas No mveis Pseudomonas Vibrio/Plesiomonas Aeromonas

Dissimilao da Glucose: 1 No dissimilada; 2 Oxidativo; 3 Fermentativo; 4 Fermentativo aerognico

6 de Julho de 2011

iii

Bactrias Gram positivas Fentipo Bastonetes Sem esporos Catalase + Listeria / Corynebacterium / Brevibacterium / Arthrobacter / Cellulomonas / Microbacterium / Brochotrix Catalase Esporos Catalase + Catalase Cocos Catalase + Dissimilao da glucose1 1-2 Dissimilao da glucose 3 Catalase Dissimilao da glucose 3 Streptococcus / Enterococcus / Pediococcus / Lactococcus Dissimilao da glucose 4
1

Gnero

Curtobacterium /

Lactobacillus

Bacillus Clostridium

Micrococcus Staphylococcus

Dissimilao da Glucose: 1 No dissimilada; 2 Oxidativo; 3 Fermentativo; 4 Fermentativo aerogenico

iv