1

O risco da doena de Chagas se tornar endmica na Regio

Amaznica (a maior oresta tropical do mundo, habitada por mais
de 30 milhes de pessoas) est relacionado intensa migrao de
pessoas de reas com incidncia signicativa da doena, carregando
parasitos e vetores j adaptados ou pela adaptao de vetores e
animais silvestres (infectados com o Trypanosoma cruzi) ao domiclio
humano, em consequncia do desorestamento incontrolado na
regio. A grande regio no Brasil e no conjunto dos pases amaznicos,
correspondendo a uma vasta rea de 7.702.264 km
2
(Figura 1),
denominada Panamaznia.
Mais de 25 espcies de triatomneos silvestres de nove gneros e
dezenas de espcies de reservatrios j foram descritas na regio, a
maioria infectada pelo Trypanosoma cruzi.
A invaso das casas por triatomneos silvestres adultos (que vivem
em palmeiras prximas) atrados pela luz muito frequente na regio
amaznica (Figura 2).
Da mesma forma, a presena de animais silvestres, principalmente
Didelphis marsupialis, com elevadas taxas de infeco pelo T. cruzi tem
sido encontrada no peridomiclio e intradomiclio naquela regio.
Um nmero crescente de casos agudos da doena de Chagas
tem sido descrito praticamente em todos os nove pases da regio
amaznica, alguns deles em surtos epidmicos atribudos a transmisso
oral atravs de alimentos contaminados (sucos de frutas, carne mal
cozida de animais silvestres e outros alimentos contaminados).
A DOENA DE CHAGAS
NA REGIO AMAZNICA
Jos Rodrigues Coura, Carlos Jos de Carvalho Moreira, Angela C.V. Junqueira
Laboratrio de Doenas Parasitrias, Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz
Av. Brasil, 4365 Rio de Janeiro RJ 21040-360
2
Casos crnicos da doena com cardiopatia grave tm sido
documentados, principalmente em coletores de bra da piaava na
regio do Rio Negro, na Amaznia Brasileira.
Um programa de vigilncia que contemple os pers de transmisso
na Panamaznia deve ser implementado de forma continuada
e uniforne nos prximos anos. consenso que em curto e mdio
prazo se evite a endemizao da doena de Chagas na regio.
Aes planejadas de controle e preveno devem ser inseridas para
Figura 1: Panamaznia. Seu territrio ocupado pelos seguintes pases: Bolvia,
Brasil, Colmbia, Equador, Guiana, Peru, Suriname, Venezuela
e o territrio ultramarino da Frana, a Guiana Francesa.
3
evitar que se reproduza o perl das reas endmicas clssicas com
estabelecimento do triatomneo no intra e peridomiclio.
Em 2004 foi criada a Iniciativa Internacional para Vigilncia e
Preveno da Enfermidade de Chagas na Regio Amaznica (AMCHA),
j tendo sido realizada a 6 reunio e diversos cursos para treinamento
de tcnicos, no reconhecimento do T. cruzi em lminas na rotina do
diagnstico de malria.
Figura 2: Habitat de triatomneos silvestres e de Didelphis
marsupialis infectados com T. cruzi na regio amaznica.
4
REFERNCIAS PARA CONSULTA
AGUILAR, M. M.; ABAD-FRANCH, F.; DIAS J.C.P.; JUNQUEIRA A.C.V.;
COURA, J.R. Chagas disease in the Amazon Region. Memrias do
Instituto Oswaldo Cruz, v. 102 (Suppl. I), p. 47-55, 2007.
ALBAJAR, P.V.; LAREDO, S.V.; TERRAZAS, M.B.; COURA, J.R. Miocardiopatia
dilatada em pacientes com infeco chagsica crnica. Relato de dois
casos fatais autctones do Rio Negro, Estado do Amazonas. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.38, p. 82-89, 2003.
BRENER, Z. ; ANDRADE, Z.A. ; BARRAL-NETTO, M. Trypanosoma cruzi
e Doena de Chagas. Editora Guanabara Koogan 2 Edio, Rio de
Janeiro, 431 p. 2000. (Excelente livro para quem deseja especializar-
se no assunto).
COURA, J.R. Chagas disease: what is known and what is needed A
background article. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, (Suppl I),
p.113-122, 2007.
COURA, J.R.; JUNQUEIRA, A.C.V., CARVALHO-MOREIRA, C.J.; BORGES-
PEREIRA, J; ALBAJAR VIAS, P. Uma viso sistmica da endemia
chagsica. In: Silveira AC, La Enfermedad de Chagas a la puerta de
los 100 aos de uma endemia americana ancestral. Organizacin
Panamericana de la Salud y Fundacin Mundo Sano, Washington DC y
Repblica Argentina. Publicacin Monogrca 7, p. 25-35, 2007.
DIAS, J.C.P.; COURA, J.R. Clnica e Teraputica da Doena de Chagas.
Uma abordagem prtica para o clnico geral. Rio de Janeiro: Editora
Fiocruz, 1997. 486 p.
DIAS, J.C.P.; MACEDO, V.O. Doena de Chagas. In: JR Coura, Dinmica
das Doenas Infecciosas e Parasitrias, Rio de Janeiro: Editora
Guanabara Koogan, 2005. p. 555-593.
E. CHOW-SHAFFER, E.; SINA, B.; HAWLEY, W.A.; DE BENEDICTIS,
J.; SCOTT, T.W. Laboratory and eld evaluation of polymerase chain
reaction-based forensic DNA proling for use in identication of human
blood meal sources of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of
Medical Entomology, v. 37, p. 492 - 502, 2000.
5
KIRSTEIN, F.; GRAY, J.S. A molecular marker for the identication of
the zoonotic reservoirs of Lyme Borreliosis by Analysis of the Blood-
meal in Its European Vector Ixodes ricinus. Applied and Environmental
Microbiology, v. 62, p. 4060 - 65, 1996.
JUNQUEIRA, A.C.V.; ALBAJAR, P.V.; COURA, J.R. Doena de Chagas na
Amaznia Brasileira. In: JR Coura, Dinmica das Doenas Infecciosas
e Parasitrias, Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2005. p.
595-603.
MOTA, J.; CHACON, J.C.; GUTIERREZ-CABRERA, A.E.; SANCHEZ-
CORDERO, V.; WIRTZ, R.A. Identication of blood meal source and
infection with Trypanosoma cruzi of Chagas disease vectors using a
multiplex cytochrome b polymerase chain reaction assay. Vector Borne
Zoonotic Disease, v. 7, p. 617 27, 2007.
MUKABANA, W.R.; TAKKEN, W.; KNOLS, B.G. Analysis of arthropod
bloodmeals using molecular genetic markers. Trends in Parasitology,
v.18, p. 505 09, 2002.
PIZARRO, J.C.; STEVENS, L. A new method for forensic DNA analysis of
the blood meal in chagas disease vectors demonstrated using Triatoma
infestans from Chuquisaca, Bolivia. PLoS One. v. 3, p. 3585, 2008.
STEUBER, S.; ABDEL-RADY, A.; CLAUSEN, P.H. PCR-RFLP analysis: a
promising technique for host species identication of blood meals
from tsetse ies (Diptera: Glossinidae). Parasitology Research, v. 97,
247 -54, 2005.
TOWNZEN, J. S.; BROWER, A. V.; JUDD, D. D. Identication of mosquito
bloodmeals using mitochondrial cytochrome oxidase subunit I and
cytochrome b gene sequences. Medical and Veterinary Entomology, v.
22, p. 386 - 93, 2008.
XAVIER, S.S.; SOUZA, A.S.; ALBAJAR, P.V.; JUNQUEIRA, A.C.V.; BIA, M.N.;
COURA, J.R.Cardiopatia chagsica crnica no Rio Negro, Estado do
Amazonas. Relato de trs novos casos autctones, comprovados por
exames sorolgicos, clnicos radiogrcos do trax e ecocardiogrcos.
Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 39, p.211-
216, 2006.
6
1. O Trypanosoma cruzi
O Trypanosoma cruzi (Chagas 1909), um protozorio
pertencente ao lo Sarcomastigophora, sublo Mastigophora,
classe Zoomastigophora, ordem Kinetoplastida, subordem
Trypanosomatina e famlia Trypanosomatidae.
Essa espcie de parasita desenvolve o seu ciclo de vida em
hospedeiros vertebrados (mamferos) e invertebrados (triatomneos),
onde assume estdios evolutivos diferentes (Hoare 1972). Assim como
outros Kinetoplastidas, o T. cruzi contm uma organela caracterstica,
chamada cinetoplasto. O DNA, ou KDNA, contido nessa organela
constitui-se de molculas organizadas em forma de maxicrculos e
minicrculos.
Entre os hospedeiros mamferos do T. cruzi est o homem,
no qual se desenvolve uma infeco cuja resultante a doena de
Chagas. Essa infeco autctone nas Amricas, onde se estima uma
prevalncia entre 10 a 12 milhes de pessoas infectadas.
Entre as possveis formas de transmisso do T. cruzi ao homem,
as consideradas mais importantes so a vetorial ou contaminativa
(entre 70 e 90 % dos casos), a transfusional (1 a 20 %) e a congnita
(0.5 a 10 %).
Na vetorial a contaminao ocorre por solues de continuidade
na pele ou mucosas ntegras em contato com fezes infectadas
eliminadas durante ou aps o repasto sanguneo. At a presente
data j foram descritas 141 espcies de triatomneos, potencialmente
transmissoras do T. cruzi, classicadas em 5 tribos e 15 gneros. A
transmisso transfusional pode variar entre 12,5% e 25% para cada
500 ml de sangue total transfundido, especialmente na ausncia de
controle de qualidade em bancos de sangue.
Acredita-se que a transmisso congnita ocorra principalmente
aps o segundo trimestre de gestao. Outros modos de transmisso
so: por via digestiva (oral), tipicamente em forma de surtos; acidental
7
e atravs de transplantes de rgos. Excepcionalmente, pode ocorrer
a transmisso por via sexual e por vetores no triatomneos (ex:
Cimicdeos).
O T. cruzi pode ser encontrado infectando hospedeiros nos mais
diferentes ectopos: nos desertos norte-americanos, nos altiplanos
andinos, nas orestas amaznica e atlntica e no complexo caatinga-
cerrado-pampa mido. Dentre esses ectopos, alguns albergam
outras espcies de tripanossomos (Figura 3), como o Trypanosoma
rangeli (Tejera 1920), que compartilha com o T. cruzi a capacidade de
infectar mamferos e triatomneos (Tabela 1). O T. rangeli, porm, no
patognico para o homem apesar de ser encontrado infectando o
mesmo. Esses dados devem ser considerados nos estudos envolvendo
ambas as espcies, j que compartilham formas evolutivas semelhantes.
O esquema do ciclo evolutivo e a forma de transmisso vetorial de
ambas as espcies so expostos nas pginas seguintes.
Tabela 1: Exemplos de subgneros e espcies de tripanossomas,
com a seco de desenvolvimento no vetor e tipo de
transmisso e uido infectado segundo Hoare (1972).
*
8
(*) No existe consenso sobre a classicao taxonmica do T. rangeli.
Alguns autores o classicam na seco Stercoraria e outros na Salivaria,
apesar da transmisso ser principalmente inoculativa. Os autores
sugerem como leitura complementar o captulo Tripanossomase rangeli do
livro Dinmica das Doenas Infecciosas e Parasitrias (COURA et al., 2005).
1.1 DIFERENTES ESTDIOS EVOLUTIVOS DO T. cruzi
O T. cruzi apresenta formas evolutivas com aspectos morfolgicos
distintos, tanto no organismo vertebrado como no inseto vetor.
A superfcie celular dessas diferentes formas constituda por
macromolculas de composio varivel, o que reete na interao
do parasita com a clula hospedeira. Alm das trs principais formas
abordadas nas pginas seguintes, uma srie de outras formas
intermedirias podem tambm ser observadas.
Figura 3: Origem geogrca de 4 diferentes grupos de T. rangeli
(A , B , C , D ) identicados no estudo logentico
de Maia da Silva, F. et al. (2004).
9
Fotograas de Snia Gumes Andrade - CPqGM/FIOCRUZ.
Figura 4: Forma amastigota de T. cruzi: B) amastigota em um macrfago;
C) amastigota no corao; D, E) amastigotas no megaesfago.
A forma amastigota de multiplicao intracelular encontrada em
mamferos e tambm em cultivo celular (Figura 4).
Depois que os tripomastigotas invadem as clulas (por fagocitose,
endocitose ou penetrao ativa), para no serem destrudos
pelo sistema imune do hospedeiro, transformam-se nas formas
amastigotas.
Estas se localizam nas bras musculares esquelticas, cardacas
e lisas, clulas do sistema monoctico fagocitrio, sistema nervoso
central e sistema nervoso perifrico. Em pacientes imunodeprimidos
esse tropismo pode se modicar.
10
Desenho de Bruno Eschenazi. Fotograa de Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.
Figura 5: Forma epimastigota de T. cruzi: A) desenho;
B) epimastigota em esfregao de fezes de triatomneo.
O epimastigota a forma de multiplicao no intestino do inseto
(Figura 5). A multiplicao ocorre por diviso binria longitudinal. Essa
forma, tambm encontrada nos meios axnicos (in vitro), est presente
na fase exponencial de crescimento. Os antgenos de superfcie de
epimastigota so tradicionalmente utilizados nas provas sorolgicas
de diagnstico e como antgeno nas reaes de imunouorescncia
indireta.
O tripomastigota uma forma do T .cruzi que no se multiplica.
encontrado no inseto vetor (tripomastigota metacclico), no sangue
e espao intercelular e tambm na cultura de clulas. As formas
encontradas no sangue podem apresentar-se com morfologias
distintas, podendo ser classicadas como forma delgada, larga e muito
larga (polimorsmo). Na gura 6 apresentam-se exemplos da forma
larga e delgada.
Desenho de Bruno Eschenazi. Fotograas de Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.
Figura 6: Forma tripomastigota de T. cruzi. A) desenho;
B, C) formas larga e delgada do T. cruzi, respectivamente.
11
1.2 CICLO DO Trypanosoma cruzi NO VERTEBRADO
O triatomneo infectado, ao sugar o sangue, deposita suas fezes
contendo formas tripomastigotas metacclicas normalmente perto
do local da picada. Essas formas penetram por uma soluo de
continuidade na pele ou atravs das mucosas ntegras. Dentro do
organismo do vertebrado, os tripomastigotas invadem diferentes
tipos de clulas, transformando-se em amastigotas. O parasita tem
tropismo por clulas musculares estriadas e lisas, macrfagos e
tambm por clulas epiteliais e broblastos. As formas amastigotas
dividem-se por diviso binria, formando pseudocistos que se
rompem. Dentro destes pseudocistos, os amastigotas transformam-
se em tripomastigotas que so liberados, aps a ruptura da clula,
atingindo a circulao sangunea, indo infectar novas clulas (Figura
7 A).
1.3 CICLO DO Trypanosoma rangeli NO VERTEBRADO
At hoje no conhecida a forma e o local da multiplicao
do parasita nos hospedeiros vertebrados. No homem a infeco
considerada benigna e pode persistir por at um ano e meio sem
manifestaes clnicas. De forma excepcional, em 1951, o Dr. Torrealba
(apud Pessoa, S. B.), em seus estudos na Venezuela, relatou casos
agudos da infeco no homem, descrevendo sintomas equivalentes
infeco por T. cruzi, como febre, poliadenite, hepatoesplenomegalia
e anemia (Figura 7 B).
1.4 CICLO DO T. cruzi NO INVERTEBRADO
O inseto vetor pica os hospedeiros vertebrados infectados,
sugando tripomastigotas presentes na corrente sangunea. As formas
tripomastigotas transformam-se em epimastigotas e esferomastigotas,
medida que migram pelas diferentes pores do intestino do inseto. As
formas epimastigotas colonizam preferencialmente o intestino mdio.
Neste local, as formas epimastigotas multiplicam-se intensamente
por diviso binria. Aps ocorrer a adeso do parasita ao epitlio,
atravs do agelo, alguns desses epimastigotas transformam-se em
12
tripomastigotas na poro nal do tubo digestivo (ampola retal). As
formas resultantes dessa transformao, denominada metaciclognese,
so denominadas tripomastigotas metacclicas (formas infectantes),
que so encontradas principalmente no reto do inseto vetor. As formas
esferomastigotas tambm podem transformar-se diretamente em
formas metacclicas. As formas infectantes so eliminadas com as fezes
ou com a urina, quando o inseto pica novamente um outro indivduo,
pois esses insetos tm o hbito frequente de defecar durante ou logo
aps o repasto sanguneo. O processo de metaciclognese ocorre
naturalmente no intestino do inseto vetor. Este fenmeno regulado
pela interao de produtos da secreo intestinal e por produtos
derivados da digesto do sangue ingerido (Carvalho-Moreira et al.,
2003), assim como pela falta destes ltimos (reduo de nutrientes),
pois os triatomneos por vezes podem car privados de alimentao
por muito tempo na natureza. A metaciclognese pode tambm ser
conseguida in vitro, em condies qumicas denidas atravs do
estresse nutricional, atravs da incubao em um meio de diferenciao
articial denominado TAU 3AAG, por exemplo.
Figura adaptada de REY, L. Parasitologia. 3 ed.: Guanabara Koogan, 2001, por
Bruno Eschenazi, Angela C. V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.
Figura 7: Esquemas representativos dos ciclos
de vida do T. cruzi (A) e do T. rangeli (B).
13
1.5 CICLO DO T. rangeli NO INVERTEBRADO
O T. rangeli foi descrito pela primeira vez na Venezuela, em 1920
(Tejera, 1920), como sendo uma espcie de parasita encontrada
exclusivamente na Amrica Central e na Amrica do Sul, onde
apresenta maior prevalncia na primeira e no Noroeste da Amrica do
Sul. Compartilha hospedeiros mamferos e vetores com o T. cruzi. A
primeira descrio de infeco humana comprovada no Brasil foi feita
por Coura et al., em 1996. Em condies naturais, o triatomneo ingere
o sangue de algum mamfero infectado com as formas tripomastigotas
sanguneas. Essas se transformam em epimastigotas na parte mdia
do trato digestivo do triatomneo. O T. rangeli consegue atravessar o
epitlio do intestino do barbeiro, invadindo a hemolinfa. Uma vez na
hemolinfa, ativa o sistema de defesa do inseto. Quando consegue
escapar deste sistema de defesa, o parasita atinge as glndulas
salivares, onde realiza a metaciclognese, transformando-se na
forma tripomastigota metacclica infectante, que ser transmitida a
outro mamfero pela picada. A seguir, so mostradas a anatomia do
tubo digestivo do triatomneo e a morfologia das principais formas
evolutivas do T. cruzi e do T. rangeli no inseto vetor (Figuras 8A, 8B e
8C).
14
Figuras desenhadas por Bruno Eschenazi, elaboradas por
Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.
Figura 8: Anatomia interna do triatomneo (A) e principais formas
evolutivas do T. cruzi (B) e T. rangeli (C) no inseto vetor.
2.1 Blastocrithidia sp
Alguns triatomneos capturados no campo podem albergar
naturalmente o tripanossomatdeo monogentico Blastocrithidia sp. A
forma de transmisso ocorre quando um inseto se alimenta das fezes
de outro inseto (coprofagismo-CO) ou quando ele se alimenta em outro
inseto (canibalismo-CA), porm na natureza isso no frequente. As
possibilidades de contaminao aumentam quando os triatomneos
so mantidos em reas restritas, como ocorre nos insetrios, quando
o jejum prolongado. Nessas situaes eles tendem a praticar a
coprofagia e possivelmente o canibalismo, o que facilita o processo
de transmisso. As guras 9 e 10 demonstram respectivamente o ciclo
evolutivo e formas epimastigotas de Blastocrithidia triatomae.
2. OUTRA ESPCIE DE TRIPANOSOMATDEO ENCONTRADA
NOS TRIATOMNEOS
15
Foto de Angela C. V. Junqueira.
Figura 10: Formas epimastigotas de Blastocrithidia triatomae.
Figuras adaptadas por Bruno Eschenazi, Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira
do site: http//:parasitology.informatik.uniwuerzburg.de/login/n/h/0163.html).
Figura 9: Ciclo da Blastocrithidia sp.
16
3. CICLOS BIOLGICOS DE TRANSMISSO
Segundo Dias (1958) e Forattini (1980), o ciclo primitivo do T.
cruzi de natureza enzotica, circulando o parasita entre vetores e
reservatrios silvestres (Figura 11). A doena de Chagas humana
uma situao recente, causada pelo crescimento e disperso da
populao humana com a consequente aproximao dos locais onde
existe esse ciclo.
Podemos dizer que a doena de Chagas foi e continua sendo
uma endemia basicamente rural, de populaes de baixa renda e de
pouca cultura, que vivem em condies precrias, onde ela no foi
erradicada, favorecendo a domiciliao de algumas espcies vetoras,
dando origem ao chamado ciclo domstico do parasita. Entretanto,
esse quadro vem se modicando com o sucesso de alguns programas
de controle.
Ref: Pessoa, S. 1962. Domiciliao dos triatomneos e epidemiologia da doena de Chagas.
Arq. Hig. Sade Pub. 27 (92): 161-171.
Figura 11: Ciclos biolgicos do Trypanosoma cruzi.
17
Outros pers tm sido descritos. Triatomneos silvestres podem
infectar o homem e os animais domsticos em seu habitat natural,
levando ao aparecimento de casos ocasionais da doena de Chagas,
denotando a no necessidade de triatomneos domiciliados para que
ocorra a transmisso vetorial.
As pginas seguintes ilustram diferentes modelos de ciclos
biolgicos do T.cruzi e algumas das principais espcies de triatomneos
existentes na Regio Amaznica. Nos ltimos anos vem merecendo a
ateno o nmero crescente de casos agudos na regio onde no
tm sido descritas espcies domiciliadas com exceo do Triatoma
maculata.
3.1 CICLO DOMSTICO
Os triatomneos, que so insetos estritamente hematfagos,
podem encontrar em algumas habitaes humanas as condies
ideais de sobrevivncia, possuindo abrigo e oferta alimentar, tornando-
se insetos domiciliados (Figura 12A). Esse fenmeno (domiciliao)
tornou a transmisso vetorial o principal mecanismo primrio da
propagao da doena de Chagas. A domiciliao e a colonizao
mostraram-se ecientes para certo nmero de espcies, como por
exemplo, o Triatoma infestans no Brasil.
3.2 CICLO PERIDOMSTICO
Algumas espcies de triatomneos podem assumir uma biologia
especial, adaptando-se a viver em reas em torno das habitaes
humanas, como telheiros, stos, chiqueiros, galinheiros etc, nutrindo-
se do sangue de animais domsticos, conforme o exemplo da Figura
12 B. No Brasil, entre as principais espcies de tritomneos encontradas
neste modelo de ciclo biolgico, podemos citar o Triatoma sordida e
T. pseudomaculata.
importante ressaltar que uma mesma espcie pode ser encontrada
tanto no domiclio como no peridomiclio.
18
Desenho de Bruno Eschenazi e Angela C.V. Junqueira.
Figura 12: Ciclos biolgicos domstico (A) e peridomstico (B) do T. cruzi.
3.3 CICLO SILVESTRE
O aparecimento da doena de Chagas ocasional, como demonstrado
em algumas reas da Regio Amaznica, vem sendo vericado entre os
trabalhadores que extraem as bras da palmeira Leopoldinia piassaba.
Esses trabalhadores cam expostos ao contato com triatomneos da
espcie Rhodnius brethesi, denominados localmente de piolhos da
piaava, que habitam a referida palmeira. Esse contato contnuo,
uma vez que o extrativista xa sua moradia perto do local de extrao.
A Figura 13 demonstra possveis formas de infeco do homem
no ambiente silvestre pelo T. cruzi: por exposio ao vetor durante
o trabalho de extrao da bra (Figura 13A) ou pela exposio
picada durante noite em colocaes, nos locais de acampamento
(Figura 13B).
19
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio Negro-
Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.
Figura 13: Ciclo biolgico do T. cruzi, em reas de extrativismo da
Regio do Mdio e Alto Rio Negro, Estado do Amazonas, Brasil (A, B).
20
3.4 CICLO DE TRANSMISSO ORAL
A transmisso por via oral acontece pela ingesto de alimentos
contaminados com o parasito. Essa contaminao pode ser natural ou
externa. A natural ocorre pela ingesto de carne crua ou mal cozida
de animais infectados, ou pelo leite materno (situao espordica
e rara); a contaminao externa ocorre pela deposio de fezes ou
urina de triatomneos sobre o alimento ou mesmo de secreo anal
de marsupiais infectados.
Segundo Barreto (1979), esse tipo de transmisso (oral) usual
entre os mamferos do ciclo silvestre da tripanossomase americana,
que ingerem triatomneos ou a carne de mamferos infectados. Com
relao ao homem no havia muitos relatos na literatura, porm a
partir da ltima dcada vrios casos tm sido descritos na Amaznia
brasileira, grande parte deles atribudos ingesto de suco de frutos
de palmeiras contaminados com a forma infectante do T.cruzi, oriunda
de triatomneos infectados (Tabela 2). S na Amaznia brasileira j
foram descritas 25 espcies de triatomneos (Aguilar et al., 2007),
estando algumas delas representadas na pgina seguinte (Figura 14).
No ciclo biolgico a seguir, est representado o possvel modelo
de transmisso oral ocorrido no municpio de Mazago, no Estado
do Amap, onde foram registrados 17 casos de infeco aguda de
doena de Chagas. Valente et al. (2009) atriburam a provvel fonte de
infeco ao suco de aa preparado em mquina eltrica, possivelmente
contaminada com fezes ou tubo digestivo de triatomneos infectados
(Figura 15).
Em maro de 2005, ocorreu um surto da doena em Santa Catarina,
onde os dados epidemiolgicos, levantados por tcnicos do Ministrio
da Sade e da Secretaria Estadual de Sade, indicavam que a nica
fonte de infeco comum seria a ingesto de caldo de cana contendo
formas infectantes do T. cruzi. Os trabalhos de campo sugeriram que
a contaminao tenha ocorrido durante a moagem da cana-de-acar
junto com inseto vetor infectado, vindo da mata prxima ao local de
processamento do caldo.
21
Fotos: Rodrigos Mxas e Marco Aurlio P. da Silva. Layout: Rodrigos Mxas.
Figura 14: Algumas espcies vetoras da Regio Amaznica.
22
Fonte: boletim Informativo sobre vigilncia epidemiolgica da doena de Chagas
FUNASA- Instituto Evandro Chagas.
Figura 15: Ciclo biolgico do T. cruzi em outra rea da Regio Amaznica.
Fonte: SVS/MS. Dados sujeitos modicao. Dados atualizados at agosto de 2011.
http://portal.saude.gov.br/portal/saude/prossional/visualizar_texto.cfm?idtxt=31454
Tabela 2: Casos de Doena de Chagas Aguda no Brasil de 2007 a 2010.
23
4. DIAGNSTICO LABORATORIAL DA INFECO PELO
Trypanosoma cruzi
Segundo Luquetti & Rassi (2000): ... o diagnstico da infeco
pelo T. cruzi deve ser apoiado pela epidemiologia, pela clnica e
conrmado quanto etiologia, pelo diagnstico laboratorial que
oferece importantes subsdios, desde que realizados com tcnicas
apropriadas, reagentes adequados e seguindo as boas prticas de
laboratrio.... Podemos tomar isso como uma norma a ser seguida.
Dentro do conhecimento geral do curso da infeco, imprescindvel
que que consolidado o conceito de que a infeco pelo T. cruzi
no homem apresenta duas fases. A fase inicial ou fase aguda
caracterizada pela relativa facilidade com que se evidencia o parasito
no sangue perifrico, com manifestaes clnicas gerais de porta de
entrada do parasito; tais manifestaes so caractersticas e conduzem
suspeita imediata de uma infeco aguda, e que se conrma com
a deteco do parasito no sangue. importante ressaltar que nem
sempre essas manifestaes se fazem presentes. Em contraste, na fase
seguinte, ou fase crnica, ocorre a diminuio do nmero de parasitos
na corrente sangunea, sendo por isso difcil seu encontro no exame
parasitolgico direto. Neste caso, utilizam-se mtodos parasitolgicos
indiretos e de enriquecimento, que demonstram maior sensibilidade
que os diretos e que permitem o isolamento do parasita para estudos
de identicao e caracterizao. Na fase crnica ocorre um perodo
de latncia clnica, na maioria dos casos, cujas manifestaes podem
aparecer anos aps a infeco (Prata, 1968; Dias & Macedo, 2005).
O diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi pode ser
dividido, didaticamente, em 3 categorias: parasitolgicos, moleculares
e sorolgicos. Alguns autores dividem em apenas dois grupos:
parasitolgicos e sorolgicos.
Os mtodos parasitolgicos baseiam-se na demonstrao do
parasito sob a forma de tripanossoma no sangue e outros lquidos
orgnicos, ou ento sob a forma de leishmania (amastigotas) nos
24
tecidos. Segundo o procedimento, esses mtodos so classicados
em diretos e indiretos, conforme mencionado anteriormente.
Recentemente, com o surgimento da tecnologia da PCR (Polymerase
Chain Reaction), um grande avano foi conseguido no diagnstico dos
agentes infecciosos. No nal da dcada de 80, vrios ensaios surgiram
utilizando a PCR na deteco do T. cruzi, cando demonstrada a sua
maior sensibilidade em relao aos mtodos parasitolgicos clssicos.
A PCR consiste na sntese enzimtica, in vitro, de milhes de cpias de
uma sequncia especca de DNA do patgeno.
A outra linha de procedimentos adotados a dos mtodos
sorolgicos, que tm como princpio a ligao antgeno (Ag)-anticorpo
(Ac), cuja ligao pode ser revelada por protocolos com fundamentos
tcnicos distintos.
A grande maioria dos testes utilizados na rotina baseia-se na
pesquisa de Acs no soro ou plasma, sendo bem menos usual a deteco
de Ags. Seu emprego no diagnstico da infeco bem abrangente, o
que se deve em grande parte a sua elevada sensibilidade, otimizao
e custos relativamente baixos em relao aos outros mtodos, sendo
o mtodo laboratorial de escolha nas triagens de doadores de sangue
e inquritos epidemiolgicos.
fundamental que que bem compreendido que A DCA corresponde
ao perodo inicial da infeco pelo Trypanosoma cruzi em mamferos,
podendo apresentar-se aparente ou inaparente. Dene-se basicamente
pela alta parasitemia detectvel por exames parasitolgicos diretos
do sangue, tendo durao geralmente efmera no ser humano (entre
trs e oito semanas), podendo ser letal em crianas de baixa idade e
indivduos imuno-comprometidos ou evoluir para uma forma crnica
de longa durao que se caracteriza por baixssima parasitemia e
um elevado e consistente teor de anticorpos da classe IgG (Figura
16). Desta forma, o mtodo de escolha para o diagnstico estar
condicionado fase da infeco apresentada pelo indivduo.
25
4.1 EXAMES PARASITOLGICOS DIRETOS
Demonstram a presena da infeco atravs da visualizao dos
parasitos ao microscpio ptico. Tm alta especicidade e sensibilidade
na fase inicial da infeco (casos agudos) e muito baixa sensibilidade
nos casos crnicos.
4.1.1 GOTA DE SANGUE EXAMINADA A FRESCO
Pesquisa direta do parasito na amostra biolgica, sem submet-
lo a processos de xao e colorao. O sangue colocado entre
a lmina e a lamnula e examinado ao microscpio ptico com o
aumento de 400 vezes (400 x). Os parasitos so visualizados pelos
seus rpidos movimentos por entre as hemcias, que so por eles
deslocadas (Luquetti & Rassi, 2000).
4.1.2 DISTENSO FINA E GOTA ESPESSA
Como no mtodo anteriormente citado, a tcnica baseia-se na
pesquisa direta do parasita na amostra clnica, que submetida a
processos de xao e colorao. O sangue pode ser coletado por
puno venosa ou digital, de preferncia sem o anticoagulante, que
Figura 16: Curva parasitmica nas fases aguda e crnica da doena de Chagas.
Fonte: Manual Prtico de Subsdeo Notio Obrigatria no SINAN, disponvel no
site http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_chagas.pdf
26
altera a xao do material. As tcnicas que empregam colorao
permitem a caracterizao morfolgica do T. cruzi e a sua diferenciao
do Trypanosoma rangeli, sendo importante sua utilizao onde as
duas espcies so encontradas coabitando. Nesse exame poderemos
encontrar diferentes formas de T. cruzi presentes no sangue perifrico
(Figura 17).
Fonte: Brener Z., Chiari E. Variaes morfolgicas observadas em diferentes amostras de
Trypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v. 5, p. 220-224, 1963.
Figura 17: Exemplo de diferentes formas tripomastigotas de T.cruzi presentes no
sangue de camundongos infectados experimentalmente (polimorsmo):
A) formas nas; B) formas largas; C) formas muito largas.
4.1.3 MTODOS DE CONCENTRAO DE PARASITAS
So mtodos que permitem a investigao direta do parasita
na amostra clnica concentrada por centrifugao. Entre os mais
empregados na rotina laboratorial esto o micro-hematcrito
(Secretaria Nacional de Vigilncia em Sade, Ministrio da Sade.
Doena de Chagas Aguda: Manual prtico de Subsdio Noticao
Obrigatria no Sinan- http://portal.saude.gov.br/saude/), o mtodo
de pesquisa do parasita no creme leucocitrio (Rey, L. Mtodos e
tcnicas usuais em parasitologia. In: Parasitologia. 3 Ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2001. p.788) e o mtodo de concentrao de
Strout (Strout, 1962).
27
No MTODO DE MICRO-HEMATRCRITO examina-se o sangue do
paciente com anticoagulante, aps centrifugao, em um microtubo
capilar.
Para tal, o sangue pode ser coletado inicialmente em tubo coletor
com EDTA ou heparina e ento transferido, por capilaridade, para
um microtubo capilar seco. O sangue pode ser tambm coletado,
por puno digital, empregando o prprio microtubo capilar com
anticoagulante.
Deve-se preencher, aproximadamente, 2/3 do microtubo por
capilaridade. Para isso, inclinar com cuidado o tubo contendo o
sangue e introduzir uma das extremidades do microtubo no interior
do mesmo; o sangue entrar por capilaridade. Sugerimos encher pelo
menos dois microtubos por amostra suspeita.
Aps o preenchimento, limpar externamente, com papel
absorvente, o lado do microtubo que entrou em contato com o sangue.
Aps a limpeza, o lado do microtubo que car mais distante do
centro do rotor da centrfuga dever ser vedado/selado com massa
selante apropriada. Durante esse processo, fechar a extremidade
oposta do microtubo com o dedo; isso evitar que o sangue escorra na
massa durante o procedimento de vedao. A seguir, pressionar uma
das extremidades do microtubo na massa selante em movimento de
rotao, preenchendo 0,3 - 0,5 cm do microtubo com massa.
Depois de vedado, o microtubo deve ser transferido para uma
microcentrifuga apropriada e centrifugado por 5 a 10 minutos a
160 g (Figuras 18A e B). Colocar o capilar na centrfuga de micro-
hematcrito com a extremidade vedada para o lado externo. Os
microtubos devem estar balanceados, ou seja, um microtubo capilar
em posio oposta ao outro. Imediatamente aps a centrifugao,
o tubo deve ser levado ao microscpio onde examina-se o creme
leucocitrio (interface entre as camadas de plasma e hemcias),
empregando aumento de 100x (Figuras 18 C e D). Outra opo ,
com cuidado e utilizando equipamentos de proteo individual para
28
evitar contaminao acidental, quebrar o microtubo na regio prxima
ao creme leucocitrio e retir-lo para exame entre lmina e lamnula
com aumento de 400x. Frente a casos suspeitos com exame inicial
negativo, o mtodo deve ser repetido em horrios diferentes durante
alguns dias (WHO Technical Report Series, 1991; Secretaria Nacional de
Vigilncia em Sade, Ministrio da Sade. Doena de Chagas Aguda:
Manual Prtico de Subsdio Noticao Obrigatria no Sinan).
Fotograas de Carlos Jos de Carvalho Moreira e desenhos de Bruno Eschenazi.
Figura 18: Centrfuga de microhematcrito (A, B), microcapilar aps a
centrifugao (C), microcapilar montado em lmina para exame
ao microscpio e destaque da rea a ser examinada (D).
No MTODO DE STROUT, coleta-se 5 a 10 ml de sangue sem
anticoagulante e faz-se uma dupla centrifugao. Aps a primeira
centrifugao a 160 g por 3 minutos, o sobrenadante separado
sendo novamente centrifugado a 400 g por 20 min. O sedimento
resultante ento examinado entre lmina e lamnula com aumento
de 400x (WHO Technical Report Series, 1991; Secretaria Nacional de
Vigilncia em Sade, Ministrio da Sade. Doena de Chagas Aguda:
Manual prtico de Subsdio Noticao Obrigatria no Sinan).
29
Na busca de um protocolo para exame do CREME LEUCOCITRIO,
utilizado na rotina de deteco de T.cruzi no sangue, nos foi enviado
o empregado pelo Laboratrio Central de Sade Pblica (LACEN) do
estado do Par (Email: lacen@sespa.pa.gov.br). Nesse protocolo, o
sangue (10 ml) coletado em tubos com anticoagulante e centrifugado
a 1500 r.p.m. por 10 minutos (Rey, 2001). Logo aps a centrifugao,
retira-se, inicialmente, empregando-se uma pipeta, toda a camada
superior de plasma, mantendo no tubo a interface na que contm
os glbulos brancos e a camada de clulas sanguneas vermelhas
inferior. Aps a retirada do plasma, com o auxlio de uma outra pipeta,
coleta-se a camada mais clara de glbulos brancos (creme leucitrio
ou buffy coat), tendo o cuidado para no pipetar junto a camada
de clulas sanguneas vermelhas. Esse creme leucitrio poder ser
diretamente examinado entre lmina e lamnula com aumento de
400x ou utilizado para a confeco de um ou mais esfregaos que
sero desemoglobinizados e xados. Neste caso, aps a xao, cora-
se pelo Giemsa (1ml de gua tamponada + 2 gotas de corante) durante
25 minutos. Por ltimo, a lmina lavada com gua tamponada e
deixada para secar na temperatura ambiente. A(s) lmina(s) corada(s)
dever(o) ser examinada(s) no microscpio ptico com aumentos
de 400x e 1000x (lente de imerso).
O LACEN do estado da Bahia (Email: lacen.diretoria@bahia.ba.gov.
br ou lacen.copram@bahia.ba.gov.br) tambm utiliza a tcnica citada
anteriormente, porm, recomenda no caso de resultado negativo (e
de disponibilidade de material), transferir o creme e o sobrenadante
para outro tubo e centrifugar a 1800-2000 r.p.m. durante 5 minutos.
Fazer um novo esfregao e seguir o mesmo procedimento em relao
colorao e exame microscpico.
Existem tambm outros mtodos, como o QBC (Quantitative
Buffy Coat) e o mtodo de concentrao em gradiente de Ficoll-
Hypaque.
30
O MTODO DO QBC consiste na concentrao dos parasitos pela
centrifugao do sangue, em tubos de micro-hematcrito, combinada
com a colorao dos cidos nucleicos do parasito pelo uorocromo
denominado Laranja de Acridina. um teste de alto custo por envolver
microscopia uorescente e tubos previamente preparados com
anticoagulante e corantes especiais. Em estudo experimental usando
a tcnica do QBC, Amato Neto e colaboradores (1996) detectaram o
T. cruzi em camundongos, na fase aguda da infeco, at uma diluio
do sangue de 1/10.000. Os equipamentos necessrios realizao do
exame esto representados a seguir (Figura 19).
O MTODO DE CONCENTRAO DE FICOLL-HYPAQUE se baseia
na centrifugao de sangue heparinizado (6 ml) em gradiente de
Ficoll-Hypaque (3 ml) (Budzko & Kierszenbaum, 1974). Consiste na
centrifugao do sangue com anticoagulante a 400 g durante 20 min.
Como o Ficoll possui uma densidade maior que a dos linfcitos, porm
menor que os glbulos vermelhos e granulcitos, aps a centrifugao
os glbulos vermelhos e os polimorfonucleares passam pelo Ficoll
formando um pellet no m do tubo. As clulas mononucleares cam na
interface entre o plasma e o Ficoll, junto camada de mononucleares,
onde o parasito dever ser pesquisado (Figura 20).
Os mtodos de concentrao tm sido empregados com sucesso
na suspeita de casos agudos de reativao da infeco (Sartori et al.,
1995; Sartori et al., 1998; Galhardo et al., 1999; Santos et al., 2002 e
Oliveira et al., 2010).
Fonte: sites www.qbcdiagnostics.com e www.labessentials.com/Lumin_uorescence_microscopy.htm
Figura 19: Equipamentos e materiais utilizados na Tcnica do QBC (A-D).
31
Esquema de Carlos Jos de Carvalho Moreira.
Figura 20: Fundamento do mtodo de concentrao de Ficoll-Hypaque.
4.1.4 INFORMAES COMPLEMENTARES:
4.1.4.1 DETECO DIRETA DO T. cruzi NO LQUIDO
CEFALORRAQUIDIANO
Em pacientes com co-infeco Chagas-HIV e pacientes chagsicos
imunocomprometidos por terapia supressiva, que apresentem sinais
e sintomas de reagudizao da infeco, a pesquisa parasitolgica
direta de T. cruzi no deve se restringir apenas ao sangue perifrico,
mas ser tambm realizada no lquido cefalorraquidiano (Figura
21). importante alertar que, para se obter amostra de lquido
cefalorraquidiano, necessrio um prossional qualicado e
experiente. Casos agudos, com envolvimento do Sistema Nervoso
Central (SNC), tambm requerem amostras biolgicas diferenciadas e
a realizao de exames complementares de diagnstico. Uma srie de
artigos na literatura tem relatado a presena de T. cruzi por mtodos
parasitolgicos diretos e indiretos realizados de amostras obtidas por
puno medular.
32
4.1.4.2 CONSERVAO DAS AMOSTRAS AT O ENVIO
SORO: 2 a 8C (geladeira), at 5 dias; -20C (freezer), at 15 dias.
EXAME PARASITOLGICO: as lminas devem ser enviadas aps
o esfregao ou a gota espessa estarem secos. Devero conter os
dados de identicao do paciente. As lminas no xadas devem ser
enviadas at 24 horas; As xadas devem ser enviadas at 7 dias aps a
confeco. Enviar temperatura ambiente. Para maiores informaes
consultar o Manual de coleta, acondicionamento e transporte de
material biolgico para exames laboratoriais da FUNED, no link:
<http://funed.mg.gov.br/wpcontent/uploads/2011/11/manual_
transporte_coleta_2011.pdf>.
4.1.4.3 CONVERSO DE g EM r.p.m.
Como as centrfugas mais antigas no permitem fazer a converso
de g em r.p.m. e vice-versa, no prprio equipamento, elaboramos um
exerccio para que o tcnico do laboratrio possa fazer essa converso
(Vide pginas 140-142 dos ANEXOS DOS MDULOS I E II).
Fonte: Oliveira, L R; Assis, L L T; Maltos, A L; Cali, M C F R; Moraes-Souza, H. Reativao da doena de
Chagas com envolvimento do sistema nervoso central durante tratamento de linfoma no Hodgkin.
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. 32(3):269-272; 2010.
Figura 21: Formas tripomastigotas de T.cruzi no uido cerebroespinhal.
33
4.2 EXAMES PARASITOLGICOS INDIRETOS
Os mtodos parasitolgicos indiretos, ou de enriquecimento,
costumam ser empregados na fase crnica da infeco, onde a
pobreza de formas tripomastigotas no sangue perifrico torna difcil a
demonstrao diretamente na amostra biolgica. Essa deteco pode
ser realizada por 4 mtodos indiretos: xenodiagnstico, hemocultura,
xenocultura e inoculao em animais de laboratrio.
4.2.1 XENODIAGNSTICO (Brumpt, 1914)
Seu resultado depende diretamente da espcie de triatomneo
empregada e do nmero de ninfas utilizadas (Dias, 1940; Schenone
et al., 1969; Cerisola et al., 1974; Borges-Pereira et al., 1996).
Tem sensibilidade de 13% at 50% em indivduos sorologicamente
positivos, na fase crnica da infeco. empregado como mtodo
conrmatrio no acompanhamento laboratorial de pacientes
chagsicos (Castro et al., 1983) e na avaliao teraputica na infeco
chagsica crnica (Canado et al., 1969).
O xenodiagnstico pode ser direto (tradicional - in vivo) ou indireto
(articial - in vitro). No xenodiagnstico direto, 40 exemplares de
triatomneos, de uma determinada espcie, so acondicionados em
quatro pequenas caixas de madeira ou de plstico. As caixas so cobertas
com l ou morim (para permitir a alimentao dos insetos) e estes
tecidos so xados com elsticos. Essas caixas devem ser devidamente
identicadas com os dados do paciente. Na sequncia, as caixas so
colocadas diretamente sobre a pele do paciente, para a alimentao
dos insetos, conforme a sequncia de fotograas a seguir (Figura 22).
No xenodiagnstico indireto, os triatomneos ingerem o sangue
(coletado com anticoagulante) do hospedeiro vertebrado por meio de
uma mamadeira de vidro ou frascos de modelos diversos (Nicolle &
Woff, 1943; Rutledge et al., 1964). Os frascos so revestidos com uma
na membrana natural ou articial que permite o contato da pea bucal
do inseto com o sangue contido no mesmo (Figura 23). importante
que este sangue seja mantido aquecido a 37C para permitir a atrao
do triatomneo pelo calor (termotropismo). Como membrana articial
34
Fotograas de Rodrigo Mxas (A, B) e Carlos Jos de C. Moreira (C, D).
Figura 22: Montagem das caixas para o xenodiagnstico direto (A, B)
e aplicao do xenodiagnstico direto (C, D).
utiliza-se normalmente um pedao de preservativo, sem lubricante,
lavado previamente com gua destilada e seco. No xenodiagnstico
indireto evita-se a reao alrgica picada do inseto.
Fotograas cedidas pelo Dr. Rodolfo A. Devera.
Figura 23: Xenodiagnstico indireto (A, B).
35
Aps a alimentao sangunea devemos vericar e selecionar
apenas as ninfas que se alimentaram (as que apresentam o abdmen
distendido, independente do grau de distenso), colocando-as em um
recipiente maior. O exame das ninfas dever ser realizado aos 45 ou
60 dias aps a alimentao, de acordo com o procedimento padro
adotado no laboratrio. At a leitura, os insetos podero ser mantidos
a temperatura ambiente. Na metade do perodo de tempo entre a
alimentao e o exame, as ninfas devero receber uma alimentao
suplementar de sangue, que poder ser feita em galinha (Gallus
gallus). Esta alimentao importante para a manuteno do T.
cruzi no inseto.
A tcnica utilizada para o exame dos triatomneos est descrita nas
pginas 96/97 do mdulo II.
4.2.2 HEMOCULTURA (Chagas, 1909)
outro procedimento indicado na deteco do T. cruzi na fase
crnica da infeco. Ele se baseia no cultivo da amostra clnica coletada
(sangue, lquor, etc.) contendo o parasito, em meios de cultura
enriquecidos. So utilizados aproximadamente 30 ml de sangue
centrifugado a 4C, sendo o sedimento semeado em tubos com meio
LIT (Liver Infusion Tryptose). Os tubos semeados so incubados
temperatura de 28C, em estufa incubadora de BOD (Chiari & Dias,
1975; Luz et al., 1994). A leitura do exame feita aos 30, 60, 90
e 120 dias aps o cultivo. Aos 120 dias (ltimo exame) realizada
uma centrifugao para exame do sedimento (pellet). A sensibilidade
desse mtodo de cerca de 30% at 79% (varivel e nem sempre
reprodutvel). Este mtodo deve ser o escolhido quando se deseja
isolar o parasito para estudos bioqumicos, biolgicos e moleculares.
4.2.3 XENOCULTURA
A xenocultura (Bronfen et al., 1989) a semeadura do tubo
digestivo ou fezes do triatomneo em meio LIT. Esse procedimento
possibilita o isolamento de cepas de T. cruzi e controla a qualidade
dos xenodiagnsticos realizados.
36
Como no representa um acrscimo signicativo na positividade
dos exames, sugere-se seu uso apenas para controle de qualidade
na avaliao dos xenodiagnsticos. Inicialmente faz-se a esterilizao
externa do triatomneo em Soluo de White, por aproximadamente 1
hora. Posteriormente, retira-se o tubo digestivo do inseto (podendo-
se fazer um pool de alguns insetos), macera-se o contedo e faz-se
a semeadura em meio LIT, contendo antibitico (tudo dentro de uma
capela de uxo laminar). Incuba-se a 28C e examina-se, pela primeira
vez, aps 20 dias. O procedimento de retirada do tubo digestivo o
mesmo empregado no xenodiagnstico direto e indireto.
Soluo Esterilizante de White: 0,25 g de HgCl
2
6,50 g de NaCl
25 ml de HCl concetrado
250 ml de Etanol a 5%
750 ml de H
2
O
Fonte: Bronfen et al. Isolamento de amostras do Trypanosoma cruzi por xenodiagnstico e hemocultura de
pacientes na fase crnica da doena de Chagas. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz,
v. 84, n. 2, p. 237-240, 1989.
4.2.4 INOCULAO EM ANIMAIS DE LABORATRIO
A inoculao em animais, dos mtodos anteriormente relatados,
o procedimento menos usual, sendo mais utilizado nos estudos de
patogenicidade das populaes ou clones do T. cruzi. Isso se deve
baixa eccia do mtodo como demonstrado por alguns autores
(Freitas, 1947). importante ressaltar que este tipo de procedimento
dever ser submetido s Comisses de tica de animais (Figura 24).
Fotograa de Carlos Jos de Carvalho Moreira.
Figura 24: Inoculao intraperitoneal
em camundongo.
37
5. EMPREGO DOS MTODOS PARASITOLGICOS
OBS: Os procedimentos anteriormente descritos esto no Manual Prtico
de Subsdio Noticao Obrigatria no SINAN do Minstrio da Sade.
5.1 CASO SUSPEITO DE CHAGAS AGUDO
Realizar exame a fresco imediato, repetindo 3 a 4 vezes ao dia durante
alguns dias;
Procurar enriquecer a pesquisa, realizando concomitantemente a
tcnica de micro-hematcrito;
Se no dispuser de microscpio no local, pode-se colher gota espessa
para exame em municpio vizinho, num esquema similar ao do exame
a fresco;
Colher sangue venoso (ou capilar, em papel de ltro) para realizar
imediatamente a pesquisa usual de anticorpos da classe IgG por
tcnicas convencionais, repetindo este exame 3 semanas aps. Uma
viragem do resultado indicar doena aguda;
Pesquisar anticorpo anti T. cruzi da classe IgM (com restries).
5.2 CASO SUSPEITO DE CHAGAS CONGNITO
Efetuar a pesquisa direta (ou por micro-hematcrito) do parasito no
cordo umbilical ou venoso (criana), repetindo como relatado no
quadro anterior;
Realizar sorologia convencional para pesquisa de IgG anti T. cruzi
na criana. Repetir a sorologia aos seis ou sete meses de idade a
qual, sendo positiva, sugestiva de doena de Chagas congnita (ou
recentemente transmitida por outra via).

Fonte: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_chagas.pdf
Esquema prtico do procedimento diagnstico frente a um caso
suspeito de Doena de Chagas (Ministrio da Sade do Brasil).
38
6. DIAGNSTICO MOLECULAR
Tem como alvo a deteco do DNA (cido desoxirribonucleico) e o
RNA (cido ribonucleico) do patgeno. Esta estratgia de diagnstico
tem duas grandes vantagens: no depender da imunocompetncia
do organismo infectado e do tempo de infeco como nos testes
sorolgicos, bem como s detectar o DNA na presena do patgeno
no uido biolgico, pois esta molcula no permanece livre por muito
tempo no organismo infectado.
6.1 REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
um mtodo de sntese enzimtica, in vitro, que permite a
obteno de milhes de cpias de sequncias de DNA. Baseia-se
na programao de ciclos repetitivos de desnaturao, hibridao e
extenso, conseguidos atravs de alteraes sucessivas de temperatura
(Figura 25). A sensibilidade do teste depende, em grande parte, do
nmero de repeties dos segmentos alvos da amplicao (stios),
enquanto que a especicidade depende dos iniciadores (primers)
empregados. um mtodo mais sensvel do que os mtodos
parasitolgicos clssicos de deteco do T. cruzi na fase crnica da
infeco.
O mtodo de PCR permite detectar DNA do parasita em diferentes
amostras biolgicas, tais como:
sangue total - Avila 1) et al. (1991) utilizaram uma soluo
composta por 6 M Guanidina HCl - 0.2M EDTA, que permitiu
estocar o sangue coletado, temperatura ambiente para
posterior anlise .
soro - Russomando 2) et al. (1992) conseguiram amplicar o T.
cruzi em amostras de soro;
lquor - Lages-Silva 3) et al. (2002) comprovaram a existncia de
DNA de T. cruzi no lquor de um paciente chagsico / HIV + ;
39
contedo fecal/ tubo digestivo de triatomneos Valejo 4) et al.
(1999) conseguiram amplicar T. cruzi em amostras de tubo
digestivo e hemolinfa de Rhodnius prolixus;
cortes de tecidos - Ghul 5) et al. (1997) mostraram ser possvel
detectar DNA de T. cruzi em amostras extradas de tecido
mumicado humano. Vago et al. (2000) vericaram, atravs
da tcnica de LSSP-PCR (low-string single primers-polymerase
chain reaction), a variabilidade gentica da populaco de T.
cruzi presente no tecido cardaco de 13 pacientes chagsicos
e em 5 com megaesfago. Elias et al. (2003) foram capazes,
atravs de uma tcnica de micromanipulaco, de detectar DNA
de T. cruzi em um nico macrfago dissecado diretamente de
uma seco de tecido cardaco.
Figura 25: Reao em cadeia de polimerase (PCR).
Figura modicada por Carlos Jos de C. Moreira e Bruno Eschenazi.
Fonte: www.sci.sdsu/.../in-vitro-genetics/PCR.gif
40
6.2 PCR QUALITATIVA
A PCR Qualitativa tem como princpio a amplicao in vitro
de sequncias especcas do material gentico (DNA ou RNA) do
organismo alvo (Kleppe et al.,1971) e seu resultado baseia-se
na visualizao do produto amplicado em gel de agarose ou
poliacrilamida (presena - PCR positiva ou ausncia - PCR negativa),
conforme mostra a Figura 26 (A e B). Neste tipo de teste, no se
admite resultado inconclusivo.
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Um estudo sobre o xenodiagnstico, a hemocultura e a reao em cadeia da
polimerase na deteco do Trypanosoma cruzi Chagas 1909 em indivduos na fase crnica da infeco
chagsica. 173 p. (tese de mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte, 1996.
Figura 26: A) Resultado padro em gel de agarose corado por brometo de etdio,
depois da amplicao de DNA extrado das amostras de sangue. A banda
de 330 pb presente representativa da amplicao da sequncia especca
do minicrculo de kDNA de T. cruzi; B) Resultado padro em gel de agarose
corado por brometo de etdio, depois da amplicao do DNA extrado
das amostras de sangue. A banda de 110 representativa da amplicao
da seqncia especca do gen de globina humana (Controle).
O avano nas tcnicas moleculares com o desenvolvimento da
PCR qualitativa aprimorou as condies de deteco de patgenos,
aliando especicidade e sensibilidade ao diagnstico (Erlich et al.,1991;
Brasileiro Filho & Pena, 1992; Silber et al., 1997). A multiplicao
de uma nica cpia de DNA em milhes de cpias lhas permite a
deteco de agentes etiolgicos antes no detectados pelos mtodos
parasitolgicos tradicionais (Breniere et al., 1995; Junqueira et
al.;1996; Gomes et al; 1999). Assim, o mtodo tem sido amplamente
41
utilizado na identicao de agentes etiolgicos de diferentes doenas,
sendo de escolha quando a quantidade de parasita escassa. Como
exemplo, a identicao de Trypanosoma cruzi em chagsicos crnicos
caracterizados pela baixa parasitemia, pode ser conseguida atrves da
PCR qualitativa (Batista et al., 2010).
A realizao da PCR precedida por uma etapa de extrao do
DNA a partir da amostra a ser estudada, que deve ser muito bem
executada. J foi demonstrado que o protocolo de extrao de DNA
inuencia o resultado da PCR. A extrao consiste de: a) lise celular
para a liberao do DNA da clula; b) remoo de protenas que
podem interferir no processo de amplicao ou que degradam o DNA
alvo (DNAses); c) precipitao e concentrao do DNA extrado. Estes
procedimentos podem ser feitos atravs do uso de mtodos in house,
kits comerciais ou preparados comerciais (DNAzol, por exemplo).
Halos et al. (2004) publicaram um estudo com carrapatos, no
qual demonstraram que diferentes protocolos de extrao geram
diferentes resultados e que a combinao de mtodos fsicos e
qumicos mais eciente do que o uso de apenas um deles. Em
outro estudo sobre extrao de DNA em artrpodes (caros), Desloire
et al. (2006) mostraram que podem ocorrer variaes na positividade
dos resultados de acordo com o estado alimentar do inseto. Em um
estudo-piloto experimental utilizando ninfas de 4 estgio de Rhodnius
brethesi e Panstrongylus megistus infectadas com 10, 100 e 1000 T.
cruzi, foram testados oito diferentes protocolos (Neves 2008, 2010).
Com a maioria dos mtodos no se obteve sucesso na extrao de
DNA, enquanto com dois, sim (surgimento de bandas de 330 pares
de base, que correspondem ao fragmento de DNA do cinetoplasto do
T. cruzi). Dos dois protocolos com os quais se conseguiu extrair DNA,
apenas um foi considerado o mais adequado por obter DNA a partir
de amostras com apenas 10 parasitas. Esses trabalhos so importantes
para demonstrar o quo importante a etapa de obteno de DNA,
para que a PCR seja convel.
42
6.3 PCR QUANTITATIVA
uma variante da reao de PCR convencional, representando
grande avano nos mtodos moleculares de auxlio do diagnstico,
particularmente por facilitar as tarefas de quanticao da expresso
gnica em determinado tecido ou amostra biolgica.
O princpio do mtodo est baseado na deteco de uorescncia
no tubo de reao medida que o DNA dupla ta sintetizado,
determinando a quantidade de DNA de uma amostra que foi
amplicada. Isso conseguido atravs de um sistema automatizado
que mede a intensidade de emisso uorescente.
A PCR em Tempo Real torna possvel, por exemplo, avaliar a carga
parasitria de um paciente chagsico. E tem a grande vantagem de
poder diminuir a contaminao da amostra, porm, apresenta um
custo mais alto do que a PCR qualitativa.
6.4 ESTUDO COMPARATIVO ENTRE A PCR E OUTROS MTODOS
DE DETECO DO T. cruzi (xenodiagnstico, hemocultura e
pesquisa em lmina)
A tabela 3 apresenta os resultados de um estudo que vem
sendo efetuado pelo Laboratrio de Doenas Parasitrias (antigo
Departamento de Medicina Tropical) do IOC-FIOCRUZ na Regio do
Mdio e Alto Rio Negro, Estado do Amazonas, Brasil, comparando o
resultado de diferentes tcnicas de diagnstico parasitolgico e uma
tcnica de diagnstico molecular em animais silvestres capturados na
Regio. Vide tambm a Figura 38 (pgina 57).
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio Negro-
Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.
Tabela 3: Comparao entre a PCR e outros Mtodos de Deteco do T. cruzi.
43
6.5 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO EMPREGO DA PCR NA
DETECO DO T. cruzi
Vantagens:
No depender diretamente da imunocompetncia do organismo 1)
infectado e do tempo* de infeco;
Possibilitar a avaliao quantitativa da parasitemia; 2)
Maior sensibilidade em relao aos mtodos parasitolgicos 3)
clssicos;
Somente detectar DNA na presena do parasita nos uidos 4)
biolgicos, visto que esta molcula no permanece muito
tempo livre no organismo (Barker,1990).
Obs.: * importante ressaltar que, apesar da alta sensibilidade, o
mtodo de PCR apresenta resultados melhores em maior parasitemia.
Desvantagens:
Alto custo - todo material importado e descartvel; 1)
Contaminao com DNA exgeno, que pode ser evitada 2)
atravs de procedimento de Condies e Condutas Bsicas
Mnimas;
No reprodutibilidade de alguns protocolos; 3)
Falta de otimizao em se tratando especicamente da deteco 4)
de DNA do T. cruzi.
44
7. DIAGNSTICO SOROLGICO
Baseia-se na deteco de antgenos, anticorpos ou imunocomplexos.
A sensibilidade mais acentuada em relao s provas parasitolgicas.
A grande maioria dos testes automatizada, o que determina um
baixo custo operacional, rapidez e simplicidade de execuo.
No caso da deteco de anticorpos, os nveis iro variar conforme
a fase da infeco (Figura 27).
Figuras adaptadas e elaboradas por Angela C. V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.
Figura 27: Pers dos nveis de anticorpos na infeco chagsica (A-B).
A formao de anticorpos especcos da classe IgM relativamente
precoce, iniciando-se ao trmino da primeira semana de infeco
e mantendo nveis detectveis durante toda fase aguda. O inverso
vericado com IgG, que comea a ser detectado ao nal da fase
aguda. Nessa fase difcil o encontro do parasita no sangue pelos
mtodos parasitolgicos diretos, como pode ser vericado nas curvas
de parasitemia feitas em camundongos infectados com diferentes
cepas (Figura 28).
45
FASE AGUDA X FASE CRNICA
Figura adaptada por Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.
Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma
cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz,
Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
Figura 28: Parasitemia experimental em camundongos nas fases aguda e crnica (A, B).
46
As provas sorolgicas podem ser realizadas e utilizadas para:
7.1 DIAGNSTICO INDIVIDUAL
Elucidao de patologias cujos sintomas clnicos no so
sucientes para o diagnstico;
Diferenciao da fase da enfermidade (investigao de IgM/
IgG);
Diagnstico de infeces congnitas;
Seleo de doadores de sangue;
Seleo de doadores e receptores de rgo para transplante;
Avaliao de teraputica especca.
7.2 INQURITOS SOROEPIDEMIOLGICOS
Estabelecimento da prevalncia da infeco. Ex.: 1 inqurito
nacional nos anos 70 no Brasil;
Avaliao dos programas de controle atravs do
monitoramento de novos casos. Ex.: 2 inqurito nacional
em menores de 5 anos de idade, em fase de publicao dos
dados/Brasil.
7.3 AVALIAO DAS PROVAS SOROLGICAS
A avaliao das provas sorolgicas independe da prevalncia da
enfermidade. Devemos levar em considerao os seguintes fatores:
Sensibilidade da prova - a capacidade de um exame se 1)
apresentar positivo quando o paciente realmente portador
da doena que se investiga (VP/VP+FN);
Especicidade - a capacidade de um exame dar negativo 2)
quando o paciente no est doente (VN/VN+FP);
Ecincia - quando se tem concordncia dos resultados de 3)
indivduos verdadeiros positivos e verdadeiros negativos
com indivduos com e sem infeco, na populao estudada
(VP+VN/VP+VN+FP+FN);
47
Reprodutibilidade - a capacidade de obteno de resultados 4)
com valores muito prximos entre si, quando se testa uma
mesma amostra em diferentes ensaios (R);
Valor preditivo positivo - a capacidade de um exame positivo 5)
representar um paciente verdadeiramente portador da doena
pesquisada (VP);
Valor preditivo negativo - a capacidade de um exame negativo 6)
representar um paciente sadio (VN);
Ponto de corte (cut off) - o ponto de corte de um teste 7)
sorolgico o valor que dene o limite entre um teste positivo
e um negativo. A escolha deste limiar leva em considerao
as frequncias dos resultados observados nos testes de uma
populao em geral, bem como os de especicidade e de
sensibilidade de um teste (Figura 29).
Figura adaptada por Bruno Eschenazi.
Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M.
Diagnstico de Laboratrio das principais
doenas infecciosas, parasitrias e auto-
imunes. Correlao Clnico-Laboratorial.
2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2001.
Figura 29: Cut-off (A, B).
48
7.4 PROVAS/TESTES MAIS UTILIZADOS ATUALMENTE
7.4.1 IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA-IFI (Fife & Muschel,
1959; Camargo, 1966)
Baseia-se na marcao de anticorpos com corantes uorescentes
e visualizao ao microscpio de uorescncia com luz ultravioleta
(Figura 30). A leitura visual (microscpio de uorescncia). Tem alta
sensibilidade, sendo mais indicado para a fase aguda da infeco
(anticorpos da classe IgM aps a 1
a
semana). Pode apresentar
reatividade cruzada com outros antgenos, dando origem a resultados
falso-positivos. (Ex.: Leishmania spp).
Figura adaptada por Bruno Eschenazi. Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico de
Laboratrio das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.
Correlao Clnico-Laboratorial. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.
Fotos da IFI de Jlio Csar Miguel- Laboratrio de Doenas Parasitrias- IOC/FIOCRUZ.
Figura 30: Imunouorescncia indireta: A) princpio do mtodo,
B) exemplo de IFI positiva, C) exemplo de IFI negativa,
demonstrando, entretanto, autouorescncia.
49
7.4.2 HEMAGLUTINAO INDIRETA (Knierim,1970; Camargo,
1971)
Baseia-se na sensibilizao de superfcie dos eritrcitos com a
adsoro de antgenos e na reao de anticorpos dirigidos contra
estes antgenos. A reao antgeno-anticorpo provoca a aglutinao
dos eritrcitos (Figura 31). A leitura visual (Figura 32).
uma tcnica accessvel para qualquer laboratrio e de simples
execuo, porm dependendo do kit apresenta problemas de
reprodutibilidade.
A hemaglutinao indireta tambm pode apresentar resultado falso
positivo. Devido a isso, normalmente, so includos nos kits os seguintes
reagentes extras: hemcias no sensibilizadas e 2-mercapto-etanol. O
primeiro empregado devido suspeita de anticorpos anti-hemcia;
neste caso os soros iro aglutinar hemcias no sensibilizadas. O
segundo (2-ME) tem como objetivo eliminar anticorpos IgM naturais,
que tambm podem produzir aglutinao das hemcias.
Figura adaptada por Bruno Eschenazi. Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico de
Laboratrio das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.
Correlao Clnico-Laboratorial. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
Figura 31: Princpio do Teste de Hemaglutinao Indireta.
50
7.4.3 ENSAIO IMUNOENZIMTICO - ELISA (Voller et al., 1976)
Baseia-se na sensibilizao de microplacas (ou prolas) com
antgenos especcos e incubao com anticorpos frente a um
substrato. Um substrato especco para um conjugado marcado
enzimaticamente com peroxidase (ou fosfatase alcalina), revela a reao.
A leitura feita com auxlio de um leitor de ELISA (espectrofotmetro
automatizado) que mede a intensidade da cor obtida em cada poo. A
intensidade de cor da reao diretamente proporcional quantidade
de anticorpos presentes na amostra (Figura 33).
Esta tcnica, que permite a realizao de vrias amostras de
maneira simultnea, em um curto perodo de tempo, pode ter sua
especicidade e sensibilidade aumentada ou diminuda, dependendo
do Ag que utilizado para sensibilizar a placa (Umezawa & Silveira,
1999). um dos mtodos mais empregados no diagnstico sorolgico
da infeco chagsica.
Foto: Jos Borges Pereira- Lab. Doenas Parasitrias- IOC/ FIOCRUZ
Figura 32: Exemplo de resultado de teste de Hemaglutinao Indireta.
51
Figura adaptada por Angela C. V. Junqueira, Carlos Jos de C. Moreira e Bruno Eschenazi.
Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico de Laboratrio
das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.
Correlao Clnico-Laboratorial. 2. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.
Figura 33: Teste Imunoenzimtico-ELISA
52
7.4.4 WESTERN BLOT
Um extrato de antgenos separado por eletroforese e transferido
para uma membrana de nitrocelulose. Aps a transferncia, a
membrana cortada em tiras pequenas e a seguir posta em contato
com o soro a ser testado. Aps a incubao, a reao revelada e a
visualizao de banda (especca) indica reao positiva (Figura 34).
A leitura visual.
O procedimento tcnico laborioso e de custo elevado, por
isso mais utilizado como teste conrmatrio, quando os testes
convencionais so divergentes (no caso da suspeita de infeco
chagsica).
Figura A - Adaptada por Bruno Eschenazi e Figura B - Tese doutorado de Junqueira ACV (2005).
Figura 34: Princpio da reao de Western-blot (A) e resultado de tesa blot
(B): 1) soro de alta reatividade; 2) soro de mdia reatividade; 3) soro de baixa
reactividade (sorologia convencional positiva); 4) soro padro SAPA; 5) soro
sem reatividade; 6) soro de baixa reatividade (sorologia convencional negativa);
7) soro com reactividade para banda de peso molecular superior a 160 kDa
(1 coleta); 8) soro com reatividade para banda de peso molecular superior a
160 kDa (2 coleta, depois de 9 meses); 9) soro de paciente chagsico;
10) soro de baixssima reactividade; 11) soro de indivduo de regio
com infeco por T. rangeli; 12) soro de indivduo de regio com infeco
por T. rangeli; PM - marcadores de peso molecular (kDa) esto esquerda.
53
7.4.5 TESTES DE EXECUO SIMPLIFICADA
Os testes rpidos para diagnstico existentes no mercado tm
como principais caractersticas a rapidez e a simplicidade na execuo,
pois normalmente no demandam equipamento ou conhecimento
qualicado para a realizao do teste ou mesmo interpretao do
resultado permitindo a utilizao tanto de sangue total, como de
plasma ou soro. Seu emprego deve ser destinado a regies onde
o acesso ao diagnstico difcil. Alguns deles tm como princpio
a imunocromatograa de partculas impregnadas com extratos de
T. cruzi em membrana de nitrocelulose, que em caso positivo concentra
a reao antgeno-anticorpo em uma nica fase slida. Exemplos: Stat
-Pak

;

Stick Chagas Teste

(SCT).
Entre os atualmente comercializados para doena de Chagas, para
ilustrar, podemos citar trs deles com fundamentos diferentes:
IDPaGIA

um teste de aglutinao de partculas sensibilizadas

com trs peptdeos sintticos. Esses polmeros precipitam
na ausncia de anticorpos, aps centrifugao de suporte
apropriado, passando pelo gel e cando no fundo do tubo
(reao negativa). No caso da presena de anticorpos anti-T.
cruzi, os polmeros reagem e so retidos na superfcie do gel
(reao positiva). Os polmeros so visveis a olho nu. Apesar
da sua execuo ser relativamente simples, este teste pode no
ser considerado teste rpido, pois necessita de um equipamento
especial.
CHAGAS STAT PACK ASSAY

um teste imunocromatogrco,
que emprega uma combinao de antgenos recombinantes com
alta especicidade contra anticorpos anti-T. cruzi (Figura 35).
IMMUNOCOMB

II um teste imunoenzimtico, que emprega

protenas recombinantes do T. cruzi e anticorpos secundrios
contra imunoglobulina humana (Figuras 36 e 37).
54
Figuras adaptadas por Bruno Eschenazi.
Figura adaptadas por Bruno Eschenazi.
Figura 35: Procedimento e leitura do CHAGAS STAT PACK ASSAY

.
Figura 36: Procedimento do teste IMMUNOCOMB

II
55
Figura adaptada por Bruno Eschenazi.
Figura 37: Interpretao de resultado de IMMUNOCOMB

II
Testes rpidos para deteco da infeco pelo
T. cruzi existentes no mercado
Fonte: Initial table: C Ponce 2007, updated by MSF and
WHO Programme on Control of Chagas disease, in 2011.
56
7.5 APLICAO DOS MTODOS SOROLGICOS
7.5.1 NA TRIAGEM DE INDIVDUOS EM BANCO DE SANGUE
As provas sorolgicas tm grande importncia para evitarmos a
propagao da infeco chagsica atravs das transfuses de sangue.
A transmisso por essa via pode ser devido a alguns fatores como:
No realizao dos testes; 1)
Testes realizados de forma inadequada; 2)
Testes com baixa sensibilidade. 3)
O risco de transmisso do parasita por transfuso de 500 ml
de sangue total oscila entre 12 e 20%. O T. cruzi tambm pode ser
transmitido pelo plasma e concentrado de hemcias. A transmisso
era mais comum nas transfuses de sangue coletado em doadores
pagos e nas transfuses de sangue total (Ref.: OMS, Srie de informes
tcnicos 950, Genebra, 2002).
As provas sorolgicas realizadas no Brasil de acordo com o RDC
153/06/2004 Ministrio da Sade so: a) HIV 1+2 (2 testes); b)
Doena de Chagas (ELISA 1 nica prova), c) HTLVI/II, d) Slis, e)
Hepatite C e f) Hepatite B (AgHBs e Anti HBc).
As provas empregadas para deteco sorolgica da doena de
Chagas na Fundao Pr-Sangue de So Paulo (FPS) e no Hemocentro
de So Paulo (HSP) so: a) Imunouorescncia (diluio 1/40) at
04/2003, b) Hemaglutinao (diluio 1/20) at 03/2002 e c) ELISA
antes de 19/11/93 (Portaria MS 1.376 de 19/11/93 - Obrigatrio
realizao de 2 testes de princpios diferentes at 12/2002).
No obstante, apesar das normas estabelecidas pelo Ministrio da
Sade do Brasil, para que no ocorra a transmisso transfusional, a
implementao de Polticas Nacionais de controle em bancos nem
sempre cumprida de maneira uniforme. Parte disso deve-se ao
fato de que, em todo o territrio nacional, nem sempre se faz uso
de mtodos sorolgicos automatizados com alta sensibilidade e
57
especicidade, conforme preconizado (Ref. OMS, Srie de informes
tcnicos 905, Genebra 2002).
Como forma de uniformizar o padro idealizado, recomenda-se
que sejam feitos, de forma sistemtica, programas externos de controle
de qualidade dos testes sorolgicos utilizados na rotina.
7.5.2 NA TRIAGEM DE INDIVDUOS DE REGIES ENDMICAS
PARA REALIZAO DOS EXAMES PARASITOLGICOS
O grco a seguir apresenta o resultado de um estudo, efetuado
pela equipe do Depto. de Medicina Tropical do IOC-FIOCRUZ, em uma
regio endmica do Estado do Piau, Brasil, onde foi comparada a
sensibilidade de deteco de T. cruzi atravs da PCR, do xenodiagnstico
e da hemocultura, em pacientes sorologicamente positivo (Figura 38).
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Um estudo sobre o xenodiagnstico, a hemocultura e a reao em cadeia da
polimerase na deteco do Trypanosoma cruzi Chagas 1909 em indivduos na fase crnica da infeco
chagsica. 1996. 173 p. (tese de mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte, 1996.
Figura 38: Resultado comparativo de diferentes
tcnicas de diagnstico para doena de Chagas.
58
7.5.3 MODELO DE INVESTIGAO EPIDEMIOLGICA
A maioria das investigaes epidemiolgicas clssicas de doena de
Chagas tem a sorologia como mtodo de triagem inicial. Isso se deve
a sua alta sensibilidade, especicidade e custo em relao aos outros
mtodos de diagnstico. Abaixo temos um organograma elaborado
para a conduta de deteco do T. cruzi em humanos (Figura 39).
Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio
Negro-Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.
Figura 39: Modelo de organograma empregado em estudo efetuado pelo
Depto. de Medicina Tropical do IOC-FIOCRUZ.
59
8. COMPLEXO Trypanosoma cruzi
Atravs de estudos efetuados com isolados de T. cruzi de
diferentes hospedeiros e regies endmicas distintas foi vericado
que esta espcie de protozorio representada por uma populao
heterognea. Pode-se dizer que o T. cruzi um complexo formado
por populaes, muitas vezes bastante heterogneas, presentes nos
diferentes ciclos de transmisso que podem estar sobrepostos ou
no (Coura JR et al., 1966). importante ter o conhecimento que
empregamos o termo cepa para denominar o isolado obtido de
triatomneos, mamferos naturalmente infectados ou pacientes. A cepa
usualmente consiste de uma populao heterognea de parasitas. Em
1999 foram denidas 2 linhagens principais do T. cruzi, denominadas
T. cruzi I e T. cruzi II, visando a padronizao da nomenclatura a ser
adotada pelos diferentes grupos de pesquisa (Anonymous,1999).
Atualmente, atravs da utilizao de diferentes marcadores
moleculares, foi aceita por consenso a subdiviso do txon T. cruzi em
seis linhagens ou DTUs (Discret Taxonomic Units): T. cruzi I a T. cruzi VI
(Zingales et al., 2009).
A diversidade do T. cruzi tem sido vericada empregando-se
distintos parmetros, que vo desde os morfolgicos aos moleculares.
Para ns didticos, podemos dividir as diferentes metodologias
utilizadas em caracterizao biolgica, caracterizao bioqumica e
molecular. Os principais critrios, at a presente data, esto descritos
a seguir:
8.1 CARACTERIZAO BIOLGICA - curva parasitmica,
taxa de mortalidade, morfologia dos parasitas no sangue
perifrico e estudo histopatolgico
No incio da dcada de 70, Andrade et al. (1970 a, b) e Andrade,
S.G. (1974) iniciaram uma srie de estudos visando caracterizao
biolgica de cepas do T. cruzi e seus pers histopatolgicos em animais
experimentais. A partir desses estudos foi possvel classicar as cepas
em trs tipos ou biodemas:
60
Biodema I (tipo I) - Cepas altamente virulentas, que se multiplicam
rapidamente, apresentando elevada parasitemia e mortalidade em
camundongos, que morrem entre o 7 e o 12 dias aps a inoculao.
Apresentam o predomnio de formas delgadas e macrofagotropismo
na fase inicial da infeco. Seu prottipo a cepa Y;
Biodema II (tipo II)- Cepas com multiplicao relativamente lenta e
picos de parasitemia irregulares entre o 12 e 20 dias aps a infeco.
Apresentam a predominncia de formas largas e miocardiotropismo.
Possui como prottipo a cepa So Felipe;
Biodema III (tipo III)- Cepas que apresentam picos da parasitemia
tardios, geralmente entre o 20 e 30 dias aps a infeco. Provocam
baixas taxas de mortalidade e apresentam o predomnio de formas
largas e de baixa multiplicao (~ 50 dias aps a infeco). Acometem
principalmente a musculatura esqueltica. Seu prottipo a cepa
Colombiana. Algumas taxas de parasitemia de cepas de biodema III
esto representadas na gura 40.
Fonte: DEVERA, R.; ILLARRAMENDI, X.; MONTOYA-ARAJO, R.; PIRMEZ, C.; FERNANDES, O.; COURA, J. R.
Biodemes of Trypanosoma cruzi strains isolated from humans from three endemic areas in Minas Gerais
State. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 2002, vol.35, n. 4, p. 323-330).
Figura 40: Taxas de parasitemia em camundongos suos infectados
por cepas do T. cruzi classicadas dentro do biodema III.
61
8.2 CARACTERIZAO BIOQUMICA - Eletroforese de
isoenzimas
A tcnica de eletroforese se isoenzimas para a classicao do
T. cruzi foi introduzida por Toy em 1974. Posteriormente, outros
pesquisadores iniciaram estudos de gentica populacional do T.
cruzi com cepas oriundas da Bahia e de diferentes regies do Brasil,
quando caracterizaram trs grupos principais que foram denominadas
zimodemas (Miles et al. 1977, 1978, 1980). Podemos concluir que
zimodemas so grupos de cepas que apresentam pers eletroforticos
isoenzimticos semelhantes. Enzimaticamente foram caracterizados
trs grupos do T. cruzi (Figura 41):
zimodema I a) , associado a isolados de marsupiais e triatomneos
silvestres,
zimodema II b) , associado a isolados domsticos,
zimodema III c) , associado ao ambiente silvestre.
Fonte: GOMES, Yara de Miranda et al . Caracterizao de uma cepa de Trypanosoma cruzi isolada
de uma zona no endmica no Nordeste do Brasil. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, So Paulo, v.
37, n. 1, 1995. Disponvel em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0036-
46651995000100014&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 29 Jan 2008. doi: 10.1590/S0036-
46651995000100014
Figura 41: Pers Eletroforticos de diferentes
cepas do Trypanosoma cruzi.
Enzimas: A) PGM; B) GPI e C) ALAT.
Cepas: PER - Peruana (tipo I); 21 SF - So Felipe e
WSL - Wild So Loureno (tipos II) e
COL Colombiana (tipo III).
62
8.3 CARACTERIZAO MOLECULAR UTILIZANDO DNA DO
CINETOPLASTO(kDNA) - Anlise do Polimorsmo de Tamanhos
dos Fragmentos de Restrio do kDNA (Restriction Fragment
Lenght Polymorphism - RFLP)
No nal da dcada de 70, Mattei et al. (1977) introduziram a
tcnica de classicao de tripanossomos pela anlise do polimorsmo
dos tamanhos dos fragmentos de restrio do kDNA (Restriction
Fragment Lenght Polymorphism- RFLP). Nesta tcnica, normalmente
um segmento do genoma amplicado e clivado por endonucleases
de restrio. O produto da clivagem separado por eletroforese e
as variaes dos tamanhos das bandas, assim como as repeties,
constituem os chamados pers de RFLP.
Posteriormente, Morel et al. (1980) empregaram a tcnica para a
caracterizao genotpica do T. cruzi e propuseram o termo esquizodema
para denominar grupos com pers semelhantes (Figura 42).
8.4 CARACTERIZAO MOLECULAR UTILIZANDO O DNA
NUCLEAR
8.4.1 TIPAGEM PELO GENE DE MINI-EXON
O gene que transcrito d origem ao mini-exon est presente no
genoma nuclear dos Kinetoplastida em aproximadamente 200 cpias
repetitivas. Este gene constitudo por 3 regies: o exon, o intron e
Montagem de Carlos Jos de C. Moreira
Figura 42: Comparao entre diferentes
isolados de T. cruzi pelo mtodo de
Anlise do polimorsmo de tamanhos
dos fragmentos de restrio do k DNA.
63
a regio intergnica. O exon uma sequncia de 39 nucleotdeos
altamente conservada, sendo adicionado ps-transcricionalmente a
todos os RNAs mensageiros nucleares, atuando no processo de trans-
splicing da parasita. O intron moderadamente conservado entre as
espcies de um mesmo gnero ou subgnero. A regio intergnica
do T. cruzi pode ser amplicada por PCR, possibilitando a classicao
em dois grupos principais T. cruzi I e T. cruzi II (Figura 43).
Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma
cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese), Fundao Oswaldo Cruz, Instituto
Oswaldo Cruz, Curso de Ps-Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
Figura 43B: Gel de agarose corado com brometo de etdio de produtos de PCR para
o gene de mini-exon. As cepas so as seguintes: linhas 1 e 2, cepas de referncia Y
e F (T. cruzi II e I, respectivamente); linhas 3-18, cepas testadas.
Figura adaptada por Carlos Jos de Carvalho Moreira.
Figura 43A: Representao esquemtica do ensaio de PCR para tipagem de
T. cruzi empregando o gene de mini-exon. A caixa preta representa o mini-exon
de 39 bp, a caixa cinza representa a sequncia do intron (70 bp) e linha espessa
limitado pelos traos vermelhos representa a regio intergnica (484 bp).
64
Esta tcnica uma ferramenta utilssima para estudos, tanto em
tripanossomatdeos, quanto para outros txons de protozorios
parasitas. Em relao ao T. cruzi o RAPD tem sido utilizado para
obter marcadores de DNA que permitem estabelecer relaes
genticas entre diferentes isolados. Apresenta algumas vantagens
como: a) como se trata de uma tcnica simples no necessita de
8.4.2 TIPAGEM PELO DNA POLIMRFICO AMPLIFICADO
ALEATORIAMENTE (Randomly Amplied polymorphic DNA - RAPD)
Esta tcnica tem sido utilizada para estudos taxonmicos e de
caracterizao de micro-organismos desde a sua introduo por
Welsh e McCleilland e Willians et al. em 1990. Basicamente uma
reao de PCR que utiliza pequenos primers de sequncias aleatrias
capazes de amplicar regies annimas do DNA nuclear. O produto
da amplicao, quando analisado por eletroforese em gel de
poliacrilamida, demonstra padres de bandas especcas para cada
isolado de um determinado agente infeccioso (Figura 44).
Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma
cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto
Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
Figura 44: Pers de RAPD de cepas de T. cruzi originais (O), aps
manuteno em camundongo (C) e meio LIT (L). A. Iniciador 2.
B. Iniciador 4. M, marcador de Peso Molecular, 100 bp.
Cepas P23-1, Ig62, Ig523-2, Ig 520, Ig192-1, Ig539, BE-25 e B84.
65
uma informao prvia sobre a sequncia do DNA a ser estudado;
b) requer pequenas quantidades de DNA para que possa ser realizada;
c) pode ser empregado um nmero limitado de primers ou iniciadores.
As desvantagens so a baixa reprodutibilidade da tcnica e no reetir
geneticamente a variabilidade populacional.
8.4.3 TIPAGEM ATRAVS DAS REGIES INTERGNICAS (IRTs)
DOS GENES RIBOSSMICOS (RFLP- ITS- rDNA)
Os genes que codicam o RNA ribossmico so altamente
conservados tendo potencial para a anlise logentica. So
encontrados como sequncias repetitivas que codicam para uma
subunidade maior e para outra menor separadas por regies que
no so transcritas, denominadas de espaadores no transcritos
(NTS - non transcribed spacers). Tambm apresentam regies
codicantes denominadas de espaadores internos transcritos (ITS -
internal transcribed spacers) que so pequenas sequncias de grande
variabilidade, anqueados por segmentos altamente conservados, o
que torna possvel a confeco de iniciadores para PCR que anelam
nessas regies.
Cupolillo et al. (1995) padronizaram uma tcnica desenhando
iniciadores de PCR que permitiram obter um produto de amplicao
correspondente a subunidade 5,8 S e mais os dois ITSs anqueadores
(Figura 45A). Os produtos da PCR so digeridos com enzimas de
restrio, e aps a eletroforese faz-se a anlise fentica (Figura 45B).
Esquema adaptado de Cupolillo, E. et al., 1995. por Carlos Jos de Carvalho Moreira.
Figura 45A: Locus de um rDNA de Tripanossomatdeo - IR1 e IR2 so
os iniciadores da PCR que anelam-se nas regies codicadoras para
as subunidades menor (SSU) e maior (LSU); ITS representa o
espaador interno transcrito e NTS espaador no transcrito.
66
8.4.4 TIPAGEM POR MICROSSATLITES
Os microssatlites so uma classe de DNA, que se apresentam
de modo repetitivo, em geral em torno de 1 a 6 pares de bases (bp),
que esto presentes de forma dispersa no genoma dos eucariotos.
Baseados no nmero de repeties podem ser denominados mono,
di, tri, tetra, penta e hexanucleotdeos. O elevado polimorsmo dos
microssatlites resultado da variao no nmero de repeties, em
tandem, de um alelo para o outro. Experimentalmente determinou-
se que a taxa de mutao dos loci de microssatlites que pode variar
de 10
-6
a 10
-2
. Essa taxa varia segundo o tamanho da repetio. Desta
maneira, os microssatlites so considerados marcadores de eleio
com aplicaes em reas biomdicas como ecologia, gentica de
populaes e reconstruo logentica.
Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma
cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo
Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
Figura 45B: Eletroforese em gel de agarose 0,8 % mostrando os
produtos de PCR corados com brometo de etidio e visualizados sob
luz UV. Os produtos correspondem as regies ITS1 + 5.8S + ITS2
do rDNA do T. cruzi: 1) marcador de peso molecular, 1kb; 2) P23orig;
3) P23; 4) P23cam; 5) Ig523orig; 6) Ig523L; 7) Ig523cam; 8) Ig62orig;
9) Ig62L; 10) Ig62cam; 11) B84orig; 12) B84L; 13) B84cam.
67
A metodologia consiste na amplicao pela PCR, usando um par
de iniciadores uorescentes especcos que anqueiam o segmento
contendo as repeties, analisando-se posteriormente, o tamanho
dos fragmentos gerados em sequenciador automtico que demonstra
os eletrouorogramas (picos, Figura 46).
Em T. cruzi a anlise dos microssatlites foi introduzida inicialmente
para estudar a estrutura da populao do parasita, tentando averiguar
se uma determinada cepa era policlonal. Esta tcnica tambm mostrou
utilidade como marcador para reconstruo logentica.
As cepas que apresentam um ou dois picos (um ou dois alelos,
correspondendo a diploidia) so consideradas monoclonais. O
aparecimento de mais de dois picos nos diferentes loci indicativo da
presena de mais de uma populao (policlonalidade).
Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosoma
cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz,
Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.
Figura 46: Exemplos de possveis resultados obtidos num teste de
microssatlites para T. cruzi. As guras representam eletrouorogramas
dos produtos da PCR de cepas hipotticas do T. cruzi para um determinado
locus de microssatlite: A) Perl mostrando a amplicao de um pico
(cepa monoclonal homozigota) ou dois picos (cepa monoclonal heterozigota);
B) Amplicao de trs ou quatro picos de cepa multiclonal.
68
8.4.5 CLASSIFICAO ATUAL POR DTUs (DISCRETE TYPING
UNIT)
Durante o Simpsio Internacional em comemorao aos 90 anos
da descoberta da doena de Chagas, um grupo de pesquisadores se
reuniu visando a padronizao da nomenclatura do T. cruzi (Anonymous,
1999). Ficou estabelecido que as cepas do T. cruzi seriam agrupadas
em dois principais grupos denominados T. cruzi 1 e T. cruzi 2. As cepas
Tc 1 estariam ligadas ao ciclo de transmisso silvestre e as Tc 2 ao ciclo
domstico, com poucas excees.
Um novo consenso para denir a nomenclatura especca para
o T. cruzi foi realizado em 2009 (Zingales et al., 2009) e uma nova
classicao foi aceita, baseada em DTUs. Podemos denir DTUs como
grupos de cepas que so geneticamente mais relacionados entre
si do que com outros grupos, sendo identicveis por marcadores
genticos, moleculares ou imunolgicos. Esta nova classicao
levou em considerao o esquema proposto por Lewis et al. (2009),
utilizando novos marcadores em ensaios triplos:
A) Anlise por eletroforese do produto da amplicao pela
PCR do gen da subunidade maior do DNA ribossmico (LSU RNA)
a classicao dada pelo tamanho do fragmento (em pares de
bases);
B) Anlise por eletroforese do produto resultante da digesto
pela enzima de restrio EcoRV do gene de HSP60 (60-kDa heat
shock protein), amplicado pela PCR (PCR/RFLP-HSP60-EcoRV) - a
classicao dada pelo perl de bandas gerado;
C) Anlise por eletroforese do produto resultante da digesto pela
enzima de restrio HhaI do gene de GPI (glicose-6-fosfato-isomerase),
amplicado pela PCR (PCR/RFLP-HhaI-GPI). Como no caso anterior, a
classicao tambm dada pelo perl de bandas gerado (Figura 47).
A Figura 48 demonstra os diferentes gentipos do T. cruzi
(classicao atual) e sua distribuio geogrca.
69
Figura 47: Esquema do triplo ensaio proposto por Lewis et al., 2009.
Figura adaptada de: WHO, how, what and where? Nature Outlook, v. 465, n. 7301, p. 58-59, Jun. 2010.
Figura 48: Distribuio geogrca dos 6 gentipos do T. cruzi.